饲料补充物
阅读：635发布：2023-03-09
专利汇可以提供饲料补充物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含 植酸酶 和脂解酶的 饲料 补充物，其中所述脂解酶在约pH1.5至约pH3.5范围内的pH下具有脂肪酶活性。，下面是饲料补充物专利的具体信息内容。
1.一种包含植酸酶和脂解酶的饲料补充物，其中所述脂解酶在约pH1.5至约pH3.5范围内的pH下具有脂肪酶活性。
2.根据权利要求1所述的饲料补充物，其中所述脂解酶包含具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列的多肽，或与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有至少70％同一性的多肽；或者通过表达包含如下序列的核苷酸序列而产生的多肽：SEQ ID NO：9或10的序列；
或者由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：9或10不同的序列；或者与SEQ ID NO：9或
10具有至少70％同一性的序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的饲料补充物，其中所述脂解酶在里氏木霉细胞中产生。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的饲料补充物，其中所述植酸酶包含：具有SEQ ID NO：13的序列的大肠杆菌植酸酶和/或布丘氏菌属植酸酶，所述布丘氏菌属植酸酶具有SEQ ID NO：1-6中任一种的序列或与SEQ ID NO：1-6中任一种具有至少70％同一性的多肽或通过表达包含如下序列的核苷酸序列而产生的多肽：SEQ ID NO：11的序列；或SEQ ID NO：14的核苷酸253至1483，或由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：11或者SEQ ID NO：14的核苷酸253至1483不同的序列；或与SEQ ID NO：11或者SEQ ID NO：14的核苷酸253至
1483具有至少70％同一性的序列。
5.根据任一项前述权利要求所述的饲料补充物，其中所述植酸酶在约pH 2.5至约pH
5.5范围内的pH下具有植酸酶活性。
6.一种饲料补充物，所述饲料补充物包含：
i)脂解酶，其为由如下特性中的至少一种来表征的脂解酶：-
a)当通过本说明书公开的脂肪酶测定法测量时在约pH 1.5至约pH 3.5范围内的pH下具有脂肪酶活性的脂解酶；
b)包含具有SEQ ID NO：7或8中所示的氨基酸序列的多肽或者与SEQ ID NO：7或8具有至少70％同一性的多肽的脂解酶；
c)通过表达包含如下序列的核苷酸序列而产生的脂解酶：SEQ ID NO：9或10的序列；
或由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：9或10不同的序列；或与SEQ ID NO：9或10具有至少70％同一性的序列；和
ii)植酸酶，其为由如下特性中的至少一种来表征：-
d)当在约pH 2.5至约pH 5.5范围内的pH下测量时具有植酸酶活性的植酸酶；
e)包含具有SEQ ID NO：1-6或SEQ ID NO：13中任一种所示的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO：1-6或SEQ ID NO：13中任一种具有至少70％同一性的多肽的植酸酶；
f)通过表达包含如下序列的核苷酸序列而产生的植酸酶：SEQ ID NO：11的序列或SEQ ID NO：14的核苷酸253至1483；或由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：11或者SEQ ID NO：14的核苷酸253至1483不同的序列；或与SEQ ID NO：11或者SEQ ID NO：14的核苷酸
253至1483具有至少70％同一性的序列。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的饲料补充物，其中所述植酸酶在约pH 5.0至约pH 5.5范围内的pH下也具有植酸酶活性。
8.根据任一项前述权利要求所述的饲料补充物，其中所述植酸酶具有至少100FTU/mg的比活性水平。
9.根据任一项前述权利要求所述的饲料补充物，其中所述脂解酶具有至少100LIPU/mg的比活性水平。
10.根据任一项前述权利要求所述的饲料补充物，其中脂解酶与植酸酶之比在约1∶3至约12∶1的范围内。
11.根据任一项前述权利要求所述的饲料补充物，所述饲料补充物还包含至少一种生理上可接受的载体。
12.根据权利要求11所述的饲料补充物，其中所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、消泡剂、Na2SO4、滑石粉和PVA以及它们的混合物。
13.根据任一项前述权利要求所述的饲料补充物，其中所述饲料补充物包含至少一种另外的酶。
14.根据权利要求13所述的饲料补充物，其中所述至少一种另外的饲料酶选自那些参与淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶，参与糖原代谢的蛋白质或酶，乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、-半乳糖苷酶、-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、包括β葡萄糖苷酶在内的-葡萄糖苷酶、葡糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、果胶酶、纤维二糖水解酶、酸性磷酸酶和/或其他酶类或者它们的组合。
15.根据权利要求13或14所述的饲料补充物，所述饲料补充物包含至少一种木聚糖酶和/或至少一种淀粉酶。
16.根据任一项前述权利要求所述的饲料补充物，所述饲料补充物包含至少1重量％、至少5重量％、至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％或至少25重量％的脂解酶和植酸酶。
17.一种饲料，所述饲料包含根据任一项前述权利要求所述的饲料补充物或至少一种脂解酶和至少一种植酸酶。
