비-바이러스성 유전자 전달체용 중합체/유전자 복합체

비-바이러스성 유전자 전달체용 중합체/유전자 복합체{Polymer/DNA complex for non-viral DNA carrier}

본 발명은 비-바이이러스성 유전자 전달체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 글리세롤 디메틸아크릴레이트 및 저분자량 폴리에틸렌이민으로 합성되어 세포독성이 없고 트렌스펙션 효율이 높은 폴리(에스테르 아민) 중합체, 및 그 제조방법에 관한 것이며, 또한 상기 중합체를 담체로하여 제조된 비-바이러스성 유전자 전달체인 중합체/DNA 복합체에 관한 것이다.

유전자 치료법은 유전적 결합을 수정하고 수많은 질병을 치료하는데 있어 커다란 희망으로 자리 잡고 있다. 이러한 유전자 치료법을 성공적이고 안전하게 수행함에 있어서, 효과적인 유전자 전달이 주요한 과제 중 하나이며, 바이러스 전달체가 효과적인 유전자 전달에 있어 효과적임이 입증되었다. 그러나 면역원성(immunogenicity), 주입된 DNA 크기의 한계 및 대량 생산의 어려움과 같은 몇 가지 결점으로 인해 유전자 전달 시스템으로서 바이러스의 이용이 제한되고 있다. 양이온성 리포좀 및 중합체와 같은 비-바이러스성 유전자 담체가 바이러스성 시스템이 대체 수단으로서 주목을 받기 시작했다.

개선된 안정성 프로파일 및 중합체 전달체의 제조와 조작의 용이성이 효과적이고 안전한 유전자 전달용 비독성 및 생분해성 중합체 담체의 디자인 및 합성에 대한 연구를 촉발시켰다. 폴리(L-라이신), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine; 이하 PEI), 스타버스트(starburst) 폴리아미도아민(polyamidoamine; 이하 PAMAM) 덴드리머, 및 양이온성 리포좀 등이, 자발적으로 자가 조립가능하고 플라스미드 DNA(pDNA)를 엔도사이토시스를 통해 세포로 진입시키기에 충분히 작은 구조로 압축할 수 있기 때문에 비-바이러스성 유전자 전달체로서 널리 연구되어 왔다.

그러나 이들 비-바이러스성 전달체의 주요 단점은 트랜스펙션 효율이 낮다는 점이다. 트랜스펙션 효율을 높이기 위해 많은 노력이 기울여져 왔으나, 이는 여전히 안정하다고 여겨지는 시스템과는 거리가 멀었다.

또한, 비-바이러스성 유전자 전달체 담체는 열악한 생체적합성 및 비-생분해성으로 인해 현저하게 높은 세포독성을 나타냈다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 비-바이러스성 유전자 전달체 담체로서 생분해성 양이온성 중합체를 개발함으로써 세포독성을 감소시키는데 주의가 집중되고 있다. 분해성 결합을 갖는 생분해성 중합체를 디자인하기 위한 디설파이드 결합, 포스파젠, 선형 폴리(에스테르 아민)[poly(ester amine); 이하 PEA], PEA 네트워크 및 포스포에스테르 등과 같은 다양한 화학적 접근이 행하여져 왔다.

선형 양이온성 폴리에스테르가 수성 매질에서 보다 빠르게 분해되기 때문에, 가교된 PEA를 합성하여 분해를 지연시키려는 노력이 행하여져 왔다. 종래 본 발명자들은 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol; 이하 PEG), 폴리카프로락톤, 폴록 사머 및 아미노실란/PEG을 갖는 PEI를 기재로 한 생분해성 중합체 유전자 담체를 개발하였으며, 이들은 현저한 트랜스펙션 효율과 두드러지게 감소된 세포독성을 보여주었다.

이와 같이 본 발명자들은 생분해성 중합체 유전자 담체를 제조하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 비-바이러스성 유전자 전달체 담체로서 합성 PEA의 유용성을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 비-바이러스성 유전자 전달체 담체로서 세포독성이 없으면서 트렌스펙션 효율이 높은 생분해성 중합체 및 이를 이용한 비-바이러스성 유전자 전달체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 가교제로서 친수성 글리세롤 디메틸아크릴레이트(glyceroldimethylacrylate; 이하 GDM) 및 저분자량 PEI(low molecular PEI; 이하 LMW-PEI)를 이용하여 가교된 PEA를 합성하고, 합성된 PEA가 세포독성이 없고 트렌스펙션 효율이 높은 이상적인 유전자 전달체의 담체로서 유용함을 평가하여 확인함으로써 달성되었다.

본 발명은 GDM 및 LMW- PEI과 무수 메탄올을 이용한 PEA의 제조방법을 제공한다.

상기의 본 발명에 따른 방법은 GDM 및 LMW- PEI를 각각 무수 메탄올에 개별적으로 용해시킨 후, GDM 용액을 PEI 용액에 가하여 혼합하는 단계; 상기 혼합 용액을 50 내지 70, 바람직하게는 60에서 12 내지 36 시간, 바람직하게는 24 시간 동안 교반하면서 가열하는 단계; 상기 반응 혼합물을 2 내지 5, 바람직하게는 4에서 12 내지 36 시간, 바람직하게는 24 시간 동안 투석하는 단계; 및 수득한 중합체를 친액화시키는 단계로 구성된다.

