制造3-巯基丙酸或其盐的方法 |
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| 申请号 | CN201080019014.8 | 申请日 | 2010-04-30 | 公开(公告)号 | CN102575273B | 公开(公告)日 | 2015-01-28 |
| 申请人 | 三井化学株式会社; | 发明人 | 安乐城正; 古屋政幸; 林秀俊; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及使用酰胺酶由3-巯基丙酰胺或其盐制造3-巯基丙酸的方法。根据本发明，可以利用酶反应在工业上制造3-巯基丙酸。 | ||||||
| 权利要求 | 1.通式(2)表示的羧酸或其盐的制造方法，所述制造方法为：在腈水合酶及酰胺酶的存在下，使用所述腈水合酶由通式(3)表示的腈或其盐制造通式(1)表示的酰胺或其盐，使用所述酰胺酶由上述酰胺或其盐制造通式(2)表示的羧酸或其盐， |
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| 说明书全文 | 制造3-巯基丙酸或其盐的方法技术领域[0001] 本发明涉及制造3-巯基丙酸或其盐的方法。 背景技术[0003] 利用3-巯基丙腈的水解来制造3-巯基丙酸的方法是公知的，进行了加入酸或碱、利用化学方法进行水解的方法(例如专利文献1、2)。另外，专利文献6、7中，公开了由丙烯腈利用化学方法合成3-巯基丙酸的方法。 [0005] 专利文献1：日本特开平4-305563号公报 [0006] 专利文献2：日本特开2001-187778号公报 [0007] 专利文献3：日本特开2008-022706号公报 [0008] 专利文献4：日本特开2005-176639号公报 [0009] 专利文献5：日本特开昭58-201992号公报 [0010] 专利文献6：中国专利公开公报CN1793117A [0011] 专利文献7：中国专利公开公报CN101125827A [0012] 非专利文献1：Journal of Applied Microbiology.95，1161-1174(2003)[0013] 非专利文献2：Journal of Applied Microbiology.91，381-393 (2001)[0014] 非专利文献3：Archives of Microbiology(1984)138，315-320 [0015] 发明内容 [0016] 在化学方法中，通过将水解条件最优化，来赋予高的反应收率，但是生成了硫代二丙酸等副产物。上述化合物需要使用蒸馏操作等的副产物的分离步骤。因此，上述化学方法在工业上未必是优异的方法。 [0017] 酶反应可以在温和条件下进行反应，因此，是工业上优异的方法。但是，没有具体公开关于3-巯基丙酸的酶的制造方法。专利文献5中，没有公开所得3-巯基丙酸的纯度，不清楚其在工业上是否有用。此外，专利文献5中，没有具体公开参与反应的酶，因此难以对3-巯基丙酸的制造步骤进行改良。 [0018] 本发明是鉴于上述情况而完成的，本发明的目的在于提供通过酶反应在工业上制造3-巯基丙酸的方法。 [0019] 即，本发明如下所述。 [0020] [1]一种制造方法，所述制造方法使用酰胺酶，由通式(1)表示的酰胺或其盐制造通式(2)表示的羧酸或其盐。 [0021] [0022] (通式(1)中，X表示H、S-C2H4-CONH2、S-C2H4-COOH、阳离子中的任一种。X为H、S-C2H4-CONH2或S-C2H4-COOH时，n为1；X为阳离子时，n表示与X的价数相同的整数。)[0023] [0024] (通式(2)中，Y表示H、S-C2H4-COOH中的任一种。) [0025] [2]如[1]所述的方法，其中，使用腈水合酶，由通式(3)表示的腈或其盐制造通式(1)表示的酰胺或其盐，由该酰胺或其盐制造通 式(2)表示的羧酸或其盐。 [0026] [0027] (通式(3)中，Z表示H、S-C2H4-CN、S-C2H4-CONH2、阳离子中的任一种。Z为H或S-C2H4-CONH2时，n为1；Z为阳离子时，n表示与Z的价数相同的整数。) [0028] [3]如[2]所述的方法，其中，在腈水合酶及酰胺酶的存在下，由通式(3)表示的腈或其盐制造通式(2)表示的羧酸或其盐。 [0029] [4]如[2]或[3]所述的方法，其中，上述腈水合酶来自假诺卡氏菌属的细菌。 [0030] [5]如[4]所述的方法，其中，反应液中的通式(1)表示的酰胺或其盐、及通式(3)表示的腈或其盐中的至少一方的浓度为11重量％以上。 [0031] [6]如[2]至[5]中任一项所述的方法，其特征在于，通式(3)表示的腈或其盐是使丙烯腈与含有硫原子的化合物反应得到的。 [0032] [7]如[6]所述的方法，其中，上述含有硫原子的化合物为氢硫化钠。 [0033] [8]如[1]至[7]中任一项所述的方法，其特征在于，上述酰胺酶属于酰胺酶特征家族(amidase Signature family)。 [0034] [9]一种季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)的制造方法，包括： [0035] 利用[1]至[8]中任一项所述的方法制造通式(2)所示的羧酸的步骤；和[0036] 将得到的上述羧酸和季戊四醇进行酯化反应的步骤。 [0037] [10]一种光学材料的制造方法，包括： [0038] 利用[9]所述的方法制造季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)的步骤；和 [0039] 将所得季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)均聚或共聚后进行固化的步骤。 [0040] [11]一种制造方法，所述制造方法使用腈水解酶，由3-巯基丙 腈或其盐制造3-巯基丙酸。 [0041] 根据上述发明，使用酰胺酶由通式(1)表示的酰胺或其盐制造3-巯基丙酸或其盐。由此，与化学合成法相比可以减少副产物，所以可以简化纯化步骤。因此，可以有效地制造3-巯基丙酸或其盐。 [0043] 根据以下所述的优选的实施方式、及附带的以下附图更详细地说明上述目的、及其他目的、特征及优点。 [0044] [图1]为说明实施例的图。 具体实施方式[0045] 本发明中的3-巯基丙腈衍生物为上述通式(3)表示的3-巯基丙腈衍生物，为通式(3)中Z表示H、S-C2H5-CN、S-C2H5-CONH2、阳离子中的任一种的化合物。 [0046] 本发明中的3-巯基丙酰胺衍生物为上述通式(1)表示的3-巯基丙酰胺衍生物，为通式(1)中X表示H、S-C2H5-CONH2、S-C2H5-COOH、阳离子中的任一种的化合物。 [0047] 本发明中的3-巯基丙酸衍生物为通式(2)表示的3-巯基丙酸衍生物，为通式(2)中Y表示H、S-C2H5-COOH中的任一种的化合物。 [0048] (第1实施方式) [0049] 本实施方式为使用酰胺酶、由通式(1)表示的3-巯基丙酰胺衍生物(其中，通式(1)中，X为H、1价、2价或3价阳离子。)制造通式(2)表示的羧酸或其盐的方法。在本实施方式中，n为1～3，n＝1时，通式(1)中，X为H、1价阳离子，通式(1)中n＝2时，X为2价阳离子，n＝3时，X为3价阳离子。具体而言，作为1价阳离子，例如可以使用碱金属+ + + + + 离子或铵离子，作为碱金属离子，可以举出Li、Na、K、Rb、Cs。作为2价阳离子，可以举出 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ Be 、 Mg 、或Ca 、Sr 、Ba 、Ra 碱土金属离子。作为3价阳离子，可以举出Al 。另外，通式(2)中，Y为H，但可以形成具有与通式(1)的X相对应的反荷离子的羧酸盐或硫醇盐。 [0050] 本实施方式的反应式的一个例子如下述反应式(4)所示。反应式(4)表示使用3-巯基丙酰胺或其盐制造3-巯基丙酸的方法的例子。反应式(4)中，X、Y优选使用1价阳离子。 [0051] [0052] 所谓酰胺酶，是指作用于酰胺化合物的酰胺基、将酰胺基水解形成羧基的酶。酰胺酶已知有被称作酰胺酶特征(amidase signature、AS)家族的一组(例如脂肪酸酰胺的酰胺酶、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY、Vol.275、No.25、Issue of June 23、pp.19177-19184、2000、以下称作“参考文献1”。)半胱氨酸(例如Pseudomonas aeruginosa的酰胺酶，FEBS Lett.，1995，pp275)，所述酰胺酶特征家族的酰胺酶活性中心为赖氨酸、丝氨酸、丝氨酸。所谓活性中心为赖氨酸、丝氨酸、丝氨酸的被称作AS家族的一组，是指如上述参考文献1的图1所示的、作为各种酰胺酶的氨基酸序列保存性高的氨基酸序列中的赖氨酸、丝氨酸、丝氨酸对活性是必须的，通过将上述氨基酸转化为其他氨基酸活性完全消失的酰胺酶的一组。 [0053] 本实施方式中，酰胺酶可以是微生物(细菌、酵母等)、植物、霉菌、动物、昆虫等任何起源的酰胺酶。作为已知产生酰胺酶的微生物，例如可以举出属于下述菌属的微生物：棒状杆菌(Corynebacterium)属、诺卡氏菌(Nocardia)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、无芽胞杆菌(Bacteridium)属、短杆菌(Brevibacterium)属、微球菌(Micrococcus)属、红球菌(Rhodococcus)属、气单胞菌(Aeromonas)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、欧文氏菌(Erwinia)属、肠杆菌(Enterobacter)属、链霉菌(Streptomyces)属、根瘤菌 (Rhizobium)属、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属、嗜酸菌(Acidphilium)属、极单胞菌(Polaromonas)属、硫化叶菌(Sulfolobus)属等。 [0054] 作为能够更有效地水解的酰胺酶，为酰胺酶的活性中心为赖氨酸、丝氨酸、丝氨酸的被称作AS家族的一组酰胺酶。作为生产酰胺酶的细菌，所述酰胺酶是酰胺酶的活性中心为赖氨酸、丝氨酸、丝氨酸的被称作AS家族的一组酰胺酶，可以举出恶臭假单胞菌NBRC12668(Pseudomonas putida NBRC12668)、嗜热假诺卡氏菌JCM3095(Pseudonocardia thermophila JCM3095)、绿 叶 假 单 胞 菌 B23(Pseudomonas B23)、隐 藏 嗜 酸 菌JF-5(Acidiphilium crytum JF -5)。根据本发明人等的知识，3-巯基丙酰胺有时会抑制酶活性，但属于AS家族的酰胺酶不易受到由3-巯基丙酰胺产生的抑制，故优选使用。其中，来自不属于高度嗜热菌及超高度嗜热菌的生物的、属于AS家族的酰胺酶在大肠杆菌等于常温下生长的宿主中使用时，易于使酰胺酶表达，故较优选使用。特别优选使用来自恶臭假单胞菌NBRC12668、嗜热假诺卡氏菌JCM3095的酰胺酶。来自恶臭假单胞菌NBRC12668的酰胺酶的氨基酸序列及DNA序列如序列表的序列号1、2所示。 [0055] 另外，本实施方式中，在酰胺酶的活性中心为赖氨酸、丝氨酸、丝氨酸的被称作AS家族的一组酰胺酶中，即使该氨基酸序列的一部分取代、插入、缺失，只要保持酶活性，则也可以作为酰胺酶使用。具体而言，也可以使用来自恶臭假单胞菌NBRC12668的酰胺酶的氨基酸序列的一部分被取代的酰胺酶。 [0056] 例如可以利用下述酰胺酶突变体，所述酰胺酶突变体包含选自下述氨基酸取代中的至少一种氨基酸取代、且具有酰胺酶活性，所述氨基酸取代为在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中第51位的Ile取代为Thr、第146位的Leu取代为Val、第149位的Ala取代为Gly、第181位的Ala取代为Ser、第186位的Leu取代为Ile、第190位的Gly取代为Thr、第262位的Val取代为Ala、第280位的Ile 取代为Val、第295位的Gly取代为Ala、第317位的Val取代为Ile、第356位的Ala取代为Gly、第379位的Met取代为Leu、第384位的Phe取代为Tyr、第400位的Ile取代为Leu、第442位的Ser取代为Ala、第447位的Met取代为Thr、第448位的Leu取代为Ile、第469位的Val取代为Leu、第480位的Gly取代为Ala、及第498位的Ala取代为Ser。 [0057] 需要说明的是，本说明书中，氨基酸、肽、蛋白质使用由如下所示的IUPAC-IUB生物化学命名委员会(CBN)采用的缩写表示。另外，只要没有特别说明，肽及蛋白质的氨基酸残基序列以从左端到右端为从N末端到C末端、另外N末端为1号的方式表示。 [0058] A＝Ala＝丙氨酸、C＝Cys＝半胱氨酸、 [0059] D＝Asp＝天冬氨酸、E＝Glu＝谷氨酸、 [0060] F＝Phe＝苯丙氨酸、G＝Gly＝甘氨酸、 [0061] H＝His＝组氨酸、I＝Ile＝异亮氨酸、 [0062] K＝Lys＝赖氨酸、L＝Leu＝亮氨酸、 [0063] M＝Met＝蛋氨酸、N＝Asn＝天冬酰胺、 [0064] P＝Pro＝脯氨酸、Q＝Gln＝谷氨酰胺、 [0065] R＝Arg＝精氨酸、S＝Ser＝丝氨酸、 [0066] T＝Thr＝苏氨酸、V＝Val＝缬氨酸、 [0067] W＝Trp＝色氨酸、Y＝Tyr＝酪氨酸、 [0068] 作为本实施方式的酰胺酶，也可以使用经转化能够产生酰胺酶的转化体。该转化体通过将已在基因数据库GenBank等中注册的编码酰胺酶的基因克隆到表达载体上，可以得到编码酰胺酶的DNA及与该DNA杂交的DNA。作为进行克隆时的载体，适用下述载体，即，使用能够在宿主微生物内自主复制的噬菌体或质粒构筑的用于基因重组的载体。作为噬菌体，例如将大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主细菌的情况下，可以举出Lambda gt10、Lambda gt11等。另外，作为质粒，例如将大肠杆菌作为宿主细菌的情况下，可以举出pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均为Boehringer Mannheim公司制)、 pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(QIAGEN公司制)、pQE-30(QIAGEN公司制)、pBluescriptII SK+、pBluescriptII SK(-)(Stratagene公司制)、pET-3(Novagen公司制)、pUC18(宝酒造株式会社制)、pSTV28(宝酒造株式会社制)、pSTV29(宝酒造株式会社制)、pUC118(宝酒造株式会社制)等。需要说明的是，在通过基因重组等导入来自与宿主不同的菌的酶并使其表达的情况下，较优选以与宿主吻合的方式改变密码子选择(codon usage)进行使用。 [0069] 作为启动子，只要能够在宿主细胞中表达酰胺酶即可，可以为任意启动子。例如可以举出trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PH启动子、PSE启动子等来自大肠杆菌和噬菌体等的启动子。另外，也可以使用如tac启动子、lacT7启动子之类经过人为设计改变的启动子等。进而，为了能够在芽孢杆菌属细菌中表达，也可以使用Np启动子(日本特公平8-24586号公报)等。 [0070] 作为核糖体结合序列，只要能够在宿主细胞中表达酰胺酶即可，可以为任意核糖体结合序列，但优选使用下述质粒，即，将夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列和起始密码子之间调节为合适的距离(例如6～18个碱基)的质粒。 [0071] 为了有效地进行转录和翻译，可以使下述蛋白质表达，所述蛋白质使编码表达载体的蛋白质的N末端部分与缺失了具有该蛋白质活性的蛋白质N末端或其一部分的蛋白质融合。 [0075] 另外，也可以在培养基中适当添加氯化镁、氯化铁等无机盐类、微量金属盐、维生素类等通常在培养中使用的营养源。另外，根据需要，也可以添加促进转化体增殖的因子、对保持培养基的pH有效的缓冲物质等。 [0076] 转化体的培养可以在适于生长的条件下，例如培养基的pH为2～12、优选为pH4～10、温度为5～50℃、优选为20～50℃的条件下进行。转化体的培养也取决于转化体的种类，可以在厌氧性或需氧性的任一种条件下进行，较优选在需氧性条件下进行。培养时间例如为1～240小时左右，优选为5～120小时左右，更优选为12～72小时左右。 [0077] 培养后的转化体可以直接用于反应，也可以在实行各种处理后用于反应。作为上述处理，例如有转化体的粉碎处理、冷冻干燥处理、萃取处理等。萃取处理可以采用超声波法、冻融法、溶菌酶法等常用的方法。通过进行上述处理，可以从转化体中取出酰胺酶。所得酰胺酶可以不经纯化直接使用，也可以在纯化后使用。 [0078] 例如，将通过离心分离等从培养液中分离得到的转化体用水等清洗后，使其悬浮于pH值处于酶的稳定区域的缓冲液，在低温(3～18℃、优选3～10℃)下通过弗氏压碎器或超声波等进行处理，将转化体粉碎。然后，通过离心分离等分离除去转化体的碎片，通过常规方法将所得转化体的萃取液用硫酸铵分离，进行透析，得到酰胺酶的粗萃取液。例如通过将该酰胺酶的粗萃取液注入使用了Sephadex G-200等的柱色谱的方法等，可以得到高纯度的酰胺酶。 [0080] 另外，也可以通过聚丙烯酰胺凝胶法等常用的方法，将转化体或酰胺酶固定化后进行使用。 [0081] 作为由3-巯基丙酰胺或其盐生成3-巯基丙酸的反应条件，温 度优选为0℃～50℃，较优选为0℃～40℃。更优选为5℃～35℃。反应pH为3.0～10.0，优选为6.0～ 8.0。调节pH时使用的酸，可以使用盐酸、硫酸、磷酸等无机酸或乙酸等有机酸。反应溶剂可以使用水、甲醇、乙醇等醇类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等脂肪酸酯类；甲苯、二甲苯等芳香族化合物，但特别优选使用水。反应液中的3-巯基丙酰胺的浓度可以优选为1重量％以上，为11重量％以上时工业上是有利的，更优选为13重量％以上。另外，反应液中的3-巯基丙酰胺的浓度可以为50重量％以下，但为17重量％以下时较优选。该段落中所谓反应液，包括下述所有情况：将作为反应基质的3-巯基丙酰胺溶解于反应溶剂而形成的反应液、在反应溶剂中分散而形成的反应液、及与反应溶剂发生相分离而形成的反应液。另外，此处所谓浓度，是指3-巯基丙酰胺全部溶解在反应溶剂中时的浓度，现实情况是3-巯基丙酰胺可以完全溶解在反应溶剂中，也可以为不溶解的状态。反应时间通常为10小时～80小时左右。优选在反应时反应液用氮等惰性气体等置换，气相也用惰性气体置换。 [0082] 所得3-巯基丙酸可以通过溶剂萃取进行分离。优选的溶剂为溶解产物的羧基、且不与水混合的合适的极性有机溶剂。上述溶剂的例子可以举出乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、二氯甲烷、甲基乙基酮及甲基异丁基酮等。进而，可以采用通过蒸馏等进行的常用方法来进行分离。本实施方式中，由于所得3-巯基丙酸的纯度高，所以即使不经过复杂的纯化步骤，也可以分离3-巯基丙酸。例如，由于通过在反应液中加入酸可以将3-巯基丙酸和水分离，所以仅通过回收3-巯基丙酸相，也可以得到3-巯基丙酸。另外，3-巯基丙酸相的液量少时，也可以如上所述通过使用极性有机溶剂的溶剂萃取进行分离。此时作为酸，可优选使用盐酸、硫酸、磷酸等无机酸。另外，也可以在大气压下或减压下进行蒸馏将3-巯基丙酸纯化。 [0083] 接下来，对本实施方式的作用效果进行说明。根据此发明，使用酰胺酶，由3-巯基丙酰胺或其盐制造3-巯基丙酸。由此，可以减少副产物，使纯化步骤简化。因此，可以在工业上有效地制造3 -巯基丙酸。 [0084] 作为副产物，已知化学式(5)的化合物。化学式(5)为硫代二丙酸。通过化学方法，无法减少上述副产物。因此，使3-巯基丙酸的纯化步骤复杂。另一方面，如本实施方式所述，通过使用酰胺酶生成3-巯基丙酸，可以使上述副产物的收率为10mol％以下。另外，通过适当选择酰胺酶的种类，可以使其为5mol％以下，较优选为1mol％以下。因此，即使不经过蒸馏操作等复杂的纯化步骤也可以以高纯度得到3-巯基丙酸。需要说明的是，上述副产物的收率通过下式(7)求出。 [0085] [0086] 副产物的收率(％)＝[(硫代二丙酸的物质量(mol)/加入的3-巯基丙酰胺的物质量(mol)]×100 (7) [0087] (第2实施方式) [0088] 本实施方式涉及下述方法：使用腈水合酶，由通式(3)表示的3-巯基丙腈衍生物(通式(3)中，Z为H、1价、2价或3价阳离子。)制造通式(1)表示的3-巯基丙酰胺衍生物，制造3-巯基丙酸。本实施方式中，n为1～3，n＝1时，通式(3)中，Z为氢、1价阳离子，通式(3)中n＝2时，Z为2价阳离子，n＝3时，Z为3价阳离子。具体而言作为1价+ + + +阳离子，例如可以使用碱金属离子、或铵离子，作为碱金属离子，可以举出Li、Na、K、Rb、+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Cs。作为2价阳离子，可以举出Be 、Mg 、或Ca 、Sr 、Ba 、Ra 碱土金属离子。作为3价 3+ 阳离子，可以举出Al 。另外，通式(1)中，X为与通式(3)的Z相对应的氢或阳离子。通式(2)中，Y为氢，也可以形成具有与通式(3)的Z相对应的反荷离子的羧酸盐或硫醇盐。 [0089] 本实施方式的反应式的一个例子如下述反应式(8)所示。反应式(8)表示使用3-巯基丙酸腈或其盐制造3-巯基丙酸的方法的 例子。反应式(8)中X为1价阳离子时较理想。 [0090] [0091] 所谓腈水合酶，是指作用于腈化合物的腈基、使腈基水解形成酰胺基的酶。本实施方式中使用的腈水合酶，只要能够有效地水解3-巯基丙腈即可，可以为微生物、植物、霉菌、动物、昆虫等任何起源的腈水合酶。 [0092] 作为已知产生腈水合酶的微生物，例如可以举出属于下述菌属的微生物：棒状杆菌(Corynebacterium)属、诺卡氏菌(Nocardia)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、无芽胞杆菌(Bacteridium)属、短杆菌(Brevibacterium)属、微球菌(Micrococcus)属、红球菌(Rhodococcus)属、气单胞菌(Aeromonas)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、欧文氏菌(Erwinia)属、肠杆菌(Enterobacter)属、链霉菌(Streptomyces)属、根瘤菌(Rhizobium)属、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属等。 [0093] 作为能够更有效地水解的腈水合酶，优选使用来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶。来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亚单位的氨基酸序列及DNA序列如序列表的序列号3、5所示，β亚单位的氨基酸序列及DNA序列如序列表的序列号4、6所示。 [0094] 另外，上述腈水合酶的氨基酸序列的一部分经取代、插入、缺失而得到的序列，只要保持作为腈水合酶的酶活性，也可以进行使用。例如由序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位构成的腈水合酶中，可以使用具有腈水合酶活性的腈水合酶突变体。 [0095] 具体而言，可以使用包含选自下述氨基酸取代中的至少1种氨基酸取代、且具有腈水合酶活性的腈水合酶突变体： [0096] (aa)α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr [0097] (ab)α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及α亚单位的第204位的Val取代为Arg [0098] (ac)β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及β亚单位的第108位的Glu取代为Asp [0099] (ad)β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及β亚单位的第200位的Ala取代为Glu [0100] (ae)β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及β亚单位的第186位的Leu取代为Arg [0101] (af)α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、及α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr [0102] (ag)α亚单位的第19位的Ala取代为Val、及α亚单位的第71位的Arg取代为His、及α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr [0103] (ah)α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及α亚单位的第204位的Val取代为Arg [0104] (ai)β亚单位的第10位的Thr取代为Asp、及β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及β亚单位的第200位的Ala取代为Glu [0105] (aj)β亚单位的第37位的Phe取代为Leu、及β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及β亚单位的第200位的Ala取代为Glu [0106] (ak)β亚单位的第37位的Phe取代为Val、及β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及β亚单位的第200位的Ala取代为Glu [0107] (al)β亚单位的第41位的Phe取代为Ile、及β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及β亚单位的第108位的Glu取代为Asp [0108] (am)β亚单位的第46位的Met取代为Lys、及β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr [0109] (an)β亚单位的第48位的Leu取代为Val、及β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr [0110] (ao)β亚单位的第127位的Leu取代为Ser、及β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及β亚单位的第186位的Leu取代为Arg [0111] (ap)α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、及α亚单位的第19 位的Ala取代为Val、及α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、及β亚单位的第46位的Met取代为Lys、及β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr [0112] (aq)α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、及α亚单位的第19位的Ala取代为Val、及α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、及β亚单位的第48位的Leu取代为Val、及β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr [0113] (ar)α亚单位的第6位的Leu取代为Ala、及α亚单位的第19位的Ala取代为Val、及α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、及β亚单位的第127位的Leu取代为Ser、及β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及β亚单位的第186位的Leu取代为Arg [0114] (as)α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、及α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、及β亚单位的第10位的Thr取代为Asp、及β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及β亚单位的第200位的Ala取代为Glu [0115] (at)α亚单位的第19位的Ala取代为Val、及α亚单位的第71位的Arg取代为His、及α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、及β亚单位的第37位的Phe取代为Leu、及β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及β亚单位的第200位的Ala取代为Glu [0116] (au)α亚单位的第19位的Ala取代为Val、及α亚单位的第71位的Arg取代为His、及α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、及β亚单位的第37位的Phe取代为Val、及β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及β亚单位的第200位的Ala取代为Glu [0117] (av)α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及α亚单位的第204位的Val取代为Arg、及β亚单位的第41位的Phe取代为Ile、及β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及β亚单位的第108位的Glu取代为Asp [0118] (aw)α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及α亚单位的第204位的Val取代为Arg、及β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、 及β亚单位的第200位的Ala取代为Glu [0119] (ax)α亚单位的第36位的Thr取代为Gly、及α亚单位的第188位的Thr取代为Gly [0120] (ay)α亚单位的第36位的Thr取代为Ala、及α亚单位的第48位的Asn取代为Gln [0121] (az)α亚单位的第48位的Asn取代为Glu、及β亚单位的第146位的Arg取代为Gly [0122] (ba)α亚单位的第36位的Thr取代为Trp、及β亚单位的第176位的Tyr取代为Cys [0123] (bb)β亚单位的第176位的Tyr取代为Met、及β亚单位的第217位的Asp取代为Gly [0124] (bc)α亚单位的第36位的Thr取代为Ser、及β亚单位的第33位的Ala取代为Val [0125] (bd)β亚单位的第176位的Tyr取代为Ala、及β亚单位的第217位的Asp取代为Val [0126] (be)β亚单位的第40位的Thr取代为Val、及β亚单位的第218位的Cys取代为Met [0127] (bf)β亚单位的第33位的Ala取代为Met、及β亚单位的第176位的Tyr取代为Thr [0128] (bg)β亚单位的第40位的Thr取代为Leu、及β亚单位的第217位的Asp取代为Leu [0129] (bh)β亚单位的第40位的Thr取代为Ile、及β亚单位的第61位的Ala取代为Val [0130] (bi)β亚单位的第61位的Ala取代为Thr、及β亚单位的第218位的Cys取代为Ser [0131] (bj)β亚单位的第112位的Lys取代为Val、及β亚单位的第217位的Asp取代为Met [0132] (bk)β亚单位的第61位的Ala取代为Trp、及β亚单位的第217位的Asp取代为His [0133] (bl)β亚单位的第61位的Ala取代为Leu、及β亚单位的第112位的Lys取代为Ile [0134] (bm)β亚单位的第146位的Arg取代为Gly、及β亚单位的第217位的Asp取代为Ser [0135] (bn)β亚单位的第171位的Lys取代为Ala、及β亚单位的第217位的Asp取代为Thr [0136] (bo)β亚单位的第150位的Ala取代为Ser、及β亚单位的第217位的Asp取代为Cys [0137] (bp)β亚单位的第61位的Ala取代为Gly、及β亚单位的第150位的Ala取代为Asn [0138] (bq)β亚单位的第61位的Ala取代为Ser、及β亚单位的第160位的Arg取代为Met [0139] (br)β亚单位的第160位的Arg取代为Cys、及β亚单位的第168位的Thr取代为Glu。 [0140] 本实施方式的腈水合酶中，也可以使用经转化能够产生腈水合酶的转化体。该转化体通过将已在基因数据库GenBank等中注册的编码腈水合酶的基因克隆到表达载体上进行制作。产生上述腈水合酶的转化体可以采用与第1实施方式中说明的产生酰胺酶的转化体同样的方法进行制作。 [0141] 本实施方式中，将3-巯基丙腈或其盐转化为3-巯基丙酰胺或其盐的反应(以下记作第一反应)、和将3-巯基丙酰胺转化为3-巯基丙酸的反应(以下记作第二反应)可以采用下述方法进行：第一反应和第二反应分别进行的方法或同时进行的方法；或在第一反应结束后分离·纯化3-巯基丙酰胺进行第二反应的方法等。 [0142] 上述方法中，第一反应和第二反应可以分别进行，也可以在3-巯基丙腈中同时添加腈水合酶及酰胺酶，在单罐中制造3-巯基丙酸。此处所谓“单罐”，是指在同一反应容器进行几个反应，具体而言为反应式(8)所示的第一反应及第二反应。 [0143] 3-巯基丙腈有时也会通过酶变为催化剂毒物。例如专利文献5 中公开了如下内容：β-取代丙腈通常为生物毒性强的化合物；在酶法中使用0.5～10wt％的β-取代丙腈；由于基质的毒性，所以优选控制基质浓度。因此，为了工业上进行制备，使用对3-巯基丙腈的稳定性高的酶是有利的，其原因在于其能够提高反应收率且减少酶使用量。通过使用对3-巯基丙腈的稳定性高的腈水合酶及酰胺酶，可以同时进行第一反应和第二反应。作为对3-巯基丙腈的稳定性高的腈水合酶及酰胺酶，可以举出来自假诺卡氏菌属的细菌的腈水合酶、及被称作AS家族的一组酰胺酶。 [0144] 另外，为了避免3-巯基丙腈的催化剂毒物，也可以使第一反应结束，然后再进行第二反应。作为对3-巯基丙腈的稳定性高的腈水合酶，可以举出来自假诺卡氏菌属的细菌的腈水合酶。酰胺酶的添加也可以在第一反应完全结束后进行或在第一反应中在3-巯基丙腈减少至不抑制第二反应的程度后进行。 [0145] 作为第二反应中使用的酰胺酶，可以使用酰胺酶的活性中心为赖氨酸、丝氨酸、丝氨酸的被称作AS家族的一组酰胺酶。更具体而言，可以举出恶臭假单胞菌NBRC12668、嗜热假诺卡氏菌JCM3095、绿叶假单胞菌B23、隐藏嗜酸菌JF-5的酰胺酶。较优选为来自恶臭假单胞菌NBRC12668、嗜热假诺卡氏菌JCM3095的酰胺酶。3-巯基丙腈的生成反应中产生的副产物有时会降低酰胺酶的活性。但是，来自恶臭假单胞菌NBRC12668的酰胺酶在反应式(8)所示的反应体系内活性不易降低。因此，可以在简化或省略3-巯基丙腈的纯化步骤的同时进行反应式(8)所示的反应。需要说明的是，来自恶臭假单胞菌NBRC12668的酰胺酶的氨基酸序列及DNA序列分别示于序列表的序列号1、2。 [0146] 作为第一反应条件，温度优选为0℃～50℃，较优选为0℃～40℃。反应pH为3.0～10.0，优选为6.0～8.0。调节pH时使用的酸可以使用盐酸、硫酸、磷酸等无机酸或乙酸等有机酸。反应溶剂可以使用水、甲醇、乙醇等醇类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等脂肪酸酯类；甲苯、二甲苯等芳香族化合物，但特别优选使用水。反应液中的3 -巯基丙腈的浓度可以优选为1重量％以上，为11重量％以上时在工业上较为有利，更优选为13重量％以上。 另外，反应液中的3-巯基丙腈的浓度可以为50重量％以下，较优选为17重量％以下。该段落中所谓反应液，包括下述所有情况：作为反应基质的3-巯基丙腈溶解于反应溶剂而形成的反应液、在反应溶剂中分散而形成的反应液、及与反应溶剂发生相分离而形成的反应液。另外，此处所谓浓度，是指将3-巯基丙腈完全溶解在反应溶剂中时的浓度，现实情况是3-巯基丙腈可以完全溶解在反应溶剂中，也可以为不溶解的状态。反应时间通常为1小时～80小时左右。 [0147] 作为在单罐中同时进行第一反应和第二反应时的反应条件，温度优选为0℃～50℃，较优选为0℃～40℃。更优选为15℃～30℃。反应pH为3.0～10.0，优选为6.0～ 8.0。调节pH时使用的酸可以使用盐酸、硫酸、磷酸等无机酸或乙酸等有机酸。反应溶剂可以使用水、甲醇、乙醇等醇类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等脂肪酸酯类；甲苯、二甲苯等芳香族化合物，但特别优选使用水。反应液中的3-巯基丙腈的浓度可以优选为1重量％以上，为11重量％以上时在工业上较有利，更优选为13重量％以上。另外，反应液中的3-巯基丙腈的浓度可以为50重量％以下，较优选为17重量％以下。该段落中所谓反应液，包括下述所有情况：作为反应基质的3-巯基丙腈及反应中间体3-巯基丙酰胺溶解于反应溶剂而形成的反应液、在反应溶剂中分散而形成的反应液、及与反应溶剂发生相分离而形成的反应液。另外，此处所谓浓度，是指3-巯基丙腈完全溶解在反应溶剂中时的浓度，现实情况是3-巯基丙腈可以完全溶解在反应溶剂中，也可以为不溶解的状态。反应时间通常为1小时～80小时左右。 [0148] 本实施方式中使用的酰胺酶可以使用与第1实施方式中说明的酰胺酶同样的酰胺酶。另外，3-巯基丙酰胺的反应条件及3-巯基丙酸的分离方法可以使用与第1实施方式中说明的条件或方法同样的条件或方法。 [0149] 本实施方式的方法中，除第1实施方式中说明的作用效果之外， 还具有以下作用效果。即，可以由3-巯基丙腈经历2阶段的酶反应制造3-巯基丙酸。因此，能够在温和的条件下制造3-巯基丙酸，可以进一步降低环境负荷。 [0150] 另外，本实施方式中，所得3-巯基丙酸也可以通过溶剂萃取进行分离。优选的溶剂为溶解产物的羧基、且不与水混合的合适的极性有机溶剂。上述溶剂的例子中，优选乙酸甲酯、乙酸丁酯、甲基异丁基酮、二氯甲烷、甲基乙基酮及甲基异丁基酮等。进而，可以采用通过蒸馏等进行的常用方法来进行分离。本实施方式中，由于所得3-巯基丙酸的纯度高，所以即使不经历蒸馏操作等复杂的纯化步骤也可以分离3-巯基丙酸。例如，通过向反应液中加入酸可以分离3-巯基丙酸和水，因此，可以仅通过回收3-巯基丙酸相即可得到3-巯基丙酸。此时作为酸，可以优选使用盐酸、硫酸、磷酸等无机酸。 [0151] (第3实施方式) [0152] 本实施方式中，使丙烯腈和含有硫原子的化合物反应制造3-巯基丙腈或其盐、及3-巯基丙酰胺或其盐，使用所得3-巯基丙腈及3-巯基丙酰胺或其盐，使酰胺酶及腈水解酶共存从而制造3-巯基丙酸。该反应式如下述反应式(9)所示。 [0153] [0154] 本实施方式中，3-巯基丙腈或其盐可以为与第2实施方式中使用的通式(3)所示的3-巯基丙腈衍生物相同的物质。另外，3-巯基丙酰胺的盐，可以使用与第2实施方式中使用的通式(1)所示的3-巯基丙酰胺衍生物相同的物质。3-巯基丙酸可以以羧酸盐或硫醇盐的形式得到，所述羧酸盐或硫醇盐具有与3-巯基丙腈的盐相对应的反荷离子。 [0155] 含有硫原子的化合物选自下述物质：硫化物、氢硫化物、硫代硫酸、碳原子数1～12的脂肪族硫代羧酸(例如硫代乙酸)、噻吨酮(thioxanthogen)及它们的碱金属盐、碱土金属盐、镁盐或铵盐以及硫脲。作为碱金属盐，特别优选为钠盐或钾盐。作为碱土金属盐，特别优选为钙盐、或钡盐。作为含有硫原子的化合物，特别优选使用氢硫化钠。作为使丙烯腈和含有硫原子的化合物反应制造3-巯基丙腈的碱金属盐的方法，可以采用公知的方法。 [0156] 作为3-巯基丙腈的盐，较优选为1价阳离子。优选在将如上所述制造的3-巯基丙腈用于酶反应之前减少存在于生成反应液中的硫化氢。作为除去硫化氢的方法，通过在中和后进行减压的方法、或利用氮等进行起泡的方法、或者将上述方法组合，可以减少硫化氢。作为硫化氢的浓度，优选为50ppm以下，较优选为20ppm以下。更优选为15ppm以下，是理想的。需要说明的是，硫化氢的浓度可以通过公知的顶空气相色谱法测定。 [0157] 所谓腈水解酶，是指作用于腈化合物的腈基、使腈基水解形成羧基的酶。本实施方式中使用的腈水解酶，只要能够有效地水解3-巯基丙腈即可，可以为微生物、植物、霉菌、动物、昆虫等任何起源的腈水解酶。 [0158] 作为已知产生腈水解酶的微生物，例如可以举出属于下述菌属的微生物：棒状杆菌(Corynebacterium)属、诺卡氏菌(Nocardia)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、无芽胞杆菌(Bacteridium)属、短杆菌(Brevibacterium)属、微球菌(Micrococcus)属、红球菌(Rhodococcus)属、气单胞菌(Aeromonas)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、欧文氏菌(Erwinia)属、肠杆菌(Enterobacter)属、链霉菌(Streptomyces)属、根瘤菌(Rhizobium)属、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属等。 [0159] 腈水解酶也可以作为试剂购买到，也可以利用上述物质中能够有效地水解3-巯基丙腈的腈水解酶。例如也可以使用购自 BioCatalytics公司的、起源不同的12种腈水解酶(产品编号NIT-12000)。 [0160] 本实施方式的腈水合酶中，也可以使用经转化能够产生腈水合酶的转化体。该转化体可以通过将已在基因数据库GenBank等中注册的编码腈水合酶的基因克隆到表达载体上进行制作。产生上述腈水合酶的转化体可以采用与第1实施方式中说明的产生酰胺酶的转化体同样的方法进行制作。 [0161] 3-巯基丙腈的反应条件可以采用与第2实施方式中说明的条件同样的条件。3-巯基丙酰胺的反应条件可以采用第1实施方式中说明的条件。 [0162] 由丙烯腈和含有硫原子的化合物得到的3-巯基丙腈及3-巯基丙酰胺可以进行分离，分别在不同的反应容器中使其反应。 [0163] 另外，由丙烯腈和含有硫原子的化合物得到的3-巯基丙腈及3-巯基丙酰胺也可以不经分离而在混合状态下直接添加腈水解酶及酰胺酶使其反应。 [0164] 另外，由丙烯腈和含有硫原子的化合物得到的3-巯基丙腈及3-巯基丙酰胺不分离、于混合状态下直接添加腈水解酶及酰胺酶使其反应的情况下，也可以与腈水解酶及酰胺酶一同添加第2实施方式中使用的腈水合酶。上述情况下的反应条件如下：温度优选为0℃～50℃，较优选为0℃～40℃。反应pH为3.0～10.0，优选为6.0～8.0。调节pH时使用的酸可以使用盐酸、硫酸、磷酸等无机酸或乙酸等有机酸。反应溶剂可以使用水、甲醇、乙醇等醇类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等脂肪酸酯类；甲苯、二甲苯等芳香族化合物，但特别优选使用水。反应液中的3-巯基丙腈的浓度可以优选为1重量％以上，为11重量％以上时在工业上较为有利，更优选为13重量％以上。另外，3-巯基丙腈的浓度可以为50重量％以下，较优选为17重量％以下。此处所谓浓度，是指3-巯基丙腈完全溶解在反应溶剂中时的浓度，现实情况是3-巯基丙腈可以完全溶解在反应溶剂中，也可以为不溶解的状态。反应时间通常为1小时～80小时左右。 [0165] 制造由丙烯腈和含有硫原子的化合物得到的3-巯基丙腈及3-巯基丙酰胺时，部分地生成3，3’-二硫代二丙腈及3，3’-二硫代二丙酰胺。这些二硫醚化合物通过腈水解酶及酰胺酶经过水解生成3，3’-二硫代二丙酸。生成的3，3’-二硫代二丙酸，可以采用在酸性条件下添加锌、铁等金属粉之类的通常公知的还原方法转化为3-巯基丙酸。 [0166] 3-巯基丙酸的分离方法可以采用与第1实施方式中说明的方法同样的方法。 [0167] 本实施方式的方法中，除第1实施方式中说明的作用效果之外，还具有以下作用效果。即，丙烯腈及含有硫原子的化合物的反应中，作为主产物(约80％)得到3-巯基丙腈，另一方面，可作为副产物得到3-巯基丙酰胺(约15％)及3-巯基丙酸。因此，本实施方式中，腈水解酶及酰胺酶作用于丙烯腈及含有硫原子的化合物的反应产物。由此，可以以高收率由丙烯腈得到3-巯基丙酸。 [0168] 另外，如本实施方式所述，与酰胺酶一同使用腈水解酶的情况下，也可以使由硫代二丙酸构成的副产物的收率为10mol％以下。另外，通过适当选择酰胺酶的种类，可以为5mol％以下，较优选为1mol％以下。因此，即使不经过蒸馏操作等复杂的纯化步骤也可以以高纯度得到3-巯基丙酸。需要说明的是，本实施方式中的上述副产物的收率按照下述数学式(10)求出。 [0169] 副产物的收率(％)＝[硫代二丙酸的物质量(mol)/丙烯腈的物质量(mol)]×100 (10) [0170] 需要说明的是，本实施方式中，除酰胺酶及腈水解酶之外，还可以使用腈水合酶。上述情况下，酰胺酶的添加量优选考虑与在丙烯腈和含有硫原子的化合物的反应中生成的 3-巯基丙酰胺反应的量、和与通过腈水合酶的作用而生成的3-巯基丙酰胺反应的量进行调节。腈水合酶对3-巯基丙腈的生成反应中生成的副产物具有耐性。因此，与腈水解酶相比，可以以更少的酶量有效地进行反应。 [0171] (第4实施方式) [0172] 本实施方式中，如第3实施方式中所述，使丙烯腈和含有硫原子的化合物反应制造第2实施方式所示的3-巯基丙腈或其盐、及3-巯基丙酰胺或其盐。通过腈水合酶使腈基发生水解反应，使所得3-巯基丙腈或其盐形成3-巯基丙酰胺或其盐，通过酰胺酶由3-巯基丙酰胺或其盐得到3-巯基丙酸。本实施方式的反应如反应式(11)所示。 [0173] [0174] 本实施方式中，作为3-巯基丙腈或其盐、及3-巯基丙酰胺的盐，也可以使用与第3实施方式同样的物质。另外，也可以以与3-巯基丙腈的盐相对应的羧酸盐或硫醇盐的形式得到3-巯基丙酸。 [0175] 反应式(11)所示的反应也可以在单罐中进行。此处所谓“单罐”，是指在同一反应容器中进行几个反应，具体而言，连续进行下述反应：由丙烯腈及含有硫原子的化合物生成作为主产物的3-巯基丙腈、生成作为副产物的3-巯基丙酰胺的反应；3-巯基丙腈的酰胺化反应；和3-巯基丙酰胺的水解反应。在上述情况下，作为含有硫原子的化合物，可以使用第3实施方式中说明的物质。 [0176] 具体而言，由丙烯腈和含有硫原子的化合物得到的3-巯基丙腈及3-巯基丙酰胺可以进行分离，分别在不同的反应容器中进行反应。 [0177] 另外，由丙烯腈和含有硫原子的化合物得到的3-巯基丙腈及3-巯基丙酰胺也可以不分离、在混合状态下直接添加腈水解酶及酰胺酶进行反应。 [0178] 优选在将3-巯基丙腈用于酶反应之前使存在于生成反应液中的硫化氢减少。作为除去硫化氢的方法，通过在中和后进行减压的方法、利用氮等进行起泡的方法或将上述方法组合，可以降低硫化 氢浓度。作为硫化氢的浓度，优选为50ppm以下，较优选为20ppm以下。更优选为15ppm以下。需要说明的是，硫化氢的浓度可以通过公知的顶空气相色谱法测定。 [0179] 作为腈水合酶，可以使用与第2实施方式中使用的腈水合酶相同的腈水合酶。 [0180] 另外，作为酰胺酶，可以使用与第1实施方式中使用的酰胺酶相同的酰胺酶，但优选使用酰胺酶的活性中心为赖氨酸、丝氨酸、丝氨酸的被称作AS家族的一组酰胺酶作为酰胺酶。更具体而言，可以举出来自恶臭假单胞菌NBRC12668、嗜热假诺卡氏菌JCM3095、绿叶假单胞菌B23、隐藏嗜酸菌JF-5的酰胺酶。较优选使用来自恶臭假单胞菌NBRC12668、嗜热假诺卡氏菌JCM3095的酰胺酶。 [0181] (第5实施方式) [0182] 本实施方式中，使丙烯腈和含有硫原子的化合物反应，制造上述通式(3)所示的3-巯基丙腈或其盐，使用所得3-巯基丙腈或其盐，使腈水合酶及酰胺酶共存，制造上述通式(2)所示的3-巯基丙酸。上述反应式的一个例子如下述反应式(12)所示。需要说明的是，反应式(12)中，硫醇基可以为硫醇盐，羧基可以为羧酸盐。作为反荷阳离子的1价阳离+ + + + + 子，例如可以使用碱金属离子、或铵离子，作为碱金属离子，可以举出Li、Na、K、Rb、Cs。 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 作为2价阳离子，可以举出Be 、Mg 、或Ca 、Sr 、Ba 、Ra 碱土金属离子。作为3价阳离 3+ 子，可以举出Al 。 [0183] [0184] 具体而言，本实施方式中，3-巯基丙腈或其盐可以使用与第2实施方式中使用的通式(3)所示的3-巯基丙腈衍生物相同的物质。3-巯基丙腈或其盐可以通过腈水合酶形成第2实施方式中说明的通式(1)所示的3-巯基丙酰胺衍生物。 [0185] 如第3实施方式所述，通过使丙烯腈和含有硫原子的化合物反应，可以制造3-巯基丙腈或其盐、及3-巯基丙酰胺或其盐。硫醇在分子间发生氧化偶合反应，形成二硫醚键。因此，2分子的3-巯基丙腈通过形成二硫醚键，变为3，3’-二硫代二丙腈(化合物(a))，2分子的3-巯基丙酰胺通过形成二硫醚键，变为3，3’-二硫代二丙酰胺(化合物(d))，1分子的3-巯基丙腈和1分子的3-巯基丙酰胺通过形成二硫醚键，变为3-(2-氰基乙基)二硫基丙酰胺(化合物(b))。 [0186] 化合物(a)通过腈水合酶将腈基水解为酰胺基，转化为化合物(b)及化合物(d)。另外，如第2实施方式所述，3-巯基丙腈通过腈水合酶变为3-巯基丙酰胺，如上所述，在分子间发生氧化偶合反应，变为化合物(d)。 [0187] 另外，化合物(b)及化合物(d)通过用酰胺酶水解酰胺基，形成3-(2-氰基乙基)二硫基丙酸(化合物(c))、3-(2-氨基羰基乙基)二硫基丙酸(e))、及3，3’-二硫代二丙酸(化合 物(f))。 [0188] 另外，3-巯基丙腈和3-巯基丙酸有时也形成二硫醚键得到化合物(c)，3-巯基丙酰胺和3-巯基丙酸有时也形成二硫醚键得到化合物(e)。 [0189] 化合物(c)在腈水合酶作用下形成为化合物(e)，化合物(e)在酰胺酶作用下形成化合物(f)。因此，通过在腈水合酶及酰胺酶共存的条件下使3-巯基丙腈完全反应，除目标3-巯基丙酸之外还可以得到化合物(f)。