通过基于磷酸抑制和超声处理样品的方式分离粘附于固体样品微生物的方法

通錄于鳅抑制械声处理#^口 的方式分离粘附于固体#^微生物的方法

鉢领域

本发明公开了一种^^基于高摩尔狄的緩冲液（0. 5M以上）和超声技术 来分离存在于固^fW^中的生物群落的触物的方法。

背景狄

固体样品中微生物的分析与多种生物技术的领域高度相关，如生物浸矿 (Biomining )、生物^f务复（Bioremediation)领域，"^而言无i^l^H^野生的 或引入的生物群落的特征，都涉^Jt^定样品。这种固^#品可以是例如矿 源、S^为^r矿（ore concentrates )、新矿、黄45^户、黄铜矿、蓝铜矿（covel ine )、 尾矿、浸出尾矿、脉石、和通常的金属的和一Mr属种；等等。

生物浸矿是具有巨大商业利益的^^领域。生物浸矿可以定义为^^]g 物;^r石中重新获4Hr属。最传统的^J^t物浸出（bioleaching)，它B

物浸矿不^(RA这一个单独的步骤，它还是对所包含^生物的监控^f预，因

为这些才i^il合的并持续j^。 ^tbi涉;s^it:的工艺^t方法学的开发的

实验室水平的^9f究。

为了有效的;^生物浸出，便于控制，甚至是干预实^Lh述操怍的微生物 群落。通过应用一些可能W"存在于矿藏中微生物的扭术来实祐J^i控制，

通常，

行。迅些孑坏经仗卞卞与 当这些^^应用到复合的Jf^^口时，获得的,艮差，因为存在的矿石物理 干駄其氧化 一 麻赠能够破坏该,斤需要的生物材料。

例如，广^I于检测和鉴别微生物的一种^t^l^^Sl^^技术，PCR。 这项^^只需要有少量完整的核苷^^子的存在就可以启动反应。M需要的 量少，但是对提取自固##本中的#^进行成功的PCR扩增^M:非常困难的。

这种情况的J^是因为当^^1直接的雜方法时，细胞与M接触时錄，所

iii^f为矿源时，外溶解到溶液中的核苷^t具有很强的破沐性。即使^^J

具有较少破坏性的矿物M，例如i^LiU^p、物，^M摊l^fii^^在pcr 中的作为才莫板的核香酸（Miller et al，A卯l.Environ.Microbiol.Vol 65: 4715-4724， 1999; Zhou et al， A卯l. Environ. Microbiol. Vol 62: 316-322, 1996 ).

第^从T源中获得核酸的分子生物学方法A^离存在于固^#本中的细 Jte着石i^些细l^纯化核酸。尽管这种方法的优势明显，因为它将核酸从 破坏性的环境中分离出来，但只有相对较少的出版物中使用该方法，并且，其 不能保证彻底的获得最初存在于样本中的细胞。

在;M页域内 一直期望能够彬'J一种将存在于固##本中的M物提取出来 的方法，无论是将其用于需粉离的孩^1物存活的孩仏物学技术中，i^l^)于 纯^^5些分离自矿藏中的孩&物核酸的^"生物才棘中。

本发明解决了这个技术问题，发明了一种方法，其^^1高狄的盐和金属 AU广藏中分离其上附着的孩性物群落，^f^)高摩尔M的磷酸緩沖^超声 技术，获#^和存活的（viable)微生物。所述微生物可用于传统的微生物 学或分子生物学技术中。

当超声技术应用于浸^^沖液中的固>^#本时，已^JL^某些控制条 件下，上清中含有4^的活的败物，因此可以直接用于孩速物学技术，或更 ^f^l]于^^生物学才棘，因为核酸可以容易的>^^1些全#^物中提取出来。

我们发^?Lt^^中没有^^r研究能够通it^声^^成功的分离存在于固 ^#本中的#^物，并且特别当这些固体是含有对M物和分离的DM均具有 破沐性的试剂的矿源时。有一些研究关于这项^l^用于分离存在于i^iU;C^ 物中做物，即^^在》br源^x更5脉"的a下，没有获得非常妤的结 果。例如，Picard等(A卯l.EnviroiL Microbiol. Vol 58: 2717-2722， 1992)描述