PEA는 통상적으로 아민에 아크릴레이트기를 공액 부가하여 단량체 화학양론에 따른 분자량 및 사슬 말단기를 갖는 중합체 길이의 넓은 평균 분포를 생성시킴으로 합성된다. 본 발명에서는 무수 메탄올 중에서 개선된 미카엘 부가 반응(도 1)을 통해 LMW-PEI(Mn: 1.2 kDa)와 GDM를 다양한 화학양론적 비율로 반응시켜 합성하였다. 무수 유기 용매를 선택하여 합성 중의 PEA의 가수분해성 분해를 최소화하였다.

본 발명에 따른 PEA는 하이드록실기의 존재가 수용성을 증진시키며, 폴리에스테르 주쇄는 합성된 PEA의 생분해성을 보장한다. in vitro 트랜스펙션이 다가양이온(polycation)에 의한 DNA 압축 단계, 세포로 폴리플렉스(polyplex) 흡수 단계, 세포질로 폴리플렉스 방출 단계, 핵으로 DNA/폴리플렉스 수송 단계, 및 최종적 전사를 일으키는 복합체로의 후속 분해 단계를 포함한다는 사실에 주목할 만하다. 폴리플렉스의 흡수 단계 및 세포질로의 후속 방출 단계가, 도입유전자(trnasgene) 발현이 대부분의 세포에서 낮다는 관찰을 기준으로 율속 단계 중 하나로서 제안된 바 있다.

본 발명은 상기의 방법으로 제조된 비-바이러스성 유전자 전달체에서 담체로서 적절한 생분해성 중합체 PEA를 제공한다.

본 발명에 따른 PEA는 2,000 - 50,000 Da의 분자량 및 약 2.0의 다분산도(polydispersity indices)를 갖는다.

본 발명에 따른 PEA는 바람직하게는 1:1 내지 1:4의 GDM:LMW-PEI로 구성된다.

본 발명은 상기 생분해성 중합체를 이용한 중합체/DNA 복합체의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기와 같은 방법으로 제조된 비-바이러스성 유전자 전달체로서 중합체/DNA 복합체를 제공한다.

본 발명에서 중합체/DNA 복합체(polymer/DNA complex)는 달리 폴리플렉스(polyplex)라 지칭하며 이와 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에 따른 상기 중합체/DNA 복합체는, 바람직하는 PEA/DNA 복합체이다.

본 발명에 따른 PEA/DNA 복합체는 바람직하게는 1 내지 30의 N/P 비로 제조된다.

본 발명의 PEA/DNA 복합체는 150nm 이하의 입도로 효과적이고 안정한 DNA 압축을 보여, 세포내 전달을 위한 그의 잠재력을 발휘하였다. PEA는 또한 조절된 분해, 긴 반감기를 보였고, 세 가지 세포주(293T, HepG2 및 HeLa) 모두에서 PEI 25K와 비교하여 높은 투여량에서 실질적으로 비독성이었다. 또한, PEA는 PEI 25K와 비교할 때 세 가지 세포주에서 보다 높은 트랜스펙션 효율을 나타내었다. PEA의 보다 큰 트랜스펙션 효율이 PEA 주쇄 중의 초삼투압 글리세롤 및 양성자 스폰지 활성 PEI 잔사에서 발생한 효과를 상승시키는데 기여할 수 있었다.

상기와 같은 본 발명의 PEA는 효과적인 비-바이러스성 유전자 전달체에서 중합체 담체로서 사용할 수 있고, 조절된 분해, 현저히 낮은 세포독성 및 높은 트랜스펙션 효율과 더불어 구조적 특징에 대한 추가의 연구를 위한 다양한 기반을 제공할 수 있다. 중합체 성질을 특성화시키기 위한 목적으로 이들 전달체에 대한 보다 포괄적인 연구, 특히 다양한 글레세롤 주쇄 및 그의 초삼투압 효과에 대한 연구가 진행 중에 있다.

본 발명에 따른 비-바이러스성 유전자 전달체인 PEA/DNA 복합체는, PEA가 조절된 분해능, 현저히 낮은 세포독성 및 높은 트랜스펙션 효율을 제공할 수 있어 효과적인 중합체 전달체로서 사용할 수 있어, 세포내 유전자 전달에 있어 큰 잠재력을 발휘하는 효과가 있어, 의학산업 상 매우 유용한 발명인 것이다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.

분지 PEI (1.2 및 25 kDa), GDM (Mn: 228.25 Da), 및 무수 메탄올은 시그마 사(Sigma; St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여, 구입한 그대로 사용하였다.

세포 생존력 시험을 위한 시약(Cell Titer 96 AQueous One Solution Reagent), in vitro 트랜스펙션 및 SV-40 프로모터를 갖는 pGL3-조절 전달체를 위한 시스템(luciferase reporter 1000 assay system) 및 개똥벌레(firefly; Photonus pyralis ) 루시페라제를 코딩하는 증진인자는 프로메가사(Promega; Medison, WI, USA)로부터 입수하였다. CMV의 초기 프로모터를 갖는 플라스미드 pEGFP-N2 및 증진된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescence protein; EGFP) 유전자는 클론텍사(Clontech; Palo Alto, CA, USA)로부터 입수하였다. 상기 플라스미드를 적당한 E. Coli 균주 JM109로 증폭시켰다.

