[0001] 本发明涉及提供基于树枝状/超支化聚合物的生物相容性和生物可降解组织粘合剂。本发明的组织粘合剂可用作湿组织粘合剂，例如，作为胸骨闭合粘合剂、切口或裂口闭合粘合剂。

[0002] 伤口闭合和愈合对于实现所有外科患者的最佳结果是必不可少的。通过外科伤口的适当闭合促进愈合过程。传统上，伤口愈合是一种特别侵入性实践。例如缝线和订钉的装置已使用多年。这些方法可对患者造成创伤。理想的切口闭合应是简单的、有效的、安全的、快速的、廉价的、无痛的、美观的并能杀菌的。虽然对机械方法投入了大量研究，但仍可能局部感染以及伤口部位发炎。感染可起因于体外携带对患者健康有害的耐抗生素细菌的存在。一般来讲，使用组织粘合剂可显著地减少保健成本并且为患者优选。粘合剂提供了一种伤口闭合的无针法，根据血源性病毒所呈示的风险的一种重要考虑因素。此外，粘合剂不需要局部麻醉。

[0003] 使用快速固化粘合剂，伤口可快速闭合并在4天或5天后消失，此使得该方法更简易并更佳。局部皮肤粘合剂附着到皮肤和自身，形成干净并强壮的粘合键，其使皮肤伤口边缘固定在一起以使一般在膜下的伤口愈合。当完整时，膜用作微生物障壁以保护伤口免于潜在污染。局部皮肤粘合剂在5至10天后从皮肤脱落下来，因为下面的皮肤愈合并不再需要，因此消除了对不被吸收的缝线和订钉的需求。可将在市面上出售的用于伤口愈合的当前粘合剂分类成三组：纤维蛋白胶、合成聚合物粘合剂和仿生聚合物粘合剂。纤维蛋白封闭剂或“纤维蛋白胶”为凝血级联的最终产物，用作初级止血栓以及提高伤口愈合的基质。与合成粘合剂相比，纤维蛋白封闭剂具有生物可相容和生物可降解的优点。纤维蛋白凝块在几天至几周内被再吸收作为一般伤口愈合方法的一部分。因此，它们不与炎症、异物反应、组织坏死、或严重纤维化相关。但是，广泛地用于外科手术的纤维蛋白胶不提供显著的粘合强度、优化应用需要干基底，并且成本高以及涉及病毒传播的风险。

[0004] 可利用的两种主要的合成聚合物粘合剂为基于氰基丙烯酸酯和聚乙二醇的产品。典型的氰基丙烯酸酯皮肤粘合剂提供与传统伤口闭合装置相比的多个优点。氰基丙烯酸酯用作防水封闭敷料，具有对抗革兰氏阳性菌的微生物障壁性质，并也可减少感染。因此，局部皮肤粘合剂不仅提供初级闭合也在此关键时期内提供有效的微生物障壁。氰基丙烯酸酯为接触水或血液快速聚合的合成胶。氰基丙烯酸正丁酯具有较短的分子链长度，此允许产物只需要一层并明显干燥更快速但仍保持其效力和强度。这些局部皮肤粘合剂在30秒内干燥，允许单层施用，并具有低放热反应。氰基丙烯酸2-辛基酯 具有更长的分子链长度，此允许产品在治愈期间具有更大的灵活性以及平滑的外观但仍保留其效力和强度。但是，因为两层施用和更长的分子链长度，所有需要花更长的时间进行干燥(聚合)。
氰基丙烯酸2-辛基酯因其更长的有机骨架而使降解要慢得多，此更长的有机骨架减缓粘合剂的降解足以保持在组织毒性阈值以下。因为氰基丙烯酸酯的毒性组织，所以对于缝线优选使用氰基丙烯酸2-辛基酯。氰基丙烯酸酯粘合剂看得出在外部组织结合应用中具有更大表现，尤其在医疗急救中，但是其对湿气敏感并危害暴露的伤口部位。

[0005] 聚乙二醇(PEG)聚合物为用于组织粘合的水凝胶。FocalSeal-L为一种水溶性生物可吸收的化合物，其需要大量时间进行光活化，其限制其用于止血。另一种PEG聚合物CoSeal为FDA批准用于US的第一批基于PEG的密封剂，不需要相同的活化来源并且目前在欧洲中用于类似目的。FocalSeal因此迄今被证实在大型胸手术后减小漏气但还未用于GI内窥镜域。Coseal允许外科医生操作血管相关的手术，改善安全性和效率。但是，聚乙二醇(PEG)胶具有两步法施用的缺点并且一些仍需要UV光-交联。最近，已对此部分进行了大量的研究，例如，丙烯酸粘合剂、水状胶体粘合剂、水凝胶粘合剂、聚氨酯粘合剂和软硅胶粘合剂，但是其中大多数必须用于伤口敷料并且令人遗憾地是，它们中没有一个是用于内部伤口修复的完美组织粘合剂。

[0006] 仿生粘合剂被视为生物粘合剂的一个替代物。仿生粘合剂被设计成模仿在血液凝固中自然发生的交联过程。因为它们在湿环境中表现出吸引人的粘合性质，所以对仿生粘合剂兴趣增加并加大了研究。但是，目前在市面上没有仿生皮肤粘合物。

[0007] 在胸心外科中的最常进行的步骤正中胸骨切开术每年全球范围进行超过一百四百万。通过利用手术刀分离胸骨上的组织然后利用电锯分开胸骨进行该步骤。在手术期间，利用胸骨牵缩肌打开胸骨。在此手术后，必须使胸骨固定在一起以允许愈合。使胸骨固定在一起的质量对于愈合过程至关重要，因为其产生疼痛、发病率和死亡率的可能性、治愈时影响愈合时间和骨强度。闭合此伤口的标准方法使用刺破骨头的不锈钢丝和销。但是，存在多个相关问题。除了使用不锈钢丝的患者所忍受的不适外，利用此技术存在0.5-8％的相关发病率和10-40％死亡率。这些方法不可生物降解并需要第二次手术进行移除，这增加手术并发症的可能性，它们造成创伤并引起骨头损伤并在并发症情况中延迟紧急手术，这种并发症最可能在手术头24小时发生。闭合的第一种方法是穿刺骨，并利用不锈钢丝缝合骨头闭合。一般使用6根丝进行。这是护理标准，尽管迹象显示在生理撑开力(咳嗽)期间的病理胸骨位移(>2mm)。不稳定的正中胸骨切开术闭合可导致明显的术后发病。功能恢复、呼吸、疼痛、胸骨裂开和感染全都受到术后胸骨稳定性影响。使用此方法在手术后8到12周内严重地减少患者流动性并强度。此期间后，患者仍需要格外小心。医生已经寻找替换此侵略性及不实际的闭合方法的一个更有效的方法。由Global Analysts Inc截至2015年近期公布的研究将伤口闭合技术的未来市场潜力定在20.8亿美元。同样的研究也显示出皮肤粘合剂和密封剂在过去的两年里经历了10-20％增长率。骨水泥和附件市场也直接涉及每年进行的臀部、膝盖、肩膀、肘部、趾、踝、和腕关节置换术次数。因为在医疗护理中更好的居住环境和改善，所以全球平均年龄一直增加。因为这个，所以预计需要骨水泥处理的患者数将增加，推动骨水泥市场。期望作为骨水泥一部分的骨科生物材料的美国市场在随后的4年里以每年12％增长。