18.根据权利要求16所述的饲料，所述饲料包含一种或多种选自如下的饲料材料：a)谷类，如小谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大谷物如玉蜀黍或高粱；b)谷类的副产物，如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、小麦麸皮、粗小麦粉、次小麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)从诸如如下的来源获得的蛋白质：大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、小麦、干椰子肉、芝麻；d)从植物和动物来源获得的油类和脂肪；e)矿物质和维生素。
19.根据权利要求17所述的饲料，所述饲料包含至少一种低纤维饲料材料以提供低纤维饲料，所述低纤维饲料材料选自玉米、小麦、动物副产物粉或大豆和/或所述至少一种低纤维饲料材料的至少一种副产物。
20.根据权利要求16至18中任一项所述的饲料，所述饲料包含含有至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％或至少60重量％的玉米和大豆粉或玉米和全脂大豆的饲料。
21.根据权利要求16至19中任一项所述的饲料，所述饲料包含水平为约200FTU/kg至约15,000FTU/kg(例如300至10,000FTU/kg、400-7,500FTU/kg以及500-5000FTU/kg)的植酸酶。
22.根据权利要求16至20中任一项所述的饲料，所述饲料包含水平为约125LIPU/kg 至 约 45,000LIPU/kg( 例 如 125 至 30,000LIPU/kg、1000-20000LIPU/kg 以 及
3000-10000LIPU/kg)的脂解酶。
23.根据权利要求16至21中任一项所述的饲料，所述饲料包含至少0.0001重量％、至少0.0005重量％、至少0.0010重量％、至少0.0020重量％、至少0.0025重量％、至少
0.0050重量％、至少0.0100重量％、至少0.020重量％、至少0.100重量％、至少0.200重量％、至少0.250重量％、至少0.500重量％的所述饲料补充物。
24.用于单胃动物食用的根据权利要求16至22中任一项所述的饲料，所述单胃动物选自禽、猪、家养宠物或鱼。
25.根据权利要求16至23中任一项所述的饲料，所述饲料包含至少一种另外的添加剂。
26.一种制备根据权利要求16至24中任一项所述的饲料的方法，所述方法包括向饲料材料添加根据权利要求1至15中任一项所述的饲料补充物。
27.一种制备根据权利要求1至15中任一项所述的饲料补充物的方法，所述方法包括将至少一种脂解酶与至少一种植酸酶混合。
28.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括添加至少一种生理上可接受的载体，所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、消泡剂、Na2SO4、滑石粉和PVA以及它们的混合物。
29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，所述方法包括均化所述饲料补充物的额外步骤。
30.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，所述方法包括对所述饲料补充物进行制粒的额外步骤。
31.一种用于增加至少一种膳食营养物的可利用性和/或增加来自饲料材料的表观代谢能(AME)的方法，所述方法包括向饲料材料添加根据权利要求1至15中任一项所述的饲料补充物。
32.一种增加动物的生长速率的方法，所述方法包括给所述动物饲喂有效量的根据权利要求16至24中任一项所述的饲料。
33.至少一种植酸酶和至少一种脂肪酶在制造饲料中的用途，所述用途用于增加至少一种营养物的可利用性和/或增加来自饲料材料的可利用代谢能。
34.根据权利要求32所述的用途，其中将所述至少一种植酸酶和至少一种脂肪酶配制为饲料补充物。
35.根据权利要求33所述的用途，其中所述饲料补充物是根据权利要求1至15中任一项所述的饲料补充物。
36.根据权利要求32至34中任一项所述的用途，其中所述至少一种营养物选自磷、钙、氨基酸、脂肪和/或淀粉。
37.一种饲料补充物，所述饲料补充物包含基本上如本文所述的植酸酶和脂肪酶。
38.一种饲料，所述饲料包含基本上如本文所述的饲料补充物或至少一种植酸酶和至少一种脂肪酶。
39.一种制备饲料的方法，所述饲料基本上如本文所述。
40.至少一种植酸酶和至少一种脂肪酶的用途或饲料补充物的用途，所述用途用于生产基本上如本文所述的饲料。
饲料补充物
技术领域
背景技术
[0002] 植酸盐是磷在谷类和豆类中的主要贮藏形式。但是，单胃动物如猪、禽和鱼不能够代谢或吸收植酸盐(phytate)(或植酸(phytic acid))，因此它被排泄，导致牲畜密集饲养区域的磷污染。此外，植酸还通过螯合金属如钙、铜和锌而在单胃动物中起到抗营养剂的作用。
[0004] 通过植酸酶的作用，植酸盐通常水解产生较低分子量的肌醇-磷酸盐和无机磷酸盐。植酸酶可用作动物饲料的添加剂，据以改善有机磷对动物的可用性并降低环境的磷酸盐污染(Wodzinski RJ，Ullah AH.Adv Appl Microbiol.42，263-302(1996))。
[0006] 文献中描述了许多真菌来源的植酸酶(Wyss M.等人，Appl.Environ.Microbiol.65(2)，367-373(1999)；Berka R.M.等人，Appl.Environ.Microbiol.64(11)，
4423-4427(1998)；Lassen S.等人，Appl.Environ.Microbiol.67(10)，4701-4707(2001))和细菌来源的植酸酶(Greiner R.等人，Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；
Kerovuo 等 人，Appl.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085(1998)；Kim H.W. 等人，Biotechnol.Lett.25，1231-1234(2003)；Greiner R. 等 人，Arch.Biochem.Biophys.341(2)，201-206(1997)；Yoon S.J.等人，Enzyme and microbial technol.18，
449-454(1996)；Zinin N.V.等人，FEMS Microbiol.Lett.236，283-290(2004))。