因此，利用公知方法将制造得到的3，3’-二硫代二丙酸还原，由此转变为3-巯基丙酸。如上所述，本实施方式中，可以省略上述反应式(12)所示的各步骤的中间所进行的纯化，有效地制造3-巯基丙酸。 [0190] 通过公知方法将第3实施方式中说明的丙烯腈及含有硫原子的化合物的反应物氧化，可以制造3，3’-二硫代二丙腈及3，3’-二硫代二丙酰胺。 [0191] 本实施方式中使用的腈水合酶，可以使用第3实施方式中说明的腈水合酶。本实施方式中使用的酰胺酶，可以使用第3实施方式中说明的酰胺酶。 [0192] 3，3’-二硫代二丙腈的反应条件可以采用与第2实施方式中说明的条件同样的条件。3，3’-二硫代二丙酰胺的反应条件可以采用第1实施方式中说明的条件。 [0193] 另外，3，3’-二硫代二丙腈及3，3’-二硫代二丙酰胺可以不分离、直接在混合状态下添加腈水合酶及酰胺酶进行反应。 [0194] 优选在将3，3’-二硫代二丙腈及3，3’-二硫代二丙酰胺用于酶反应之前降低存在于生成反应液中的硫化氢浓度。作为除去硫化氢的方法，通过在中和后进行减压的方法、利用氮等进行起泡的方法或将上述方法组合，可以降低硫化氢浓度。作为硫化氢的浓度，优选为50ppm以下，较优选为20ppm以下。更优选为15ppm以下。需要说明的是，硫化氢的浓度可以通过公知的顶空气相色谱法测定。 [0195] 反应条件如下：温度优选为0℃～50℃，较优选为0℃～40℃。 反应pH为3.0～10.0，优选为6.0～8.0。调节pH时使用的酸可以使用盐酸、硫酸、磷酸等无机酸或乙酸等有机酸。反应溶剂可以使用水、甲醇、乙醇等醇类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等脂肪酸酯类；甲苯、二甲苯等芳香族化合物，但特别优选使用水。反应液中的3，3’-二硫代二丙腈及3，3’-二硫代二丙酰胺的浓度可以优选为1重量％以上，为11重量％以上时在工业上较有利，更优选为13重量％以上。本段落中所谓反应液，包括下述全部情况：作为反应基质的3，3’-二硫代二丙腈或3，3’-二硫代二丙酰胺溶解在反应溶剂中而形成的反应液、分散在反应溶剂中而形成的反应液、与反应溶剂发生相分离而形成的反应液。此处所谓浓度，是指3，3’-二硫代二丙腈及3，3’-二硫代二丙酰胺完全溶解在反应溶剂中时的浓度，现实情况是3，3’-二硫代二丙腈及3，3’-二硫代二丙酰胺可以完全溶解在反应溶剂中，也可以为不溶解的状态。反应时间通常为1小时～80小时左右。 [0196] 生成的3，3’-二硫代二丙酸可以采用在酸性条件下添加锌、铁等金属粉之类的通常已知的还原方法转化为3-巯基丙酸。 [0197] 3-巯基丙酸的分离方法可以采用与第1实施方式中说明的方法同样的方法。 [0198] 以上对本发明的实施方式进行了说明，但上述实施方式是本发明的示例，也可以采用除上述之外的各种构成。 [0199] 例如，也可以使利用实施方式的方法得到的3-巯基丙酸和季戊四醇进行酯化反应制造季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)。上述酯化反应可以采用公知的方法。另外，也可以将如上所述得到的季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)均聚或共聚后进行固化，制成塑料透镜等光学材料。需要说明的是，在本发明中，3-巯基丙酸和β-巯基丙酸为同一化合物，二硫代二丙酸和β，β-二硫代二丙酸、3，3’-二硫代二丙酸为同一化合物。 [0200] 实施例 [0201] <1.酰胺酶产生菌的构筑> [0202] (1)恶臭假单胞菌NBRC12668的酰胺酶产生菌 [0203] 解析日本特开平8-266277号公报记载的质粒pBAN-7的碱基序列，以该质粒所具有的碱基序列为基础，设计序列表的序列号7及8的引物。将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NBRC12668的染色体DNA作为模板，进行PCR，扩增酰胺酶基因。将扩增后的基因用EcoRI及HindIII消化。同样地使用Ligation high(东洋纺制)连接用限制酶消化得到的pUC18(宝酒造制)，将其导入到Competent high DH5α(东洋纺制)中，制作恶臭假单胞菌NBRC12668的酰胺酶产生菌。将该菌记作“Ppu-酰胺酶产生菌”。 [0204] (2)嗜热假诺卡氏菌JCM3095的酰胺酶产生菌 [0205] 解析日本特开平9-275978号公报记载的质粒pPT-B1的碱基序列，以该质粒所具有的碱基序列为基础，设计序列表的序列号9及10的引物。将嗜热假诺卡氏菌JCM3095的染色体DNA作为模板进行PCR，扩增酰胺酶基因。将扩增后的基因用EcoRI和HindIII消化。同样地使用Ligation high(东洋纺制)连接用限制酶消化得到的pUC18(宝酒造制)，将其导入到Competent high DH5α(东洋纺制)中，制作嗜热假诺卡氏菌JCM3095的酰胺酶产生菌。将该菌记作“Pth-酰胺酶产生菌”。 [0206] (3)绿叶假单胞菌B23的酰胺酶产生菌 [0207] 基于已在NCIBM(美国国立生物工程学信息中心)中注册的绿叶假单胞菌B23的酰胺酶基因信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/216850？ordinalpos＝1&itool＝EntrezSystem2.PEntrez.Sequence.Sequence-ResultsPanel.Sequence-RVDocSum)，合成DNA。DNA的合成根据Nucleic Acids Res.2004Jul 1；32(Web Server issue)：W176-80.的方法进行。将合成得到的DNA作为模板，使用序列表的序列号11及12的引物，扩增在酰胺酶基因上加入SD序列的DNA，用限制酶EcoRI及HindIII消化。同样地使用Ligation high(东洋纺制)连接用限制酶消化得到的 pUC18(宝酒造制)，将其导入到Competent highDH5α(东洋纺制)中，制作绿叶假单胞菌B23的酰胺酶产生菌。将该菌记作“Pch-酰胺酶产生菌”。 [0208] (4)Polaromonas sp.JS666的酰胺酶产生菌 [0209] 从ATCC(美国典型培养物保藏中心)购入Polaromonas sp.JS666的染色体DNA即ATCC-BAA-500D-5。基于已在NCIBM(美国国立生物技术信息中心)注册的Polaromonas sp.JS666的 酰 胺 酶 基 因 信 息 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/91785913、GeneID：4010994)，以序列表的序列号13及14作为引物，将ATCC-BAA-500D-5作为模板，扩增酰胺酶基因。将扩增后的酰胺酶基因用EcoRI和HindIII消化。同样地使用Ligation high(东洋纺制)连接用限制酶消化得到的pUC18(宝酒造制)，将其导入到Competent highDH5α(东洋纺制)中，制作酰胺酶产生菌。将该菌记作“Psp-酰胺酶产生菌”。 [0210] (6)Acidphilium cryptum JF-5的酰胺酶产生菌 [0211] 从NBRC(独立行政法人制品评价技术基础机构生物工程本部生物遗传资源部门)购入NBRC-14242。将NBRC-14242在NBRC的培养基编号234中培养，使用DNeasy Blood&Tissue Kit(株式会社QIAGEN)得到染色体DNA。基于已在NCIBM(美国国立生物工程学信息中心)中注册的酰胺酶基因信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/148259021、GI：148259263)，以序列表的序列号15及16作为引物，将培养NBRC-14242所得的染色体DNA作为模板，扩增酰胺酶基因。将扩增后的酰胺酶基因用EcoRI和HindIII消化。同样地使用Ligation high(东洋纺)连接用限制酶消化得到的pUC18(宝酒造制)，将其导入到Competent highDH5α(东洋纺制)中，制作酰胺酶产生菌。将该菌记作“Acr-酰胺酶产生菌”。 [0212] <2.酰胺酶产生菌的培养> [0213] 在500ml带挡板的锥形瓶中配制100ml的LB液体培养基，通过 高压釜在121℃下进行灭菌20分钟。向该培养基中添加氨苄西林使其终浓度为100μg/ml后，将制作得到的酰胺酶产生菌分别植菌1铂环量，在30℃且130rpm的条件下，培养约20小时。通过离心分离(5000G×15分钟)，仅将菌体从培养液中分离，然后，将该菌体再次悬浮于5ml的生理盐水中，分别得到菌体混悬液。菌体混悬液在冷库中冷冻、解冻后进行使用。 [0214] <3-1.嗜热假诺卡氏菌JCM3095·腈水合酶产生菌的构筑和培养> [0215] 在500ml带挡板的锥形瓶中配制含有40μg/ml硫酸铁·七水合物及10μg/ml氯化钴·二水合物的LB液体培养基100ml，通过在121℃下用高压釜处理20分钟，进行灭菌。向该培养基中添加氨苄西林使其终浓度为100μg/ml后，植菌1铂环量的保藏微生物(FERM BP-5785、在茨城县筑波市东1-1-1独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、于1996年2月7日进行保藏)，在37℃且130rpm的条件下，培养约20小时。通过离心分离(5000G×15分钟)仅将菌体从培养液中分离，然后，将该菌体再次混悬于5ml的生理盐水，得到菌体混悬液。将菌体混悬液在冷库中冷冻、解冻后进行使用。将该菌记作“Pth-腈水合酶产生菌”。 [0216] <3-2.恶臭假单胞菌NBRC12668·腈水合酶产生菌的构筑和培养 [0217] 将上述1.酰胺酶产生菌的构筑(1)恶臭假单胞菌NBRC12668的酰胺酶产生菌中使用的染色体DNA作为模板，将序列表的序列号17(GTGAATTCACAAAAAGGATAAAACAATGACGGCAACTTCAACCCC)及序列表的序列号18(TCGAAGCTTTTAGAAAATGGCATCAGCCG)作为引物，进行PCR，扩增腈水合酶基因。将扩增得到的腈水合酶基因用EcoRI和HindIII消化。同样地使用Ligation high(东洋纺制)连接用限制酶消化得到的pUC18(宝酒造制)，将其导入到Competent high DH5α(东洋纺制)中，制作恶臭假单胞菌NBRC12668的腈水合酶产生菌。将该菌记作“Ppu-腈水合 酶产生菌”。 [0218] 在500ml带挡板的锥形瓶中配制含有40μg/ml硫酸铁·七水合物的LB液体培养基100ml，通过高压釜在121℃下处理20分钟，进行灭菌。向该培养基中添加氨苄西林使其终浓度为100μg/ml后，植菌1铂环量的Ppu-腈水合酶产生菌，在37℃且130rpm的条件下培养约20小时。通过离心分离(5000G×15分钟)仅将菌体从培养液中分离，然后，将该菌体再次混悬于5ml的生理盐水，得到菌体混悬液。将菌体混悬液在冷库中冷冻、解冻后进行使用。 [0219] <4.巯基丙腈的合成> [0220] 实施例1～4、7-27、32、及比较例中使用的3-巯基丙腈如下所述地进行合成。向48.1g(0.6mol)70％氢硫化钠中加入43.5g水，溶解后，一边保持在40℃一边经30～60分钟滴入26.5g(0.5mol)丙烯腈。接着，保持在40℃，同时再搅拌10小时。然后，向所得反应母料(reaction mass)中加入70g左右的47％硫酸水，确认反应液的pH为2.0以下后，用 50g氯仿萃取2次。合并有机层，在减压下浓缩，将残液在45～48℃/3Torr下进行减压蒸馏，得到40.3g纯度99.8％的3-巯基丙腈。 [0221] <5.分析法(1)> [0222] 对于实施例1～29、比较例，通过高效液相色谱法(HPLC)对3-巯基丙酸、3-巯基丙酰胺、硫代二丙酸及二硫代二丙酸进行定量。3-巯基丙酸的收率通过数学式(13)算出。 [0223] 柱；Mightysil RP-18 GP 250-6.0(5μm)(关东化学株式会社制) [0224] 柱温度；40℃ [0225] 泵流速；1.0ml/分钟 [0226] 检测；UV225nm、 [0227] 洗脱液；0.01M KH2PO4水∶乙腈(AN)＝1600∶400(V/V)(磷酸pH3.0) [0228] 3-巯基丙酸的收率(％)＝(3-巯基丙酸的物质量(mol)/ 投入的3-巯基丙酰胺的物质量(mol))×100(13) [0229] <6.3，3’-二硫代二丙腈的合成> [0230] 实施例36～38中使用的3，3’-二硫代二丙腈如下所述地进行合成。向3-巯基丙腈(18.39g、0.21mol)中加入水(23.00g)，冷却至5℃。一边将反应液的温度保持在5～25℃一边经1小时滴入0.5mol/L碘溶液(225.4ml、0.11mol)，然后，在25℃下熟化2小时。 过滤反应混合物的固体后，用水(1800ml)清洗，得到粗品3，3’-二硫代二丙腈(湿体)。 将其在室温下干燥一晚。接着，将粗品3，3’-二硫代二丙腈用正己烷(300ml)及正己烷/甲苯(体积比：2/1)混合液(300ml)分别进行洗涤，每1次1小时，然后过滤，进行己烷清洗(500ml)，得到3，3’-二硫代二丙腈(湿体)。接着，使其溶解在甲苯(650ml)中，进行柱过滤(硅胶C-300、100ml)，得到3，3’-二硫代二丙腈的甲苯溶液。通过蒸发仪将甲苯减压除去，将浓缩物滴入己烷(500ml)，使其再次沉淀。过滤结晶，进行己烷清洗(250ml)，得到3，3’-二硫代二丙腈(湿品，10.2g)。将其再次溶解于甲苯(650ml)，进行柱过滤(硅胶C-300、100ml)。通过蒸发仪将甲苯减压除去，将浓缩物滴入己烷(500ml)，使其再次沉淀。 过滤结晶，进行己烷清洗(250ml)，在干燥器内、于室温下进行减压干燥，得到3，3’-二硫代二丙腈(9.0g)。 [0231] <7.分析法(2)> [0232] 实施例30～40中，通过HPLC对3-巯基丙腈、3-巯基丙酰胺、3-巯基丙酸、3，3’-二硫代二丙腈、3，3’-二硫代二丙酰胺、及3，3’-二硫代二丙酸进行定量。将试样溶解在水/乙腈(8/2)的混合液中，将苄醇作为内标物，通过高效液相色谱法进行测定。 [0233] I.装置DGU-14A、LC-10A、SPD-10A、CTO-10A、SCL-10A [0234] 送液单元：岛津制作所SCL-10A [0235] 检测器： 岛津制作所SPD-10A [0236] 柱温箱： 岛津制作所CTO-10AxL [0237] [0238] II.测定条件 [0239] [0240] III.分析操作 [0241] 在20mL样品瓶中准确地量取约70mg试样及约100mg内标物质苄醇，加入水∶乙腈＝8∶2混合液10mL，混合溶解，制成试样溶液。在上述测定条件下导入2μL该试样溶液，通过所得色谱图求出成分峰面积，算出试样纯度(％)。 [0242] (实施例1) [0243] 将1g 3-巯基丙腈溶解在100mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)100mL中，保持在4℃。加入Pth-腈水合酶产生菌的菌体混悬液1g，搅拌24小时。通过HPLC分析所得混合液，结果，99％的3-巯基丙腈转化为3-巯基丙酰胺。接着，进行反应式(4)的反应。分别添加制作的酰胺酶产生菌的菌体混悬液各1g，在35℃下使其反应。经过规定时间后的3-巯基丙酸的收率示于表1。在所有反应中硫代二丙酸及二硫代二丙酸的收率都为5％以下。 [0244] [表1] [0245] (表1) [0246] [0247] (实施例2) [0248] 进行反应式(8)的反应。在1g的1M磷酸缓冲液(pH7.5)中加入1.5g 3-巯基丙腈，加入蒸馏水使其为9g。接着，加入Pth-腈水合酶产生菌的混悬液1g、Pth-酰胺酶产生菌的混悬液1g，在25℃下搅拌20小时。3-巯基丙酸的收率为99％，二硫代二丙酸的收率为0.5％。 [0249] (实施例3) [0250] 进行反应式(8)的反应。在4.4g 3-巯基丙腈中加入1M磷酸缓冲液(pH7.5)1g。加入蒸馏水，使3-巯基丙腈的终浓度为13重量％、15重量％、17重量％，加入制作的Pth-腈水合酶产生菌的混悬液1g及Ppu-酰胺酶产生菌的混悬液1g，在20℃下搅拌20小时。3-巯基丙酸的收率的结果示于表2。 [0251] [表2] [0252] (表2) [0253]3-巯基丙腈的浓度(重量％) 收率(％) 13 98 15 97 17 96 [0254] (实施例4) [0255] 在1M磷酸缓冲液(pH7.5)1g中加入0.1g 3-巯基丙腈，加入9g蒸馏水。接着，添加试剂腈水解酶(BioCatalytics公司、产品编号NIT-12000、NIT-1、2、3、4、5、7、8、9、10、11)各0.1g， 在25℃下搅拌20小时。分析反应液，3-巯基丙酸的收率的结果示于表3。在所有反应中硫代二丙酸及二硫代二丙酸的收率都为5％以下。 [0256] [表3] [0257] (表3) [0258]腈水解酶 收率(％) NIT-1 ＞99 NIT-2 ＞99 NIT-3 ＞99 NIT-4 ＞99 NIT-5 ＞99 NIT-7 ＞99 NIT-8 ＞99 NIT-9 ＞99 NIT-10 ＞99 NIT-11 ＞99 [0259] (比较例) [0260] 对于反应式(11)的反应，不使用腈水合酶及酰胺酶，通过化学方法进行3-巯基丙腈的酰胺化反应及3-巯基丙酰胺的水解反应。向187.1g氢硫化钠中加入174.2g蒸馏水，加热到35℃。加入106.1g丙烯腈，经10小时合成3-巯基丙腈。在472.6g反应液中添加46.64重量％的氢氧化钠溶液257.3g，在60℃下进行水解反应10小时。然后，冷却至室温，加入硫酸使pH为1.8，利用氯仿进行萃取。萃取液的组成示于表4。需要说明的是，生成量表示为各产物的物质量(mol)相对于丙烯腈的物质量(mol)的百分率。 [0261] [表4] [0262] (表4) [0263]产物 生成量(摩尔％) 3-巯基丙腈 ＜0 3-巯基丙酸 68 3-巯基丙酰胺 ＜0 硫代二丙酸 15 二硫代丙酸 5 [0264] (实施例5) [0265] 进行反应式(11)的反应。在70w/w％氢硫化钠(和光纯药制)48.1g(0.6mol)中加入43.5g水，使其溶解后，一边保持在40℃一边经30～60分钟滴入丙烯腈26.5g(0.5mol)。接着，在保持40℃的状态下，再继续搅拌10小时。然后，一边向所得反应母料中加入47w/v％硫酸水一边将反应液pH调节为6.5～7.5，得到3-巯基丙腈、3-巯基丙酰胺及3-巯基丙酸的混合物。所得混合物的组成示于表5。需要说明的是，表5给出各成分相对于投入的丙烯腈的摩尔％。向上述混合物中加入蒸馏水，使用硫酸及氢氧化钠调节pH为7.0。加入蒸馏水，使3-巯基丙腈的浓度为13重量％，加入Pth-腈水合酶产生菌的混悬液1g，在 4℃下搅拌24小时。然后，将反应液加热至35℃，加入Ppu-酰胺酶产生菌的混悬液1g，搅拌24小时。结果，表5所示的相对于3-巯基丙腈和3-巯基丙酰胺的总量、3-巯基丙酸的收率为98％。 [0266] [表5] [0267] (表5) [0268]成分名称 组成(摩尔％/丙烯腈) 3-巯基丙腈 88 3-巯基丙酸 2 3-巯基丙酰胺 6 硫代二丙酸 3 二硫代丙酸 ＜0 [0269] (实施例6) [0270] 实施例5中，使用Pch-酰胺酶产生菌的混悬液代替Ppu-酰胺酶产生菌的混悬液进行同样的操作。结果，以收率10％得到3-巯基丙酸。 [0271] (实施例7)利用高浓度3-巯基丙酰胺的制造 [0272] 进行反应式(8)的反应。向4.4g 3-巯基丙腈中加入1M磷酸缓冲液(pH7.5)1g。加入蒸馏水使3-巯基丙腈的终浓度为15重量％，加入制作得到的Pth腈水合酶产生菌的混悬液1g，在30℃下反应20小时。3-巯基丙腈的99％以上转化为3-巯基丙酰胺。接着， 加入酰胺酶产生菌的混悬液1g，搅拌20小时。3-巯基丙酸的收率的结果示于表6。使用的菌体混悬液的电泳图示于图1。图1中箭头所示的谱带的深浅表示反应中使用的酶的表达量。A为Psp-酰胺酶。B为Acr-酰胺酶，C为Ppu-酰胺酶，D为Pch-酰胺酶。 [0273] [表6] [0274] (表6) [0275]反应收率(％) Acr-酰胺酶 ＞99 Ppu-酰胺酶 ＞99 Pch-酰胺酶 ＞99 Psp-酰胺酶 52 [0276] (实施例8)利用突变型酰胺酶的反应(1) [0277] 将pUC 18作为模板，所述pUC18含有编码序列表的序列号2的基因，使用序列表的序列号19及20的引物，利用快速变换法(Quick change method)，制作编码下述突变体的基因，所述突变体是将序列表的序列号1的氨基酸序列中第51位的Ile变换为Thr。快速变换法按照Stratagene公司的报告书进行。使用通过上述操作制作的质粒进行大肠杆菌DH5α细胞的转化。与实施例1中使用的酰胺酶产生菌的培养同样地得到突变型酰胺酶产生菌。使用突变型酰胺酶进行实施例7的反应。所得3-巯基丙酸的收率为99％，二硫代二丙酸的收率为0.5％。 [0278] (实施例9～27)利用突变型酰胺酶的反应(2) [0279] 将pUC 18作为模板，所述pUC18含有编码序列表的序列号2的基因，使用表7所示的序列号的引物，利用快速变换法，制作编码下述突变体的基因，所述突变体是在序列表的序列号1的氨基酸序列中如表7所示进行氨基酸变换得到的。除此之外，与实施例8同样地进行。在所有突变型酰胺酶中，3-巯基丙酸的收率均为99％，二硫代二丙酸的收率均为0.5％。 [0280] [表7] [0281] (表7) [0282] [0283] (实施例28) [0284] 向实施例5中得到的3-巯基丙腈、3-巯基丙酰胺及3-巯基丙酸的混合物中加入蒸馏水，使用硫酸及氢氧化钠，调节pH至7.0。向添加有蒸馏水使3-巯基丙腈的浓度为1.0重量％的反应液5g中加入Pth-腈水合酶产生菌的混悬液或Ppu-腈水合酶产生菌的混悬液0.1g，在30℃下搅拌2小时。所有反应均获得如下结果，即，3-巯基丙腈的99％以上被水解为3-巯基丙酰胺。 [0285] (实施例29) [0286] 向46.42w/v％氢硫化钠溶液(144.92g、1.2mol)中加入水(36.12g)，一边保持在40℃一边经1小时向其中滴入丙烯腈(53.06g、1.0mol)，然后在40℃下熟化10小时。接下来，一边将反应混合物的温度保持在25～30℃，一边经2小时滴入47w/v％硫酸(125.3g、 0.3mol)(pH14→pH6.5～7)，然后在25～30℃下熟 化1小时。该反应混合液中的硫化氢浓度采用利用顶空气相色谱法的方法进行分析。熟化后的反应混合液中的硫化氢浓度为 8000ppm。在减压下除去反应混合物内的硫化氢(25～30℃、6.7kPa(50torr)、3小时)，直至该反应混合液中的硫化氢浓度为15ppm。在滴入硫酸时、熟化时、减压脱气时释放到反应体系外的硫化氢气体用碱性捕集器(caustic trap)捕集。接着，通过倾析从分离成2层的反应混合物中获得上层部的粗品3-巯基丙腈(75.6g)和下层部分水层(270.0g)。以重量比率(75.6∶270)使用上述获得的粗品3-巯基丙腈和水层。向所得3-巯基丙腈、3-巯基丙酰胺及3-巯基丙酸的混合物中加入蒸馏水，使用硫酸及氢氧化钠，调节pH为7.0。向 5g反应液中加入Pth-腈水合酶产生菌的混悬液1g或2g，进行调节使3-巯基丙腈的浓度为13重量％，从10℃至30℃下搅拌24小时。同样地加入Ppu-腈水合酶产生菌的混悬液，进行反应。结果示于表8。 [0287] [表8] [0288] (表8) [0289] [0290] (实施例30)利用突变型腈水合酶的反应 [0291] [实施例30-(1)]改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)的获得[0292] 通过PCR反应，得到约0.7Kbp的基因片段，所述PCR反应以日本特开平9-275978号公报的实施例3记载的质粒pPT-DB1作为模板，使用序列表的序列号：59及60记载的引物。利用限制酶EcoRI及NotI对上述PCR片段进行切割，然后对该限制酶处理液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，对该DNA片段进行纯化。同样地利用EcoRI及NotI切割pPT-DB1，进行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖 凝胶中仅切下约3.9Kbp的DNA片段。使用DNA连接试剂盒(宝酒造株式会社制)连接如上所述得到的约0.7kbp和约3.9Kbp的DNA片段，制作上述核糖体结合序列被改变的腈水合酶表达质粒(1)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(1)。另外，利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在pPT-DB1中具有表9所示的被改变的核糖体结合序列。 [0293] [表9] [0294] (表9) [0295] [0296] [实施例30-(2)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(2) [0297] 如表10所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(2)，以日本特开2004-194588号公报的实施例79记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(2)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(2)。 [0298] [实施例30-(3)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(3) [0299] 如表10所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(3)，使用宝酒造株式会社制的“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”(以下称作诱变试剂盒)进行位点定向诱变(Site-Directed Mutagenesis)。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作 为模板进行PCR反应。 [0300] PCR反应No.1如下进行：在含有序列表的序列号：61记载的引物及M13引物M4(于序列表的序列号：62中记载序列)各50pmol的总量为50μL的体系(组成根据诱变试剂盒中记载的条件而不同)中，将热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、延长反应(72℃)120秒的条件重复25个循环。 [0301] PCR反应No.2如下进行：在含有MUT4引物(于序列表的序列号：63中记载序列)及M13引物RV(于序列表的序列号：64中记载序列)各50pmol的总量为50μL的体系(组成根据诱变试剂盒中记载的条件而不同)中，进行与PCR反应No.1相同的操作。 [0302] 通过使用了PCR反应No.1及No.2的反应结束液各5μL的琼脂糖电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)，对DNA扩增产物进行分析，结果可以确认存在扩增DNA产物。使用Microcon 100(宝酒造株式会社制)从各PCR反应结束液中除去过量的引物及dNTP后，加入10mM Tris-盐酸·1mM EDTA缓冲液(pH8.0)(以下简称作TE溶液)，分别配制50μL的溶液。配制含有该TE溶液各0.5μL的总量为47.5μL的退火溶液(组成根据诱变试剂盒中记载的条件而不同)，进行10分钟的热变性处理(98℃)，之后以一定的速度经60分钟冷却至37℃，接着在37℃下保持15分钟，由此进行退火处理 [0304] 在其中加入M13引物M4(于序列表的序列号：62中记载序列)及M13引物RV(于序列表的序列号：64中记载序列)各50pmol，使总量为50μL，之后将热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、延长反应(72℃)120秒的条件重复25个循环，由此进行PCR反应No.3。使用PCR反应No.3的反应结束液5μL，利用琼脂糖电泳(使用Sigma公司制VII型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.8重量％)进行DNA扩增产物的分析，结果可以确认存在约2kb的扩增DNA产物。 [0305] 接着，从琼脂糖凝胶中仅切下约2Kb的DNA片段，将该琼脂糖片(约0.1g)细微地粉碎并混悬在1mL的TE溶液中，然后在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔融。对该熔融液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀来纯化该DNA片段，最终将其溶解在10μL的TE溶液中。利用限制酶EcoRI及HindIII对经纯化的约2kb的扩增DNA片段进行切割，然后，对该限制酶处理液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，纯化该DNA片段，最终将其溶解在10μL的TE溶液中。 [0306] 同样地利用EcoRI及HindIII对实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)进行切割，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma公司制VII型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中仅切下约2.7Kb的DNA片段。将切下的琼脂糖片(约0.1g)微细地粉碎并混悬在1mL的TE溶液中，然后于55℃下保温1小时，使琼脂糖完全熔融。对该熔融液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，纯化该DNA片段，最终将其溶解在10μL的TE溶液中。 [0307] 使用DNA连接试剂盒(宝酒造株式会社制)将通过上述方式得到的约2Kb和约2.7Kb的DNA片段连接，之后对大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)进行转化。将从该转化体萃取得到的质粒作为模板，使用序列号：65记载的引物代替序列号：61记载的引物实施上述操作，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(3)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(3)。 [0308] [实施例30-(4)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(4) [0309] 如表10所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(4)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作 为模板，使用序列表的序列号66及67记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(4)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(4)。 [0310] [表10] [0311] (表10) [0312] [0313] [实施例30-(5)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(5) [0314] 如表11所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(5)，将从上述实施例30-(2)记载的转化体(2)回收得到的质粒(2)作为模板，使用序列表的序列号：68记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(5)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(5)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(2)记载的质粒(2)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu。 [0315] [实施例30-(6)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得 (6) [0316] 转化体(6)如表11所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变，为了获得上述转化体(6)，将从上述实施例30-(3)记载的转化体(3)回收得到的质粒(3)作为模板，使用序列表的序列号：68记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(6)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(6)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(3)记载的质粒(3)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu。 [0317] [实施例30-(7)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(7) [0318] 如表11所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(7)，将从上述实施例30-(4)记载的转化体(4)回收得到的质粒(4)作为模板，使用序列表的序列号：68记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(7)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(7)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(4)记载的质粒(4)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu。 [0319] [表11] [0320] (表11) [0321] [0322] [实施例30-(8)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(8) [0323] 如表12所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(8)，以日本特开2004-194588号公报的实施例68中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(8)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(8)。 [0324] [实施例30-(9)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(9) [0325] 如表12所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(9)，以日本特开2004-194588号公报的实施例73中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合 酶突变体的质粒(9)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(9)。 [0326] [实施例30-(10)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(10) [0327] 如表12所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(10)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：69及70记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(10)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(10)。 [0328] [表12] [0329] (表12) [0330] [0331] [实施例30-(11)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(11) [0332] 如表13所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(11)，将从上述实施例30-(8)记载的转化体(8)回收得到的质粒(8)作为模板， 使用序列表的序列号：71记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(11)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(11)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(8)记载的质粒(8)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。 [0333] [实施例30-(12)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(12) [0334] 如表13所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(12)，将从上述实施例30-(9)记载的转化体(9)回收得到的质粒(9)作为模板，使用序列表的序列号：71记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(12)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(12)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(9)记载的质粒(9)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。 [0335] [实施例30-(13)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(13) [0336] 如表13所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(13)，将从上述实施例30-(10)记载的转化体(10)回收得到的质粒(10)作为模板，使用序列表的序列号：71记载的引物，采用使用实施例30- (3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(13)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(13)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒、利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(10)记载的质粒(10)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。 [0337] [表13] [0338] (表13) [0339] [0340] [实施例30-(14)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(14) [0341] 如表14所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(14)，以日本特开2004-194588号公报的实施例71中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(14)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(14)。 [0342] [实施例30-(15)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获 得(15) [0343] 如表14所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(15)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：72及73记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(15)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(15)。 [0344] [实施例30-(16)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(16) [0345] 如表14所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(16)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号74及75记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(16)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(16)。 [0346] [表14] [0347] (表14) [0348] [0349] [实施例30-(17)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(17) [0350] 如表15所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(17)，将从上述实施例30-(14)记载的转化体(14)回收得到的质粒(14)作为模板，使用序列表的序列号：76记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(17)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(17)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(14)记载的质粒(14)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys。 [0351] [实施例30-(18)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(18) [0352] 如表15所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(18)，将从上述实施例30-(15)记载的转化体(15)回收得到的质粒(15)作为模板，使用序列表的序列号：76记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(18)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(18)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(15)记载的质粒(15)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys。 [0353] [实施例30-(19)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获 得(19) [0354] 如表15所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(19)，将从上述实施例30-(16)记载的转化体(16)回收得到的质粒(16)作为模板，使用序列表的序列号：76记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(19)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(19)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(16)记载的质粒(16)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys。 [0355] [表15] [0356] (表15) [0357] [0358] [实施例30-(20)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(20) [0359] 如表16所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(20)，以日本特开2004-194588号公报的实施例75中记载的质粒作为模板，利用 实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(20)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(20)。 [0360] [实施例30-(21)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(21) [0361] 如表16所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(21)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：77及78记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(21)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(21)。 [0362] [实施例30-(22)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(22) [0363] 如表16所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(22)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：79及80记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(22)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(22)。 [0364] [表16] [0365] (表16) [0366] [0367] [实施例30-(23)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(23) [0368] 如表17所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(23)，将从上述实施例30-(20)记载的转化体(20)回收得到的质粒(20)作为模板，使用序列表的序列号：81记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(23)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(23)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(20)记载的质粒(20)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met。 [0369] [实施例30-(24)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(24) [0370] 如表17所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(24)，将从上述 实施例30-(21)记载的转化体(21)回收得到的质粒(21)作为模板，使用序列表的序列号：81记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(24)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(24)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(21)记载的质粒(21)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met。 [0371] [实施例30-(25)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(25) [0372] 如表17所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(25)，将从上述实施例30-(22)记载的转化体(22)回收得到的质粒(22)作为模板，使用序列表的序列号：81记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(25)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(25)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(22)记载的质粒(22)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met。 [0373] [表17] [0374] (表17) [0375] [0376] [实施例30-(26)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(26) [0377] 如表18所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(26)，以日本特开2004-194588号公报的实施例72中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(26)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(26)。 [0378] [实施例30-(27)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(27) [0379] 如表18所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(27)，以日本特开2004-194588号公报的实施例77中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(27)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受 态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(27)。 [0380] [表18] [0381] (表18) [0382] [0383] [实施例30-(28)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(28) [0384] 如表19所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(28)，将从上述实施例30-(26)记载的转化体(26)回收得到的质粒(26)作为模板，使用序列表的序列号：82记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(28)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(28)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(26)记载的质粒(26)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala。 [0385] [实施例30-(29)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(29) [0386] 如表19所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(29)，将从上 述实施例30-(27)记载的转化体(27)回收得到的质粒(27)作为模板，使用序列表的序列号：82记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(29)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(29)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(27)记载的质粒(27)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala。 [0387] [实施例30-(30)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(30) [0388] 如表19所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(30)，将从上述实施例30-(16)记载的转化体(16)回收得到的质粒(16)作为模板，使用序列表的序列号：82记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(30)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(30)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(16)记载的质粒(16)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala。 [0389] [表19] [0390] (表19) [0391] [0392] [实施例30-(31)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(31) [0393] 如表20所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(31)，以日本特开2004-194588号公报的实施例78中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(31)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(31)。 [0394] [实施例30-(32)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(32) [0395] 如表20所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(32)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：83及84记载的引物，在每个突变 位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(32)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(32)。 [0396] [表20] [0397] (表20) [0398] [0399] [实施例30-(33)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(33) [0400] 如表21所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(33)，将从上述实施例30-(31)记载的转化体(31)回收得到的质粒(31)作为模板，使用序列表的序列号：85记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(33)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(33)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(31)记载的质粒(31)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn。 [0401] [实施例30-(34)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(34) [0402] 如表21所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列 表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(34)，将从上述实施例30-(32)记载的转化体(32)回收得到的质粒(32)作为模板，使用序列表的序列号：85记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(34)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(34)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(32)记载的质粒(32)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn。 [0403] [实施例30-(35)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(35) [0404] 如表21所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(35)，将从上述实施例30-(10)记载的转化体(10)回收得到的质粒(10)作为模板，使用序列表的序列号：85记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(35)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(35)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(10)记载的质粒(10)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn。 [0405] [表21] [0406] (表21) [0407] [0408] [实施例30-(36)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(36) [0409] 如表22所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(36)，以日本特开2004-194588号公报的实施例58中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(36)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(36)。 [0410] [实施例30-(37)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(37) [0411] 如表22所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(37)，以日本特开2004-194588号公报的实施例65中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(37)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感 受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(37)。 [0412] [实施例30-(38)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(38) [0413] 如表22所示使序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(38)，以日本特开2004-194588号公报的实施例74中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(38)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(38)。 [0414] [表22] [0415] (表22) [0416] [0417] [实施例30-(39)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(39) [0418] 如表23所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(39)，将从上述实施例30-(36)记载的转化体(36)回收得到的质粒(36)作为模板，使用序列表的序列号：86记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(39)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(39)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(36)记载的质粒(36)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。 [0419] [实施例30-(40)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(40) [0420] 如表23所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(40)，将从上述实施例30-(37)记载的转化体(37)回收得到的质粒(37)作为模板，使用序列表的序列号：86记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(40)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(40)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒、利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(37)记载的质粒(37)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。 [0421] [实施例30-(41)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(41) [0422] 如表23所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(41)，将从上述实施例30-(38)记载的转化体(38)回收得到的质粒(38)作为模板，使用序列表的序列号：86记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(41)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(41)。另外利用碱性SDS提取法由上述 菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(38)记载的质粒(38)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。 [0423] [表23] [0424] (表23) [0425] [0426] [实施例30-(42)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(42) [0427] 如表24所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(42)，以日本特开2004-194588号公报的实施例62中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(42)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(42)。 [0428] [实施例30-(43)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(43) [0429] 如表24所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突 变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(43)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：87及88记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(43)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(43)。 [0430] [表24] [0431] (表24) [0432] [0433] [实施例30-(44)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(44) [0434] 如表25所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(44)，将从上述实施例30-(42)记载的转化体(42)回收得到的质粒(42)作为模板，使用序列表的序列号：89记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(44)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(44)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(42)记载的质粒(42)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。 [0435] [实施例30-(45)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(45) [0436] 如表25所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(45)，将从上述实施例30-(31)记载的转化体(31)回收得到的质粒(31)作为模板，使用序列表的序列号：120记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(45)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(45)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(31)记载的质粒(31)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。 [0437] [实施例30-(46)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(46) [0438] 如表25所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(46)，将从上述实施例30-(43)记载的转化体(43)回收得到的质粒(43)作为模板，使用序列表的序列号：89记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(46)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(46)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(43)记载的质粒(43)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。 [0439] [表25] [0440] (表25) [0441] [0442] [实施例30-(47)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(47) [0443] 如表26所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(47)，将从上述实施例30-(36)记载的转化体(36)回收得到的质粒(36)作为模板，使用序列表的序列号：90记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(47)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(47)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(36)记载的质粒(36)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。 [0444] [实施例30-(48)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(48) [0445] 如表26所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列 表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(48)，将从上述实施例30-(8)记载的转化体(8)回收得到的质粒(8)作为模板，使用序列表的序列号：90记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(48)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(48)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(8)记载的质粒(8)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。 [0446] [实施例30-(49)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(49) [0447] 如表26所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(49)，将从上述实施例30-(15)记载的转化体(15)回收得到的质粒(15)作为模板，使用序列表的序列号：90记载的引物，采用使用实施例30-(3)记载的诱变试剂盒的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(49)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(49)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(15)记载的质粒(15)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。 [0448] [表26] [0449] (表26) [0450] [0451] [实施例30-(50)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(50) [0452] 如表27所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(50)，以日本特开2004-194588号公报的实施例63中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(50)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(50)。 [0453] [实施例30-(51)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(51) [0454] 如表27所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得编码该腈水合酶突变体的转化体(51)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：91及92记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(51)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(51)。 [0455] [实施例30-(52)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(52) [0456] 如表27所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(52)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：93及94记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(52)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(52)。 [0457] [表27] [0458] (表27) [0459] [0460] [实施例30-(53)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(53) [0461] 如表28所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(53)，将从上述实施例30-(50)记载的转化体(50)回收得到的质粒(50)作为模板，使用序列表的序列号：95及71记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(53)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细 胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(53)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(50)记载的质粒(50)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。 [0462] [实施例30-(54)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(54) [0463] 如表28所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(54)，将从上述实施例30-(51)记载的转化体(51)回收得到的质粒(51)作为模板，使用序列表的序列号：95及71记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(54)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(54)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(51)记载的质粒(51)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。 [0464] [实施例30-(55)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(55) [0465] 如表28所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(55)，将从上述实施例30-(52)记载的转化体(52)回收得到的质粒(52)作为模板，使用序列表的序列号：95及71记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(55)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(55)。另外利用碱性SDS提 取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(52)记载的质粒(52)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。 [0466] [表28] [0467] (表28) [0468] [0469] [实施例30-(56)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(56) [0470] 如表29所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(56)，以日本特开2004-194588号公报的实施例70中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(56)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(56)。 [0471] [实施例30-(57)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(57) [0472] 如表29使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变 体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(57)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：96及97记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(57)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(57)。 [0473] [表29] [0474] (表29) [0475] [0476] [实施例30-(58)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(58) [0477] 如表30所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(58)，将从上述实施例30-(56)记载的转化体(56)回收得到的质粒(56)作为模板，使用序列表的序列号：86及95记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(58)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(58)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(56)记载的质粒(56)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。 [0478] [实施例30-(59)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获 得(59) [0479] 如表30所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(59)，将从上述实施例30-(27)记载的转化体(27)回收得到的质粒(27)作为模板，使用序列表的序列号：86及95记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(59)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(59)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(27)记载的质粒(27)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。 [0480] [实施例30-(60)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(60) [0481] 如表30所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(60)，将从上述实施例30-(57)记载的转化体(57)回收得到的质粒(57)作为模板，使用序列表的序列号：86及95记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(60)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(60)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(57)记载的质粒(57)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。 [0482] [表30] [0483] (表30) [0484] [0485] [实施例30-(61)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(61) [0486] 如表31所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(61)，将从上述实施例30-(50)记载的转化体(50)回收得到的质粒(50)作为模板，使用序列表的序列号：71及98记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(61)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(61)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(50)记载的质粒(50)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile，及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。 [0487] [实施例30-(62)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获 得(62) [0488] 如表31所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(62)，将从上述实施例30-(26)记载的转化体(26)回收得到的质粒(26)作为模板，使用序列表的序列号：71及98记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(62)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(62)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，在实施例30-(26)记载的质粒(26)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile，及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。 [0489] [实施例30-(63)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(63) [0490] 如表31使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(63)，将从上述实施例30-(21)记载的转化体(21)回收得到的质粒(21)作为模板，使用序列表的序列号：71及98记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(63)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(63)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(21)记载的质粒(21)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile，及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。 [0491] [表31] [0492] (表31) [0493] [0494] [实施例30-(64)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(64) [0495] 如表32所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(64)，以日本特开2004-194588号公报的实施例67中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(64)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(64)。 [0496] [实施例30-(65)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(65) [0497] 如表32所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(65)，以日本特开2004-194588号公报的实施例76中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(65)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感 受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(65)。 [0498] [实施例30-(66)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(66) [0499] 如表32所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(66)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：99及100记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(66)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(66)。 [0500] [表32] [0501] (表32) [0502] [0503] [实施例30-(67)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(67) [0504] 如表33使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(67)，将从上述实施例30-(64)记载的转化体(64)回收得到的质粒(64)作为模板，使用序列表的序列号：98及120记载的引物，在每个突变位点 反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(67)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(67)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(64)记载的质粒(64)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile，及β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。 [0505] [实施例30-(68)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(68) [0506] 如表33所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(68)，将从上述实施例30-(65)记载的转化体(65)回收得到的质粒(65)作为模板，使用序列表的序列号：89及98记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(68)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(68)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(65)记载的质粒(65)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile，及β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。 [0507] [实施例30-(69)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(69) [0508] 如表33所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(69)，将从上述实施例30-(66)记载的转化体(66)回收得到的质粒(66)作为 模板，使用序列表的序列号：89、及98记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(69)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(69)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(66)记载的质粒(66)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile，及β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。 [0509] [表33] [0510] (表33) [0511] [0512] [实施例30-(70)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(70) [0513] 如表34所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(70)，以日本特开2004-194588号公报的实施例69中记载的质粒作为模板，利用 实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(70)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(70)。 [0514] [实施例30-(71)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(71) [0515] 如表34所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(71)，以日本特开2004-194588号公报的实施例80中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(71)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(71)。 [0516] [实施例30-(72)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(72) [0517] 如表34所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(72)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：101及102记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(72)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(72)。 [0518] [表34] [0519] (表34) [0520] [0521] [实施例30-(73)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(73) [0522] 如表35所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(73)，将从上述实施例30-(70)记载的转化体(70)回收得到的质粒(70)作为模板，使用序列表的序列号：68及90记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(73)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(73)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(70)记载的质粒(70)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu，及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。 [0523] [实施例30-(74)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(74) [0524] 如表35所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(74)，将从上述实施例30-(71)记载的转化体(71)回收得到的质粒(71)作为 模板，使用序列表的序列号：68及90记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(74)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(74)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(71)记载的质粒(71)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu，及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。 [0525] [实施例30-(75)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(75) [0526] 如表35所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(75)，将从上述实施例30-(72)记载的转化体(72)回收得到的质粒(72)作为模板，使用序列表的序列号：68及90记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(75)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(75)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(72)记载的质粒(72)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu，及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。 [0527] [表35] [0528] (表35) [0529] [0530] [实施例30-(76)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(76) [0531] 如表36所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(76)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：103及104记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(76)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(76)。 [0532] [实施例30-(77)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(77) [0533] 如表36所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(77)，使用上述 实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：105及106记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(77)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(77)。 [0534] [表36] [0535] (表36) [0536] [0537] [实施例30-(78)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(78) [0538] 如表37所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(78)，将从上述实施例30-(14)记载的转化体(14)回收得到的质粒(14)作为模板，使用序列表的序列号：81及85记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(78)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(78)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(14)记载的质粒(14)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met，及β亚单位的第79位的His被取代为Asn。 [0539] [实施例30-(79)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(79) [0540] 如表37所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列 表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(79)，将从上述实施例30-(76)记载的转化体(76)回收得到的质粒(76)作为模板，使用序列表的序列号：81及85记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(79)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(79)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(76)记载的质粒(76)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met，及β亚单位的第79位的His被取代为Asn。 [0541] [实施例30-(80)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(80) [0542] 如表37所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(80)，将从上述实施例30-(77)记载的转化体(77)回收得到的质粒(77)作为模板，使用序列表的序列号：81及85记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(80)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(80)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(77)记载的质粒(77)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met，及β亚单位的第79位的His被取代为Asn。 [0543] [表37] [0544] (表37) [0545] [0546] [实施例30-(81)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(81) [0547] 如表38所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(81)，以日本特开2004-194588号公报的实施例64中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(81)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(81)。 [0548] [实施例30-(82)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(82) [0549] 如表38所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(82)，以日本特开2004-194588号公报的实施例66中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(82)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感 受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(82)。 [0550] [表38] [0551] (表38) [0552] [0553] [实施例30-(83)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(83) [0554] 如表39所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(83)，将从上述实施例30-(81)记载的转化体(81)回收得到的质粒(81)作为模板，使用序列表的序列号：85及112记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(83)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(83)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(81)记载的质粒(81)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn，及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。 [0555] [实施例30-(84)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(84) [0556] 如表39所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(84)，将从上述 实施例30-(82)记载的转化体(82)回收得到的质粒(82)作为模板，使用序列表的序列号：85及112记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(84)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(84)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(82)记载的质粒(82)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn，及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。 [0557] [实施例30-(85)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(85) [0558] 如表39所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(85)，将从上述实施例30-(38)记载的转化体(38)回收得到的质粒(38)作为模板，使用序列表的序列号：85及112记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(85)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(85)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(38)记载的质粒(38)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn，及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。 [0559] [表39] [0560] (表39) [0561] [0562] [实施例30-(86)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(86) [0563] 如表40使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(86)，以日本特开2004-194588号公报的实施例61中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(86)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(86)。 [0564] [实施例30-(87)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(87) [0565] 如表40所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(87)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：107及108记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(87)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(87)。 [0566] [表40] [0567] (表40) [0568] [0569] [实施例30-(88)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(88) [0570] 如表41所示使序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(88)，将从上述实施例30-(86)记载的转化体(86)回收得到的质粒(86)作为模板，使用序列表的序列号：109及110记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(88)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(88)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(86)记载的质粒(86)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn，及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。 [0571] [实施例30-(89)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(89) [0572] 如表41所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列 表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(89)，将从上述实施例30-(64)记载的转化体(64)回收得到的质粒(64)作为模板，使用序列表的序列号：109及110记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(89)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(89)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(64)记载的质粒(64)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn，及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。 [0573] [实施例30-(90)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(90) [0574] 如表41所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(90)，将从上述实施例30-(87)记载的转化体(87)回收得到的质粒(87)作为模板，使用序列表的序列号：109及110记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(90)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(90)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(87)记载的质粒(87)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn，及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。 [0575] [表41] [0576] (表41) [0577] [0578] [实施例30-(91)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(91) [0579] 如表42所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(91)，将从上述实施例30-(86)记载的转化体(86)回收得到的质粒(86)作为模板，使用序列表的序列号：111及112记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(91)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(91)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(86)记载的质粒(86)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu，及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。 [0580] [实施例30-(92)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(92) [0581] 如表42所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(92)，将从上述实施例30-(65)记载的转化体(65)回收得到的质粒(65)作为模板，使用序列表的序列号：111及112记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(92)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(92)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(65)记载的质粒(65)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu，及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。 [0582] [实施例30-(93)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(93) [0583] 如表42所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(93)，将从上述实施例30-(2)记载的转化体(2)回收得到的质粒(2)作为模板，使用序列表的序列号：111及112记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(93)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(93)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(2)记载的质粒(2)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu，及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。 [0584] [表42] [0585] (表42) [0586] [0587] [实施例30-(94)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(94) [0588] 如表43使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(94)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：113及114记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(94)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(94)。 [0589] [表43] [0590] (表43) [0591] [0592] [实施例30-(95)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(95) [0593] 如表44所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(95)，将从上述实施例30-(81)记载的转化体(81)回收得到的质粒(81)作为模板，使用序列表的序列号：95、98及109记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(95)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(95)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(81)记载的质粒(81)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及α亚单位的第27位的Met被取代为Ile，及β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn。 [0594] [实施例30-(96)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(96) [0595] 如表44所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(96)，将从上述实施例30-(56)记载的转化体(56)回收得到的质粒(56)作为模板，使用序列表的序列号：95、98及109记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(96)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(96)。另外利用碱性 SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(56)记载的质粒(56)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及α亚单位的第27位的Met被取代为Ile，及β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn。 [0596] [实施例30-(97)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(97) [0597] 如表44所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(97)，将从上述实施例30-(94)记载的转化体(94)回收得到的质粒(94)作为模板，使用序列表的序列号：95、98及109记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(97)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(97)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(94)记载的质粒(94)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及α亚单位的第27位的Met被取代为Ile，及β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn。 [0598] [表44] [0599] (表44) [0600] [0601] [实施例30-(98)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(98) [0602] 如表45所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(98)，以日本特开2004-194588号公报的实施例59中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(98)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(98)。 [0603] [表45] [0604] (表45) [0605] [0606] [实施例30-(99)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获 得(99) [0607] 如表46所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(99)，将从上述实施例30-(98)记载的转化体(98)回收得到的质粒(98)作为模板，使用序列表的序列号：90、95及111记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(99)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(99)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(98)记载的质粒(98)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu，及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。 [0608] [实施例30-(100)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(100) [0609] 如表46所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(100)，将从上述实施例30-(82)记载的转化体(82)回收得到的质粒(82)作为模板，使用序列表的序列号：90、95及111记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(100)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(100)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(82)记载的质粒(82)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu，及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。 [0610] [实施例30-(101)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(101) [0611] 如表46所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(101)，将从上述实施例30-(4)记载的转化体(4)回收得到的质粒(4)作为模板，使用序列表的序列号：90、95及111记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(101)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(101)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(4)记载的质粒(4)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu，及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu，及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。 [0612] [表46] [0613] (表46) [0614] [0615] [实施例30-(102)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获 得(102) [0616] 如表47所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(102)，以日本特开2004-194588号公报的实施例60中记载的质粒作为模板，利用实施例30-(1)记载的方法改变核糖体结合序列，制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(102)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(102)。 [0617] [表47] [0618] (表47) [0619] [0620] [实施例30-(103)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(103) [0621] 如表48所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(103)，将从上述实施例30-(98)记载的转化体(98)回收得到的质粒(98)作为模板，使用序列表的序列号：68、81及111记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(103)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(103)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(98)记载的质粒(98)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu，及β亚单位的第4位的Val被取代为Met，及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu。 [0622] [实施例30-(104)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获 得(104) [0623] 如表48所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(104)，将从上述实施例30-(37)记载的转化体(37)回收得到的质粒(37)作为模板，使用序列表的序列号：68、81及111记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(104)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(104)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(37)记载的质粒(37)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu，及β亚单位的第4位的Val被取代为Met，及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu。 [0624] [实施例30-(105)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(105) [0625] 如表48所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(105)，将从上述实施例30-(102)记载的转化体(102)回收得到的质粒(102)作为模板，使用序列表的序列号：68、81及111记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(105)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(105)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(102)记载的质粒(102)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu，及β亚单位的第4位的Val被取代为Met，及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu。 [0626] [表48] [0627] (表48) [0628] [0629] [实施例30-(106)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(106) [0630] 如表49所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(106)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：115及116记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(106)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(106)。 [0631] [表49] [0632] (表49) [0633] [0634] [实施例30-(107)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(107) [0635] 如表50所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(107)，将从上述实施例30-(42)记载的转化体(42)回收得到的质粒(42)作为模板，使用序列表的序列号：71、82及86记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(107)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(107)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(42)记载的质粒(42)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第94位的Met被取代为Ile，及β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala，及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。 [0636] [实施例30-(108)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(108) [0637] 如表50所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(108)，将从上述实施例30-(20)记载的转化体(20)回收得到的质粒(20)作为模板，使用序列表的序列号：71、82及86记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(108)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(108)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(20)记载的质粒(20)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第94位的Met被取代为Ile，及β亚单位的第8位的Gly被取 代为Ala，及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。 [0638] [实施例30-(109)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(109) [0639] 如表50所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(109)，将从上述实施例30-(106)记载的转化体(106)回收得到的质粒(106)作为模板，使用序列表的序列号：71、82及86记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(109)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(109)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(106)记载的质粒(106)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第94位的Met被取代为Ile、β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。 [0640] [表50] [0641] (表50) [0642] [0643] [实施例30-(110)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(110) [0644] 如表51所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(110)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：105及117记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(110)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(110)。 [0645] [表51] [0646] (表51) [0647] [0648] [实施例30-(111)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(111) [0649] 如表52所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(111)，将从上述实施例30-(102)记载的转化体(102)回收得到的质粒(102)作为模板，使用序列表的序列号：76、89及112记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(111)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(111)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(102)记载的质粒(102)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为 α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。 [0650] [实施例30-(112)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(112) [0651] 如表52所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(112)，将从上述实施例30-(70)记载的转化体(70)回收得到的质粒(70)作为模板，使用序列表的序列号：76、89及112记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(112)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(112)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(70)记载的质粒(70)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。 [0652] [实施例30-(113)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(113) [0653] 如表52所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(113)，将从上述实施例30-(110)记载的转化体(110)回收得到的质粒(110)作为模板，使用序列表的序列号：76、89及112记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(113)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(113)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(110)记载 的质粒(110)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。 [0654] [表52] [0655] (表52) [0656] [0657] [实施例30-(114)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(114) [0658] 如表53所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(114)，使用上述实施例30-(3)记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例30-(1)记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)作为模板，使用序列表的序列号：118及119记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(114)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(114)。 [0659] [表53] [0660] (表53) [0661] [0662] [实施例30-(115)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(115) [0663] 如表54所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(115)，将从上述实施例30-(38)记载的转化体(38)回收得到的质粒(38)作为模板，使用序列表的序列号：85及121记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(115)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(115)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(38)记载的质粒(38)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。 [0664] [实施例30-(116)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(116) [0665] 如表54所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(116)，将从上述实施例30-(9)记载的转化体(9)回收得到的质粒(9)作为模板，使用序列表的序列号：85及121记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(116)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(116)。另外利用碱性SDS提取 法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(9)记载的质粒(9)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。 [0666] [实施例30-(117)]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(117) [0667] 如表54所示使包含序列表的序列号：3所示的α亚单位和序列表的序列号：4所示的β亚单位的腈水合酶发生突变得到腈水合酶突变体，为了获得表达该腈水合酶突变体的转化体(117)，将从上述实施例30-(114)记载的转化体(114)回收得到的质粒(114)作为模板，使用序列表的序列号：85及121记载的引物，在每个突变位点反复进行实施例30-(3)记载的方法，由此制作编码上述腈水合酶突变体的质粒(117)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺绩公司制)，得到转化体(117)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在实施例30-(114)记载的质粒(114)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。 [0668] [表54] [0669] (表54) [0670] [0671] [评价] [0672] 与实施例1中使用的Pth-腈水合酶产生菌同样地培养转化体1～117，制备菌体混悬液。除使用制备得到的转化体1～117代替Pth-腈水合酶之外，与实施例29同样地使3-巯基丙腈反应，结果均为：99％以上的3-巯基丙腈被转化为3-巯基丙酰胺。 [0673] (实施例31) [0674] 向实施例30的反应中得到的3-巯基丙酰胺的反应液中，分别加入表55所示的酰胺酶产生菌1g，反应20小时。结果示于表55。 [0675] [表55] [0676] (表55) [0677] [0678] (实施例32)利用含有硫化氢的3-巯基丙腈进行的反应(Pth-酰胺酶) [0679] 在500g的1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中吹入硫化氢气体。由于吹入后的重量为500.22g，所以该缓冲液的硫化氢浓度为440ppm。向实施例1中制造的纯化3-巯基丙腈 0.5mL中加入缓冲液使总量为4.5mL，使硫化氢浓度为15ppm至180ppm。加入实施例1中使用的Pth-腈水合酶产生菌的混悬液0.25mL和Pth-酰胺酶产生菌的混悬液0.25mL，在 25℃下保温6小时。结果示于表56。 [0680] [表56] [0681] (表56) [0682]硫化氢浓度(ppm) 反应收率 0 97％ 15 95％ 36 80％ 180 68％ [0683] (实施例33)利用对硫化氢进行脱气处理得到的3-巯基丙腈的反应(Pth-酰胺酶) [0684] 向46.42w/v％氢硫化钠溶液(144.92g、1.2mol)中加入水(36.12g)，一边保持在40℃一边经1小时向其中滴入丙烯腈(53.06g、1.0mol)，然后在40℃下熟化10小时。接着，一边保持反应混合物的温度为25～30℃一边经2小时滴入47w/v％硫酸(125.3g、 0.3mol)，从pH14调节至pH6.5～7，之后在25～30℃下熟化1小时。该反应混合液中的硫化氢浓度通过利用顶空气相色谱 法的方法进行分析。熟化后的反应混合液中的硫化氢浓度为8000ppm。在减压下除去反应混合物内的硫化氢(25～30℃、6.7kPa(50torr)、3小时)，直至该反应混合液中的硫化氢浓度为15ppm。滴入硫酸时、熟化时、减压脱气时释放到反应体系外的硫化氢气体利用碱性捕集器捕集。接着，通过倾析从分离为2层的反应混合物中获得上层部的粗品3-巯基丙腈(75.6g)和下层部分水层(270.0g)。以重量比率(75.6∶270)使用上述获得的粗品3-巯基丙腈和水层。量取上层部粗品3-巯基丙腈1g、下层部分水层3.6g，使用硫酸及氢氧化钠调节pH为7.0，使其总重量为5.5g。加入Pth-腈水合酶产生菌的混悬液1g和Pth-酰胺酶产生菌的混悬液1g，在20℃下搅拌24小时。反应液中的3-巯基丙腈的99％以上被转化为3-巯基丙酸。 [0685] (实施例34) [0686] 向实施例29中得到的3-巯基丙腈、3-巯基丙酰胺及3-巯基丙酸的混合物中加入蒸馏水，使用硫酸及氢氧化钠调节pH为7.0。向反应液5g中加入Pth-腈水合酶产生菌的混悬液1g和Pth-酰胺酶产生菌的混悬液1g，进行调节使3-巯基丙腈的浓度为13重量％，在20℃下搅拌24小时。3-巯基丙腈的99％以上被转化为3-巯基丙酸。 [0687] (实施例35) [0688] 除将Pth-酰胺酶产生菌改变为Ppu-酰胺酶产生菌之外，与实施例34同样地进行。99％以上的3-巯基丙腈被转化为3-巯基丙酸。 [0689] (实施例36)3，3’-二硫代二丙腈利用酶向3，3’-二硫代二丙酰胺的合成[0690] 向3，3’-二硫代二丙腈(0.43g，0.0025mol)中加入水(3.72g)，调节温度至20℃。一边搅拌一边使用0.02w/v％NaOH水溶液(0.02g)调节pH为7.0，接下来，装入水(0.73g)。 将该pH7.0的反应液保温为20℃并搅拌，在此过程中加入Pth-腈水合酶产生菌的混悬液 0.1g，搅拌并反应24小时。对该反应液进行HPLC分析，结果3，3’-二硫代二丙腈的峰消失，确认到3，3’-二硫代二丙酰胺 的峰生成，利用HPLC得到的3，3’-二硫代二丙酸的峰面积值为100.0％，99％以上的3，3’-二硫代二丙腈被转化为3，3’-二硫代二丙酰胺。 [0691] (实施例37)3，3’-二硫代二丙酰胺利用酶向3，3’-二硫代二丙酸的合成[0692] 在20℃下一边搅拌实施例36中得到的3，3’-二硫代二丙酰胺的反应液一边添加Pth-酰胺酶产生菌的混悬液0.6g，在20℃下反应24小时。对该反应液进行HPLC分析，结果3，3’-二硫代二丙酰胺的峰消失，确认到3，3’-二硫代二丙酸的峰，利用HPLC得到的3，3’-二硫代二丙酸的峰面积值为100.0％，99％以上的3，3’-二硫代二丙酰胺被转化为3， 3’-二硫代二丙酸。 [0693] (实施例38)3，3’-二硫代二丙腈利用酶向3，3’-二硫代二丙酸的合成[0694] 向3，3’-二硫代二丙腈(0.43g，0.0025mol)中加入水(3.72g)，调节温度至30℃。一边在30℃下搅拌该浆料液一边使用0.02w/v％的NaOH水溶液(0.02g)调节pH为7.0，然后装入水(0.73g)。将该pH7.0的该浆料液保温为30℃并搅拌，在该过程中添加Pth-腈水合酶产生菌的混悬液0.14g，接着，添加Pth-酰胺酶产生菌的混悬液0.6g，在30℃下反应 24小时。对该反应液进行HPLC分析，结果3，3’-二硫代二丙腈的峰消失，确认到3，3’-二硫代二丙酸的峰，利用HPLC得到的3，3’-二硫代二丙酸的峰面积值为100.0％，99％以上的3，3’-二硫代二丙腈被转化为3，3’-二硫代二丙酸。 [0695] (实施例39)3，3’-二硫代二丙酸的利用锌粉的还原 [0696] 向实施例38中制造的3，3’-二硫代二丙酸(0.526g，0.0025mol)中加入水(20g)。加入32w/v％的NaOH水溶液0.67g。在35℃、搅拌条件下向该水溶液中加入锌粉(0.41g， 0.0063mol)，经42分钟滴入47w/v％硫酸水(5.58g)，在该温度下熟化1小时。对该还原反应液进行HPLC分析，结果3，3’-二硫代二丙酸的峰消失，确认到3-巯基丙酸的峰，利用HPLC得到的3-巯基丙酸的峰面积值 为100.0％，99％以上的3，3’-二硫代二丙酸被转化为3-巯基丙酸。 [0697] (实施例40)3，3’-二硫代二丙酸的利用铁粉的还原 [0698] 将实施例39的锌粉改变为铁粉(0.35g，0.0063mol)，与实施例39完全同样地进行反应·熟化。对该还原反应液进行HPLC分析，结果3，3’-二硫代二丙酸的峰消失，确认到3-巯基丙酸的峰，利用HPLC得到的3-巯基丙酸的峰面积值为100.0％，99％以上的3，3’-二硫代二丙酸被转化为3-巯基丙酸。 [0699] (实施例41)季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)的合成 [0700] 与实施例34同样地反复实施反应。向安装有搅拌机、冷却管、氮气清除管、温度计及pH计的3升的四颈瓶内加入该反应液(2000g)，一边搅拌一边加热至60℃。向该反应液中装入锌粉(22.6g)，使用47w/v％硫酸水(506g)，调节pH为1.0以下。在60℃保温·搅拌条件下，将该反应液熟化1小时，冷却至室温。一边搅拌该反应液一边在室温下装入活性炭(PMSX)(83.1g)，经0.5小时吸附不需要的菌体成分。将该活性炭处理液过滤·水洗，从滤块中除去废活性炭及不需要的菌体成分，由滤液获得3-巯基丙酸。在40℃下用乙酸正丁酯(350g)将该滤液反复萃取·分离液体3次，合并乙酸丁酯层。将所得乙酸丁酯层浓缩，然后进行蒸馏，由此以收率为91(％/丙烯腈)得到高纯度(99.9％以上)的3-巯基丙酸。反复实施本方法，制造3-巯基丙酸。 [0701] 向安装有搅拌机、回流冷却水分离器、氮气清除管及温度计的1L的4颈反应烧瓶内加入利用上述方法制造得到的3-巯基丙酸(442.3g、4.15mol)、季戊四醇(136.2g，1.00mol)、对甲苯磺酸1水合物(3.82g，0.02mol)、甲苯(185.2g)。在加热回流下，一边将副反应产生的水连续排出体系外，一边进行反应10小时(内温102～122℃)，之后，冷却至室温。对反应液进行碱清洗，然后进行水清洗，在加热减压下除去甲苯及微量的水。之后，进行过滤得到季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)(463.6g)。所得季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)色调(黄色度：YI)为1.0。 [0702] (实施例42)塑料透镜的制造 [0703] 在20℃下，将二正丁基二氯化锡0.014g(相对于聚合性组合物总重量为200ppm)、内部脱模剂(STEPAN公司、商品名：Zelec UN)0.084g、紫外线吸收剂(共同药品株式会社、商品名Biosorb 583)0.035g混合溶解在2，5-双(异氰酸甲酯基)-双环[2.2.1]庚烷和2，6-双(异氰酸甲酯基)-双环[2.2.1]庚烷的混合物35.4g中，形成均匀的溶液。向该均匀的溶液中添加16.7g季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)、17.9g 4-巯基甲基-1，8-二巯基-3， 6-二硫杂辛烷的混合溶液，在20℃下使其混合溶解。在400Pa下，将该混合溶液进行脱泡1小时，之后，利用1μmPTFE制过滤器进行过滤，将其注入由玻璃模和胶带形成的模具中。将该模具投入聚合炉中，经21小时从25℃缓慢升温至120℃进行聚合。聚合结束后，从炉中取出模具，进行脱模得到树脂。将所得树脂进一步在130℃下进行退火处理4小时。所得树脂具有透明性，折射率(ne)为1.597，阿贝数(νe)为40.6，耐热性(Tg)为118.1℃，色调(黄色度：YI)为3.8，作为光学用透明树脂是理想的。对于催化活性，将聚合性组合物在 20℃下保持5小时后的粘度为61mPa·s。 |
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