[0008] 粘合剂，尤其骨粘合剂，在与活生物体接触发挥作用后被再吸收并降解成非毒性物。发现使用这些骨粘合剂在医疗的所有领域中在过去50年里兴趣增长。第一批骨粘合剂在1931年由Hedri描述并为胶原蛋白和纤维蛋白‘ossocol’的混合物。报道了骨折的良好的初始结合强度和愈合，但是严重的过敏反应阻止其使用。然后，对环氧树脂、氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、纤维蛋白粘合剂、明胶-间苯二酚-醛、蛋白-醛系统、基于肽的粘合剂、基于低聚-和聚内酯的粘合剂和烷撑双(低聚乳酰基)-甲基丙烯酸酯进行了大量研究。虽然在过去十年里对组织和骨粘合剂进行了大量工作，但明显的是成功的骨粘合剂的开发处于非常早期的阶段。现在，广泛使用的作为骨粘合剂的生物可降解材料包括PGA、PLLA、PDLLA、PGA/TMC、PDS和PBHBA。研究揭示了它们对于大多数踝骨折而言是安全的，但是不适于粉碎性骨折和不稳定骨折，目前使用的大部分骨粘合剂为具有最低粘合性的水泥，此通过联锁到下面骨的表面中的孔和瑕疵中将表面结合在一起。加拿大研究人员领先一种称为 的新型骨水泥，其为一种生物相容性聚合物并广泛地用于治愈骨损伤。此骨水泥在多个正中胸骨切开术案例中也用于辅助修复。显示出，与只使用丝相比，改善胸骨稳定性，这将改善治愈时间和舒适。也允许在手术后就增加稳定性。KRYPTONITETM允许胸骨在几小时内连接在一起，而不是在使用传统方法的情况中需要几周，其为一种帮助心内直视手术患者更好并更快地恢复的方式的第一批粘合剂。表明了，在胸外科中使用粘合剂比只使用丝增加胸骨闭合的机械强度5到10倍，减少一般恢复时间达一半并且患者在术后前六个星期具有较差的身体残疾并可更快地深呼吸。患者能够咳嗽，不适感降低并且明显需要更少的药物治疗例如麻醉药以处理疼痛。但是，前24小时的结合强度过高以至于不能允许简易的急救手术。正中胸骨切开术为在胸骨中制造垂直的内线切口允许外科医生到达心脏和肺的一种手术。其为胸心外科中最常进行的操作，在美国每年超过750,000个案例。手术后，通常利用不锈钢丝并使订钉穿过胸骨，将胸闭合。因为如果出现失败或裂开(25％)则存在相关的发病率(5％)和死亡率，所以医生长时间寻找替换此侵略性的不实际的闭合法的一种更有效的方法。在需要再次开胸的初期操作后不久通常也会出现术后并发症，自此情况中钢丝或订钉会引起致命延迟。与其一样，胸骨闭合的一个非生物可降解的方法将需要二次手术，这将增加致命伤害的可能性。需要此方法的一个替代法来降低不适感、治愈时间并允许在24小时内轻易地到达。此项目的目的是开发针对此申请制定的一种生物可降解的骨粘合剂。目前，进行了大量研究以开发用于有效骨修复的粘合剂。生物可降解的骨粘合剂为引起完全骨再生并在骨恢复后就消失的材料，因为它们会在体内逐渐地自己降解。因此，生物可降解的粘合剂作为传统粘合剂的替代物并具有骨折治愈后不必去除的优点。多种生物可降解材料表现出作为用于大多数踝骨折的骨粘合剂是安全的但是对于不稳定或粉碎性骨折是不安全的。这些生物材料包括聚乙醇酸(PGA)、聚-L-乳酸(PLLA)、聚-DL-乳酸(PDLLA)、PGA/三亚甲基碳酸酯共聚物(PGA/TMC)、聚对二氧杂环己酮(PDS)和聚-β-羟基丁酸(PBHBA)。但是，现在使用的大多数骨粘合剂为具有最小粘合性的水泥，其通过互锁到下面的骨的表面中的孔和瑕疵中而将表面结合在一起。KRYPTONITETM骨水泥因创伤和手术而在治疗颅骨缺陷中表现出巨大进步并且其为批准用于颅骨成形术应用的第一批非毒性、低放热水泥和骨空隙填充物，其向有机和无机物提供强粘合性。KRYPTONITETM骨水泥为一种自固化骨水泥，其通过将三种天然组分组合以产生一种粘合、非毒性骨修复溶液而形成，该溶液以多孔性固化并被设计成模拟天然骨。但是，如上所述，KRYPTONITETM因其交联速度过快而不应用于胸骨闭合案例。只在6分钟内，就能达到高粘合强度。其在一些案例中使用并比钢丝和订钉有所改善，但是仍需要一种更适宜的替代物。水泥在短时间内达到的高强度意指不向存在内出血或其它术后并发症风险的患者推荐，因为使用这种粘合剂将延迟急救手术。这些并发症可能在手术24小时内出现。此骨水泥也可与不锈钢丝的传统方法一起使用，这仍需要二次手术进行移除。

[0009] 本发明的一个目的是提供一种具有以下品质的生物可相容的局部皮肤粘合剂：良好的生物相容性、良好的湿粘合性、在施用15分钟内相对大的强度。

[0010] 本发明的一个目的是提供一种具有以下品质的生物可再吸收的骨粘合剂：良好的生物相容性、良好的湿粘合性、促进治愈而定制的降解性、在施用24小时内初期的低强度。本发明的另一个目的是提供一种用于胸骨闭合的粘合剂，其在24小时内不具有高粘合强度利于急诊治疗，但会随时间增强，在1-2天后会达到耐骨折的某个强度并在一星期后达到非常高的强度。降解在3-4个月内应与治愈成反比。

[0011] 本发明的一个目的是提供一种针对本申请的特定需求定制的适宜的生物可降解的骨粘合剂，其允许在操作24小时内轻易地到达。

[0012] 根据本发明，如随附权利要求中所述，提供一种包含多个分支的树枝状或超支化聚合物，其中至少一个分支包含可氧化成半醌部分和/或醌部分的至少一个儿茶酚部分。

[0013] 优选地，本发明的所述树枝状或超支化聚合物为生物可再吸收、生物可降解、和/或生物可吸收。

[0014] 适宜地，在本发明的树枝状或超支化聚合物中，儿茶酚部分衍生自DOPA部分或多巴胺部分或取代的苯乙胺。应了解，DOPA部分基于二羟苯丙氨酸(DOPA)，其可未取代或经至少一个其它官能团取代。也应了解，多巴胺部分意指可未取代或经至少一个其它官能团(例如胺基)取代的多巴胺(DA)。