4423-4427(1998)；Lassen S.等人，Appl.Environ.Microbiol.67(10)，4701-4707(2001))和细菌来源的植酸酶(Greiner R.等人，Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；
Kerovuo 等 人，Appl.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085(1998)；Kim H.W. 等人，Biotechnol.Lett.25，1231-1234(2003)；Greiner R. 等 人，Arch.Biochem.Biophys.341(2)，201-206(1997)；Yoon S.J.等人，Enzyme and microbial technol.18，
449-454(1996)；Zinin N.V.等人，FEMS Microbiol.Lett.236，283-290(2004))。
[0007] 然而，真菌植酸酶往往因蛋白水解而不稳定(Igbasan F.A.等人，Arch.Anim.Nutr.53，353-373(2000))，因此易受降解，而一些细菌植酸酶仅对植酸盐具有窄的底物特异性，对中度磷酸化的肌醇磷酸盐的降解差(Greiner R.等人，Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；Kerovuo J等人，Biochem.J.352，623-628(2000))。
[0008] 此外，已知钙与植酸盐相互作用形成钙-植酸盐复合物对于植酸酶活性是有害的(Selle，P.H.等人，Livestock Science.124，126-141(2009))。据猜测，这些钙-植酸盐复合物中的钙会使植酸盐不能接触植酸酶或者与非复合的植酸盐竞争酶的活性位点(Long，C.，Phytase，Biochemists Handbook，Princeton，NY，Van Nostrand-Reinhold(1961)；Wise，A.，Nutrition Abstracts&Reviews，53，791-806(1983))。
[0009] 已证实添加植酸酶能增加高植酸盐饮食的AME。Ravindran等人(Br.Poult.Sci.，2000，41，193-200)提出钙-植酸盐复合物与脂肪酸反应而在肠内腔中形成不溶性皂，从而降低脂肪的消化率。已提出添加植酸酶来降低这些皂的水平。植酸盐与玉米中的脂质相互作用的证据(Cosgrove，1966，Rev.Pure App.Chem.16：209-224)支持了这个假设。这些“脂肪植酸盐钙镁(lipophytins)”已被描述为Ca/Mg-植酸盐、脂质和肽的复合物(Cosgrove，
1966，Rev.Pure App.Chem.16：209-224)。其他的报道也已提出了饮食中钙、脂肪和植酸盐之间的相互作用。例如，Matyka等人(1990)(Anim.Feed.Sci.Technol.31：223-230)发现，饮食中的动物脂降低了植酸盐的磷在幼鸡中的利用率，提高了作为皂脂肪酸排泄的脂肪的百分比。
1966，Rev.Pure App.Chem.16：209-224)。其他的报道也已提出了饮食中钙、脂肪和植酸盐之间的相互作用。例如，Matyka等人(1990)(Anim.Feed.Sci.Technol.31：223-230)发现，饮食中的动物脂降低了植酸盐的磷在幼鸡中的利用率，提高了作为皂脂肪酸排泄的脂肪的百分比。
[0010] 外源脂肪酶的添加在提高脂质和矿物质消化率方面取得了有限的成功。但是，这可能受到了游离脂肪酸与钙和植酸盐结合形成复合物的限制(Cosgrove，1966(同上))，该复合物在胃肠道中不可溶，吸收差(Matyka等人，1990(同上))。
[0011] 之前已有人建议在动物饲料中使用外源脂肪酶，目的是改善动物对脂肪的消化。脂肪酶据猜测能改善消化，因为它使得可吸收的游离脂肪酸(FFA)的释放比没有脂肪酶的情况下快。但是，通过使用外源脂肪酶来证明动物性能或消化率的改进的尝试，在最好的情况下也是不一致的，且往往证实脂肪酶并不起作用。Dierick和Decuypere(2004)(J.Sci.Food Agric.84：1443-1450)证实在猪饮食中添加微生物脂肪酶没有改善脂肪消化率。
Hurtado等人(2000)(Rev.Bras.Zootec.29：794-802)没有检测到因为在小猪中使用外源脂肪酶导致的体重增加、饲料效率和能量消化率的增量。另外，他们报道当将这种脂肪酶与淀粉酶和蛋白酶组合时对任何这些参数没有相加作用。Officer(1995)(Anim.Feed Sci.Technol.56：55-65)报道说使用外源酶类的两种组合没有导致小猪的饲料摄入的体重增加的显著改变，这两种组合他们描述为脂肪酶、蛋白酶、B-葡聚糖酶、淀粉酶和纤维素酶以及脂肪酶、B-葡聚糖酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶。
Hurtado等人(2000)(Rev.Bras.Zootec.29：794-802)没有检测到因为在小猪中使用外源脂肪酶导致的体重增加、饲料效率和能量消化率的增量。另外，他们报道当将这种脂肪酶与淀粉酶和蛋白酶组合时对任何这些参数没有相加作用。Officer(1995)(Anim.Feed Sci.Technol.56：55-65)报道说使用外源酶类的两种组合没有导致小猪的饲料摄入的体重增加的显著改变，这两种组合他们描述为脂肪酶、蛋白酶、B-葡聚糖酶、淀粉酶和纤维素酶以及脂肪酶、B-葡聚糖酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶。
[0012] 在肉鸡中，Meng等人(2004)(Poult.Sci.83：1718-1727)当在基于小麦的饮食中使用细菌脂肪酶时，未能检测到脂肪酶对脂肪、淀粉、氮和NSP的表观消化率以及AME的任何作用。另外，他们否定了这样的假说，即在脂肪酶之上的糖酶(包括木聚糖酶、葡聚糖酶和纤维素酶)的组合会通过降低消化物的粘度和增加脂肪消化和吸收而提高脂肪酶对营养物消化率的作用。
[0013] Al-Marzooqi和Leeson(1999)测试了来自动物来源和胰腺提取物的脂肪酶。虽然他们能够证明当这些添加剂用于饮食时脂肪消化率改善和在粪便水平上皂的水平下降，但他们也报道了厌食效应(饲料摄入的减少)，这一点他们解释为在这类提取物中可能存在缩胆囊素的污染。该事实限制了其在动物饲料中的利用和动物中生长或饲料效率的可能改进。