실시예 1 : PEA 합성

GDM 및 LMW- PEI를 무수 메탄올에 개별적으로 용해시키고, 세가지 상이한 화학양론적 GDM:PEI 비율(표 1 참조)로 GDM 용액을 PEI 용액에 서서히 가하여 혼합하였다.

<표 1>

합성된 PEA의 특성

이어서 반응 혼합물을 60에서 24 시간 동안 정속 교반하면서 가열하였다. 반응 혼합물을 4에서 24 시간 동안 스펙트라/포(Spectra/Por) 멤브레인(molecular mass cutoff 3.5kDa Spectrum Medical Industries, Inc., California)을 이용하여 증류수로 투석하였다. 최종적으로 중합체를 친액화시키고, 0에서 보관하였다.

상기 반응은 승온(60) 하에서 수행하여 가교도를 높임으로써 합성된 중합체의 분자량을 크게 하였다. PEI의 아민기의 친핵성성질로 인하여 GDM의 디메틸아크릴레이트 말단기와 반응하였다.

실시예 2 : PEA 의 특성화

합성된 PEA의 조성을 ¹ H NMR 분광법으로 확인하였다. 도 2에 GDM/PEI- 1.2(1:1)의 대표적인 ¹ H NMR 스펙트럼을 나타내었다. PEA의 조성은 반응물의 화학양론적 공급비에 따라 가변적임을 알 수 있었다. 또한 PEA는 DMSO 및 물과 같은 고도로 극성인 용매에 가용성이나 THF와 같은 몇몇 유기 용매에는 불용성임이 밝혀졌다.

PEA의 분자량 감소를 측정하여 중합체 분해 정도를 추산하였다. PBS (0.1 g /ml)에 용해시킨 중합체를 진탕 배양기(37 ^o C 100 rpm)에서 배양하고, 다양한 시간 간격으로 시료를 채취하였다. 이어서, 동결건조된 시료에 대해 GPC를 실시하여 분자량을 측정하였다.

일반적으로 단량체 구조, 용매 선택 및 반응 온도가 중합체의 평균 분자량에 영향을 미쳤고, 이들의 범위는 2,000 내지 50,000 이었다. 그러나 합성된 PEA의 평균 분자량 분포는 그다지 넓지 않은 것으로 밝혀졌고 [다분산도(polydispersity indices) 2.0에 근접함], 이는 반응물 공급비를 단순히 변화시키는 것으로는 분자량의 조절이 어려움을 시사한다(표 1 참조).

상기에서 얻은 중합체를 10 mg/mL 농도로 CDCl ₃ 에 용해시켜 ¹ H NMR 시료를 제조하였다. 어벤스(Avance) 500 분광계(Bruker, Germany)를 이용하여 NMR 스펙트럼을 기록하였다. 중합체의 분자량은 컬럼(GPCusing Sodex OHpack SB-803 HQ column; Phenomenox, USA)을 이용하여 컬럼 온도 25 및 유속 0.5 mL/min에서 측정하였다. 아세트산 암모늄(0.5M, pH 5.5)을 이동상으로 이용하였다.

약물/유전자 전달 시스템의 생분해도는 적용 직후 담체 분자가 붕괴되는 것을 의미하는 것이 아니라, 유기체에서의 장기간 독성을 회피하기 위해 서서히 분해되는 것을 의미한다. 또한, 분해되지 않고 방출되지도 않은 담체의 축적이 세포독성을 야기시킨다. PEA의 에스테르 결합 분해의 동력학을 분자량의 감소를 측정함으로써 조사하였다. 도 3에 생리학적 조건하에서 PEA의 전형적인 분해 패턴을 도시하였다. PEA는 가수분해를 거쳐 각각 산 및 알코올을 형성함으로써 저분자량 비독성 부산물을 생성시킨다. GDM/PEI-1.2 (1:1)의 반감기는 9 내지 10일 인 것으로 밝혀졌고, 이는 조절된 방식으로 분해가 일어났음을 의미한다.

실시예 3 : 중합체/ DNA 복합체 제조

상기 실시예 1에서 합성한 PEA 용액(10 μL)과 DNA (pGL3 control; 0.1 ㎍)를 다양한 N/P 비로 부드럽게 혼합하여 PEA/pDNA 복합체를 제조하였다. 상기 복합체를 실온에서 30 분 동안 배양하고, 적재용 염료 혼합물을 포함한 12 μL를 브롬화 에티디움(0.1μg/mL)을 함유한 0.8% 아가로스 겔에 적재하였다. 상기 겔을 100 V에서 40 분 동안 트리스-아세테이트 완충액으로 구동시켰다. UV 조명하에서 겔 이미지를 캡쳐하였다.

