[0001] 本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗技术领域，具体地，涉及一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，编码其的核酸，含有该核酸的构建体、表达载体和转化的细胞，以及它们的制药用途。

[0002] CAR-T细胞肿瘤治疗现状

[0003] 2015年10月，国家癌症中心在著名癌症专业期刊《Cancer Letters》上首次发布我国居民癌症现患数据。结果显示，我国5年内诊断为癌症且仍存活的病例数约为749万(其中男性患者368万人，女性患者381万人)，总体5年癌症患病率为556/10万，数据从整体上反映了癌症病人对新治疗研究进展的迫切需求。

[0004] 而免疫疗法已然成为人类对抗癌症新的希望，而CAR-T治疗血液肿瘤特别是B-ALL白血病的临床试验结果，使其成为了近年来最备受瞩目的肿瘤免疫疗法之一。然而靶向实体瘤的CAR T免疫治疗研究仍然面对巨大的考验：如何突破实体瘤组织壁垒、如何抵抗肿瘤组织内的免疫抑制、免疫细胞如何在缺氧微环境中竞争生存等。

[0005] 肿瘤治疗的难题，特别是实体瘤及其肿瘤微环境中的免疫抑制作用

[0006] 肿瘤微环境可下调肿瘤抗原特异性的辅助/毒性杀伤细胞的数数量和炎症因子的释放，上调免疫抑制细胞数量和抑制功能，如调节性T细胞(Regulatory T cells)和髓系来源的抑制细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cells)，将正常免疫系统颠覆为促进肿瘤自身生长的优势因素。

[0007] 针对肿瘤免疫抑制的相应措施现状

[0008] 针对实体瘤免疫抑制的情况，科学家陆续研发出阻断抑制信号通路，下调肿瘤微 环境中的抑制性细胞的方法，如特异性靶向PD-1(Programmed Death 1)、PD-L1(Programmed Death Ligand 1)、CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte-associated Antigen-4)抗体或抑制剂，免疫激活因子等。

[0009] 在现有技术中，将免疫抑制相关抗原PD-1和CTLA-4应用于肿瘤免疫治疗的手段通常是构建PD-1抗体(Pembrolizumab、Nivolumab)或CTLA-4抗体(Ipilimumab)，或者使用PD-1或CTLA-4的抑制剂或信号通路阻断剂。然而，PD-1抗体和CTLA-4抗体存在一定的限制性，即，抗体需要渗入肿瘤组织中才可发挥疗效，所以抗体的临床应用具有不确定性。据报道，CAR-GD2T细胞联合PD-1抗体进行免疫治疗时，可抵抗肿瘤微环境的免疫抑制作用，加强CAR T细胞肿瘤杀伤。对于PD-1和CTLA-4的免疫治疗应用，现有技术中也报道了共表达靶向肿瘤相关抗原CAR T和抑制性CART(胞外抗原为正常细胞抗原，胞内段为PD-1或者CTLA-4的抑制信号域)，可防止CAR T脱靶现象的发生(脱靶现象：CAR T细胞识别杀伤正常细胞)。

[0010] 另外，现有技术中还报道了共表达双抗体PD-1和CD19/Mesothelin/PSCA的CART，这虽然扩大了靶点范围(表达PD-1或CD19/Mesothelin/PSCA或同时表达两者的肿瘤细胞)，但是忽略了盲目增加细胞杀伤作用所引起的副作用：细胞因子风暴、脱靶现象(正常细胞也表达两个抗原或之一，导致CAR T杀伤正常细胞，引起正常细胞缺失的机体功能缺陷)。

[0011] 本发明的目的在于提供一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，编码其的核酸，含有该核酸的构建体、表达载体和转化的细胞，以及它们的制药用途。本发明的表达所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子的转化的细胞可营造一种肿瘤免疫抑制微环境，具有增强的肿瘤杀伤作用；并且，该转化的细胞有自调节功能，可缓解过度的非特异免疫效应和细胞因子风暴等副作用。

[0012] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：

[0013] 第一方面，本发明提供了一种嵌合的免疫抑制检查点受体分子，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中，所述胞外结构域和任选地跨膜结构域为免疫抑制检查点受体分子的相应结构域或基于该结构域进行的基因改造，所述胞内结构域为一个或多个免疫激活信号结构域。

[0014] 作为优选，所述免疫抑制检查点受体分子选自PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、A2AR、B7H3、B7H4、BTLA、IDO、KIR、CD160、2B4(CD244)和VISTA(C10orf54)；