[0014] 本发明的一个目标是提供这样的饲料补充物，其能使至少一种营养物的可用性改善或者来自饲料材料的表观代谢能改善。
发明内容
[0015] 本发明基于这样的出乎意料的发现，即向饲料中添加包含至少一种特异性脂解酶和至少一种特异性植酸酶的饲料补充物，能导致与单独使用这些酶类相比，至少一种营养物和/或矿物质的摄入改善。
[0016] 根据本发明的最广泛的方面，提供了包含如下酶类的饲料补充物：-
[0017] i.至少一种脂解酶；和
[0018] ii.至少一种植酸酶。
[0019] 本发明人出乎意料地发现，与之前的报道(Mulyantini，N.G.A.等人，Aust.Poult.Sci.Symp，17，305-307(2005))相反，向饲料材料中添加包含至少一种特异性植酸酶和至少一种特异性脂解酶的饲料补充物以生产饲料，能导致至少一种营养物的可用性提高和/或表观代谢能(AME)的提高。
[0020] 虽然不想受理论的约束，但本发明人还是猜测，该出乎意料的发现可能是由于脂解酶在pH为酸性的消化早期阶段释放游离脂肪酸(FFA)的作用所致。这些FFA可与过量的钙结合而在肠中形成皂。于是可供与植酸盐结合的游离钙变少，从而增加胃肠道(GIT)中植酸和钙往往会形成抗植酸酶复合物的区域中的植酸酶活性。这导致磷酸盐释放和吸收增加。游离脂肪酸钙复合物随后在GIT中溶解，导致脂肪和钙吸收提高和/或AME提高。
[0021] 根据本发明的另一个方面，提供制备饲料补充物的方法，所述方法包括将至少一种脂解酶和至少一种植酸酶混合。
[0022] 根据本发明的另一个方面，提供包含饲料材料和根据本发明的饲料补充物或至少一种脂解酶和至少一种植酸酶的饲料。
[0023] 根据本发明的又一个方面，提供制备饲料的方法，所述方法包括向饲料材料添加根据本发明的饲料补充物或至少一种脂解酶和至少一种植酸酶。
[0024] 根据本发明的又一个方面，提供提高至少一种膳食营养物的可用性和/或提高来自饲料材料的表观代谢能(AME)的方法，所述方法包括向饲料材料添加包含至少一种脂解酶和至少一种植酸酶的组合的饲料补充物，或者向饲料材料添加至少一种脂解酶和至少一种植酸酶。
[0025] 根据本发明的又一个方面，提供提高动物的生长速率的方法，所述方法包括给动物饲喂有效量的根据本发明的饲料。
[0026] 根据本发明的又一个方面，提供至少一种植酸酶和至少一种脂肪酶在制造饲料中的用途，用来提高至少一种营养物的可用性和/或提高来自饲料材料的可利用代谢能。
[0027] 应认识到，本文公开的任何优选的特征都被认为同等适用于如上所述的任何方面，除非另有明确说明。任何优选的特征也被认为与本文公开的任何其他优选特征相组合进行公开。
[0028] 为了能有效作为动物饲料的酶添加剂，植酸酶必需兼有多种不同的性质。为了能够在动物的胃的酸性环境中降解植酸，其必须在低pH下、优选在宽广的pH值范围内具有活性。另外，它必须具有高特异性活性，优选具有高热稳定性，以使得它这种蛋白质能够承受在饲料(如颗粒饲料)的制备中常见的高温。
[0029] 还重要的是，该酶具有宽广的底物特异性，使得它能不仅水解植酸盐，而且能水解植酸盐降解的中间产物，如肌醇五磷酸、四磷酸和三磷酸。对植酸盐在猪中的降解的研究显示，若没有该酶则这些肌醇寡磷酸在小肠和大肠中保持基本上不可溶，从而难以接触动物和肠道微生物群落所产生的碱性磷酸酶(Schlemmer U.等人Arch.Anim.Nutr.55，255-280(2001))。已鉴别了不同的酶的底物特异性谱(profile)的变化。例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的植酸酶所产生的肌醇三磷酸基本上抵抗由此酶进行的进一步水解[Kerovuo J.等人Biochem J.352，623-628(2000)]。
[0030] 在优选的实施方案中，植酸酶优选是由Danisco A/S以商品名Phyzyme XPTM销售的大肠杆菌植酸酶。或者，植酸酶可以是布丘氏菌属(Buttiauxella)植酸酶，例如在WO2006/043178、WO 2008/097619、WO2008/092901和PCT/US2009/41011中所教导的植酸酶，将所有这些专利以引用方式并入本文。
[0031] 在最优选的实施方案中，植酸酶包含大肠杆菌植酸酶和/或布丘氏菌属植酸酶。更优选地，植酸酶包含具有SEQ ID NO：1-6或SEQ ID NO：13中任一种所示的氨基酸序列的多肽；或者与SEQ ID NO：1-6或SEQ ID NO：13中任一种相比具有一个或几个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽；或者与SEQ ID NO：1-6或SEQ ID NO：13中任一种具有至少70％、
80％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽；或者通过表达含有如下序列的核苷酸序列所产生的多肽：SEQ ID NO：11的序列；或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483，或者由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483不同的序列；或者与SEQ ID NO：11的序列或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483相比具有一个或几个核苷酸添加、缺失和/或置换的序列；或者与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。
80％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽；或者通过表达含有如下序列的核苷酸序列所产生的多肽：SEQ ID NO：11的序列；或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483，或者由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483不同的序列；或者与SEQ ID NO：11的序列或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483相比具有一个或几个核苷酸添加、缺失和/或置换的序列；或者与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。