세포로 DNA를 전달하기 위해서는, 양이온성 중합체가 정전기적 상호작용을 통해 음이온성 DNA와 결합하여, 양전하로 충전된 나노크기의 복합체로 압축되어야 한다. 아가로스 겔 전기이동법을 이용하여 PEA의 플라스미드 DNA (pGL3-control) 와의 결합능을 평가하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 세 개의 PEA에 대하여, 중합체의 충전 비율이 증가하여 pGL3-control 밴드가 점진적으로 유효하게 분해되었다. N/P 비 5에서, 모든 PEA가 유효하게 압축되었고, DNA의 이동이 완전하게 지연되었으며, 이는 양전하로 충전되었거나 중성인 폴리플렉스가 형성되었음을 지시한다.

아가로스 겔 전기이동법에 의해 DNA를 DNase-I로부터 보호할 수 있는 PEA의 효율을 확인하였다. 효소 DNase-I의 존재 하에 완전하게 분해되는 무방비 DNA와 비교할 때, 세 개의 PEA가 DNA를 유효하게 압축시켜 보호하였다(도 5 참조).

실시예 4 : 중합체/ DNA 복합체의 입도 및 제타 포텐셜 측정

동적 광 산란 분광광도계(dynamic light scattering spectrophotometer; DLS; ELS8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 각각 90 및 20 ^o 의 산란각으로 중합체/DNA 복합체(다양한 N/P 비로 물에서 제조된 것임)의 입도 및 제타 포텐셜을 측정하였다. 물 중에서 1 내지 30의 N/P 비로 중합체/DNA 복합체를 제조하였다.

PEA/DNA 복합체의 입도 및 제타 포텐셜을 중합체 세 개의 N/P 비의 함수로서 결정하였다(도 6a 및 6b 참조). 세 개의 PEA가 나노크기의 양전하로 충전된 중합체/DNA 복합체가 유효하게 압축되었음을 알 수 있다. 입도는 PEA/DNA 충전 비의 증가에 따라 감소됨이 관찰되었다. 완전한 전하 중성이 일어나는 특정 N/P 비 이상 에서, 입도 92 내지 190 nm인 양전하로 충전된 복합체의 안정한 분산이 얻어졌다. 유사하게 폴리플렉스의 제타 포텐셜 또한 N/P 비의 증가에 따라 증가됨이 관찰되었다. 충전 비가 5 내지 30으로 증가하여 폴리플렉스의 제타 포텐셜이 +25 내지 +50 mV로 상승하였다(도 6b 참조). 이러한 데이터는 본 발명자들에 의해 종래에 밝혀진 것과 유사한 경향을 가지며, 전하 중성화 메카니즘을 통해 양이온성 중합체의 첨가시에 DNA가 초기에 거대 입자로 압축되어지는 DNA 압축 패턴과 전형적으로 상응한다. 중합체 압축의 점진적 증가가 전하 역전을 가져와서, 최종적으로 양전하로 충전된 폴리플렉스의 안정한 현탁을 가져왔다.

실시예 5 : 중합체/ DNA 복합체의 투과 전자 현미경( Transmission electron microscopy ; TEM ) 분석

투과 전자 현미경(TEM)(JEM 1010, JEOL, Japan)을 이용하여 PEA/DNA (pEGFP-N2) 복합체의 형태를 관찰하였다. PEA/DNA 복합체 한 방울을 구리 격자에 적하시켜 TEM 표본을 제작하고, 1% 아세트산 우라닐 용액으로 5 초 동안 염색하였다. 상기 표본을 추가로 10 초 동안 건조시킨 후, 현미경으로 조사하였다.

폴리플렉스를 균일한 구형의 나노미터 크기로 형성시키는 것은 일반적으로 폴리플렉스를 엔도사이토시스를 통해 세포로 도입시킬 수 있는 크기인 200 nm 이하의 입자로서 폴리플렉스 매개 유전자 전달에 있어 매우 중요한 파라미터로 여겨진다. TEM 이미지가 DLS 측정을 통해 얻어진 수치 보다 작은 평균 직경을 갖는 구형 PEA/DNA 나노입자가 형성되었음을 나타내었다(도 6c 참조).

실시예 6 : 중합체/ DNA 복합체의 세포 생존력 분석

종래의 방법에 따라 중합체/DNA 복합체 및 유리 DNA (0.2 ㎍)를 37에서 30 분 동안 DNase/Mg ^{2 +} 소화 완충액(50 mM Tris-Cl, 10 mM MgCl ₂ 및 pH 7.6) 중의 DNase-I (1 unit)로 개별 배양하였다.

인간 경부 상피 종양 세포(Human cervix epithelial carcinoma cells) (HeLa), 인간 간모세포종 세포(human hepatoblastoma cells)(HepG2), 및 인간 신장 형질전환 세포(human kidney transformed cells)(293T)를 10% 열-불활성화 FBS, 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배양 배지에 보존하였다. 세포를 5% CO ₂ 를 함유한 37 습윤 배양기에서 표준 조건하에 배양하였다.