了超声^M^作为最有效的方法分离与土壤粘附的细胞，但是其缺点在于釆用该 超声才1^处理分离自i^L的细^导致产生DM小片艮我们;NKt这些片段化 的DNA是在没有^m冲液的情况下城超声^Ht的结果，^it种糾下细胞 不仅被秋出来，而JL^L破坏。^^本发明的方法就不会jgjt这种情况，分离 自固*品的细;!&###完^^存活，并且，如果要纯4诚酸，可以在与从常

规实验室培絲获得的相同糾下获得。

另一个出版物中在土壤中使用超声技术的方法是Buesing和 Gessner(Aquat.Microb.Ecol.Vol 27: 29-36， 2002)描述的。四个步J^f^J了不 同的仪器用于秋与环嫂J5E^物^M目结合的细菌，该文章对这两个步l^ii行 t嫩。"W^仪器是具有强度80W的棒W1声器；具有强度95W的溶液型超声 器；Ultra-Turrax⑧组织均浆器和Stomacher 80@实验室用的混合器。在每种 情况下对样品处理0. 5到20分绅。已经发KL^有效的;A^^物中a细菌的方 法是使用Sto咖cher 80®,而iWM^R器的提取糾非常苛刻，这絲致 明显的细JMC坏。Buesing的结果对超声方法来说并不是有利的。而且，因为以 ^^的盐^r属处理5f^阵品，而且由于其i殳计Stomacher 80Wf磨系^ti 要适合于小颗iWo。。或糊，该系^t矿源样品的有效性是有4H义的。矿源样品 中通常含有;U1寸颗粒（直径2-5cm)并富含盐和矿物。同时<^1本专利中的高 摩尔就的磷酸緩冲^^声技术，当对具有不同颗狄寸和舰的盐和矿物 不同来源的矿源进行处理3^皮证明是有#方便的，并且因为如此，表明;UI] 于解决对来自矿源细胞的提取问题的有效可选择方法。

另 一 方面,Craig 等(Journal of Applied Microbiology,Vol 83: 557-565， 2002)蕭了用于分离来自海岸^^物的细菌的多种^t^。 AX搅 拌；溶^^声，700 W， 35 kHz 6到10^4中，然后棒超声，100 W， 20 kHz 15 秒到1 *，进行t嫩。1克^^浙的#/口与9ml的蛋白胨水（含有0.1%的蛋 白胨）混^*£行不同的处理。结^示^^声对从含有高^L的沙石的沉 积物提取细菌更有效，^t含有污泥，粘土和有M的沉农浙中提取细菌的效 率较低。^il些;^P、物的氣昏类型中，最有效的方法^AX撒泮，本发明中开 展的方法不同与Craig描述的^T一个方法，因为本^发明的方法使用了高摩尔 狄的^^緩冲液，其可以保证大多数细J!^皮提取出来，当然tbAX,更有 效。

正如你所看到的，迄今为JB^殳有介绍过^1的从含有高^1的盐和金属 的固M品中分离g物的方法。本发明将要解决这一^L^问题，证明4捐超 声技术可以将存在与固>«*^中的触物分离出来。

发明简述

本发明^iHf 了 一种用于分离存在于固*品中的te物群落的M物的方 法，并且， 一旦分离出这些孩&物，在做物学^^中^J^它们，或从它们中

提取核酸DM和RNA用于H生物学4支术。

这种固*品可以是例如矿源其含有例如，精矿、新矿、黄铁矿、黄铜矿、

蓝4^A >CT、浸出4/户、乐^S、和^t矿中的金属'I^M^r属'断类；等等。 该方法可以应用于^f可固^M^粒尺寸，^f户石样品的情况下，无论是>^^广

藏、碎石、渣滓（ground)或粉末中获得。它可以同样的应用到未经生物学处 理的固^W品上或经ii^养的样品中，以增加其生物数量。

该方法主要包括w曼i錄高摩尔、;;iyL的基于磷,緩沖液中的固^#品进

行超声处理，目的是获^"有4^te物的上清，其可以用于孩姓物学或衬

生物学技术。

本发明的超声緩沖液包括^^緩冲液、乙醇和聚山梨酯20或80表面活性 剂（吐温20⑧或吐温80⑧）。该緩冲^E含有非^iJ^成分，例如^IU匕剂、'^it: 压调节剂、^剖、岩酶（Uthic enzyme )、溶剂和盐。