[0032] 在一个优选的实施方案中，植酸酶至少在约pH 2.5至约pH 5.5范围内的pH下具有植酸酶活性。更优选地，当通过下文“材料和方法”部分中公开的植酸酶测定法测量时，植酸酶至少在约pH 2.5至约pH 3.5范围内以及在约pH 5至约pH 5.5范围内的pH下具有植酸酶活性。
[0033] 优选地，植酸酶具有至少100FTU/mg酶的比活性水平。更优选地，至少200、300、400、500、700、1000FTU/mg。
[0034] 应当理解，本文所用的1FTU(植酸酶单位)定义为在“材料与方法”部分中所述的pH 5.5下植酸酶测定中在本文所定义的反应条件下在一分钟内从底物释放1μmol的无机正磷酸盐所需的酶量。
[0035] 在优选的实施方案中，用于本发明的植酸酶具有在pH 2-5.5、优选4.0-4.5范围内的pH最佳值，保留pH 2.0-5.5范围内最大活性的至少50％和/或具有300FTU/mg以上的比活性。
[0036] 优选地，当通过下文“材料和方法”部分中所述的脂肪酶测定法测量时，用于本发明的脂解酶在约pH 1.5至约pH 5.5范围内的pH下具有脂肪酶活性。更优选地，脂解酶在约pH 1.5至约pH 3.5或约pH 2.0至约pH 3.5范围内的pH下具有脂肪酶活性。
[0037] 应当理解，用于本发明的脂解酶可以为任何合适的显示脂解酶活性(使用本文所定义的测定法)的脂解酶。优选地，脂解酶具有至少100LIPU/mg酶的活性水平。更优选地，至少200、300、400、500、700、1000LIPU/mg。
[0038] 本文所用的1LIPU(脂肪酶单位)定义为在下文“材料与方法”部分中所述的脂肪+酶测定中所描述的条件下每分钟释放1μmol的H 所需的酶量。
[0039] 在一个优选的实施方案中，用于本发明的脂解酶衍生自如WO98/45453中所述的丝状真菌塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。
[0040] 优选地，脂解酶包含：具有SEQ ID NO：7或8中所示的氨基酸序列的多肽；或者与SEQ ID NO：7或8相比具有一个或几个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽；或者与SEQ ID NO：7或8具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽；或者通过表达包含如下序列的核苷酸序列而产生的多肽：SEQ ID NO：9或10的序列；或者由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：9或10不同的序列；或者与SEQ ID NO：9或10的序列相比具有一个或几个核苷酸添加、缺失和/或置换的序列或者与SEQ ID NO：9或10具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。
[0041] 或者，脂肪酶可选自：来自Pseudomonas gessardii的酸性脂肪酶(Ramani，K.等人，J Ind Microbiol Biotechnol(2010)37：531-535)、来自少根根霉(Rhizopus arrhizus)的酸性脂肪酶(Kumar，KK.等人，Hindustan Antibiot Bull.1993 Feb-May；35(1-2)：33-42)(SEQ ID NO：32，33)、来自简青霉(Penicillium simplicissimum)的酸性脂肪酶(Gutarra M.L.E.等人，Bioresource Technology 100(2009)5249-5254)、来自黑曲霉(Aspergillus niger)NCIM 1207的酸性脂肪酶(Mhetras N.C.等人，Bioresource Technology100(2009)1486-1490，Pel，H.J.等人，Nat.Biotechnol.25(2)，221-231(2007))(SEQ ID NO：27)、来自例如人(SEQ ID NO：17，18)、牛(SEQ ID NO：19，20)、小鼠(SEQ ID NO：21，22)、大鼠(SEQ ID NO：23，24)和犬(SEQ ID NO：25，26)的哺乳动物胃脂肪酶(Chahinian，H.等人，Biochemistry 2006，45，993-1001)、来自蓖麻豆的酸性脂肪酶(Eastmond，P.J.The Journal of Biological Chemistry，279(2004)；45540-45545)(SEQ ID NO：28，29)和来自解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)的LIP2脂肪酶(Aloulou，A.等人，Biochimica et Biophysica Acta 1771(2007)228-237)(SEQ ID NO：30，31)。
[0042] 如上所指出，本发明人已发现本发明饲料补充物的性能的改善是由于脂解酶在消化的早期阶段释放游离脂肪酸(FFA)的作用所致的。这导致钙皂的形成和钙-植酸盐复合物的相关减少。
[0043] 在又一个优选的实施方案中，用于本发明的脂解酶在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞中产生，例如通过在里氏木霉宿主细胞中表达具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的序列的核苷酸产生。
[0044] 在又一个优选的实施方案中，根据本发明的饲料补充物包含：
[0045] i)脂解酶，其为由如下特征中的至少一种来表征的脂解酶：-
[0046] a)当通过本文公开的脂肪酶测定法测量时在约pH 1.5至约pH 3.5范围内的pH下具有脂肪酶活性的脂解酶；
[0047] b)包含具有SEQ ID NO：7或8中所示的氨基酸序列的多肽或者与SEQ ID NO：7或8具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽的脂解酶；
[0048] c)通过表达包含如下序列的核苷酸序列而产生的脂解酶：SEQ ID NO：9或10的序列；或者由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：9或10不同的序列；或者与SEQ ID NO：9或10具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列；和
[0049] ii)植酸酶，其为由如下特征中的至少一种来表征：-
