牛樟芝的培养方法 |
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| 申请号 | CN201310432728.7 | 申请日 | 2013-09-22 | 公开(公告)号 | CN104412830B | 公开(公告)日 | 2017-04-12 |
| 申请人 | 东海大学; 绿茵生技股份有限公司; | 发明人 | 杨芳锵; 吴嘉利; 纪亚辰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 所述 牛 樟芝的培养方法，主要是通过光照 波长 改变，而使所培养出的牛樟芝的内活性成份含与种类量增加，并再通过调整如培养基 含 水 量 、培养基的组成成份及其比例、培养 温度 等环境因子，更得有助于提高牛樟芝内活性成份的含量与种类。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种牛樟芝的培养方法，该培养方法是将种菌接种于培养基中，在至少一培养条件下进行培养，所述培养条件包含有光照环境，所述光照环境是选自由绿光及蓝光所组成的群，其中，当光照环境为蓝光时，该照光强度为2μmol/s·m2至16μmol/s·m2；而当光照环境为绿光时，该照光强度为11μmol/s·m2至20μmol/s·m2。 |
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| 说明书全文 | 牛樟芝的培养方法技术领域背景技术[0002] 牛樟芝（Antrodia cinnamomea）又被称为樟芝，其为台湾所特有种的真菌，主要生长于台湾山区海拔约450～1500公尺间的牛樟树的腐朽心材内。近期研究指出牛樟芝营养价值极高，并具有许多生理活性，因此，牛樟芝乃成为目前十分珍贵的真菌，市场上的需求量也日渐增加。更进一步而言，牛樟芝主要活性成份包含有多糖体、多酚类化合物及指标性产物三萜类（triterpene），其中，经研究发现多糖体可用以提升免疫力以及具有抗肿瘤的效用；多酚类化合物被认为可作为生物体的还原剂，具有清除自由基抗氧化及抑制坏胆固醇氧化等能力，并且可阻断癌细胞生长所需的酵素，达到抑制癌症的效果；三萜类被证明可促进癌细胞死亡、抑制肝癌细胞增值、修复肝脏、提升肝脏机能、抗发炎、降血脂、降血压、防止中风以及调节免疫等功能。然而，基于牛樟芝寄生的牛樟树为保育类树种，并且牛樟芝生长速度缓慢，因此自然环境中是无法取得大量的牛樟芝，因而如何获得牛樟芝，及有效地提高牛樟的内活性成份含量成为目前生医产业的研究重点。 [0003] 随着培养牛樟芝的方法及其使用的培养条件不同，所能够获得的活性成份也随之改变。目前主要生产牛樟芝培育方法有液态培养法、固态培养法及椴木培养法，其中，液态培养法是将牛樟芝养于已调配好比例的碳源及氮源的液态培养基中，优点在于成本低，培养时间短，仅须约7～14天即可培育出牛樟芝，但是，所培养出的牛樟芝三萜含量低，且所含有的三萜是非野生牛樟芝所特有的三萜类；固态培养法是以天然谷物及水组成的固态培养基培育牛樟芝，并且藉由人工方式控制温度、湿度，而使所培育出的牛樟芝具有较高含量的三萜类，只是，需要较长的培养时间，约3～6个月，且依据所使用的培养基不同，所培养出的牛樟芝所含有活性成份也不相同，造成量产上品质不一，此外，也无法涵盖野生牛樟芝所特有的有效三萜类成份；椴木培养法是利用牛樟木作为培养基，具有可培养出与野生牛樟芝子实体相同成份的优点，辅以人工方式控制培养环境，能增加牛樟芝子实体品质的稳定性，但，椴木培养法需要1～3年的培养时间，并由于牛樟树为保护树种而取得不易，使得培养成本增加且量产困难。 [0004] 而为兼顾牛樟芝内含活性成份的产量及生产成本，目前大多选择以固态培养法养育牛樟芝，但目前技术仍有若干缺陷，举例来说，培养完成的牛樟芝与颗粒状的固态培养基分离不易，后续应用则须连带着培养基而使产品受到局限；再者，所培养出的牛樟芝子实体较薄，内含的活性成份产量也亦随之减少。另也有藉由改变牛樟芝液态培养时的光照波长以影响牛樟芝活性成份的含量，但，蓝光是仅能增加胞外多糖的含量，无法增加三萜含量，而红光则对三萜含量有助益，却无法影响胞外多糖含量。据此，目前仍无法提供一种培养牛樟芝的方法，能够提高其活性成份的含量，并有效控制生产成本。 发明内容[0005] 本发明的主要目的是在于提供一种牛樟芝的培养方法，用以提升牛樟芝内活性成份的含量与种类。 [0006] 本发明采用以下技术方案： [0007] 一种牛樟芝的培养方法，该培养方法是将种菌接种于培养基中，在至少一培养条件进行培养，所述培养条件包含有光照环境，所述光照环境是选自由绿光及蓝光所组成的群。 [0008] 其中： [0009] 所述光照环境的照光强度是介于1μmol/s·m2至20μmol/s·m2，当光照环境为蓝光时，该光照环境的照光强度以2μmol/s·m2至16μmol/s·m2为较佳；当光照环境为绿光时，该光照环境的照光强度以11μmol/s·m2至20μmol/s·m2为较佳。 [0010] 所述培养条件包含有25℃～35℃的培养温度。 [0011] 所述培养基是包含有粉末状基质及水，所述粉末状基质是具有至少一五谷杂粮，如为苦荞麦粉、糙米粉、红薏仁粉或至少二上述粉末以一定比例混合而成者。 [0012] 所述粉末状基质是以糙米粉、苦荞麦粉及红薏仁粉混合而得，其中，红薏仁粉的含量是为最低，苦荞麦粉的含量次之，糙米粉的含量最高；或红薏仁粉的含量是为最低，糙米粉的含量次之，苦荞麦粉的含量最高；具体来说，所述粉末状基质的组成比例是以红薏仁粉为1，糙米粉为红薏仁粉的10～2倍，苦荞麦粉为红薏仁粉的2～10倍者为较佳，例如糙米粉、苦荞麦粉及红薏仁粉的组成比例为9：2：1。 [0013] 所述培养基的水含量是介于35～55％之间，又以水含量为35～50％者为较佳。 [0014] 所述种菌是由打碎的牛樟芝菌块所培养制备而成的，用以使菌球在可视状态下均匀分配，有利于接种，可避免污染。 [0015] 更进一步而言，本发明所述方法是包含有二培养条件，其中一培养条件是在无光照环境下进行培养15天，另一培养条件是在该光照环境下进行培养至少15天。 [0016] 其中，所述一培养条件的培养温度是低于另一培养条件的培养温度，具体来说，所述一培养条件的培养温度是为25℃，另一培养条件的培养温度是为25～35℃。 [0017] 本发明的有益效果在于： [0019] 图1是以不同强度的绿光进行牛樟芝培养，测定各牛樟芝内的各活性成份含量的结果。 [0020] 图2是以不同强度的蓝光进行牛樟芝培养，测定各牛樟芝内的各活性成份含量的结果。 [0021] 图3是以不同含水量的糙米粉末固态培养基进行培养，测定各牛樟芝内的各活性成份含量的结果。 [0022] 图4是以不同含水量的苦荞麦粉末固态培养基进行培养，测定各牛樟芝内的各活性成份含量的结果。 [0023] 图5是以不同含水量的红薏仁粉末固态培养基进行培养，测定各牛樟芝内的各活性成份含量的结果。 [0024] 图6是以不同温度变化培养牛樟芝，测定各牛樟芝内的各活性成份含量的结果。 [0025] 图7是以不同组成比例的固态培养基进行培养，测定各牛樟芝内的各活性成份含量的结果。 具体实施方式[0026] 本发明所述牛樟芝的培养方法，主要是通过光照波长改变，而使所培养出的牛樟的内活性成份含量与种类增加，并再通过调整如培养基含水量、培养基的组成成份及其比例、培养温度等环境因子，更有助于提高牛樟芝内活性成份的含量与种类。 [0028] 所谓培养基，是包含用以培养真菌类的液态培养基及固态培养基。 [0030] 以下，将通过若干实例并搭配图式作更进一步说明本发明。 [0031] 实施例1：制备种菌 [0032] 本实施例中所使用的牛樟芝菌株（BCRC35396）是由台湾新竹食品工业发展研究的生物资料保存及研究中心所提供，于25℃下培养于斜面培养基中，直至牛樟芝菌丝长满，其中，斜面培养基的组成是为2％葡萄糖、2％麦精、0.1％蛋白分解物（Peptone）及2％胶体。 [0033] 取适量已长有牛樟芝菌丝体的斜面菌种移接至牛樟芝平面培养皿培养基进行培养，至牛樟芝菌丝于平面培养皿中成长至半径约3.5公分的圆形即为完成，其中，牛樟芝平面培养皿培养基的组成是如同斜面培养基。将制备完成的培养基分为8等分， [0034] 将上述培养完成的平面培养皿培养基分为8等分，分别加入已调配好的8瓶液态培养基中，其中，液态培养基的组成为2％葡萄糖、2％麦精、0.1％蛋白分解物。再将各该液态培养基的菌块完全打碎，而后置于25℃、100rpm的培养箱中培养5天，以供下列实施例之用。 [0035] 实施例2胞内多糖测定法 [0036] 将一待测样品100毫克粉末与10毫升蒸馏水置于离心管中，进行灭菌，而后以8000rpm离心5分钟，收集一上清液。将该上清液与95％酒精以体积比1：4的比例混合，于4℃冰箱静置约24小时，用以使其内多糖体沉淀，再以8000rpm进行离心5分钟，除去其上清液而获得沉淀物。将该沉淀物以氢氧化钠回溶并稀释，以酚-硫酸法（Phenol-sulfuric acid assay）测定胞内多糖浓度，将完成稀释后的溶液与5％酚溶液混合，加入5毫升浓硫酸，混合 10分钟，再以25℃恒温水浴槽反应15分钟，以分光光度计测定于490nm波长下的吸光值，对照葡萄糖标准品浓度与其吸光值标准曲线即可得知该待测样品的多糖浓度。 [0037] 实施例3总多酚含量测定 [0038] 取待测样品的菌丝体以固定倍数（1：20）的甲醇于50℃、130rpm的水槽内进行萃取反应约12小时，之后以8000rpm进行离心5分钟，得到上清液。将该上清液加入6毫升2％的碳酸钠溶液均匀混合，再加入酚试剂（Folin-Clocalteu’s phenol reagent）进行反应约30分钟，而后以波长730nm测定其吸光值，比对已知浓度的标准没食子酸（Gallic acid）检量线，用以计算出该待测样品的总多酚含量。 [0039] 实施例4三萜类含量测定 [0040] 取待测样品100毫克与50％乙醇3毫升于离心管中混合，以超声波震荡萃取30分钟，再以8000rpm离心5分钟。自离心管中取出上清液3毫升放入一样品瓶中，再于离心管重复上述加入乙醇、萃取及离心等步骤，而后取出上清液3毫升加入该样品瓶中。烘干该样品瓶中的上清液而成为干糙物，加入3毫升水回溶和3毫升氯仿，以超声波震荡萃取30分钟，而取出其下层液体，并加入3毫升5％碳酸氢钠，再以超声波震荡萃取30分钟，进行酸碱值调整至约2～3，取其下层液进行烘干，加入2毫升饱和乙醇，以波长245nm测定吸光值，则可得该待测样品的三萜类含量。 [0041] 实施例5培养光照波长及强度分析 [0042] 先将糙米以磨粉机磨成粉末状，取25千克糙米粉置于一玻璃平板上而与15千克水均匀混合，经灭菌后作为用以培养牛樟芝的固态粉末培养基。将实例1中所培养完成的牛樟芝种菌，以5％接菌量均匀接至该固态粉末培养基中，封口后于25℃恒温培养箱进行培养15天后，再进行照射光线。