[0015] 理想地，在本发明的树枝状或超支化聚合物中，多个聚合分支中每一个可包含基于烷基的链，由此分出其它基于烷基的链以形成进一步分支。

[0016] 适宜地，在本发明的树枝状或超支化聚合物中，树枝状或超支化聚合物可包含至少一个其它官能团。

[0017] 适宜地，至少一个其它官能团可选自由以下组成的组：可为未取代乙烯基或官能化乙烯基的乙烯官能团、胺官能团、二硫官能团、至少一个可电离胺、二胺、三胺、氨基醇官能团、和/或其组合。理想地，胺基可为伯胺基、仲胺基或叔胺基或具有通式-NH-烷基-NH2的二胺基，其中烷基为具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，其可经C1-6烷基取代或未取代。理想地，胺基或二胺基包含阳离子胺基或在某种条件下变成阳离子的胺基，也就是可离子化。适宜地，该条件包括生理条件。特别优选的是叔胺，因为它们在酸性pH下可轻易质子化。

[0018] 在一个特别优选的实施方案中，在本发明的聚合物中，封端乙烯基可以提供为未取代或经C1-6烷基取代的甲基丙烯酸酯根。乙烯基团也可以提供为C1–C6烷基甲基丙烯酸酯根，例如，甲基、乙烯、丙基、丁基、戊基或己基甲基丙烯酸酯根基团。在这些情况中，烷基可经至少一个甲基或乙基取代或未取代。

[0019] 优选地，至少一个共-乙烯基单体或三聚体可用于本发明的方法以与儿茶酚部分共聚并可具有以下通式：

[0020]

[0021] 其中R1为选自由以下组成的组的C1-C6烷基-胺：C0-C6烷基-NH2、C0-C6烷基-NHR2、C0-C6烷基-NR2R3，其中R2和R3单独地为-H或C0-C6烷基，以及R2为C0-C6烷基。特别优选的烷基为甲基、乙基、丙基或丁基，其可为直链或支链。优选的烷基为甲基。优选地，R1为甲基、乙基或丙基，或其组合。优选地，胺为二甲胺或二乙胺。用于共聚的三聚物类型起始物可用于需要树状体的情况，但是单体用于需要超支化聚合物的情况。

[0022] 适宜地，特别优选的单体为：聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、2-二甲氨基乙基丙-2-烯酸酯、2(二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯或2(二甲氨基乙基)丙烯酸酯，但是可使用具有乙烯基和胺基的其它单体。优选地，三聚体为三羟甲基-丙烷三丙烯酸酯(TMPTA)或季戊四醇三丙烯酸酯以及二聚体为聚(乙二醇)二丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯和二甘醇二丙烯酸酯。

[0023] 适宜地，二乙烯基二硫化物单体或三聚体与共-乙烯基单体的比率可在1:99与99:1之间。具有一些结的优选聚合物具有10:90的比率。

[0024] 在一个优选的实施方案中，在本发明的树枝状或超支化聚合物中，多个聚合分支中至少一个利用羟基官能团封端。理想地，多个聚合分支中每一个的至少一个利用选自由以下组成的组的卤素封端：F、Cl、Br和I。

[0025] 适宜地，本发明的树枝状或超支化聚合物为多分散的并具有相对高的多分散指数，这意指当交联时，利用凝胶渗透色谱(GPC)确定，会大量提高分子量。

[0026] 在一个优选的实施方案中，聚合物的基于烷基的链可为亚乙基链，可未取代或经直链或支链C1-6烷基取代。未取代的亚乙基链是特别优选的。

[0027] 在一个特别优选的实施方案中，使本发明聚合物超支化并包含多个支化亚烷基链，其中亚烷基分支中至少一个在亚烷基链中具有至少一个DOPA部分或多巴胺部分，亚烷基侧链进一步被至少一个乙烯基或乙烯基官能团取代；并且其中亚烷基分支中至少一个利用碳阳离子、卤素、可电离胺、二胺或羟基中的至少一个封端。

[0028] 在一个优选的实施方案中，提供了一种包含至少一聚合乙烯骨架的聚合物，该聚合乙烯骨架具有：至少一第一侧链重复单元，其中每个侧链的一端通过酯、酰胺或硫代键以共价的方式结合到乙烯骨架，其中每个第一侧链的另一端包含儿茶酚部分，例如DOPA部分或多巴胺部分以及乙烯基、氢氧化物、胺基或二胺基中至少一个以形成聚合物或包含结合聚合乙烯骨架(可相同或不同)的酯、酰胺或硫代键中至少一个以形成具有至少两个聚合乙烯骨架的分支聚合物，并且其中第一侧链中每一个进一步包含位于第一侧链重复单元各端之间的至少一个二硫基；以及至少一个第二侧链重复单元，其中每个侧链的一端通过酯键、酰胺键或硫化键共价结合至少一个聚合物乙烯骨架，其中每个第二侧链的另一端包含可电离胺或二胺基团。

[0029] 在一个优选的实施方案中，聚合物进一步包含具有如上所述的至少一个第一侧链重复单元和至少一个第二侧链重复单元的多个额外的聚合物骨架链，多个额外的聚合物骨架链以分支聚合重复模式布置以形成超支化聚合物。

[0030] 因此，本发明提供了一种具有控制的分子量和窄分子量分布的直链、支链或超支化聚合物。适宜地，第一和第二侧臂链的分子量和组成(例如，数量和比率)可通过适当地选择用于提供聚合物的共聚单体组合物进行控制或调整(例如，通过迈克尔加成、点击化学、RAFT、ATRP或DE-ATRP或其它控制的活聚合方法)。理想地，聚合物与试剂例如甲基碘的季铵盐化反应可得到具有直链、支链或超支化结构的水溶性阳离子聚电解质。本发明的聚合物是一个重大成就，因为在本领域中已知难以合成具有离子或可电离基团的明确分支的聚合物。

[0031] 优选地，本发明聚合物为可单环化或多环化的打结聚合物。

[0032] 理想地，在本发明的树枝状或超支化聚合物中，乙烯基基团或乙烯基官能团为甲基丙烯酸酯根基团，其可未取代或经直链或支链C1-6烷基取代。甲基和乙基取代基是优选的。

[0033] 适宜地，多个聚合分支中至少一个包含酯、醚、硫化或酰胺官能团中至少一个。

[0034] 在一个特别优选的实施方案中，提供一种具有如图7所示的1H NMR谱的树枝状或超支化聚合物。

[0035] 适宜地，本发明的聚合物可衍生自多巴胺HCl单体和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯单体(TMPTA)的共聚。

[0036] 适宜地，聚合物为多巴胺-丙烯酸酯共聚物。

[0037] 在本发明的一个相关方面中，在本发明的树枝状或超支化聚合物中，可利用交联剂或交联剂系统使多个分支中至少一个交联，可任选地与交联促进剂一起使用。适宜地，可利用壳聚糖或经氧化促进的交联系统使分支交联。理想地，交联系统为高锰酸盐、Fe(III)、纤维蛋白原、HRP和过氧化物、或其组合。Fe(III)可以FeCl3、Fe(acac)3或其它Fe(III)盐形式提供。

[0038] 在又一个相关方面中，本发明聚合物或本发明聚合物的组合物可用作医学粘合剂或骨水泥。适宜地，医学粘合剂为一种用于皮肤切口和/或内伤口闭合的粘合剂。在一个相关实施方案中，骨水泥为一种用于胸骨闭合或其它矫形操作步骤的水泥。因此，本发明的聚合物可用于制造医疗粘合剂或骨水泥。