[0050] d)细菌植酸酶；
[0051] e)当通过下文所述的植酸酶测定法测量时在约pH 2.5至约pH 3.5范围内的pH下具有植酸酶活性的植酸酶；
[0052] f)包含具有SEQ ID NO：1-6或SEQ ID NO：13中任一种所示的氨基酸序列的多肽或者与SEQ ID NO：1-6或SEQ ID NO：13中任一种具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽的植酸酶；
[0053] g)通过表达包含如下序列的核苷酸序列而产生的植酸酶：SEQ ID NO：11的序列或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483；或者由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483不同的序列；或者与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14的核苷酸253-1483具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。
[0054] 在又一个优选的实施方案中，饲料补充物包含脂解酶和植酸酶，脂肪酶活性(以脂肪酶单位(LIPU)测量)与植酸酶活性(以植酸酶单位(FTU))的比率在约1∶5至约12∶1的范围内，优选在约1∶3至约3∶1的范围内，更优选在约1∶1至约3∶1的范围内，如由下文描述的pH5.5下脂肪酶和植酸酶测定所定义的。
[0055] 优选地，其可用性得到提高的所述至少一种膳食营养物选自磷、钙、氨基酸、脂肪和/或淀粉。优选地，所述可用性在回肠和/或整个胃肠道中都得到改善。
[0056] 技术人员会认识到，用于本发明的脂解酶和植酸酶可作为液体或作为固体/颗粒状组合物独立提供。
[0057] 优选地，当所述酶为液体形式时，所述酶处于在培养包含所述酶的细胞之后所述酶已被分泌至其中的培养基中。优选地，所述培养基是无细胞的(即已从该培养基分离了细胞)。优选地，对所述培养基进行浓缩。应当理解，可将培养基进行制粒以提供固体酶组合物。
[0058] 还应理解，根据本发明的饲料补充物或至少一种脂解酶和至少一种植酸酶可以以溶液的形式提供或者作为固体提供，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
[0059] 在一个实施方案中，根据本发明的饲料补充物或至少一种脂解酶和至少一种植酸酶处于适合食用的液体制剂中，优选这种液体组合物含有缓冲剂、盐类、山梨醇和/或甘油。
[0060] 在一个另选的实施方案中，根据本发明的饲料补充物或至少一种脂解酶和至少一种植酸酶可作为一个或多个包含所述脂解酶和/或植酸酶的细胞提供。
[0061] 在一个实施方案中，将饲料补充物制粒或与其他酶一起制粒。
[0062] 优选地，饲料补充物还包含至少一种生理上可接受的载体。
[0064] 在一个实施方案中，植酸酶和/或脂解酶在生理上可接受的载体上干燥。
[0065] 在优选的实施方案中，饲料补充物可包含至少一种另外的酶。在优选的实施方案中，该至少一种另外的饲料酶选自那些参与淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶，参与糖原代谢的蛋白质或酶，乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、-半乳糖苷酶、-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、-葡萄糖苷酶(包括β葡萄糖苷酶)、葡糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC1.1.3.5)、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、果胶酶、纤维二糖水解酶、酸性磷酸酶和/或其他酶类或者它们的组合。这些包括例如能调节饲料的粘度的酶类。
[0066] 在一个更优选的实施方案中，饲料补充物包含植酸酶、脂解酶、木聚糖酶和/或淀粉酶。在一个最优选的实施方案中，饲料补充物包含植酸酶、脂解酶、木聚糖酶和淀粉酶。
[0067] 优选地，淀粉酶以10U/kg-10000U/kg饲料的范围存在，更优选100U/kg-7500U/kg，甚至更优选500U/kg-5000U/kg。应理解，一淀粉酶单位是在pH 6.5和37℃下每分钟从水不溶性交联淀粉聚合物底物释放1mmol的糖苷键的酶量。
[0068] 优选地，木聚糖酶以100U/kg-10000U/kg饲料的范围存在，更优选250U/kg-7500U/kg，甚至更优选500U/kg-5000U/kg。应理解，一木聚糖酶单位是在pH 5.3和50℃下每分钟从燕麦斯佩耳特小麦木聚糖底物释放0.5μmol的还原糖当量(通过DNS[4])还原糖法以木糖计)的酶量。(Bailey，M.J.Biely，P.和Poutanen，K.，Journal of Biotechnology，第23卷，(3)，1992年5月，257-270)。
[0069] 应理解，饲料补充物可用于任何合适的动物。优选地，动物是单胃动物，例如禽或猪。
[0070] 显然的是，饲料补充物可以以任何合适的量含有至少一种植酸酶和至少一种脂解酶。优选地，饲料补充物包含至少0.1重量％的脂解酶和植酸酶(单独地或作为组合百分数)。更优选地，饲料补充物可包含至少0.5重量％、至少1重量％、至少2重量％、至少3重量％、或至少4、5、6、7、8、9或10重量％的脂解酶和植酸酶(单独地或作为组合百分数)。
[0071] 对于技术人员显而易见的是，根据本发明的饲料补充物或至少一种脂解酶和至少一种植酸酶还可包含其他组分，如稳定剂和/或增量剂和/或其他酶类。
[0072] 优选地，根据本发明的饲料补充物或至少一种脂解酶和至少一种植酸酶对于高达约70℃、高达约85℃或高达约95℃的热处理将是热稳定的。热处理可进行长达约1分钟、长达约5分钟、长达约10分钟、长达约30分钟、长达约60分钟。术语“热稳定的”意指在加热到指定温度之前在添加剂中存在/有活性的酶组分有至少约75％在其冷却到室温后仍存在/有活性。优选地，在加热到指定温度之前在添加剂中存在和有活性的酶组分有至少约80％在其冷却到室温后仍存在和有活性。
[0073] 根据本发明的饲料补充物或至少一种脂解酶和至少一种植酸酶可具有大于约30个星期、大于约40个星期、大于约50个星期、大于约1年、大于约1.5年的贮藏期。贮藏期意指在添加剂制备时在添加剂中存在和有活性的酶组分有至少约80％仍存在和有活性。