[0015] 进一步优选地，所述免疫检查点分子为PD-1、CTLA-4、LAG3或TIM3。

[0016] 优选地，所述胞内结构域包含免疫共刺激信号组合和任选的信号肽；

[0017] 进一步优选地，所述免疫共刺激信号组合包含TLR1和/或TLR2信号结构域；

[0018] 进一步优选地，所述胞内结构域为TLR1和/或TLR2与41BB和/或CD28信号结构域的组合。

[0019] 进一步优选地，任选的信号肽为免疫抑制检查点受体分子相对应的信号肽。

[0020] 进一步优选地，所述胞内结构域还包括CD3ζ胞内结构域；

[0021] 在具体的优选实施方案中，所述TLR1和/或TLR2信号结构域和任选地41BB和/或CD28信号结构域配置在CD3ζ胞内结构域的N末端侧。

[0022] 第二方面，本发明提供了编码如第一方面所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子的核酸。

[0023] 第三方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如第二方面所述的核酸，以及与之可操作连接、可指导所述嵌合的免疫抑制检查点受体分子在宿主细胞中表达的一个或多个控制序列。

[0024] 第四方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如第三方面所述的核酸构建体；优选地，所述表达载体为慢病毒。

[0025] 第五方面，本发明提供了一种转化的细胞，其包含如第二方面所述的核酸，或者其中转化了如第三方面所述的核酸构建体或如第四方面所述的表达载体；

[0026] 优选地，所述转化的细胞为免疫细胞，进一步优选为T细胞、B细胞或NK细胞。

[0027] 在具体的实施方案中，所述转化的细胞为宙斯盾细胞毒性T淋巴细胞(S-CTL,Shielded Cytotoxic T Lymphocyte)，其为过表达免疫抑制向激活转型的检查点分子的淋巴细胞，特别是T淋巴细胞。S-CTL细胞包括表达嵌合的PD-1受体分子的SP-CTL细胞、表达嵌合的CTLA-4受体分子的SC-CTL细胞、表达嵌合的TIM3受体分子的ST-CTL细胞和表达嵌合的LAG3受体分子的SL-CTL细胞等。S-CTL细胞通过在人体T细胞中转染嵌合的免疫抑制-激动转型的检查点分子基因，获得可抵抗免疫抑制的淋巴细胞。S-CTL淋巴细胞具有以下特点：

[0028] 1)对表达免疫抑制检查点分子的配体(如PD-L1、B7.1、B7.2、Galectin-9、MHC II等)的肿瘤细胞具有强效细胞杀伤作用；

[0029] 2)天然的免疫抑制检查点分子受体(如PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3等)表达在淋巴细胞特别是T细胞、NK细胞等表面，与肿瘤细胞配体结合后，可抑制免疫细胞自身的激活、增殖、识别、杀伤等功能的发挥；

[0030] 3)S-CTL结构：胞外段和跨膜区域为完全的免疫抑制检查点分子结构，用于特异性识别肿瘤细胞表面配体；胞内区域为一个或多个免疫激活信号域，其中本发明发现含TLR1和/或TLR2信号激活域的胞内结构域，可进一步促进肿瘤杀伤效应；

[0031] 4)自调节功能，由于正常淋巴细胞表达天然的免疫抑制检查点分子受体，转化的细胞表达嵌合的免疫抑制-激动转型的检查点分子，而天然的免疫抑制检查点分子受体为传导抑制信号，嵌合的免疫抑制检查点分子受体为传导激活信号，由此可通过自身表达调节方式减缓S-CTL细胞的副作用，如脱靶杀伤、细胞因子；

[0032] 5)SP-CTL细胞可促进自身的增殖。

[0033] 第六方面，本发明提供了制备如第五方面所述的转化的细胞的方法，其包括：向细胞中引入如第二方面所述的核酸，或者转化如第三方面所述的核酸构建体或如第四方面所述的表达载体的步骤。

[0034] 第七方面，本发明提供了如第一方面所述的嵌合的免疫抑制检查点受体分子、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的核酸构建体、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的转化的细胞在制备与免疫抑制检查点受体分子、优选与PD-L1、B7.1、B7.2、Galectin-9、MHC II的表达相关的疾病的药物中的用途；

[0035] 优选地，所述疾病为表达免疫抑制检查点受体分子、优选表达PD-L1、B7.1、B7.2、Galectin-9、MHC II的肿瘤；

[0036] 进一步优选地，所述表达免疫抑制检查点受体分子、优选表达PD-L1、B7.1、B7.2、Galectin-9、MHC II的肿瘤选自肺癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌。