[0039] 在又另一个相关方面中，提供了一种合成包含至少一儿茶酚部分的树脂状或超支化聚合物的方法，该方法是通过使二乙烯基单体或三丙烯酸酯与其它任选的可聚合单体和/或引发剂——其包括具有至少一个儿茶酚部分的那些——在适宜聚合条件下聚合以通过迈克尔加成、点击化学或活聚合方法进行单体聚合。附图说明

[0040] 图1显示了用于本发明的儿茶酚-修饰的树枝状聚合物粘合剂的合成机理和方案。目标合成粘合剂通过单步迈克尔加成或点击化学步骤制备；

[0041] 图2显示多巴胺-三丙烯酸酯共聚物的合成路径和示意结构，迈克尔加成；

[0042] 图3显示PDA与Fe3的交联机理：(a)通过氧化DOPA的内聚偶合(b)一个铁离子中心在三个DOPA残基中的络合(c)氧化还原自由基聚合；

[0043] 图4显示氧化还原控制和逐步吸收以及利用多硫醇基(纤维蛋白原)作为交联剂使DOPA残基交联。(a)通过纤维蛋白原中的二硫键将未吸收的多巴胺氧化为多巴胺-醌。(b)还原的硫醇盐与多巴胺-醌通过迈克尔加成的内聚偶合。(c)通过H－键或配位与无机表面结合。(d)通过迈克尔加成或希夫反应与有机表面结合。

[0044] 图5显示了通过HRP和H2O2的PDA交联的示意图；

[0045] 图6显示了用于纯化的多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)的GPC谱图；

[0046] 图7显示了多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)的1H NMR谱。

[0047] 图8显示了(a)PDA粘合剂的组成(b)利用Autodesk Inventor制得的伤口闭合强度试验的3D动画(c)利用不同浓度的四种不同固化剂在15分钟的固化时间后PDA-中聚合物对猪皮肤样品的剪切搭接结果(d)利用优化浓度的纤维蛋白原(3重量％)在15分钟的固化时间后PDA-低、PDA-中和PDA-高聚合物的剪切搭接试验结果(e)显示剪切搭接试验如何进行的图(f)利用优化浓度的四种不同固化剂在15分钟、1小时和1天的固化时间后，在市售纤维蛋白胶 控制下，PDA-中等聚合物的剪切搭接试验结果。结果表明纤维蛋白胶非常弱并且强度甚至不足以在1小时的固化时间内测试到。本发明的多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)可在短时间(15分钟)内达到更高的粘合强度；

[0048] 图9显示了(a)利用低/中/高浓度的两种不同固化剂在1天、4天和7天的固化时间后的PDA聚合物的初级PMMA剪切搭接试验结果。(b)利用优化浓度的(20mmol/L)固化剂以及不同添加剂(乙醇和壳聚糖)的辅助在4小时、12小时、1天和7天的固化时间后的PDA聚合物的剪切搭接试验结果。(c)对PMMA板的剪切搭接试验图。(d)与市售骨水泥KRYPTONITETM相比，利用优化的固定条件在4小时、12小时、1天、4天和7天的固化时间后PDA粘合剂和PDA纳TM米复合粘合剂(具有10％HA)的剪切搭接试验结果。*表示组间或来自KRYPTONITE 组的统计显著差异(ANOVA)，n＝5。结果表明KryptoniteTM立刻硬化(强度>900KPa)，这在术后并发症中延迟急诊操作。本发明的多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)粘合剂的强度随时间逐渐增大并最终在第7天达到760KPa；

[0049] 图10显示了(a)湿胸骨样品已切割并随后胶合以测试。(b)压缩试验进行中以及完成。(c)利用金属条钻孔并夹住骨样品用于横向牵拉试验。(d)横向牵拉试验进行中以及完成。

[0050] 图11显示了通过将(a)压力和(b)横向牵拉力负载在胸骨对上测试粘合强度，所述胸骨对利用PDA粘合剂结合，在1天、4天或7天的固化时间后，并与市售骨水泥KRYPTONITETM对比。

[0051] 图12显示了(a)通过断裂酯键(R-三丙烯酸酯单体、R’-多巴胺单体)以水解方式降解PDA聚合物(b)在PBS缓冲溶液中在37℃下在一个月的时间里PDA聚合物可降解到几乎60重量％。

[0052] 图13显示了在200μg PDA和四种不同的交联剂存在下的3T3成纤维细胞活力分析，并与仅PDA和 纤维蛋白胶比较。在第7天，相对于仅细胞而言，在PDA存在下，活性没有显著地减小。*P<0.05。

[0053] 本发明涉及用于在正中胸骨切开术后修复胸骨并也用于局部皮肤闭合或用于其它矫形操作处理，例如肩部、肘部、脊椎、臀部、膝盖、腕、脚和踝手术的粘合剂的开发。发明者开发了一种实现此目的的儿茶酚修饰的树枝状聚合物。本发明粘合剂生物相容并且内用安全。其具有湿粘合品质。其利用不同交联剂具有可控制的固化速度以允许在头24小时内急诊操作也允许在短时间(15分钟)内皮肤闭合。利用交联剂(KMnO4、Fe3+、HRP&H2O2和纤维蛋白原)，可制定交联速率，和多种其它品质以实现之。对于胸骨闭合，在前几天后，粘合剂强度必须增加以牢固地固定胸骨以修复，并必须达到此强度而没有产生过多热量，否则将引起周围组织坏疽。治愈期后，粘合剂必须降解成体内可安全地代谢的非毒性/非致癌性/非致畸性副产物。

[0054] 所进行的初期试验已经显示出对于皮肤闭合，粘合剂在足以闭合伤口的15分钟内表现出高粘合强度。对于胸骨闭合，可控制在头几天内的聚合速率并且本发明的粘合剂表现出对于骨样品极佳的粘合性。本发明聚合物的粘合剂的降解过程的副产物也满足先前所述的生物可相容的必要条件。

[0055] 对于临床上用于创伤和矫形手术的医用骨粘合剂存在多个要求：粘合剂和其降解物必须无毒、无致癌性、和无致畸性。粘合剂必须与骨和周围组织生物相容(无组织刺激或组织坏疽)，并在聚合期间产生最少热量。应在前缀时间内可生物降解-通过降解和细胞再吸收-没有作为愈伤组织形成(骨生成)的障碍。降解过程应与愈合成反比，以确保机械稳定性。粘合剂必须在潮湿环境中结合(原位高结合强度)以允许早期承重，需要足够的弹性以确保拉伸强度的稳定性。骨粘合剂的轻易制备、实用性和适用性、最小的体积压缩、储存期间的稳定性、无菌性和效率。对于此特定应用，粘合剂也需要初期缓慢聚合以允许在急救操作的情况中在头24小时内快速达到。