固体#^^^声緩冲液的';^^物，超声处理15到300秒，尤其;lj^声水 浴中，特别是60到150秒，优选90秒。功率为20到200瓦，特别是80到150 瓦，更特别是IOO瓦，而诚率在10到lOOKHz的范围内，特别是25到75KHz， 更特别的是42 KHz。

一^SJ^行了超声处理，通过传统的细胞分离方法可以从固糾品中分离出 感^的生物材料。在其中获得的细Jlfe^存活的，因此它们可以应用在任何的 微生物学或^"生物学方法中。

附图简述

图i显示:n^i超声处ig^ o、 i、 7和ii天时的#^和对照中的存在于培

;^中的细胞的数量（^a微镜下进行细胞计数)。在没有进行，的培养^Ji 没有M^到细胞的生长，而在^^M明的方法用"经M的矿石1"和"经接 种的矿石2"处理过的样品中观瘵到明显的细胞生长，在"Wenelen培养物"和 "^^声的Wenelen"阳性对照中观肩:到相似的情况。

结论^^I本发明的方法从固僻游品中提WJ细Jf&^存活的。

图2显示了应用本发明的方法的#^和阳'!^照的核酸的^^凝欧，其中

所述#^口 "经糾的矿石1" =1 "经糾的矿石2" =2，并且阳'ltxt照"Wenelen 培养物"=2和"经超声的Wenelei^5"。 4种样品財相同的条带，最上面的一 条对应于基因组DNA而下面的两条"对应于核^^RNA。

结论：通it^发明的方法从固M品种中提取出的细Jffe^有新陈代谢的活 性，通i^目应于核糖体RM(23S和16Sr RNA)条带的存在证明^^"上必奮性。

图3显示了用溴化乙咬染色的0. 9%琼脂糖皿，显示在沙道1和2中，其 中的^f对应于^^I本发明的方法从固g?P中提取出的总DNA，该方法使用了 扩展的超声緩沖液，除了含有^i^成分（高摩尔狄的^^緩冲液、乙醇和非 离子表面活性剂）夕卜还含有其它非J^成^^'J如岩酶、@«_钠、DMS0、 EDTA和 甘油。提取自固^#品的总DM的相同^f显示在沙道3和4中，这欢使用的 ^L^发明的方法，但是使用的^^緩冲液仅含有3种1^成分。

DNA提取的总J^殳有明显的差别。

发明详述

超声技术是^^声^^I于不同目的的应用。它通常用于»^絲中的颗粒， 其使得溶液中的特定物质分解加速，尤其是在物理^f亍不通时其非常有用， 如在用于核磁M (腿）的试管的情形下。它也用于为化学AJI提供能量。

超声的传统生物学应用破坏了多种生物材料例如细胞和嚢泡，并且^ll失

活。^M1于^^生物学材料，例如粘附到^H^上的做物iUai只。

有两种典型的方法进"ff^声，^^超声7jC^其中通it7JO^声波能量^^化

n^到样品，或^^超声棒其中^A^样品中的金^^产生声波能量。^r这 些技术可以应用到本发明中。当4M超声棒时，声能的功率和频率必须降低， 相反应用超声溶液时，样品必须有*的保护以消除产生的热量，从而避免由

于高^^孩ii物产生的损伤。在7JC^超声下，声波的能量通it7JC来雜，因此，

可以使用较高的功率^M率而不^"存在的微生物带iM员伤。

本发明的方法用于分离粘附到含有高?ML的盐和金属的固体样品上的g

物群落，获#^部的、存活的微生物，这样就可用于常皿生物学和^生物 学狄了。

能够应用本发明的方法的含有高M的盐和金属的固,品，可以是与铜

矿藏有关的矿源或与已发现其他商业刚兴趣的金属的矿絲关，例:黄铁矿、 黄铜矿、蓝铜矿、尾矿，脉石， 和非金属种类。

该方法可以应用到任何大小的固体样品粒，在矿源的情况下，只要从矿 中获得，那怕是矿、碎石、渣滓或粉末。可以同时应用到生物学未处理过的固 M品或经ii^养的样品，以增加其中的生物量。