本实施例中是依据照射光线波长不同而分为两组实验设计组，其中，第一实验设计组是照射绿光，第二实验设计组是照射蓝光；各实验设计组又分别依具光2 线强度不同而分为四组，其中，第一组是为空白组，第二组的照光强度为1～2μmol/s·m ，第三组的照光强度为15～16μmol/s·m2，第四组的照光强度为19～20μmol/s·m2。各组经照光培养15天后，分别收集各组所生长的牛樟芝，经过24小时烘干，磨粉并且以实施例2至4所述方法测定各组牛樟芝中三萜类、总多酚以及胞内多糖的含量。各组重复上述流程三次，将各组牛樟芝各活性成份的含量经统计后的结果乃如图1和图2所示，其中，图1和图2依序分别为第一实验设计组和第二实验设计组所测得的结果。 [0043] 由图1的结果可知在第一实验设计组中第二组至第四组的胞内多糖的含量分别为66.38mg/g、96.55mg/g及60.19mg/g，总多酚含量分别为38.86mg/g、43.71mg/g及25.46mg/g，粗三萜含量分别为22.28mg/g、39.64mg/g及17.81mg/g；而由图2的结果可知第二实验设计组中第二组至第四组的胞内多糖的含量分别79.78mg/g、73.83mg/g及41.61mg/g，总多酚含量分别为27.46mg/g、41.90mg/g及29.09mg/g，粗三萜含量分别为22.59mg/g22.39mg/g、 13.15mg/g。更进一步来说，当以绿光强度为15～16μmol/s·m2进行照射培养后，所得的总多酚含量是为未照光组的2.69倍，且粗三萜含量是为未照光组的2.92倍；当以蓝光强度为 15～16μmol/s·m2进行照射培养后，所得的总多酚含量是为未照光组的2.53倍，且粗三萜含量是为未照光组的2.70倍。 [0044] 因此，整体来说，由图1和图2的结果显示不论照射绿光或蓝光，皆能提升牛樟芝内活性成份的含量或种类，而照射蓝光时，是以强度为2～16μmol/s·m2，所得的各活性成份2 含量最高；照射绿光时，是以强度为11～20μmol/s·m，所得的各活性成份含量最高[0045] 实施例6固态培养基含水量分析 [0046] 将分别以适量糙米粉末与比较例的水在培养容器中进行混合，制备而成含水量为55％的糙米粉末固态培养基和含水量为45％糙米粉末固态培养基，分别用以作为第一组及第二组。再分别于各组的固态培养基上接种5％种菌，进行培养3个月，并于培养至第3个月时将所生长的牛樟芝与其固态培养基分离，通过实施例2至4所述方法测定于各组所培养出牛樟芝内活性成份的含量，结果如图3所示。 [0047] 如同上述步骤分别制备不同含水量的苦荞麦粉末固态培养基和不同含水量的红薏仁粉末固态培养基的牛樟芝培养，并且分别如同上述糙米粉末固态培养基依据其含水量分为第一组和第二组，而后进行于各组固态培养基进行牛樟芝培养，并测定各组于培养3个月所得牛樟芝的内活性成份含量，结果如图4和图5所示，其中，图4为以不同含水量的苦荞麦粉末固态培养基进行培养的结果，图5为以不同含水量的红薏仁粉末固态培养基进行培养的结果。 [0048] 由图3的结果可知，以含水量55％的糙米粉末固态培养基所培养出牛樟芝，其胞内多糖含量为2.42mg/g，总多酚含量为46.38mg/g，粗三萜含量为51.84mg/g；而相较于此，以含水量45％的糙米粉末固态培养基所培养出牛樟芝，其内活性成份含量皆增加，胞内多糖、总多酚及粗三萜的含量分别为33.55mg/g、41.60mg/g及51.84mg/g。 [0049] 由图4的结果可知，以含水量55％的苦荞麦粉末固态培养基所培养出牛樟芝，其胞内多糖含量为5.01mg/g，总多酚含量为33.90mg/g，粗三萜含量为23.95mg/g，而以含水量45％的苦荞麦粉末固态培养基所培养而得的胞内多糖是为43.02mg/g，总多酚为36.27mg/g，粗三萜的含量为44.82mg/g，也就是说，以含水量45％的苦荞麦粉末固态培养基培养而得的各活性成份含量都高于以含水量55％的苦荞麦粉末固态培养基所培养而得者。 [0050] 由图5的结果可知，以含水量55％的红薏仁粉末固态培养基所培养出牛樟芝，其胞内多糖含量为2.84mg/g，总多酚含量为26.53mg/g，粗三萜含量为8.41mg/g，而相较于此，以含水量45％的红薏仁粉末固态培养基所培养出牛樟芝内活性成份含量皆增加，胞内多糖、总多酚及粗三萜的含量分别为18.70mg/g、28.20mg/g及20.06mg/g。 [0051] 由图3至图5的结果显示含水量为45％的固态培养基进行牛樟芝培养所得的各活性成份含量是高于含水量为55％的固态培养基进行牛樟芝培养所得的。 [0052] 实施例7培养温度分析 [0053] 本实施例中共有三组实验组，各组是先分别将糙米以磨粉机磨成粉末状，取25公克糙米粉置于玻璃平板上，并以水调整其含水量为45％而形成一固态培养基，经灭菌后，再将实施例1的种菌以5％接菌量接至各组固态培养基，而后设置依据不同培养温度进行牛樟芝培养，其中，第一组是为以25℃恒温培养室固态培养牛樟芝30天，第二组是先以25℃恒温培养室固态培养牛樟芝15天，再以培养温度30℃培养15天，第三组是先以25℃恒温培养室固态培养牛樟芝15天，再以培养温度35℃培养15天。收集完成培养的各组牛樟芝，以实施例2至4所述方法测定各组牛樟芝内活性成份的含量，结果如图6所示。 [0054] 由图6的结果可知，第一组所得的各活性成份含量，第二组和第三组所得的各活性成份含量均增加。更进一步而言，第二组所得获得的总多酚和粗三萜含量分别为23.27mg/g和23.51mg/g，大幅高于第一组；而第三组的胞内多糖含量（121.26mg/g）比第一组所得的胞内多糖增加。因此，由图6的结果显示牛樟芝培养15天后将温度升高至30～35℃得有助于提高其内活性成份的含量，如果要提升总多酚及粗三萜的含量是将温度调整为30℃进行培养较佳；如果欲使胞内多糖的含量大幅增加则将温度调整为35℃进行培养较佳。 [0055] 实施例8固态培养基组成分析 [0056] 首先，分别将糙米、苦荞麦及红薏仁予以磨制成粉末状，而依据不同比例混合制备成为含水量为45％的固态培养基，设置4组，其中，各组培养基所使用的各成份比例如下，第一组是仅使用糙米粉，第二组为糙米粉、苦荞麦粉和红薏仁粉组成比例为5：2：1，第三组为糙米粉、苦荞麦粉和红薏仁粉组成比例为7：2：1，第四组为糙米粉、苦荞麦粉和红薏仁粉组成比例为9：2：1。将各组固态培养基灭菌后，将实例一的种菌以5％接菌量接至各组固态培养基中，进行牛樟芝培养3个月，以实施例2至4所述方法测定各组牛樟芝内活性成份的含量，结果如图7所示。 [0057] 由图7的结果可知第四组所测得的各活性成份含量皆高于其他三组，显示第四组所使用的固态培养基的组成比例（糙米粉：苦荞麦粉：红薏仁粉＝9：2：1）是有助提升于牛樟芝内活性成份的含量。更进一步而言，由图7的结果可知以糙米粉、苦荞麦粉和红薏仁粉混合制成的固态培养基中，红薏仁粉所占比例越低时，是越有助于提升牛樟芝内粗三萜的含量。 [0058] 由上述各该实施例与实例的说明可知本发明所述牛樟芝的培养方法可通过光照来源和强度来控制，提升所培养的牛樟芝内活性成份含量，而辅以其他培养条件的控制，如以两阶段培养温度的控制、培养基组成的调配、培养基的含水量等，可增加牛樟芝内活性成份的含量。因此，通过本发明所述牛樟芝的培养方法是可使牛樟芝子实体厚度增加，有效提高其内活性成份的产量，且所培养完成的牛樟芝可与培养基完全分离，增加未来商业利用的价值与变化性。 |
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