[0056] 本发明集中于开发儿茶酚-修饰的树枝状聚合物粘合剂以利用它们独特的结构和官能团克服目前组织粘合剂的缺点(图1)。此策略在发明者组中已成功地用于切开的皮肤伤口并显示出非常有前景的结果。成功的结果将导致保健巨大的进步-最明显地用于治疗内伤和手术切口伤口，在未来也用于其它伤口愈合处理。这些令人兴奋的结果使我们延伸此新颖方法用于骨粘合应用。初步试验结果表明开发的试验性儿茶酚-修饰的聚合物对骨模型表现出极佳的粘合性和机械性。甚至更令人兴奋的是，粘合强度可在头个星期内受到控制以允许在一个星期内轻易地到达结合强度和获得强度的头一天内。对此项目选择PDA使其含有多巴胺结构，此允许湿粘合，并且PDA中存在的官能团允许定制机械性质。

[0057] 在此研究中，将新颖生物可降解和可交联的树枝状聚合物，多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)的开发定位为湿组织粘合材料，例如，内用的粘合剂。利用多种不同的交联剂可轻易地使PDA交联，以使本发明的粘合剂可作为用于局部伤口闭合的强壮、牢固并快速固化的粘合剂或作为用于胸骨闭合案例的可控制的固化粘合剂。

[0058] 我们的目的是通过在超支化结构聚合物中包含多巴胺(L-3,4-二羟基苯丙氨酸DOPA的衍生物，在MAP中一种丰富的氨基酸)以形成粘合剂来模拟MAP。因此，本发明者通过使用当前技术的失活增强的ATRP(DE-ATRP)合成方法设计并合成了用于比目前组织粘合剂具有极佳性质的湿组织粘合剂的生物启发的树枝状聚合物。

[0059] 多巴胺-丙烯酸酯共聚物PDA的合成

[0060] 通过迈克尔加成使多巴胺和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA)单体自缩合以得到高分子量聚合物(约90.0kDa)而成功地合成树枝状/超支化聚合物多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)(图2)。目标树枝状聚合物多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)由儿茶酚、乙烯基和羟基官能团组成，得到关于干/湿组织的可制定的官能团、交联(利用交联剂)、生物可降解性、低细胞毒性和所需的机械性质。

[0061] 为了控制交联速度，重要的是了解到，儿茶酚/多巴胺粘合系统如何实现粘合。过渡金属在非结晶生物物质的生成中发挥着重要作用。以类似于Fe3+还原成Fe2+的电位多巴胺通过一个电子氧化成半醌。半醌为一种可引起内聚结合的聚合物-聚合物偶合的自由基。认为，自由基也可直接地偶合表面以发生粘合作用。并且，醌可与铁螯合以得到另一种交联方式。我们建议交联三个DOPA残基中的铁中心(图3)。利用最近的这些观察结果，看得出，多巴胺在儿茶酚/多巴胺粘合系统中起着两个作用。粘合表面来自于还原形式。宏观内聚由多巴胺的一电子(半醌)或两电子(醌)氧化形式提供。PDA通过利用交联剂(KMnO4、Fe3+、HRP/H2O2或变性纤维蛋白原)而具有制定的交联速度。当使用NaIO4(一种作为固化剂的强氧化剂)时，DOPA被立刻转化为DOPA-醌，其引发分子间交联，促进PDA聚合物的内聚强度。虽然会损及到一些内聚强度，但是反应相对快速。考虑到其氧化性，使用高碘酸盐(NaIO4)交联PDA聚合物为用于临床的隐患的一个潜在来源。但是，如我们所知，高碘酸钠因其氧化性被广泛地用于临床，例如，用于氧化纤维素并产生生物可相容以及生物可降解的化合物，该化合物可作为缝合，作为组织工程的支架，或用于药物递送。通过氧化反应消耗DOPA中的电子将通-
过获得高碘酸盐离子中的电子以形成还原产物碘酸盐离子(IO3)(盐的加成物)实现，该碘酸盐离子可进一步还原成无毒性的碘离子(I-)。当交联剂为Fe3+/C2H5OH的氧化剂或NaIO4/C2H5OH为氧化还原对时，交联系统也涉及乙醇，该氧化还原对可在水溶液中产生自由基，自由基可与PDA中的乙烯基反应并因此加速交联速度。与其它强氧化交联剂例如NaIO4相比，纤维蛋白原能更好地在短固化时间内实现相对更高的粘合强度，因为来自S-S键分裂的硫醇与DOPA氧化形成的DOPA-醌偶合，这对于改善粘合聚合物之间的内聚强度并提供有利于保持粘合强度的抗氧化环境至关重要。如图4所示，二硫化物和硫醇盐的氧化还原系统可有效地先作为氧化剂(图4a和b)，其在初期确保足够的粘合强度。随后，二硫化物和硫醇盐用作DOPA-醌的交联搭档，此对于改善粘合聚合物之间的内聚强度至关重要(图4c)。HRP为一种在苯酚羟基存在下，能够在苯酚与具有分解的H2O2的苯胺衍生物之间交联。已证实，HRP浓度影响交联动力学，而H2O2浓度的变化主要影响机械性质。从我们的试验可看出，H2O2中的HRP为一种用于PDA的非细胞毒性固化剂，其可在一天固化时间后实现高粘合强度(76±
13.4KPa)。我们提出图5中的PDA与HRP-H2O2的交联机理。

[0062] 多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)合成-多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)的制造方案[0063] 将三羟甲基丙烷三丙烯酸酯单体(2.96g，10mmol)、盐酸多巴胺单体(1.90g，10mmol)和DMSO(10g)加入两颈烧瓶中。将60μL抑制剂(4-甲氧基-苯甲醛)加入混合物中以去除自由基聚合的可能性。搅拌混合物直到形成清澈溶液。通过在室温下将氩气鼓入溶液中10分钟去除氧气。在鼓入氩气时最后添加TEA(1.42g,14mmol)并磁力搅拌5分钟以上。使溶液在600rpm下搅拌并在60℃下在油浴中聚合2小时。每隔一小时取GPC样品。

[0064] 多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)的纯化方案

[0065] 将40ml THF加入聚合物混合物中，然后磁力搅拌直到完全混合。当TEA盐溶液不溶于THF时，混合物溶液变浑浊。通过离心(5分钟，4000rpm)分离多余的TEA盐溶液。在磁力搅拌条件下，将清澈的聚合物溶液逐滴加入大量沉淀剂(己烷：乙醇＝1:1)(500mL)和100μL抑制剂(4-甲氧基-苯甲醛)中。使沉淀系统静置0.5小时，然后倾倒出上清液。使用丙酮溶解烧杯底部的聚合物以得到50重量％溶液。

[0066] 多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)的GPC结果

[0067] 图6显示了纯化的多巴胺-丙烯酸酯共聚物(PDA)的GPC谱图。

[0068] 优化交联剂

[0069] 对于每个组织粘合试验，通过涡旋1分钟先将PDA溶于丙酮中以达到50重量％的浓度。当将FeCl3和NaIO4用作交联剂时，使60μl 2mmol/L、20mmol/L和200mmol/L FeCl3/H2O或1重量％、2重量％和3重量％NaIO4/H2O与60μl纯乙醇在埃彭道夫管中混合。当将纤维蛋白原用作固化剂时，将纤维蛋白原溶于0.9％盐水中以达到1重量％、2重量％和3重量％浓度并对于每个试验使用60μl溶液。通过将300μl 50重量％PDA溶液与交联剂溶液混合制得PDA粘合剂，然后在室温下，将充分混合的粘合剂流体施用于猪皮肤组织基质表面，该猪皮肤组织基质在试验前放在PBS缓冲溶液中。对于酶介导的氧化交联剂而言，使20μl 0.1重量％、0.2重量％和0.3重量％辣根过氧化物酶与PDA溶液混合，然后添加20μl 0.1重量％、0.2重量％和0.3重量％H2O2并温和涡旋以确保均匀混合。以与粘合样品相同的方式处理不含交联剂的对照样品。然后，重叠两块皮肤，确保保持适宜的重叠面积(2cmx1.5cm)。使饱和含有PBS的纱布缠绕样品以在固化时间期间保持水合。使样品在室温下保持15分钟、1小时和24小时，然后进行强度测试。

