[0001] 本发明涉及一种检测H2S叠氮化罗萨明荧光探针（Ros-N3）的制备和分析应用,属于有机小分子荧光探针领域。

[0002] 硫化氢(H2S)是一种具有特殊气味的气体，对环境的毒性污染已经得到深入的研究。同时，H2S是继一氧化碳和一氧化氮之后第三种可在生命体内发挥生理作用的内源性气体信号分子。人体内源性H2S主要通过L-半胱氨酸的酶解作用产生。H2S生理相关浓度的范围从纳摩尔级到毫摩尔级水平不等。在生理浓度水平下，H2S参与一系列的生理调控过程，例如调节血管张力、心肌收缩、神经传导和胰岛素分泌等。细胞如果不能维持其正常的H2S 浓度，便会引起动脉和肺动脉高压、阿尔茨海默氏症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。H2S还可以清除活性氧和活性氮物种。一些常见疾病如阿尔滋海默症、唐氏综合症、糖尿病及肝硬化等与内源性H2S的调节紊乱相关。因此，选择性识别和高灵敏检测生物体内的H2S具有十分重要的生物医学意义。

[0003] 目前，与比色法、电化学分析、色谱分析和金属硫化物沉淀等检测H2S技术手段相比，荧光探针法具有选择性好、灵敏度高、对生物样品损伤小以及可实现实时原位检测等独特的优势。应用荧光探针法检测细胞内H2S浓度的变化是近年来研究热点之一。目前，H2S荧光探针在设计、作用机制和生物应用等方面得到飞跃发展。利用H2S的强的还原性，能将荧光探针结构中的叠氮基或硝基还原成氨基，导致其结构改变，荧光属性也发生变化。已报道了很多利用H2S的还原性设计的分子荧光探针。这些探针有些可以实现H2S 的体外检测，有些可以实现细胞内的H2S 检测，有些甚至可以实现亚细胞器内的痕量检测。但开发出响应更快、现象更明显、实用性更高的分子探针仍然十分重要。

[0004] 该发明属于罗萨明荧光探针，属于罗丹明衍生物Rh系列。传统合成罗丹明染料分离异构体大多利用制备色谱，此方法成本高而且只能得到毫克级的产品。利用醛代替酸酐合成异构纯罗丹明荧光染料（即罗萨明染料）是一种简便,低成本,收率较高的方法。该发明在得到的罗萨明染料上进行修饰，引入曡氮基团，使其结构改变，荧光属性会发生变化。当前报道的关于罗萨明染料荧光探针很少，研发具有高灵敏度、高选择性和应用效果好的罗萨明荧光探针具有重要意义。

[0005] 本发明的目的在于深入探究关于罗萨明荧光染料制备和应用，提出一种检测H2S的罗萨明荧光探针，可以在细胞中选择性识别H2S。

[0006] 本发明利用的罗萨明荧光染料的结构通式如式（2）所示，4’位的氨基反应生成曡氮基，得到目标荧光探针，该方法简单，且原料成本低廉；该探针可选择性识别H2S，在DMF和磷酸缓冲液的混合溶液中，加入NaHS后，溶液由荧光粉色变为清透的紫色，紫外-可见光谱蓝移了8nm；最低检测限为0.34μM，可用于MGC-803细胞内的H2S的识别。

[0007] 本发明提出的叠氮化罗萨明荧光探针的制备方法，该方法合成简单，成本低。具体步骤如下：称取氨基罗萨明化合物溶于甲醇，加入盐酸，冷却至0℃，加入NaNO2  ,混合物搅拌0.5小时，慢慢加入NaN3，室温搅拌5小时。悬浮液用二氯甲烷萃取，合并有机相，真空浓缩。过柱子提纯（甲醇：二氯甲烷=1:15，v/v），所得叠氮化罗萨明为深紫色固体。