[0074] 优选地，制备根据本发明的饲料补充物的方法包括混合步骤，该步骤包括将至少一种植酸酶和至少一种脂解酶任选与至少一种生理上可接受的载体进行混合。
[0075] 在一个特别优选的实施方案中，将饲料补充物均化以产生粉末。
[0076] 在一个另选的优选实施方案中，如WO2007/044968中所述将饲料补充物配制成颗粒(称为TPT颗粒)。
[0077] 在另一个优选的实施方案中，当将饲料补充物配制成颗粒时，颗粒包含涂覆在蛋白质芯上的水合阻挡盐。这种盐涂层的优点在于使耐热性改善，使保藏稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响该酶的饲料添加剂的影响。
[0078] 优选地，用于盐涂层的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或者大于60％的恒定湿度。
[0079] 优选地，盐涂层包含Na2SO4。
[0080] 制备饲料补充物的方法还可包括将粉末粒化的另外步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可迫使粉末或包含粉末的混合物通过模具，并将所得的料条切成可变长度的合适粒料。
[0081] 任选地，粒化步骤可包括在粒料形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调理机中，例如带蒸汽喷射的混合机。将混合物在调理机中加热至指定的温度，如60-100℃，典型的温度将为70℃、85℃、90℃或95℃。停留时间不定，可从数秒钟到数分钟甚至数小时。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。
[0082] 应认识到，本发明的饲料补充物适合添加到任何适宜的饲料材料。
[0084] 在一些实施方案中，饲料材料将包含如下组分中的一种或多种：a)谷类，如小谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大谷物如玉蜀黍或高粱；b)谷类的副产物，如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、小麦麸皮、粗小麦粉、次小麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)从诸如如下的来源获得的蛋白质：大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、小麦、干椰子肉、芝麻；d)从植物和动物来源获得的油类和脂肪；e)矿物质和维生素。
[0085] 还显然的是，本发明的饲料补充物当添加到高植酸盐饲料材料时是特别有利的。
[0086] 本文所用的术语饲料指已添加了一种或多种饲料补充物的饲料材料。
[0087] 技术人员会认识到，不同的动物要求不同的饲料，甚至同一种动物也可能要求不同的饲料，这取决于饲养该动物的目的。还应理解，取决于初始饲料材料，饲料可以是高纤维饲料或低纤维饲料。
[0088] 优选地，饲料可包含这样的饲料材料，其包含玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、黑麦、大米、木薯、高粱和/或任何副产物，以及富含蛋白质的成分，如大豆粉、油菜籽粉、卡诺拉粉、棉籽粉、葵花籽粉、动物副产物粉和它们的混合物。更优选地，饲料可包含动物脂和/或植物油。
[0089] 任选地，饲料还可含有额外的矿物质(例如钙)和/或额外的维生素。
[0090] 技术人员会清楚，本发明的饲料补充物当用于钙含量高的饲料中时将是特别有益的。更具体而言，钙和植酸盐含量高的饲料。
[0091] 技术人员会清楚，代表高钙饮食的钙水平可随动物的类型甚至饲养动物的用途而变。例如，对于下蛋的母鸡，含量＞3％的饮食将是高钙饮食。对于肉鸡和所有火鸡，钙含量＞1％的饮食将是高钙饮食。出于本发明的目的，高钙饮食认为是包含至少1-2％钙的饮食。
[0092] 技术人员还会清楚，高植酸盐饮食是包含＞0.90重量％的植酸的饮食。
[0093] 如本文所定义，低纤维饲料是这样的包含一种或多种饲料材料的饲料，其含有的水不溶性细胞壁的最大含量为约25％，和/或可溶性非淀粉多糖的最大含量为约4％。更优选地，水不溶性细胞壁的最大含量为约22.5％、约20％、约17.5％、约15％、约12.5％；和/或可溶性非淀粉多糖的最大含量为约3％、约2.5％、约2％、约1.75％、约1.5％、约
1.25％。
1.25％。
[0094] 在优选的实施方案中，将根据本发明的饲料补充物或至少一种脂解酶和至少一种植酸酶与至少一种低纤维饲料材料(例如玉米、小麦、动物副产物粉或大豆和/或任何副产物)混合，以提供低纤维饲料。
[0095] 优选地，饲料为玉米大豆粉混合物。
[0096] 优选地，饲料材料不是脱脂米糠。
[0097] 在优选的实施方案中，饲料包含的植酸酶水平为约250FTU/kg至约15,000FTU/kg饲料(例如250-10,000FTU/kg、400-7,500FTU/kg以及500-5000FTU/kg)。
[0098] 在另外优选的实施方案中，饲料包含的脂解酶水平为约125LIPU/kg至约45,000LIPU/kg饲料(例如500-30,000LIPU/kg、1000-20000LIPU/kg以及3000-10000LIPU/kg)。
[0099] 技术人员会很清楚，为了使本发明的饲料补充物能提供所宣称的优点，植酸盐必须存在于饲料材料或饲料中。还应很清楚的是，这个植酸盐可以作为饲料材料的组分天然存在，或者可作为额外的补充物以所需的水平添加。
[0100] 在另一个方面，提供生产饲料的方法。饲料通常在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的颗粒大小，然后与适宜的添加剂混合。然后可将饲料生产成糊料或粒料；后者通常涉及这样的方法：将温度提高的目标水平，然后使饲料通过模具以生产出特定大小的粒料。让粒料冷却。随后，可添加液体添加剂如脂肪和酶。饲料的生产还可涉及这样的额外步骤，其包括在进行粒化之前先进行挤出或膨胀-具体而言通过可包括至少使用蒸汽的合适技术来进行。
[0101] 饲料可以是用于单胃动物如禽(如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)、猪(所有年龄类别)、宠物(例如狗、猫)或鱼。