[0070] 为了对比目的，利用根据制造商说明制得的市售纤维蛋白外科密封胶(Baxter)将组织表面结合在一起。将纤维蛋白原与抑肽酶溶液混合，然后将凝血酶与氯化钙溶液合并。然后，将两种混合物负载到一组复式注射器中。当分配时，两种组分在注射器系统的出口混合，在此处它们交联形成纤维蛋白粘合剂。以与PDA粘合剂样品类似的方式施用300μL纤维蛋白。

[0071] 在猪皮上PDA-赋予的粘合强度的机械试验

[0072] 在室温下固化粘合剂15分钟、1小时和1天后对猪真皮表面上利用四种不同固化剂的PDA聚合物的组织粘合性质的研究。通过利用四种低/中等/高浓度的固化剂在15分钟的固化时间后对PDA-中等聚合物进行剪切搭接试验来优化固化剂的浓度(图8(c))。利用优化浓度的纤维蛋白原(3重量％)在15分钟的固化时间后，对PDA-低、PDA-中等和PDA-高聚合物进行剪切搭接试验来优化PDA聚合物的分子量(图8(d))。在室温下，固化粘合剂15分钟、1小时和1天后，对猪真皮表面研究利用优化浓度的四种固化剂的PDA-中等聚合物(优化)的组织粘合性。对不含固化剂的PDA聚合物和 纤维蛋白胶进行对照试验(图8(f))。纤维蛋白胶在15分钟的固化时间内没有表现出粘合的迹象，因为所有样品在尝试负载到机械试验机器上之前或期间都失败了。纤维蛋白粘合剂分别在1小时和1天的固化时间后得到
9.45KPa(SD＝3.3KPa，n＝5)和15.34KPa(SD＝4.65KPa，n＝5)的平均剪切搭接强度(图8(f))，此接近针对纤维蛋白粘合剂8、9由其它所报道的强度。纤维蛋白胶结合样品失败表明其属于内聚类型。

[0073] 从我们初步的研究可看出，最大粘结力在15分钟后短时间内达到平稳值并在1天固化时间后增加到约70KPa。当将纤维蛋白原用作固化剂时，只在15分钟内就可形成特别高的粘合强度(37±5.6KPa)，这对于切口皮肤伤口闭合很重要。从我们的试验结果可看出，为在短时间内达到相对更高的粘合强度，纤维蛋白原始最好的，并且为在一天的固化期后达到高粘合强度(76±13.4KPa)，HRP是最好的。

[0074] 证实在PMMA板上的粘合强度

[0075] 按照ASTM标准F2255-05中所述的步骤，对PMMA板进行剪切搭接应力测量以得到纵向剪切模量。适合时，对方案进行轻微的修饰。将测得60mmx15mmx3mm的PMMA样用作骨替代物进行剪切搭接试验。使用具有1000N负载单元的Zwick拉伸试验机，其由携带一个基质固持器的固定元件和携带负载单元的可移动元件、将试验样品固定在两个元件之间的两个兼容的固持器和允许移动元件根据需要以恒定速率移动的驱动机构组成。将尼龙选作基质固持器的材料。尼龙提供足够的强度以承受施加在片件上的剪切应力。螺旋夹钳用于将样品固定在固持器上。装上结合固定装置直到在5mm/min的十字头速度下失效。利用此方法，每组测试最少5个样品。

[0076] 离体机械强度测量：在压缩和横向牵引力试验中使用Instron 4467材料试验系统。利用湿润时结合的羊胸骨样品测量负载压缩失效时的粘合强度和横向牵引强度。沿垂直方向将每个胸骨切成两半，如在正中胸骨切开术中使用带锯，然后沿水平方向切成10块样品。切割样品后，利用橡皮带将5对样品绑在一起并放在PBS缓冲液中，持续24小时。

[0077] 根据ASTM标准D905–08e1所述的步骤并进行修改，对羊胸骨进行压缩测量。机器具有可互换的钳子以允许进行压缩试验。针对此试验特定地选择压缩器以将所施加力集中在粘合位置。这会确保试验的最准确结果。在试验前，将结合样品安装在两区块上以阻止压缩器压碎骨头并确保得到的结果是关于切割部位的粘合强度。第三区块用于保持安装区块之间的空间对于所有试验而言是一致的。小心地将结合位置与压缩器中心对准。十字头移动速率为5mm/min。试验后，测量粘合位置的骨头的结合面积。

[0078] 根据ASTM标准D2095-96所述的步骤并进行修改，对羊胸骨进行横向牵引试验。利用3mm钻头以手钻方式对骨头进行钻孔。钻孔离粘合位置稍靠后些以阻止损伤表面积。钻孔后，胶合样品并固化一段时间，然后通过以5mm/min的恒定速率沿相反方向移动的一对台钳将结合样品在机器中斜着钳住。具有洞的金属带用于将骨头固定至台钳。利用3mm螺纹杆和螺母将金属带固持骨头。没有连接骨头的金属带的端处利用台钳钳住。对于一些不规则样品，有必要切除过多的肉以确保样品端直并可放于机器中而无需将初期压力放于粘合剂上。测试完每个样品后，移除金属带和杆，并每次重新放置，测试新的样品。每次测试后，测量结合面积并利用标准公式由此计算横向牵引强度。

[0079] 通过剪切搭接试验(体内纵向剪切)对作为骨替代物的两片PMMA片研究纳米复合物的粘合强度，因为难以得到具有适当几何形状和尺寸的骨样品所以将两片PMMA片结合在一起(图9(c))。利用两种低/中等/高浓度(2mmol/L,20mmol/L and 200mmol/L)的固化剂(FeCl3和KMnO4)，通过对PDA聚合物进行剪切搭接试验来优化固化剂的浓度(图9(a))。选择每种固化剂的最佳浓度后(20mmol/L)，利用两种优化的固化剂和作为添加剂的乙醇，通过对PDA聚合物进行剪切搭接试验来优化固化条件(图9(b))。最近，对PMMA片分析优化的PDA粘合剂(20mmol/L FeCl3/H2O+10μl乙醇)和PDA纳米复合物粘合剂(PDA粘合剂+10重量％HA)，并与KRYPTONITETM比较(图9(d))。从我们的研究可看出，在初期(≤1天)，KRYPTONITETM样品表现出几乎满强度，分别在4小时和1天的固化时间后，得到614KPa(SD＝50KPa，n＝5)和787KPa(SD＝96KPa，n＝5)的平均搭接剪切强度(图9(d))。如果需要急诊再进入时，此高搭接剪切强度需要医生使用电锯，这将患者置于高风险下。但是，PDA粘合剂具有可控制的固化速度，由于其独特的结构和官能团而允许在一周内发生。当利用FeCl3固化时，为便于急诊，可在一天内达到低得多的相对剪切强度(509KPa，SD＝37KPa，n＝5)，但在7天固化后，最终形成743KPa的高剪切强度(SD＝39KPa，n＝5)，这对于胸骨伤口闭合是重要的。具有10％HA增强的PDA粘合剂在7天固化后表现出明显改善，达到约850KPa(SD＝70KPa，n＝5)(图9(d))。粘合剂强度的增强是因为超支化聚合物的多种端官能团(儿茶酚部分)连同HA系统的极性基团和粘合基质上的羟基的强氢键相互作用(图9)。