[0037] 术语定义

[0038] 在本发明的上下文中，“免疫检查点”(Immune Checkpoint)是免疫系统中可上调或下调免疫刺激信号的分子，分为免疫刺激检查点分子(Stimulatory Checkpoint)和免疫抑制检查点分子(Inhibitory Checkpoint)。

[0039] “免疫抑制检查点”是免疫系统中可下调免疫刺激信号的分子，例如：PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、CD160、2B4(CD244)、VISTA(C10orf54)、TIGIT、LAIR1、2B4等。

[0040] “免疫激活信号”：淋巴细胞激活过程中，T细胞需要获取两个信号以充分激活；第一信号是抗原特异性的，即通过T细胞受体与抗原递呈细胞APC表面MHC分子结合产生的；第二信号，即共刺激信号，是抗原非特异性的，通过T细胞和APC细胞表面的共刺激信号分子结合产生的。

[0041] 本发明的嵌合的免疫抑制检查点受体分子的胞内结构域可以包括共刺激信号分子CD28、OX40、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CD40、CD27、CD134、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、CD2、BTLA等的胞内段，或者它们的任意组合。

[0042] 有益效果

[0043] 本发明所述转化的细胞是一种新型的肿瘤杀伤细胞，其为营造肿瘤免疫抑制微环境而表达免疫抑制检查点受体分子，具有低脱靶率；并且，其胞内结构域的独特设计可进一步促进其肿瘤杀伤效应，同时可以有效消除肿瘤免疫抑制作用；而所转化的细胞(如T细胞)处于肿瘤微环境中会诱导表达一定量的天然免疫抑制检查点受体分子，其与肿瘤PD-L1抗原结合产生一定的抑制信号，对转化的细胞产生的免疫效应有一定的调节作用。鉴于上述优势，本发明的表达所述嵌合受体分子的转化的细胞在抗肿瘤治疗中具有良好的临床应用前景。附图说明

[0044] 图1显示实施例1中的合成序列图谱。

[0045] 图2显示实施例1中构建的pWPXLd-S(PD1)-CTL-2A-EGFP质粒、pWPXLd-S(CTLA-4)-CTL-2A-EGFP质粒、pWPXLd-S(TIM3)-CTL-2A-EGFP质粒和pWPXLd-S(LAG3)-CTL-2A-EGFP质粒图谱。

[0046] 图3显示流式细胞仪检测SP-CTL细胞的病毒感染阳性率；Blank组：不使用CD3流式抗体刺激的非转染T细胞。

[0047] 图4显示流式细胞仪检测SC-CTL细胞的病毒感染阳性率；Normal组：非转染T细胞。

[0048] 图5显示SP-CTL细胞对人T-ALL细胞系JURKAT-GL的杀伤作用。

[0049] 图6显示SP-CTL细胞对人非小细胞性肺癌H460-GL的杀伤作用。

[0050] 图7显示SC-CTL细胞对人B-ALL细胞系NALM6-GL杀伤作用。

[0051] 图8显示SP-CTL细胞对人非小细胞性肺癌H460-GL的体内杀伤作用。

[0052] 为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

[0053] 实施例1、S-CTL细胞的制备

[0054] 质粒构建

[0055] 1)通过基因合成，得到“免疫抑制检查点分子(信号肽+胞外段+跨膜区)-刺激信号1-刺激信号2(一般为TLR1或者TLR2)-CD3ε”的DNA序列，DNA序列的首尾分别包含PmeI和Spe1限制性酶切位点。合成序列图谱如图1所示。

[0056] 所合成的基因序列请见SEQ NO.1(为制备靶向PD-1的S-CTL，即SP-CTL，而合成的DNA序列)和SEQ NO.2(为制备靶向CTLA-4的S-CTL，即SC-CTL，而合成的DNA序列)和SEQ NO.3(为制备靶向TIM3的S-CTL，即ST-CTL，而合成的DNA序列)和SEQ NO.4(为制备靶向LAG3的S-CTL，即SL-CTL，而合成的DNA序列)。

[0057] S-CTL(Shielded Cytotoxic T Lymphocyte)，为免疫增强的细胞毒性T淋巴细胞，即表达嵌合的免疫抑制检查点分子，胞外段和跨膜段为人免疫抑制检查点受体分子的相应区段，而胞内段为免疫刺激信号域组合，可特异性识别和杀伤表达免疫抑制检查点配体的肿瘤细胞和免疫抑制细胞。

[0058] SP-CTL，表达嵌合的PD-1受体的S-CTL细胞，特异性识别杀伤表达PD-L1的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。

[0059] SC-CTL，表达嵌合的CTLA-4受体的S-CTL细胞，特异性识别杀伤表达B7.1和/或B7.2的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。