[0008] 本发明提供了曡氮化罗萨明荧光探针的合成路线如下：
本发明提供的Ros-N3对H2S的识别体系为DMF/PB=6:4。

[0009] 本发明对Ros-N3的荧光选择性进行了探究，加入H2S后，荧光发生淬灭。

[0010] 本发明对Ros-N3的紫外选择性进行了探究，单独配体ROSN3在564nm有最大吸收，当加入10当量HS-时，在556nm有最大吸收。

[0011] 本发明提供了Ros-N3的检测限和探针对pH的响应范围。

[0012] 本发明提供了其他离子（Cl-, F–,ClO-, AcO-, CO32-, HCO3-,NO3-, SO42-,HSO3-, SCN-, S2O32-, PO43-）和含硫醇衍生物（Hcy, Cys, GSH）对Ros-N3的H2S识别的干扰能力。

[0013] 本发明提供了Ros-N3在MGC-803 细胞内对H2S的识别功能。

[0014] 本发明的优点是：本发明为罗丹明衍生物类的H2S荧光探针，属于罗萨明系列，具有合成工艺简单、成本低廉、操作简便、选择性好、应用前景广泛等优点，目前有关罗萨明类荧光探针文献报道很少。该发明对罗萨明染料的发光性质的研究和认识具有一定的意义。该荧光探针可在较宽pH范围内对H2S进行识别，它对识别体系中的其他小分子或离子的抗干扰能力强，是一种高效的荧光淬灭型H2S荧光探针，并成功应用于活细胞中H2S的识别，为实时探测细胞中內源性H2S提供了可能。
附图说明

[0015] 下面结合附图来对本发明作进一步说明：图1是本发明实施例3中化合物Ros-N3(10 μM) 与10当量阴离子在DMF/ PB(6 : 4 v/v,10 mM, pH = 7.4) 溶液中的紫外吸收图。

[0016] 图2是本发明实施例3中化合物Ros-N3与10当量阴离子在DMF/ PB(6 : 4 v/v,10 mM, pH=7.4 ) 溶液中的荧光发射图。

[0017] 图3是本发明实施例3中化合物Ros-N3对H2S的检测限图。

[0018] 图4是本发明实施例3中其他阴离子对Ros-N3识别H2S的干扰性图。

[0019] 图5是本发明实施例3中pH对Ros-N3识别H2S的影响图。

[0020] 图6是本发明实施例4中Ros-N3荧光探针的细胞应用图。

[0021] 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明，应当理解，此处所描述的举例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

[0022] 实施例1：制备曡氮化罗丹明Ros-N3称取2-3g 3-（二乙胺）苯酚和1-2g对硝基苯甲醛溶于30-50丙酸中，加入0.1-0.2g对甲基苯磺酸，在65℃下搅拌下回流16小时。反应后，将混合液冷却至室温，加入到3mol/L的醋酸钠溶液中，悬浮物用二氯甲烷溶液萃取，合并有机相，并用水反萃取除丙酸。用无水硫酸钠干燥，浓缩。所得固体溶于甲醇和二氯甲烷的混合液中（1:1）。加入1-1.5g四氯对苯醌，快速搅拌2小时，真空浓缩。梯度过柱子提纯（二氯甲烷：甲醇=50:1-9:1，v/v）。得到紫色硝基罗萨明化合物，产率 13 %。

[0023] 称取0.4-0.6g硝基罗萨明化合物溶于20-40mL甲醇中，加入0.6-0.8g SnCl2 和1mL盐酸，搅拌下回流15小时。混合液冷却至室温，真空浓缩。所得产物经过柱层析提纯（二氯甲烷：甲醇=10:1，v/v），得到暗紫色氨基罗萨明，产率58% 。

