一种源于I型CRISPR-Cas系统中基因cas5-3的原核基因编辑方法 |
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| 申请号 | CN201710846388.0 | 申请日 | 2017-09-19 | 公开(公告)号 | CN107523583A | 公开(公告)日 | 2017-12-29 |
| 申请人 | 安徽大学; | 发明人 | 童望宇; 孙焰; 王安静; | ||||
| 摘要 | 本 发明 首次公开了一种源于I型CRISPR-Cas系统中基因cas5-3的原核基因编辑方法，包括蛋白表达质粒和基因编辑质粒的构建及大肠杆菌和枯草杆菌中的基因编辑操作过程。该方法对原核 生物 基因组可方便、快速、有效地进行基因编辑；可望有效地应用于与原核基因工程相关的任何领域。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种源于I型CRISPR-Cas系统中基因cas5-3的原核基因编辑方法，其特征在于：包含一个I型CRISPR-Cas系统中基因cas5与基因cas3所组成的蛋白表达质粒和/或一个基因编辑质粒对原核生物进行基因编辑。 |
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| 说明书全文 | 一种源于I型CRISPR-Cas系统中基因cas5-3的原核基因编辑方法 背景技术[0002] 在生物技术领域中，2013年的CRISPR-Cas9系统是继1996年锌指核酸内切酶/ZFN(zinc-finger nucleases)、2011年类转录激活因子效应物核酸酶/TALEN(transcription activator-like effector nucleases)之后出现的第三代基因编辑技术。与前两代技术相比，因其成本低、操作简便、快捷高效而迅速风靡于世界生物技术领域，现已成为科研、医疗、食品等领域的有效工具。 [0003] CRISPR-CAS系统(Clustered Regularly Interspaced short Palindromic Repeats/CRISPR-associated genes)是一种针对外来质粒和噬菌体的免疫系统。目前CRISPR-CAS系统根据效应物的组成被分为两大类，其中只有含单一Cas蛋白的第2大类中的酶(如：Cas9/cjCas9和Cpf1)已证明可被开发成功能强大的基因编辑工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov；Zetsche B,Gootenberg JS,Abudayyeh OO,Slaymaker IM,Makarova KS,Essletzbichler P,Volz SE,Joung J,van der Oost J,Regev A,Koonin EV,Zhang F(2015)Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.Cell 163(3):759-71 doi:10.1016/j.cell.2015.09.038)，能方便灵活的对基因组的任何靶点或多个靶位点进行反复和同时编辑，包括DNA的插入(insertion)、删除(deletions)、无痕单核甘酸替换(scar-less single-nucleotide substitutions)(Jiang,W.,Bikard,D.,Cox,D.,Zhang,F.and Marraffini,L.A.(2013)RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.Nature Biotechnology.31,233-239)及RNA水平调控(CRISPR interference/CRISPRi)等。 [0004] 目前的基因编辑系统存在着分子量大与脱靶等问题。我们实验室在维吉尼亚链霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)中发现一个subtype I-B-svi CRISPR-Cas系统，并幸运地证实该系统可对维吉尼亚链霉菌IBL14自身染色体进行基因编辑_ENREF_1(童望宇；雍德祥；李雪；邱彩花；一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法.申请号：CN2015110028173,2015；童望宇，李雪，雍德祥；一种维吉尼亚链霉菌IBL14产青霉素重组菌株的构建方法，申请号：CN201510999333.4)，并进一步发现由该系统中6个基因cas7-5-3-4-1-2与3个基因cas7-5-3组成的基因编辑系统能对原核生物基因组进行基因编辑(童望宇，许鑫，张雁，孙焰，曹素丽；一种维吉尼亚链霉菌IBL14type I-B-sv14型CAS基因编辑系统，申请号：CN201611113137.3；童望宇，邱彩花，杨兴旺，王安静；一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，申请号： CN201611089333.1)。