PEA의 세포 생존력을 조사 키트(Cell Titer 96 ^R Aqueous One Solution Cell Proliferation Kit)(Promega)로 조사하였다. 96 웰 플레이트에 0.2 mL 배양 배지 중 초기 밀도 1x10 ⁴ (HeLa and 293T) 또는 2x10 ⁴ (HepG2) cells/well로 적재된 세포를 18 내지 20 시간 동안 배양한 후, 다양한 농도(5 내지 40㎍/mL)의 PEA를 가하여 80%의 처리 시 유착도에 이르게 하였다. 배양 배지를 신선한 다양한 농도(5, 10, 20, 및 40㎍/mL)의 PEA 용액이 함유된 무혈청 배지로 교환하고, 종래의 방법에 따라 세포 생존력 연구를 수행하였다.

MTS-기재 세포 생존력 분석법을 이용하여 PEA의 양을 증가시면서 세 개의 상 이한 세포주(HeLa, HepG2 and 293T cells)에 대한 PEA의 세포독성을 조사하였다. 도 7에 GDM과 LMW-PEI로 구성된 PEA가 세 개의 상이한 세포주에서 PEI 25K 보다 현저하게 낮은 세포독성을 갖는다는 사실을 나타내었다. 40 ㎍/mL의 농도에서, PEI 25K는 세포 생존력의 약 80% 감소를 가져왔으나, 동일한 농도에서 PEA는 적어도 70%의 세포 생존력을 유지하였다. 중합체 세포독성이 세포주 의존적이고 유리 중합체가 통상적으로 세포 및 조직에 대해 보다 독성인 반면, 중합체가 DAN와 복합체를 이루었을 때 세포독성이 감소된다는 사실이 주목할 만하다. 흥미롭게도, 합성된 PEA가 40㎍/mL 까지의 농도에서 모든 세포주에서 적어도 70%의 세포 생존력을 나타내었다. 다가양이온의 세포독성 특성은 통상적으로 분자량에 상응한다. 유기 PEA의 존재하에 관찰된 세포 생존력의 증가가 비독성 빌딩 블록의 형성에 기여할 수 있고, 저분자량 생분해 생성물이 PEA의 에스테르 주쇄로부터 생성되었다. 반면에, 고분자량 PEI는 세포 표면에 집적되어 중요한 멤브레인 기능을 손상시킴으로써 세포 생존력을 감소시켰다(도 7 참조). 유리 PEA의 존재하에 관찰된 현저한 세포 생존력이 이들의 안전한 유전자 담체로서의 가능성을 보여주었다.

실시예 7 : 중합체/ DNA 복합체의 In vitro 세포 트랜스펙션 시험

모든 분석은 24-웰 플레이트에서 수행하였다. 1 mL의 HeLa, 293T 및 HepG2 세포 배양액(HeLa 및 293T에 대하여는 1×10 ⁵ cells/mL, HepG2에 대하여는 2×10 ⁵ )을 표준 배양조건 하에서 약 70 내지 80 %의 유착도까지 배양하였다. 웰 내의 배 지를 다양한 N/P 비의 중합체/pGL3 복합체 1 μg이 보충된 무혈청 배지로 교체하고, 37에서 6 시단 동안 배양하였다. 이어서, 무혈청 배지를 혈청 함유 신규 배지로 교체하고 표준 배양 조건하에서 추가로 24 시간 동안 배양하였다. 루시페라아제 분석은 제조사(Promega)의 프로토콜에 따라 수행하였다. Relative light units (RLU)는 케미루미노메터(chemiluminometer)(Autolumat, LB953, EG&G Berthold, Germany)로 측정하였다. 수득한 RLU 값을, 단백질 분석 키트를 사용하여 측정한 세포 추출물 중 단백질 농도로 표준화시켰다.

합성된 PEA를 이용한 293T, HepG2 및 HeLa 세포에서의 트랜스펙션 효율을 도 8에 나타내었다. 5 내지 30의 상이한 N/P 비로 제조한 복합체를 이용하였다. 모든 세포주를 1 ㎍ 의 pDNA 복합 PEA로 in vitro 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 효율을 루시페라아제 효소 활성도로서 측정하고, 총 세포 단백질로 표준화하였다. 리포터 유전자 발현의 증가가 보다 효율적인 DNA와 나노크기 복합체의 복합화에 기여했을 것이다. 293T 및 HeLa 세포에서 리포터 유전자 발현은 세 개의 PEA 경우에서와 다소 유사한 수준으로 유지되었고, 이는, PEA의 트랜스펙션 효율이 그들의 분자량에 의존적이라고 나타난 바와 같이, 유사한 분자량에 기인하는 것이다. 흥미롭게도, 각각 293T 및 HeLa 세포주에서, N/P 비 30에서 GDM/PEI-1.2(1:4) 에 대한 루페라아제 발현 수준은 PEI 25K의 수준 보다 20 및 30배 높았다. 반면에, 고도로 양이온화되 PEI 25K의 현저한 독성이 N/P 비가 30까지 증가됨에 따라 그의 트랜스펙션 능력을 감소시켰다. In vitro 루시페라아제 결과는 PEI 25K 보다 증진된 PEA의 트랜스펙션 효율이 고도의 양이온성 PEI를 갖는 GDM 구획으로부터 생성된 생분 해성 에스테르 결합이 도입된 때문이며, 이는 세포독성을 감시킬 뿐만 아니라 트랜스펙션 효율의 증가된 모먼텀을 유지시킨다는 사실을 지시하였다.