[0024] 称取0.2-0.3g氨基罗萨明化合物溶于10-20mL甲醇，加入3mL盐酸，冷却至0℃，加入0.05-0.1g NaNO2 ,混合物搅拌0.5小时，慢慢加入0.05-0.1g NaN3，室温搅拌5小时。悬浮液用二氯甲烷萃取，合并有机相，真空浓缩。过柱子提纯（甲醇：二氯甲烷=1:15，v/v），所得为深紫色固体叠氮化罗萨明，产率68.4%。结果如下：1H NMR (400MHz, CDCl3, ppm):1.31 (t, 12H, J=6.8Hz), 3.65  (q, 8H, J=
6.4Hz), 6.77 (s, 2H), 6.96 (d, 2H, J=8.8), 7.25 (d, 2H, J=8.0), 7.31 (d, 2H, J=10.4), 7.38 (t, 2H, J=7.8)
13
C NMR (100MHz, CDCl3) δ (ppm):12.66  , 46.20 , 96.47  , 113.18  , 144.42 , 
119.61 , 128.09 , 131.21 , 131.82 , 142.54 , 155.49 , 156.20 , 157.90.HR-MS:440.2448
实施例2：溶液配制
溶液的配制：实验中用到的试剂均为分析纯，未进一步处理，直接使用；用到的水是二次高纯水，通过 Milli-Q纯水机纯化。

[0025] 1mM配体标准溶液的配制：精确度为万分之一克的分析天平，准确称取化合物Ros-N3的固体于10 mL的容量瓶中，甲醇定容，配制成1mM 的基础溶液。

[0026] 10mM阴离子标准溶液的配制：与配置配体标准溶液相似，用分析天平准确称取一定量的各种阴离子的钠盐于10 mL的容量瓶中，高纯水定容，配制成浓度为10 mmol/L的溶液。

[0027] 识别体系中，配体浓度为10μM,干扰离子和NaHS浓度为100μM。

[0028] 实施例3：波谱分析单独配体Ros-N3在564nm有最大吸收，当加入10当量HS-时，在556nm有最大吸收。但当- - – - - 2- - - 2- - -
加入10当量的其它离子（Br , Cl , F ,ClO , AcO , CO3 , HCO3 ,NO3 , SO4 ,HSO3 , SCN , S2O32-, PO43-）和含硫醇衍生物（Hcy, Cys, GSH）时，并没有特别明显的紫外吸收变化。由以上结果可知，ROSN3在DMF/ PB( 6 : 4 v/v,10 mM, pH = 7.4 ) 体系中对HS-有良好的紫外吸收选择性，结果见图1。

[0029] 探针Ros-N3在589nm处有显著荧光，当加入10 equiv.HS-时，荧光淬灭。但当加入其它离子和生物小分子时，并没有特别明显的荧光变化。由上述实验结果可知，ROSN3在 DMF/ PB(6 : 4 v/v,10 mM, pH = 7.4 ) 体系中对HS-有好的荧光选择性，结果见图2。

[0030] 在缓冲溶液DMF/ PB中固体配体浓度为(10 μM)不变，随着HS-离子浓度增加，拟合出线性方程Y=168.04-57.35X，R2=0.9954，经计算检测限为0.34μM，见图3。

[0031] 向配体(10 μM)和10当量各种离子溶液中各加入10当量的HS-, 然后测其荧光发射光谱。通过图3可知，其它离子对化合物Ros-N3识别HS-无明显干扰，见图4。

[0032] 配制pH=4-8的缓冲溶液，加入配体后，荧光无变化；加入配时体和10 equiv.HS-时，荧光淬灭。表明该探针在pH=4-8范围内，对H2S的识别不产生影响，结果见图5。

[0033] 实施例4：细胞实验对探针Ros-N3在MGC-803细胞中检测HS-进行了细胞成像实验。细胞实验步骤如下：在MGC-803细胞中先加入10μM的Ros-N3探针溶液，在37 ℃条件下孵育30 min，分别在自然光和红光下成像。如图6中b，可观察到有强烈红色荧光。然后水洗两次，再往体系中加入10 μM的HS-溶液，相同条件下孵育30 min后成像。如图6 d，可以看出细胞内几乎无荧光。a和c 是Ros-N3、Ros-N3+HS-在自然光下的细胞成像，细胞形态良好，说明加入的探针和HS-离子并没对细胞形成不可逆伤害。Ros-N3可以应用于细胞内检测HS-，说明该探针具有潜在应用价值。

[0034] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。