在第一阶段中，获取其中存^^分离微生物的固,品。合适的#^量是1

到50 g，特别是5到20 g，舰10 g。将获取的样品;^J^被的^I试管中， 如50mL Falcon试管向固体样品中加 发明所述一定^P、的超声緩沖液（与固##品的僻浙 相等)。超声緩冲液包舍

.基于^^的緩沖液

.乙醇

.非离子表面活性剂

^^緩冲液的pH值在4到9的范围内，虽然在任阿的pH范围能够到勤目 同的^，鉴于本发明的重点在于高的^Wf尔M而不是緩冲液的pH值。磷 酸緩冲液的摩尔^l可以^it0.5 M， ^i^0.8 M到2 M之间，最她l M。

乙醇使用的是5%到20%重量/重量赋的无水乙醇（下i^斤有的重量/重量 百分比简单的表示为T),舰的^1:8%到12%^间，最舰10%。

其中的非离子表面活性剂她聚山梨酯酯20或80表面活性剂（-W显20® 或^^显80@)，加入的狄范围是0. Ol到O. 5%，她0. 02到0.1%,最舰0. 05%。

方便时，本发明的超声緩沖液具有其它雜冲液带来有科性质的非基本化 •^^。

緩沖液可以含有岩酶，其能够帮助^A物膜（biof ilm)和衬粘附的细 胞，使得它们容易^U'j上清中。溶菌酶、喊，例:fo^S!A、 B、 C、 Y;氨 UfeSl、胰岛素、胰凝#源白酶、胃液素等，B酶的例子。岩酶的^ML^ 0.1 到1 mg/mL， M的，浓^^b范围为0. 3到0. 8 mg/mL，更优选0. 5 mg/mL。

其它非J4^成分是盐，其能够增加緩冲液的摩尔浓度，例如醋酸钠、醋酸 钟、柠^i^钠或钾、^酸钠或钾，作为例子。盐的摩尔浓度可以是20到200 mM， 优选的M是50到150 niM，更M为100 mM。渗i^调节剂例如蔗糖、海藻 糖、甘棘、bethaine、甘^j^等，也可以<^1。

緩沖^£可以含有^^化剂例如DMS0(二甲JJL^)，其浓度可以是1到 10%,特别是5%; ^^剂例如EDTA(乙二胺四乙酸)，EGTA (乙二醇四乙酸）其 摩尔M范围是10到100mM，舰50mM。方便时，緩沖液也可以含有"^由作 为增稠剂，其i^;l到10。/。，特别是5%。

緩冲液中含有还原剂的话^(f，其可以选自P-5tt乙醇、DTT或谷胱甘肽。 在M的例子中，超声緩冲液包括 •基于^^l的緩沖液 .乙醇

.聚山梨酯20或80表面活性剂（吐温20 @或吐温80 ®) .岩酶

•扁 • EDTA .浙由

固^*?口^1声緩冲液的:^^超声处理15到300秒，^i^^声7JC^中， 特别;^^声处理60到150秒，更特别的超声处理90秒。在50到200瓦，特别 是80到150瓦的功率，更特别是100瓦的功率，并JU5率从10到100KHz，特 别是从25到75 KHz，更特别是42 KHz。在这个阶^^占附在固体样品上的樹生 物变得+^，悬浮^^声M中。

为了从固^^?。中分离出含有M物的上清，M域内^^r已知的用于分 离细胞的方法^r以《^j。

在一，选的方面，超声的^JI试管可以进行冷冻离心，"iato^#， 利于倾析。离心应当itJL,以使固*品^^定而生物材料留在悬浮液中。离心 可以在500到3， 000 g进行15到10分钟。特别的，离心在l， 000g时进行2分 钟。离心^，获得了含有秋细胞的上清。