[0060] ST-CTL，表达嵌合的TIM3受体的S-CTL细胞，特异性识别杀伤表达Galectin-9 的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。

[0061] SL-CTL，表达嵌合的LAG3受体的S-CTL细胞，特异性识别杀伤表达MHCⅡ的肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞或免疫抑制细胞。

[0062] 2)使用Thermo限制性内切酶Pme1和Spe1，分别通过双酶切获得合成的S-CTL DNA片段(SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4)和pWPXLd-EGFP载体的线性化DNA(含粘性末端)。

[0063] 3)通过琼脂凝胶电泳回收，获得带粘性末端的线性化合成的S-CTL(SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4)和pWPXLd-EGFP载体DNA片段。

[0064] 4)通过T4DNA连接酶(来自Invitrogent公司)，分别连接线性化的SEQ NO.1和pWPXLd-2A-EGFP、线性化的SEQ NO.2和pWPXLd-2A-EGFP，获得pWPXLd-S(PD1/CTLA-4/TIM3/LAG3)-CTL-2A-EGFP质粒，其质粒图谱参见附图2。

[0065] S-CTL慢病毒包装

[0066] 1)培养293T细胞至密度达80-90％，将培养基更换为：DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；

[0067] 2)2-6小时后，用PEI分别将pWPXLd-S(PD1/CTLA-4/TIM3/LAG3)-CTL-2A-EGFP质粒与慢病毒辅助质粒(pMD2.G、psPAX2)共同转染入293T细胞，以空载体pWPXLd-EGFP与辅助质粒共转染作为对照组；

[0068] 3)分别于转染后24、48和72小时，收集培养基上清，即S(PD1/CTLA-4/TIM3/LAG3)-CTL病毒上清，冻存于-80℃备用。

[0069] T细胞激活和慢病毒感染

[0070] 1)通过Ficoll密度梯度法或红细胞裂解法分离出血液中的单核细胞；

[0071] 2)通过MACS Pan-T磁珠分选出T细胞，用T细胞培养基(AIM-V加5％FBS、青霉素100U/ml和链霉素0.1mg/ml)稀释至浓度2.5×106个/ml待用；

[0072] 3)通过包被CD2、CD3、CD28抗体的磁珠(美天旎)刺激T细胞，于37℃、5％CO2条件下的培养箱中培养刺激48h；

[0073] 4)去除T细胞中磁珠，离心去上清，重悬；

[0074] 5)加入S(PD1/CTLA-4/TIM3/LAG3)-CTL慢病毒上清和8μg/ml的polybrene和300IU/ml IL-2，病毒加入量为MOI＝10，于37℃，5％CO2条件下的培养箱中培养；

[0075] 6)24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/ml IL-2的新鲜T细胞培养基重悬，于37℃、5％CO2条件下的培养箱中培养，每2-3天进行半量换液；

[0076] 7)通过流式细胞技术，检测GFP阳性T细胞S-CTL(SC-CTL或ST-CTL)比例，结果如图3、图4所示。

[0077] 实施例2、SP-CTL细胞对人白血病细胞系JURKAT的体外杀伤效应

[0078] 1)在白血病细胞系JURKAT中转导表达荧光素酶(Luciferace)，构建JURKAT-GL报告细胞系；

[0079] 2)分别将SC-CTL GFP阳性细胞与JURKAT-GL细胞以细胞数1：2比例混合共培养(对照组为加GFP T细胞，空白组为不加T细胞，每组设置三个复孔)；

[0080] 3)18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；

[0081] 4)通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间设为1秒。

[0082] 5)杀伤比例计算公式：100％×(空白孔读数-实验孔读数)/空白孔读数，SP-CTL细胞对人白血病细胞系JURKAT的体外杀伤比例如图5所示。

[0083] 实施例3、SP-CTL细胞对非小细胞性肺癌H460的体外杀伤效应

[0084] 1)在非小细胞性肺癌H460中转导表达荧光素酶(Luciferace)，构建H460-GL报告细胞系；

[0085] 2)分别将SP-CTL GFP阳性细胞与H460-GL细胞以细胞数1：2比例混合共培养 (对照组为加GFP T细胞，空白组为不加T细胞，每组设置三个复孔)；

[0086] 3)18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；

[0087] 4)通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，，测定时间设为1秒。

[0088] 5)杀伤比例计算公式：100％×(空白孔读数-实验孔读数)/空白孔读数(如图4)，SP-CTL细胞对非小细胞性肺癌H460的体外杀伤细胞比例如图6所示。