但上述基因编辑工具除cjCas9(MW：114896.12Da)，(Kim,E.,Koo,T.,Park,S.W.,Kim,D.,Kim,K.,Cho,H.Y.,Song,D.W.,Lee,K.J.,Jung,M.H.,Kim,S.,Kim,J.H.and Kim,J.S.(2017)In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni.Nat Commun.8,14500)外均存在分子量大(MW：大于 143,000Da)缺陷。本发明将公开一个由subtype I-B-svi CRISPR-Cas系统cas5-3为基础构建的蛋白表达质粒(MW：107867Da)plasmid-cas5-3，结合基因编辑质粒和/或其它质粒在原核微生物大肠杆菌与枯草杆菌中的基因编辑方法。 发明内容[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14 subtype I-B-svi CRISPR-Cas系统的cas5-3而建立的原核微生物的基因编辑工具。为达此目的，采用如下技术方案： [0006] 一种源于I型CRISPR-Cas系统中基因cas5-3的原核基因编辑方法，其特征在于：包含一个I型CRISPR-Cas系统中基因cas5与基因cas3所组成的蛋白表达质粒和/或一个基因编辑质粒对原核生物进行基因编辑。 [0007] 所述的一种源于I型CRISPR-Cas系统中基因cas5-3的原核基因编辑方法，包括以下步骤： [0008] (1)根据维吉尼亚链霉菌IBL14中cas基因簇的序列信息设计引物，以维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模版，用TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase聚合酶通过PCR反应扩增得到基因cas5与cas3，连接到质粒plasmid上，得蛋白表达质粒plasmid-cas5-3； [0009] (2)根据靶向基因DNA序列信息设计引物，以提取到的原核生物基因组为模版，用TransTaq DNA Polymerase High Fidelity DNA聚合酶通过PCR反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶识别和切割位点以及overlap PCR互补序列的靶向基因上下同源臂PCR片段，并用overlap PCR将上下同源臂结合起来构建基因编辑模版t-DNA，同时根据生物靶向基因序列信息设计并直接合成首尾分别含T7启动子和RNA转录终止子的靶向基因片段g-DNA，将基因编辑模版与靶向基因片段连接到质粒上得基因编辑质粒plasmid-t/g-gene abbreviation； [0010] (3)制备原核微生物细胞感受态，并将按步骤(1)得到的蛋白表达质粒和按步骤(2)得到的各种基因编辑质粒分别转化到目标菌感受态中得到不同的基因编辑后的重组子，对重组子染色体进行PCR验证，以确证编辑后的目的重组子。 [0011] 所述原核生物指大肠杆菌、枯草杆菌或其它原核微生物。 [0012] 所述的基因编辑指是对原核细胞的染色体基因进行插入、敲除、无痕点突变及任意组合。 [0013] 所述的转化包括单质粒转化、双质粒转化、电转化或化学转化。 [0014] 本发明提供了一种源于I型CRISPR-Cas系统中基因cas5-3的原核基因编辑方法。首次实现了CRISPR-Cas I型系统中双基因cas5-3对其它原核生物基因组的基因编辑。原核生物中该双基因cas5-3因可位于同一转录单位内象单一基因一样进行转录并翻译成蛋白Cas5与Cas3，故该方法对原核生物基因组可方便、快速、有效地进行基因编辑；可望有效地应用于与原核基因工程相关的任何领域。 附图说明 [0015] 图1基因编辑工具构建图。(A)蛋白表达质粒pCas-cas5-3的构建，pSC101ori/the origin from pSC：来自低拷贝(copy)质粒载体pSC101的复制起始点，Rep101：基于基因RepA控制质粒pSC101复制拷贝数，araC/L-arabinose regulatory protein：阿拉伯糖调节蛋白，KanR/Kanamycin resistance：卡那霉素抗性，aBAD promoter/promoter of the L-arabinose operon of E.coli：大肠杆菌中受阿拉伯糖调控的araB启动子；(B)基因编辑质粒pKC1139-lacZ-t/g-DNA的构建，Ori pSG5/the origin from pSG5：pSG5质粒载体上的复制起始点，oriTRK2/the origin of conjugal transfer from RK2：RK2质粒载体上的结合转移复制起始点，lac promoter/lactose promoter：乳糖操纵子的启动子，T7promoter：T7启动子起始DNA转录，T7terminator：T7终止子终止DNA转录，AprR/apramycin resistance：安普霉素抗性。 [0016] 图2菌株EC JM109(DE3)中LacZ基因的敲除结果。