[0080] 离体压缩(图10(a)和(b))和横向牵引测量(图10(c)和(b))通过向结合两个半块羊胸骨的PDA纳米复合物粘合剂进行负载压缩和横向牵引得到机械强度。在将HA颗粒引入疏水性PDA聚合物中，粘合剂流动性变差，使其更容易粘合骨头并不会过早地滑落或渗入骨孔中。KRYPTONITETM在1天的固化时间后得到514KPa的平均压缩强度(SD＝97KPa，n＝5)，此因为快速的固化速率而接近满强度(图11(a))以及255KPa的平均横向牵引强度(SD＝57KPa，n＝5)(图11(b))。但是，PDA粘合剂在一周内具有可控制的固化速度以及在一天内相对更低的粘合强度，7天固化时间后，但负载压缩(251KPa，SD＝52KPa，n＝5)(图11(a))和横向牵引(171KPa，SD＝45KPa，n＝5)(图11(b))力最终增到623KPa的高压缩强度(SD＝71KPa，n＝5)(图6(a))和633KPa的横向牵引强度(SD＝52KPa，n＝5)(图11(b))，这对于承受体内应力很重要。试验结束时，所有样品显示出粘合剂与骨表面的失败，而不是内聚失败。利用四种不同固化剂，在室温下固化粘合剂15分钟、1小时和1天后研究对猪表皮的PDA聚合物的组织粘合性。利用四种低/中/高浓度的固化剂，在15分钟的固化时间后，通过对PDA-中聚合物进行剪切搭接试验优化固化剂的浓度(图8(c))。利用优化浓度的纤维蛋白原(3重量％)，在
15分钟的固化时间后，通过对PDA-低、PDA-中和PDA-高聚合物进行剪切搭接试验优化PDA聚合物的分子量(图8(d))。利用优化浓度的四种固化剂，在室温下固化粘合剂15分钟、1小时和1天后，研究对猪真皮的PDA-中聚合物(优化)的组织粘合性。对不含固化剂的PDA聚合物和 纤维蛋白胶进行对照试验(图8(f))。纤维蛋白胶在15分钟的固化时间内没有显示出粘合的迹象因为所有样品在尝试负载到机械试验机中前或期间失败。纤维蛋白粘合剂分别在1小时和1天的固化时间后得到9.45KPa(SD＝3.3KPa，n＝5)和15.34KPa(SD＝
4.65KPa，n＝5)的平均搭接剪切强度(图8(f))，此接近针对纤维蛋白粘合剂8、9由其它所报道的强度。纤维蛋白胶结合样品失败表明其属于内聚类型。

[0081] 从我们初步的研究可看出，最大粘结力在15分钟后短时间内达到平稳值并在1天固化时间后增加到约70KPa。当将纤维蛋白原用作固化剂时，只在15分钟内就可形成特别高的粘合强度(37±5.6KPa)，这对于切口皮肤伤口闭合很重要。从我们的试验结果可看出，为在短时间内达到相对更高的粘合强度，纤维蛋白原始最好的，并且为在一天的固化期后达到高粘合强度(76±13.4KPa)，HRP是最好的。

[0082] 证实在PMMA板上的粘合强度

[0083] 按照ASTM标准F2255-05中所述的步骤，对PMMA板进行剪切搭接应力测量以得到纵向剪切模量。适合时，对方案进行轻微的修饰。将测得60mmx15mmx3mm的PMMA样用作骨替代物进行剪切搭接试验。使用具有1000N负载单元的Zwick拉伸试验机，其由携带一个基质固持器的固定元件和携带负载单元的可移动元件、将试验样品固定在两个元件之间的两个兼容的固持器和允许移动元件根据需要以恒定速率移动的驱动机构组成。将尼龙选作基质固持器的材料。尼龙提供足够的强度以承受施加在片件上的剪切应力。螺旋夹钳用于将样品固定在固持器上。装上结合固定装置直到在5mm/min的十字头速度下失效。利用此方法，每组测试最少5个样品。

[0084] 离体机械强度测量：在压缩和横向牵引力试验中使用Instron 4467材料试验系统。利用湿润时结合的羊胸骨样品测量负载压缩失效时的粘合强度和横向牵引强度。沿垂直方向将每个胸骨切成两半，如在正中胸骨切开术中使用带锯，然后沿水平方向切成10块样品。切割样品后，利用橡皮带将5对样品绑在一起并放在PBS缓冲液中，持续24小时。

[0085] 根据ASTM标准D905–08e1所述的步骤并进行修改，对羊胸骨进行压缩测量。机器具有可互换的钳子以允许进行压缩试验。针对此试验特定地选择压缩器以将所施加力集中在粘合位置。这会确保试验的最准确结果。在试验前，将结合样品安装在两区块上以阻止压缩器压碎骨头并确保得到的结果是关于切割部位的粘合强度。第三区块用于保持安装区块之间的空间对于所有试验而言是一致的。小心地将结合位置与压缩器中心对准。十字头移动速率为5mm/min。试验后，测量粘合位置的骨头的结合面积。

[0086] 根据ASTM标准D2095-96所述的步骤并进行修改，对羊胸骨进行横向牵引试验。利用3mm钻头以手钻方式对骨头进行钻孔。钻孔离粘合位置稍靠后些以阻止损伤表面积。钻孔后，胶合样品并固化一段时间，然后通过以5mm/min的恒定速率沿相反方向移动的一对台钳将结合样品在机器中斜着钳住。具有洞的金属带用于将骨头固定至台钳。利用3mm螺纹杆和螺母将金属带固持骨头。没有连接骨头的金属带的端处利用台钳钳住。对于一些不规则样品，有必要切除过多的肉以确保样品端直并可放于机器中而无需将初期压力放于粘合剂上。测试完每个样品后，移除金属带和杆，并每次重新放置，测试新的样品。每次测试后，测量结合面积并利用标准公式由此计算横向牵引强度。