폴리카프로락톤(PCL)과 PEI로 구성된 PEA의 트랜스펙션 효율이 현저하게 세포주 의존적이었다는 본 발명자들의 종래 연구와는 다르게, GDM과 LMW-PEI로 구성된 PEA는 모든 세포주에서 거의 유사한 트랜스펙션 효율을 보여주었다. HepG2 세포주에서 PEA의 트랜스펙션 효율은 GDM/PEI-1.2(1:4) > GDM/PEI-1.2(1:2) > GDM/PEI-1.2(1:1) 순서였음이 주목할 만하다. PEA/pDNA 복합체의 보다 작은 입도(<150 nm) 및 보다 손쉬운 복합체 분해와 같은 보다 우수한 생체물리학적 특성이 이입소체 탈출을 촉진시켰다.

실시예 8 : 중합체/ DNA 복합체의 유세포 분석 및 공초점 현미경 시험

트랜스펙션 효율을 EGFP 리포터 유전자를 이용하는 유세포(flow cytometer) 분석 측정법으로 확인하였다. 293T 세포를 PEA/pEGFP-N2로 트랜스펙션시킨 후 PBS로 세척하고 트립시나이징하였다. 벡톤-디킨슨사(Becton-Dickinson)(San Joes, CA)에서 입수한 FACS 캘리버 시스템(Calibur System)을 이용하여 세포 발현 녹색 형광 단백질의 비율(%)을 기록하여 트랜스펙션 효율을 평가하였다. 상기 실험은 3 회 수행하였고, 20개의 세포를 각 실험에서 계수하였다.

293T 세포를 24-웰 플레이트(5×10 ⁴ cells/well) 중 콜라겐-코팅 유리 커버슬립 상에 도말하고, 약 60 내지 70%의 유착도까지 배양하였다. 이어서, 배지를 PEA/pEGFP-N2 (1 μg) 복합체(N/P 비 30)를 함유한 무혈청 배지로 교체하였다. 배양 6 시간 후, 무혈청 배지를 혈청 함유 신규 배지로 교환하고, 추가로 18 시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 2 회 세척하고, 2% 글루타르알데하이드 용액 200μL를 가하여 고정시켰다. 커버슬립을 PBS로 세척하고, 글리세롤 내에 봉입하고, 최종적으로 세포를 488 nm 아르곤/크립톤 레이저를 구비한 공초점 레이저 스캐닝 현미경(confocal laser scanning microscopy (CLSM) (Micro Systems LSM 410, Carl Zeiss, Germany)으로 시각화시켰다. 515 nm/30 nm 대역여파기(bandpass filter)를 사용하여 형광 방출을 수집하였다. PBS 또는 중합체 만으로 처리한 세포를 대조구로 사용하였다.

PEA에 의한 GFP 리포터 유전자 발현을 공초점 현미경으로 분석하였다(도 9a 참조). pEFGP-N ₂ 발현 플라스미드를 함유한 PEA/pDNA 트랜스펙션 복합체(가장 큰 루시페라아제 활성을 나타내는 N/P 비 30)를 생성시키고, 293 T 세포로 트랜스펙션시켰다. 도 9a에 나타낸 바와 같이, PEI 25K와 비교할 때, 현저히 큰 GFP 발현이 모든 PEA에서 관찰되었다.

합성된 중합체의 트랜스펙션 효율을 추가로 조사하기 위해, 293T 세포에서 이들 PEA의 GFP 발현을 유세포 분석법으로 모니터링하였다. 유세포 분석 연구로 PEA/pEGFP-N ₂ 복합체가 가장 높은 수준의 양전하로 트랜스펙션된 세포를 제공함이 나타났다. 또한, 얻어진 데이터는 293T 세포주에서 PEA에 의해 현저한 정도로 세포 트랜스펙션이 일어났음을 나타냈다(도 9b 참조). PEA의 트랜스펙션 효율은 N/P 비의 증가에 따라 증가한( N/P = 30에서 약 30-34%) 반면, PEI GFP 발현은 N/P 비 10(약 10%)에서 최적에 도달한 후 N/P 비가 30이 될 때까지 점진적으로 감소하였다. 이는 보다 높은 농도에서 PEI의 독성에 기인한 것이며, PEA는 보다 낮은 세포독성으로 인하여 매우 효율적으로 남아있었다. 이러한 결과는 PEA의 트랜스펙션 효율이 PEI 25K 보다 우수하다는 사실을 지시하는 것이며, 효과적인 유전자 전달체로서 PEA의 가능성을 보여주는 것이다.

실시예 9 : 중합체/ DNA 복합체의 적혈구 용적( Packed cell volume ; 이하 PCV ) 측정

트립시나이징시킨 293T 세포를 원심분리하고 10% FBS가 보충된 DMEM에 재현탁시켰다. PCV에 대한 PEA의 글리세롤 함량(중량%)의 효과를 모니터링하기 위해, 상이한 농도의 PEA 및(또는) PEA/DNA 복합체를 세포 현탁액에 가하였다. 각각의 세트에 대하여, 세포 현탁액 1 mL를 미니-PCV 튜브(TPP, Trasadingen, Switzerland)에 옮겨 5,000 rpm으로 1 분 동안 원심분리하였다.