(A)蓝白斑筛选，蓝色表明为原始菌株，白色表明为重组菌株；(B)菌落PCR的DNA凝胶电泳，泳道M：5000bp DNA ladder，泳道1：野生型EC JM109(DE3)基因组的lacZ基因PCR，泳道2-4：质粒pCas-cas5-3、pKC1139-lacZ-t/g-DNA转化子的lacZ基因PCR(泳道2-4中DNA条带较泳道1中DNA条带小表明基因敲除成功)。 具体实施方式[0017] 为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明，旨在更好的解释本发明的内容，以下实施例不限制本发明的保护范围。此外，在所列实施例中如无特别说明均采用如下材料： [0018] 1)菌株与质粒 [0019] 维吉尼亚链霉菌Streptomyces virginiae IBL14/SV IBL14；大肠杆菌Escherichia coli DH5α/EC DH5α；Escherichia coli JM109/EC JM109(DE3)；枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168/BS 168，质粒pCas，pKC1139。 [0020] 2)培养基 [0021] LB液体培养基 [0023] LB固体培养基 [0024] 酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂20g，加入适量自来水溶解后，定容至1L，pH调至7.0～7.2，分装包扎后，121℃/20min灭菌。 [0025] 10×spizzen盐溶液(100ml)： [0026] K2HPO4 14g，KH2PO4 6g，(NH4)2SO4 2g，柠檬酸钠1g，MgSO4·7H2O 0.2g按顺序依次溶解在双蒸水中，加水至100ml。 [0027] GM I(100ml)： [0029] GM II(100ml)： [0030] 1×spizzen盐溶液97.5ml，50％葡萄糖1ml，5％水解酪蛋白80μl，10％酵母汁40μl，2mg/ml L-trp 500μl，0.5mol/L MgCl2 500μl，0.1M CaCl2 500μl [0031] 所用试剂均为市售品。 [0032] 实施例1双质粒一步法敲除EC JM109lacZ基因 [0033] (1)pCas-cas5-3蛋白表达质粒的构建 [0034] 根据SV IBL14基因cas5-3测序信息及质粒pCas序列信息，设计基因cas5-3特异性引物cas5-3-F和cas5-3-R以及pCas-F和pCas-R；用提取的SV IBL-14基因组DNA为模板，以引物cas5-3-F和cas5-3-R进行cas5-3基因PCR扩增，反应条件：98℃2min，98℃20s，61℃20s，72℃90s，30个循环，72℃5min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的cas5-3全长基因片段；提取pCas质粒，以pCas质粒为模板和设计的pCas质粒特异性引物pCas-F和pCas-R，进行PCR扩增，反应条件：95℃2min，95℃20s，61℃20s，72℃5min，250unit的TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase(50μl反应体系)，30个循环，72℃5min。通过一步法将cas5-3全长基因序列与质粒pCas质粒骨架连接，得蛋白表达质粒pCas-cas5-3备用。 [0035] (2)基因编辑质粒pKC1139-lacZ-t/g-DNA的构建 [0036] (A)基因lacZ引物设计与lacZ全长基因的扩增 [0037] 根据EC JM109基因组测序信息，设计基因lacZ特异性引物lacZ-F和lacZ-R。提取EC JM109基因组DNA，使用Pfu DNA Polymerase进行lacZ基因PCR扩增，反应条件：95℃5min，94℃30s，52℃30s，72℃1min，2.5U Pfu DNA Polymerase(50μl反应体系)，30个循环， 72℃10min。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的lacZ全长基因片段备用。 [0038] (B)上、下游同源臂的制备 [0039] 根据lacZ基因全序列(序列来源NCBI)设计lacZ基因上游同源臂引物lacZ-UF和lacZ-UR、下游同源臂引物lacZ-DF和lacZ-DR(黑体加粗为overlap PCR互补序列)，且上同源臂上游引物含BamHI限制性内切酶酶切位点，下同源臂下游引物含HindIIII限制性内切酶酶切位点。以纯化的lacZ基因DNA为模板，先分别扩增上、下游同源臂，反应条件为：95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃45s，2.5U Pfu DNA Polymerase(50μl反应体系)，30个循环， 72℃10min。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化后的上、下游同源臂DNA片段备用。 [0040] (C)基因编辑模版载体pKC1139-lacZ-t-DNA的构建 [0041] 取上同源臂纯化产物与下同源臂纯化产物0.5μl混合作为模板，25μl反应体系进行overlap PCR，反应条件为：94℃5min，94℃l min，58℃1min，72℃30s，一个循环后加引物lacZ-UF与lacZ-DR各1μl，继续PCR，反应条件为：95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃90s，进行30个循环，72℃10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化，得基因编辑模版；将获得的基因编辑模版通过BamHI限制性内切酶酶、HindIIII限制性内切酶切出粘性末端，然后通过全式金生物技术有限公司生产的T4连接酶将其连接到pKC1139质粒上，得基因编辑模版载体pKC1139-lacZ-t-DNA。 [0042] (D)基因编辑质粒pKC1139-lacZ-t/g-DNA的构建 [0043] 含乳糖操纵子启动子及guide DNA-lacZ连接产物的靶向基因片段由滁州通用生物公司直接合成，首尾分别加上BamHI及EcoRI酶切位点，中间依次是启动子，重复序列(repeat)，间隔序列(spacer)，重复序列(repeat)及终止子；将合成的靶向基因片段通过BamHI和EcoRI限制性内切酶切出粘性末端，然后通过T4连接酶将其连接到得基因编辑模版载体pKC1139-lacZ-t-DNA上得基因编辑质粒pKC1139-lacZ-t/g-DNA。 [0044] 合成的靶向基因片段g–lacZ序列为： [0045]cgGGATCCtaatacgactcactatagggaatattgtcctcatcgccccttcgaggggtcgcaacccgcccggtgcagtatgaaggcggcggagccgacaccacggtcctcatcgccccttcgaggggtcgcaac GAATTCcg，其中大写字母为酶切位点，波浪线为保护碱基，黑体 加粗为互补区，单下划线为启动子promoter，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator。 [0046] (3)重组子的制备与检验 [0047] (A)EC JM109(DE3)感受态制备 [0048] 在无菌条件下用已灭过菌的牙签挑取大肠杆菌平板上的单克隆于30ml LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养。取过夜培养的菌液100μl转接至新的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养约2h，至菌液OD600值约为0.5左右。取30ml上述菌液至50ml离心管中，4℃下4000rpm离心10min，除尽上清液后，取已经在冰上预冷的SSCS溶液(Generay Biotech公司) 1ml将菌体沉淀吹打均匀，即得大肠杆菌的感受态细胞，-80℃下保存备用(此过程全程在冰上进行)。 [0049] (B)质粒pCas-cas5-3和pKC1139-lacZ-t/g-DNA的共转化 [0050] 将质粒pCas-cas5-3和pKC1139-lacZ-t/g-DNA充分混匀后转化到EC JM109感受态中，在涂有5μl异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG 200mg/ml)、40μl5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal 20mg/ml)和20μl阿拉伯糖(10mM/L)的安普霉素和卡那霉素抗性的LB固体培养基中30℃过夜培养，得转化子。 [0051] (C)重组子染色体PCR和基因测序分析 [0052] 挑取白色单克隆作为模板，再以lacZ基因验证引物lacZ-UF/lacZ-R进行PCR扩增反应，反应条件：95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃90s，2.5U生工生物工程(上海)股份有限公司生产的EasyTaq DNA Polymerase(25μl反应体系)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，观察重组子染色体DNA扩增条带减小，并经通用生物系统(安徽)有限公司测序证明lacZ基因敲除成功，结果见图2。 [0053] 各步骤涉及的引物及其序列见表1，表中大写字母为酶切位点，单下划线为启动子promoter，黑体加粗为互补区。 [0054] 表1引物及其序列 [0055] [0056] 实施例2双质粒二步共转化敲除EC JM109 lacZ基因 [0057] (1)蛋白表达质粒pCas-cas5-3的构建 [0058] 同实施例1步骤(1)。 [0059] (2)基因编辑质粒pKC1139-lacZ-t/g-DNA的构建 [0060] 同实施例1步骤(2)。 [0061] (3)重组子的获取与检验 [0062] (A)质粒pCas-cas5-3转化及EC JM109-pCas-cas5-3感受态制备 [0063] 将质粒pCas-cas5-3转化到EC JM109感受态中，通过卡那霉素抗性筛选转化子，再以该转化子制备感受态，获得含有质粒pCas-cas5-3的EC JM109-pCas-cas5-3菌株感受态。感受态制备方法同实施例1中步骤(3A)。 [0064] (B)质粒pCas-cas5-3和pKC1139-lacZ-t/g-DNA的共转化 [0065] 将质粒pCas-cas5-3和pKC1139-lacZ-t/g-DNA充分混匀后转化到EC JM109-pCas-cas5-3感受态中，在涂有5μl IPTG、40μl X-gal和20μl阿拉伯糖的安普霉素和卡那霉素的LB固体培养基中30℃过夜培养，得转化子。 [0066] (C)重组子染色体PCR和基因测序分析 [0067] 挑取白色单克隆作为模板，再以lacZ基因验证引物lacZ-F/lacZ-R进行PCR扩增反应，反应条件：95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃2min 40s，2.5U EasyTaq DNA Polymerase(25μl反应体系)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，观察重组子染色体DNA扩增条带大小变化，并经基因测序证明lacZ基因敲除成功。 [0068] 实施例3单质粒敲除EC JM109lacZ基因 [0069] (1)蛋白表达质粒pCas-cas5-3的构建 [0070] 同实施例1步骤(1)。 [0071] (2)基因编辑质粒pCas-cas5-3-lacZ-t/g-DNA的构建 [0072] 除将lacZ-t-DNA片段和lacZ-g-DNA片段分别连接到pCas-cas5-3上外，其余步骤同实施例1(2)。 [0073] (3)重组子的制备与检验 [0074] 同实施例1步骤(3)。 [0075] 实施例4双质粒敲除BS 168基因lysC [0076] (1)蛋白表达质粒pCas-cas5-3的构建 [0077] 同实施例1步骤(1)。 [0078] (2)基因编辑质粒pKC1139-lysC-t/g-DNA的构建 [0079] 除根据枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168基因lysC序列信息设计并合成lysC-t-DNA片段与lysC-g-DNA片段外，其余同同实施例1步骤(2)。 [0080] 合成的lysC-g-DNA片段序列为： [0081]cccAAGCTTtaatacgactcactatagggaatattgtcctcatcgccccttcgaggggtcgcaacttcatccgagagcagttgagttcgcgaaaaattaccaagtgtcctcatcgccccttcgaggggtcgcaacctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgAGATCTtcc，其中大写字母为酶切位点。 [0082] (3)重组子的获取与检验 [0083] (A)BS168感受态的制备 [0084] 接种新鲜的BS 168单菌落于5ml GM I中，30℃，100～150转/分钟摇床培养过夜。次日接种1ml上述培养物于9ml GM I培养基中，在摇床中37℃，200转/分钟培养3～4h。取 5ml第二步培养物转接于45ml GM II培养基中进行第二次传代，37℃，100～150转/分钟摇床培养90min。取全部培养物，4000转/分钟室温离心5min，用1/10体积上清液重悬菌体，即得BS168感受态细胞。 [0085] (B)质粒pCas-cas5-3和pKC1139-lysC-t/g-DNA的共转化 [0086] 将质粒pCas-cas5-3和pKC1139-lysC-t/g-DNA加入1ml BS 168感受态细胞悬液中混匀，37℃恒温水浴中静置30～60min,然后在摇床中以37℃，200转/分钟振荡培养2～4h。将转化液涂布含有卡那霉素和安普霉素抗性的(终浓度为50μg/ml)LB固体培养基，在37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。 [0087] (C)重组子染色体PCR和基因测序分析 [0088] 挑取在卡那霉素和安普霉素抗性平板上长出的单菌落，提取其基因组或用热处理过的菌落作为模板，敲除基因的上下游引物为模板进行PCR扩增，将所得基因片段进行电泳，产物经1％琼脂糖电泳检测，观察重组子染色体DNA扩增条带大小的改变与预期一致，并经基因测序证明BS168-lysC基因敲除成功。 [0089] 各步骤涉及的引物及其序列见表2，表中表中大写字母为酶切位点，波浪线为保护碱基，黑体加粗为互补区。 [0090] 表2引物及其序列 [0091] [0092] 实施例5单质粒敲除BS 168基因lysC [0093] (1)蛋白表达质粒pCas-cas5-3的构建 [0094] 同实施例1步骤(1)。 [0095] (2)基因编辑质粒pCas-cas5-3-lysC-t/g-DNA的构建 [0096] 除lysC-t/g-DNA靶基因片段连接到pCas-cas5-3质粒外，其余步骤与实施例3中步骤(2)相同。 [0097] (3)重组子的获取与检验 [0098] 同实施例3步骤(3)。 [0099] 以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。 |
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