为了从悬浮液中^M^t的细胞与其它成分分开，可以对获取的上清进行离 心。离心应当^j^i样的条降下进行，以使细胞留在i5^内而^^小的成^^ 如多糖有机残留物、蛋白、脂类或简单的盐，留在上清中，其lt^L丢弃。离 心^中进行将;l^^更的，可以避免生物材料的降解。在优选的情况下，可以 在41C冷冻离心41C下^^过4， 000 g离心5 ^4中。

获得的沉淀可以^^理任河细J^一样^Mh理，It^的处理m^于使用的 孩&物学或衬生物学技术。例如，可以将获得的^定重新悬浮以用于培# 的树体，或用于细胞计数，或可以^^;WJ域内的常^i^M)于分离核酸，

并将这些核妙用到PCIU^、 DM或RM朝刚、FISH、测序等。

可用于重新悬浮沉淀以提M酸的緩冲液有STT tampon (TRIS 10 mM pH 8.0; EDTA20mM; SDS 2%; h±i§L201%; TRITON X 100 1%; Biotechniques 27， p1140—pll45; 1999 )补充了 Proteinaze-K和3M pH 5. 2的醋酸钠。

一种m的获得核酸的方法是s^氯仿-异戊sf^取，其对于^M页域专家是 熟知的。也可以通过核酸l^:^iM^取。

实St^发明的实施例如下。 实施例1

两个4-g的矿石#^0"^#在40mL的Wenelen菌林的培养物中，BioSigma (DSM 16786 )的特征，生"JL^9K Fe"培养基（10% p/vM)并孵育24小时。 然后去除多余的培养基，这样留下的矿石^j显的，并粘附有细胞。

每个矿石样品以这种方狄理，；^A到50 mL的Falcon试管中，加入与样

^JM^p湘同的超声緩冲液^p、：

•基于^^液的緩冲液pH 5. 0..................1 M

•聚山梨酯20表面活性剂（20).............. 0. 05 %

•乙醇........................................10%

. 岩酶.........................................0. 5 mg/mL

•醋酸钠pH 5.2...............................100 mM

'DMSO......................................5 %

* EDTA.......................................50mM

.賴.......................................5 %

矿石^^冲液的^^^^声》:fc^谷中以100瓦的功率和42 KHz固定的频 率妙90秒。与矿石粘附的te物^i^t一阶段被树出来，并留^^声絲的 悬浮液中。

A^试管以l， 000g在4X:冷冻离心机中离心2分钟，离心之后，获取含有 M物的上清；丢弃舍有矿石的小块。

上清以9， 000g在4iC冷冻离心机中离心5分钟，本夂离心中，细胞保留在 ^定中，雞更小的#^成^^如膜或盐类留在上清中，！^被去除。

将提取细胞的^定重新悬浮在没有核麟的lmL水中，然后才科己为"经接

种的矿石1"和"经糾的矿石2"。从每个悬浮样品中取出0. 5 mL，并糾到

5 mL的9K Fe2+培养基。将另外的0. 5 mL直接用于提取核酸，使用Kiu Choong Syn

等，1999描述的方法提;^酸。

为了^HWit^发明的方法获得的细胞的存活性，将培养基中的样品培育

11天，在此期间监领'傳在于培养物中的细胞数目，如图1所示。 除了4^发明方法的样品，培养^t对照：

-Wenelen培絲：M长的Wenelen培絲中取出0. 5 mL并糾到5 mL 的9K Fe2+培养^Ji。另取出0. 5 mL用于提絲酸。

-^l声的Wenelen: M长的Wenelen培絲中取出40 mL，然后在与含 有矿石的试管同样的*下超声处理，换句"^i兌，添加来自相同发明的超声緩 冲液，在超声7jc浴中以100 W的功率和42 KHz固定的频率超声处理90秒。随 后在的冷冻离心机中以9， 000 g离心5分钟，获取的^i定重新悬浮于1 mL 的iL^^^7K中。从该悬浮液中取出0. 5 mL糾到5 mL的9K Fe2+培养^iJi, 另取0. 5mL用于进4沐酸提取。