눈금 모세관내의 PCV를 % PCV로서 보고하고, 대조구로서 PEA/DNA 복합체 대신에 상이한 농도의 글리세롤을 이용하여 이상 조건 하에서 수행된 실험과 비교하였다.

이어서 본 발명자들은 트랜스펙션 효율에 대한 PEA의 글리세롤 주쇄의 영향을 평가하였다. 인산 칼슘 매개 트랜스펙션이 글리세롤과 같은 고 삼투압농도 작용제를 이용한 짧은 삼투압 쇼크에 의해 개선될 수 있다는 사실이 잘 알려져 있다. 또한 플라스미드 흡수 수준에 영향을 미치는 것이 세포 표면 상의 pDNA의 농도가 아니라, 인산 칼슘 공-침전물/DNA 복합체의 형태라는 사실이 보고된 바도 있다. 후 트랜스펙션 삼투압 쇼크가 비합성 CHO 세포에서 현저한 세포 부피 감소 및 과도 리포터 단백질 발현 감소를 가져왔다는 사실이 나타났다. 예상된 바와 같이, 삼투압 쇼크 처리의 시점 및 횟수 또는 동일한 세포주에서 전체적인 트랜스펙션 효율을 개선시키는데 중요한 파라미터라는 사실 또한 밝혀졌다. 글리세롤과 폴리-L-라이신(PLL)의 조합이 인간 적혈구 및 H225 세포의 내부 소포(마이크로좀)을 두 가지 화합물을 단독으로 사용하는 것 보다 효율적으로 용리시킬 수 있었다. 자우너(Zauner) 등은 글리세롤이 소포막을 순화시켜 PLL-매개 붕괴를 가능케 함으로써 소포 성분을 세포질로 방출시킨다는 사실을 보여주었다. 그러나, 인산 칼슘 매개 트랜스펙션과는 다르게, 트렌스페린-PLL-매개 유전자 전달의 경우에 있어, 글리세롤을 이용한 후-트랜스펙션 삼투압 쇼크가 유전자 전달을 거의 증가시키지 못하여, 글리세롤과 다가양이온/DNA 복합체가 트랜스펙션 동안 함께 존재하여야 한다는 사실이 입증되었다. 따라서 세포 재흡수를 증진시킴으로써 트랜스펙션 효율을 증가시키기 위하여, 본 발명자들은 그 자체로 초삼투압 글리세롤 주쇄를 함유하는 생분해성 유전자 담체를 합성하려고 시도하였다. 높은 삼투압에 대한 단기 반응의 효과를 측정하기 위하여, 293T 세포를 10% FBS를 갖는 DMEM, 상이한 농도의 글리세롤 또는 중합체 주쇄에 다양한 글리세롤 함량(3, 4 및 5-wt %)을 갖는 PEA/pGL3 복합체에 현탁시켰다.

배양한지 5 분 후, 세포를 1 분 동안 미니-PCV 튜브에서 원심분리하여 세포의 용적 변화를 측정하였다. DMEM 중 10 중량% 글리세롤에 노출시킨 결과 세포 용 적의 60% 감소가 관찰되었다(도 10b 참조). 3, 4 및 5 중량% 글리세롤을 함유한 PEA/DNA 복합체가, 각각의 순수 글리세롤 양에 의해 야기된 것과 동일한 방식으로 PCV를 감소시켰다. 도 10b에 도시한 바와 같이, 증진된 글리세롤 성분(3, 4 및 5 중량%)을 갖는 GDM/PEI-1.2(1:4)/pGL3-control 복합체가 PCV를 각각 10, 14 및 24 % 감소시켰다. 유사하게, 3, 4 및 5 중량% 농도에서 순수 글리세롤이 각각 20, 22 및 40% PCV 감소를 가져왔다. 다른 두가지 PEA(GDM/PEI-1.2(1:1) 및 GDM/PEI-1.2(1:2))도 유사한 효과를 나타냈다(데이터는 나타내지 않음). PEA/DNA 복합체 존재하의 PCV 감소는 PEA 중의 글리세롤 주쇄가 세포막에 삼투압을 부여하여 세포막을 순화시켜 막 투과도의 개선에 의한 세포 재흡수를 촉진시킨다는 가설에 의해 설명될 수 있다.

이러한 결과는 PEI 25K 이상으로 PEA에 의해 나타난 리포터 유전자 발현 증가가 의심할 여지없이 글리세롤 잔기의 존재, PEI 아민기에 의한 이입소체 완충 능력 및 생분해성 에스테르 결합의 존재로 인한 세포 재흡수 증가, 그에 따른 세포독성 감소의 현저한 이점이라는 사실을 강력하게 제안한다.