[0089] 实施例4、SC-CTL细胞对人白血病细胞系NALM6的体外杀伤效应

[0090] 1)在白血病细胞系NALM6中转导表达荧光素酶(Luciferace)，构建NALM6-GL报告细胞系；

[0091] 2)分别将GFP阳性细胞数为3.5×104、1.75×104、8.6×103、4.4×103、2.2×103、1.1×103的SC-CTL病毒感染混合细胞与1×104个NALM6-GL细胞共培养(对照组为加GFP T细胞，空白组为不加T细胞，每组设置三个复孔)；

[0092] 3)18小时后，轻轻用移液器吸除一半体积的培养基上清，加入等体积的荧光素酶底物(浓度：300μg/ml)，混匀；

[0093] 4)通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间设为1秒。

[0094] 5)杀伤比例计算公式：100％×(空白孔读数-实验孔读数)/空白孔读数，SC-CTL细胞对人白血病细胞系NALM6的体外杀伤比例如图7所示。

[0095] 实施例5、SP-CTL细胞对人非小细胞性肺癌H460的体内杀伤效应

[0096] 1)将1×105个H460-GL细胞皮下移植入免疫缺陷小鼠NOD/SCID IL2rg-/-体内；

[0097] 2)10天后，在H460-GL荷瘤小鼠中注射SP-CTL GFP阳性细胞数为1×105的SP-CTL病毒感染混合细胞，对照组为注射GFP T细胞的荷瘤小鼠，每个实验组设置三个重复；

[0098] 3)于肿瘤移植后，第10、14、17、20、23、26、29、32、35天量取H460肿瘤 块体积，结果如图8所示。

[0099] 通过以上检测结果可知，本发明的S-CTL细胞对表达相应配体的各种各样的肿瘤具有显著的体内、外杀伤效应。

[0100] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的产品、用途及其使用方式，但本发明并不局限于上述详细用途和使用方式，即不意味着本发明必须依赖上述详细用途和使用方式才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

[0101] 本文所涉及基因序列的列表

[0102] SEQ ID NO.1

[0103]gtttAAACATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCTTCGAAaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgGAATTCCAGGCCAAAAGGAAGCCCAGGAAAGCTCCCAGCAGGAACATCTGCTATGATGCATTTGTTTCTTACAGTGAGCGGGATGCCTACTGGGTGGAGAACCTTATGGTCCAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCCCTTCAAGTTGTGTCTTCATAAGCGGGACTTCATTCCTGGCAAGTGGATCATTGACAATATCATTGACTCCATTGAAAAGAGCCACAAAACTGTCTTTGTGCTTTCTGAAAACTTTGTGAAGAGTGAGTGGTGCAAGTATGAACTGGACTTCTCCCATTTCCGTCTTTTTGATGAGAACAATGATGCTGCCATTCTCATTCTTCTGGAGCCCATTGAGAAAAAAGCCATTCCCCAGCGCTTCTGCAAGCTGCGGAAGATAATGAACACCAAGACCTACCTGGAGTGGCCCATGGACGAGGCTCAGCGGGAAGGATTTTGGGTAAATCTGAGAGCTGCGATAAAGTCCGCGATCGCAagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcACTAGT

[0104] SEQ ID NO.2

[0105]GTTTAAACATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCTACCAGGACCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCTACATGATGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCCAGTGGAAATCAAGTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGACTTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCAGTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCACATTCGAAaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccGAATTCAACATACCCTTAGAAGAACTCCAAAGAAATCTCCAGTTTCATGCATTTATTTCATATAGTGGGCACGATTCTTTCTGGGTGAAGAATGAATTATTGCCAAACCTAGAGAAAGAAGGTATGCAGATTTGCCTTCATGAGAGAAACTTTGTTCCTGGCAAGAGCATTGTGGAAAATATCATCACCTGCATTGAGAAGAGTTACAAGTCCATCTTTGTTTTGTCTCCCAACTTTGTCCAGAGTGAATGGTGCCATTATGAACTCTACTTTGCCCATCACAATCTCTTTCATGAAGGATCTAATAGCTTAATCCTGATCTTGCTGGAACCCATTCCGCAGTACTCCATTCCTAGCAGTTATCACAAGCTCAAAAGTCTCATGGCCAGGAGGACTTATTTGGAATGGCCCAAGGAAAAGAGCAAACGTGGCCTTTTTTGGGCTAACTTAAGGGCAGCCATTAATATTAAGCTGACAGAGCAAGCAAAGAAAGCGATCGCAagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcACTAGT

[0106] SEQ ID NO.3

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