-ib^种的培养基将0. 5mL的ib^^l^水加入到5 mL的9K Fe2+培养基中。

将两个样品，"经糾的矿石l"和"经糾的矿石2"和三个对照，"Wenelen 培养基"，"经超声的Wenelen"和"^L^种的培养基"，;M在6孔的无菌板上， 在^^f的情况下，301C,培养11天。在第0、 1、 7和11天时从每个孔中取 出20 ji 1的样品，以通itjt^微镜下M^^十数细胞。

图1显示了在经处S^在所示天数时样品和对照的相对显微镜计数。在没 有，的培养基中没有M^到细胞的生长，而^^明的方法处理过的#^"经 ，的矿石1"和"经接种的矿石2"中有明显的细胞生长，在阳'1^照，enelen 培养基"和"经超声处理的Wenelen"中观察到了相似的结果。这证明了使用本 发明的方法从固^W品中提取中的细l&?i存活的。

正如指出的那#[錢Kiu Choong Syn等，1999描述的方法提械酸，使 用来自"经糾的矿石l"、"经接种的矿石2"、 ，enelen培养基"和"经超声 处理的Wenelen "的辨品各5mL。图2中的:^显示了提取的核亂可以观幕 到4个^^存^f目同的^f,其中^h面的^f对应于基因组DNA，下面的两条

^^对应于核糖体RNA。核^:^f的存在;l^-HM^I本发明方法从固^T?口 中提取的细胞活的并具有新陈代躺活性的另一个清楚的鄉。 实施例2;

为了评^f錢含有简单组分（与扩展的组^目对）的高摩尔^t^于磷酸 緩冲液（超声抑制）从固^?。中分离te物方法的有效性，进^下的步骤; .将40g相同的均质矿物#^口分^目等的4份，^^中加入10mL相等体

积的高摩尔M的基i^W的抑制物。

.在,A中（图3中的1和2的副本（r印lica)) ^J?I扩充的组^的

超声緩冲船且分：

•基于^^t的緩冲液pH 5. 0.....................1 M

• 聚山梨酯20表面活性剂（g 20)................ 0. 05%

'。帛..........................................10%

.岩酶.........................................0. 5mg/mL

•醋酸钠pH 5.2.....................................100 mM

.画........................................5%

• EDTA..............................................50 nM

.賴..........................................外

•在情形B下（3和4的副本）使用简化的组合物的超声緩沖、泉

•基于^^的緩冲液pH 5. 0.....................1 M

. 聚山梨酯20表面活性剂（pi^显20)............... 0. 05%

'。醇.........................................10%

.将A和B矿石与緩冲液的';a^^^声7K^中以ioo瓦的功率和固体的

频率42 KHz超声90秒。

.将四^h^声试管在4X:的冷冻离心机中以1, 000 g离心2分钟。离心之 后，回收含有微生物的上清；丢弃含有矿石的沉淀。

•将在41C的冷冻离心机中以9， 000 g对上清离心5分冲。^Eil样离心条 件下细胞留在^it内，样品中其它较小的成分，例如膜或盐，留在了上清中， 将絲除。

.将提取的细J!fe^定重新悬浮在不含核^l的1 mL水中。从该#^中取 出0.5 mL，才MHKiu Choong Syn等人，1999描述的方法进械酸的提取。

图3显示了经过0.9。/。溴化乙錄色的琼脂糖m，表明^^1扩展的或简单 的超声緩冲^i行DNA提^j殳有明显的差别。而且，当^J?J NanoDrop ND 1000 分ibt^计定i^取自4个副本的DNA时，如表1所示，经ii^目同类型超声器 处理的1和2之间的^t别比经it^同类型超声緩沖狄理的1和3之间的 差别要大。',A(1和2)中DNA的平均狄，555.95ng/nl，非常接近于', B (3和4)中DM的平均狄，522.98ng/nl。因此，可以得出两种组^是 等效的緩冲液，只有^t处理样品U杂时才建i^p入一些或4^可选的緩沖 成分（EDTA或EGTA、甘油、岩酶、盐例如醋酸钠、醋酸钾、柠^^钠或钾、琥 珀酸钟或钠、渗i^a调节剂、DMSO和/或还原剂）。

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