[0087] 通过剪切搭接试验(体内纵向剪切)对作为骨替代物的两片PMMA片研究纳米复合物的粘合强度，因为难以得到具有适当几何形状和尺寸的骨样品所以将两片PMMA片结合在一起(图9(c))。利用两种低/中等/高浓度(2mmol/L,20mmol/L and 200mmol/L)的固化剂(FeCl3和KMnO4)，通过对PDA聚合物进行剪切搭接试验来优化固化剂的浓度(图9(a))。选择每种固化剂的最佳浓度后(20mmol/L)，利用两种优化的固化剂和作为添加剂的乙醇，通过对PDA聚合物进行剪切搭接试验来优化固化条件(图9(b))。最近，对PMMA片分析优化的PDA粘合剂(20mmol/L FeCl3/H2O+10μl乙醇)和PDA纳米复合物粘合剂(PDA粘合剂+10重量％HA)，并与KRYPTONITETM比较(图9(d))。从我们的研究可看出，在初期(≤1天)，KRYPTONITETM样品表现出几乎满强度，分别在4小时和1天的固化时间后，得到614KPa(SD＝50KPa，n＝5)和787KPa(SD＝96KPa，n＝5)的平均搭接剪切强度(图9(d))。如果需要急诊再进入时，此高搭接剪切强度需要医生使用电锯，这将患者置于高风险下。但是，PDA粘合剂具有可控制的固化速度，由于其独特的结构和官能团而允许在一周内发生。当利用FeCl3固化时，为便于急诊，可在一天内达到低得多的相对剪切强度(509KPa，SD＝37KPa，n＝5)，但在7天固化后，最终形成743KPa的高剪切强度(SD＝39KPa，n＝5)，这对于胸骨伤口闭合是重要的。具有10％HA增强的PDA粘合剂在7天固化后表现出明显改善，达到约850KPa(SD＝70KPa，n＝5)(图9(d))。粘合剂强度的增强是因为超支化聚合物的多种端官能团(儿茶酚部分)连同HA系统的极性基团和粘合基质上的羟基的强氢键相互作用(图9)。

[0088] 体外压缩(图10(a)和(b))和横向牵引测量(图10(c)和(b))通过向结合两个半块羊胸骨的PDA纳米复合物粘合剂进行负载压缩和横向牵引得到机械强度。在将HA颗粒引入疏水性PDA聚合物中，粘合剂流动性变差，使其更容易粘合骨头并不会过早地滑落或渗入骨孔中。KRYPTONITETM在1天的固化时间后得到514KPa的平均压缩强度(SD＝97KPa，n＝5)，此因为快速的固化速率而接近满强度(图11(a))以及255KPa的平均横向牵引强度(SD＝57KPa，n＝5)(图11(b))。但是，PDA粘合剂在一周内具有可控制的固化速度以及在一天内相对更低的粘合强度，7天固化时间后，但负载压缩(251KPa，SD＝52KPa，n＝5)(图11(a))和横向牵引(171KPa，SD＝45KPa，n＝5)(图11(b))力最终增到623KPa的高压缩强度(SD＝71KPa，n＝5)(图6(a))和633KPa的横向牵引强度(SD＝52KPa，n＝5)(图11(b))，这对于承受体内应力很重要。试验结束时，所有样品显示出粘合剂与骨表面的失败，而不是内聚失败。

[0089] 定量降解(重量损失)

[0090] 在放于PBS中称重样品。在烘箱中加热PBS瓶，加热15-20分钟，加热到37℃。将样品放入PBS中并再次放入烘箱中长达一段时间以允许降解。从PBS中移除并测试样品的机械强度。与非降解样品比较用于对照。随时间称量损失。PDA显示了适当的可降解性能并在一个月内降解到几乎60％。Kryptonite在一个月内几乎没有降解(图12)。

[0091] 定量细胞毒性

[0092] 使3T3成纤维细胞在补充了10％FBS和1％Pen/Step的DMEM中在标准无菌细胞培养条件下在37℃和5％CO2下培养。将细胞以10,000个细胞/孔的浓度接种在48孔平板中。在接种一天后，将1mg粘合剂和多种交联剂加入细胞中以得到2mg/ml的最终浓度。为在添加粘合剂一天、四天和七天后评价细胞活性，使用如上所述的 细胞代谢活性法。通过针对没接受处理的细胞标准化代谢活性得到细胞活性。将不含交联剂的PDA粘合剂和纤维蛋白胶用于比较(图13)。

[0093] 超支化聚合物属于被称为树枝状聚合物的一类合成的树状大分子。它们是具有密集分支结构和大量端基的聚合物。树枝状聚合物包括具有完全分支的星状拓扑结构的树状物和具有不完全支化或不规则结构的超支化聚合物。树状物和超支化聚合物分子由从中心核发生的重复单元组成。核的特征在于其官能团，其为化学键的数目，通过化学键可与分子外部相连。核的官能团一般为三个(例如胺)或四个(例如乙二胺)。通过核心的键，直链单元(单个单体或直链)的层体与核心相连并且这些臂中每一个利用多官能分支单位封端。通过将直链单位的壳体加入下面层体的端基产生更大分子。如果这些所有单位完美地连接分子，则形成树状物。相反，分子中缺少这些单位中的任一个会得到超支化聚合物结构。

[0094] 进一步，本发明提供了一种适用于制造特定设计的粘合剂的合成平台，这些粘合剂在本发明上下文内被证明表现改善的粘合性。文中提供的方法能够合成具有极佳生物可降解性【细胞内】并特定地加成了可修饰的官能团的聚合物，使多种其它应用中的一部分很有前景。

[0095] 具体地讲，发明者阐述了适用作医用粘合剂，和/或骨水泥的超支化或直链分支阳离子聚合物的合成和表征。

[0096] 聚合物合成&表征——共缩聚反应不适于形成超支化共聚物，因为乙烯基单体不能通过这些方法合成。但是，SCVP可用于制造这些超支化聚合物。一般来讲，可使用结构AB的乙烯基单体，其中A为乙烯基并且B为能通过外界刺激转化为引发基团B*的官能团。此种类被称为单体引发剂。活化种类可为“活”自由基，亲电子阳离子基团或负碳离子。单体引发剂通常包含卤素基团，从而通过移除卤素以形成阳离子或自由基而发生活化。可控/活自由基聚合(CRP)为一种广泛使用的技术，其允许通过精确地控制分子量和分布来合成明确的聚合物结构。通过CRP技术制得的聚合物的结构被报道为直链、交联、支链/树枝状结构。通过精确地控制链生长与可逆链封端之间的竞争，聚合物可缓慢并有效地生长，以控制的方式通过多官能乙烯基单体引入分支并延迟交联反应。DE-ATRP允许可利用的廉价的多官能乙烯基单体通过均聚和共聚轻易地用于合成具有高度分支和控制链结构的可溶性超支化聚合物。此策略的关键为通过失活增强法控制链生长与可逆链封端之间的竞争。因此，聚合物链可有效生长，并以控制的方式通过多官能乙烯基单体引入分支，导致超支化聚合物而非交联凝胶的形成。

[0097] 本发明的粘合剂为合成聚合物，其通过原子转移自由基聚合(ATRP)或可逆加成断裂链-转移(RAFT)聚合的方法合成以得到超支化或直链支化聚合物。其它可能的合成方法包括迈克尔加成和点击化学方法。

[0098] 表1显示了纯化后超支化PDA的分子量；

[0099]

[0100] 表2显示了PDA-中聚合物的进料比率、最终组成比率、乙烯基比率、DOPA比率和分支比率；

[0101]