실시예 10 : 중합체/ DNA 복합체의 바필로마이신 ( Bafilomycin ) A ₁ 의 효과

12-웰 플레이트(2×10 ⁵ cells/well)에 파종된 293 T 세포를 18 시간 동안 배양한 후, 이입소체 양성자 펌프 억제제, 바필로마이신 A1(소포형 H ⁺ -ATPase 특이적 억제제)로 10 분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 상기에 기술한 바와 같이 in vitro 루시페라아제 분석하였다. 바필로마이신 A1으로 처리하지 않은 세포를 대조구로서 취하였다.

이입소체 양성자 펌프 억제제인 바필로마이신 A1을 도입하여 PEA/DNA 복합체의 증진된 트랜스펙션 효율이 PEI 주쇄로부터 발생된 '양성자 스폰지 효과(proton sponge effect)'에 기인한 것인지 여부를 측정하였다. 293T 세포에 대한 PEA/DNA 매개 트랜스펙션은 바필로마이신 A ₁ 에 대해 민감성이었다. 바필로마이신 A ₁ 은 20 nM 농도에서 20 배 이상 PEA의 트랜스펙션 효율을 감소시켰다(도 10a 참조). 따라서 PEA의 트랜스펙션 효율의 중요한 부분은 그들의 상당한 완충 능력에 의존하고, 이는 현저한 이입소체용해-유사 활성을 가져온다. 바필로마이이신 A1의 존재 하에 PEA의 트랜스펙션 효율 감소한다는 증거는 PEI 매개 트랜스펙션에서 양성자 스폰지 효과가 관련되었음을 제안하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 PEA의 합성과정을 개략적으로 나타낸 도로서, GDM 링커가 PEI의 1급 및 2급 아민과 반응하여 에스테르 결합을 생성시킨다.

도 2는 CDCl ₃ 중 PEAs (GDM/PEI-1.2(1:1)의 대표적인 ¹ H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.

도 3은 GDM/PEI-1.2 (1:1)의 분해 패턴을 나타낸 도이다.

도 4는 다양한 N/P 비 (a) GDM/PEI-1.2 (1:1) (b) GDM/PEI-1.2 (1:2) 및 (c) GDM/PEI-1.2 (1:4)에서 PEA/DNA (pGL3-control) 복합체의 아가로스 겔 전기이동 결과를 나타낸 도로서, 0.1 ug pDNA를 사용하여 PEA를 갖는 복합체를 제조하였다.

도 5는 DAN의 보호 및 방출 분석 결과를 나타낸 도로서, DNA는 1% SDS를 N/P 비 10에서 GDM/PEI-1.2 (1:1)/DNA 복합체에 첨가하여 방출되었다.

도 6은 다양한 N/P 비에서 PEA/DNA 복합체의 생체물리학적 특성을 나타낸 도로서, (a) PEA/DNA 복합체의 입도, (b) PEA/DNA 복합체의 제타 포텐셜 측정값, 및 (c) N/P 비 30에서 GDM/PEI-1.2(1:4)/DNA 복합체의 TEM 이미지를 나타낸 그림이다(에러바는 표준 편차를 나타냄, n=3).

도 7은 상이한 세포주에 대한 다양한 농도에서 PEA의 세포독성을 나타낸 도로서, (a) HeLa, (b) HepG2 및 (c) 293T 세포이다(n=3, 에러바는 표준 편자를 나타냄).

도 8은 세 개의 상이한 세포주에서 다양한 N/P 비에서 PEA/pGL3-control의 루시페라아제 활성을 나타낸 도로서, (a) HeLa, (b) HepG2 및 (c) 293T 세포이다(n=3, 에러바는 표준 편자를 나타냄).

도 9는 (a) N/P 비 30에서 PEA/pEGFP-N2 복합체로 트랜스펙션된 293T 세포주에서 발현된 GFP를 나타낸 도로서, A1, B1, C1 및 D1은 각각 GDM/PEI-1.2(1:1), GDM/PEI-1.2(1:2), GDM/PEI-1.2(1:4) 및 PEI 25K와 복합화된 pEGFP-N2 리포터 유전자의 형광 이미지를 나타내고, 역상 이미지(A2 내지 D2)는 각각 형광 이미지를 나타낸 도이며, (b) 다양한 N/P 비에서 PEA/DNA (pEGFP-N2) 복합체로 트랜스펙션된 293T 세포에서 발현되고, FACS로 분석된 pEGFP-N2를 나타낸 그래프이다(n=3, 에러바는 표준 편자를 나타냄).

도 10은 (b) 루시페라아제 분석에 의한, 무혈청 트랜스펙션 배지에서 N/P 비 30에서 PEA를 사용한 EGFP 발현에 대한 바필로마이신 A1(소포성 H+-ATPase 억제제)의 효과를 나타낸 도이고, (a) 세포 용적에 대한 고 삼투압의 GDM/PEI-1.2(1:4)/pGL3 복합체의 그의 글리세롤 농도에서의 효과를 나타낸 도로서, 293T 세포의 대략적 용적은 미니-PCV 튜브를 사용하여 측정한 후, 5 분 동안 제시된 조건에 노출시켰다. 대조구로서 세포를 5 분 동안 DMEM에 현탁시킨 후, PCV 측정을 행하였고, 각 바는 3회의 독립적 실험의 평균값이다(n=3, 에러바는 표준 편자를 나타냄).