[0102] 任选地，饲料可包含另外的添加剂。例如，可将钙以任何合适的量添加到饲料中以补充动物的饮食和/或作为增量剂。钙可以为有机钙形式(例如多叶绿色植物)或无机钙形式(石灰石/碳酸钙)。优选地，在添加钙补充物后，饲料将包含至少约0.5％的钙。更优选地，至少约0.8％、至少约1.0％、至少约2.0％、至少约3％的钙。
[0103] 饲料可包含至少0.0001重量％的饲料补充物。合适地，饲料可包含至少0.0005重量％、至少0.0010重量％、至少0.0020重量％、至少0.0025重量％、至少0.0050重量％、至少0.0100重量％、至少0.020重量％、至少0.100重量％、至少0.200重量％、至少0.250重量％、至少0.500重量％的饲料补充物。
[0104] 在又一个方面，提供至少一种植酸酶和至少一种脂解酶用于制造饲料的用途，用于提高至少一种营养物的可用性和/或提高来自饲料材料的可利用代谢能。
[0105] 优选地，将该至少一种植酸酶和至少一种脂解酶配制成饲料补充物。更优选地，饲料补充物是根据本发明的饲料补充物。
[0106] 在优选的实施方案中，该至少一种营养物选自磷、钙、总脂肪和/或氨基酸。
[0107] 本文所用的术语“提高至少一种营养物的可用性和/或提高可利用代谢能”意指与可从单位重量的没有添加植酸酶和脂解酶或饲料补充物的饲料材料获得的营养物或能量相比，食用单位重量的所述饲料时可供动物使用的营养物或能量的量的提高。
[0109] 现将参考如下附图描述本发明，其中：-
[0110] 图1示出了野生型布丘氏菌属植酸酶的氨基酸序列(SEQ ID No.1)。
[0111] 图2示出了命名为BP-112的布丘氏菌属植酸酶变体的氨基酸序列(SEQ ID No.2)。
[0112] 图3示出了野生型布丘氏菌属植酸酶和4种布丘氏菌属植酸酶变体的氨基酸比对(SEQ ID NO.1-5)。
[0113] 图4示出了命名为BP-11的另一种布丘氏菌属植酸酶变体的氨基酸序列(SEQ ID No.6)。
[0115] 图6示出了塔宾曲霉的脂解酶的氨基酸序列(SEQ ID No.8)，其除了内源信号肽已被去除之外与SEQ ID No.7相同。
[0116] 图7示出了编码包含信号肽的塔宾曲霉脂解酶(如SEQ ID No.7中所示)的核苷酸序列—该核苷酸序列是基因组DNA序列(已被命名为SEQ ID No.9)。信号肽序列以粗体显示，内含子以小写字母显示。
[0117] 图8示出了编码不包含信号肽的塔宾曲霉脂解酶(如SEQ ID No.8中所示)的核苷酸序列-该核苷酸序列是基因组DNA序列(已被命名为SEQ ID No.10)。内含子以小写字母显示。
[0118] 图9示出了源自布丘氏菌属的植酸酶变体BP-17、BP-110、BP-111和BP-112以及Phyzyme XP、Natuphos和Ronozyme P对渐增的胃蛋白酶浓度的抗性。
[0119] 图10示出了Technological Institute in Kolding的粒化装置的示意图。
[0120] 图11示出了得自用于本发明的三种植酸酶B变体的粒化试验的相对残余活性。
[0121] 图12示出了当将Phyzyme XP(一种大肠杆菌植酸酶)配制在全磨(whole grounded)小麦上时的相对残余活性。
[0122] 图13示出了试验结果，在该试验中将植酸酶从带涂层的Ronozyme产品提取出来并配制在全磨小麦上以研究植酸酶分子在没有保护的情况下的热稳定性。
[0123] 图14-17示出了在不同pH下用于本发明的植酸酶和对照物对植酸盐的活性。
[0124] 图18和19是HPLC色谱图，其清楚显示来自布丘氏菌属变体的植酸酶在高于85℃的温度下催化了植酸的水解。
[0125] 图20示出了含有塔宾曲霉脂肪酶3基因组DNA的pDONR221::lip 3。
[0126] 图21示出了最终的脂肪酶表达构建体ATlipase3Trex。
[0127] 图22示出了编码野生型布丘氏菌属植酸酶的核苷酸序列(SEQ ID No：11)。
[0128] 图23A示出了插导管的猪的回肠能量消化系数(SEM＝0.0009)。带不同字母的柱条以P＜0.05水平差异。
[0129] 图23B示出了插导管的猪的回肠粗蛋白质消化系数(SEM＝0.0009)。带不同字母的柱条以P＜0.05水平差异。
[0130] 图24示出了猪的总管道(total tract)可消化能量系数(SEM＝0.009)。带不同字母的柱条以P＜0.05水平差异。
[0131] 图25A示出了猪的总管道钙保持率(SEM＝0.027)。带不同字母的柱条以P＜0.05水平差异。
[0132] 图25B示出了猪的总管道磷保持率(SEM＝0.030)。带不同字母的柱条以P＜0.05水平差异。
[0133] 图26示出了包含信号序列的野生型大肠杆菌植酸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。
[0134] 图27示出了成熟野生型大肠杆菌植酸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。
[0135] 图28示出了编码野生型大肠杆菌植酸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。
[0136] 图29示出了当玉米-大豆饲料与多种脂解酶/植酸酶组合一起温育时，游离脂肪酸从玉米-大豆饲料的产生。
[0137] 图30示出了抗植酸酶的植酸和钙复合物的产生以及通过添加游离脂肪酸进行的逆转。图30A示出了渐增的CaCl2浓度对植酸酶活性的影响。图30B示出了向含有15mM的反应混合物添加游离脂肪酸对植酸酶活性的影响。
[0138] 图31示出了抗植酸酶的植酸和钙复合物的产生以及通过添加包含脂肪酶的脂肪酶反应混合物进行的逆转。图31A示出了渐增的CaCl2浓度对植酸酶活性的影响，图31B示出了向含有30mM CaCl2的植酸酶反应混合物添加脂肪酶反应混合物对植酸酶活性的影响。
[0139] 图32示出了在玉米-大豆饮食中测量的脂肪酶3和胰腺脂肪酶的pH谱。
[0140] 图33显示磷在肉鸡中的回肠消化系数。带不同字母的柱条以P＜0.05水平差异。
[0141] 图34示出了钙在肉鸡中的回肠消化系数。带不同字母的柱条以P＜0.05水平差异。
[0142] 图35示出了磷在肉鸡中的总管道保持系数。带不同字母的柱条以P＜0.05水平差异。
[0143] 图36钙在两个肉鸡实验中的总管道保持系数。带不同字母的柱条以P＜0.05水平差异。
[0144] 图37示出了本发明人关于涉及脂肪酶和植酸酶在禽消化道中的相互作用的机制的假设。该图显示了所观察到的脂肪酶和植酸酶之间的协同作用的可能机制的示意图。由于脂肪酶3在酸性条件下的作用，与没有脂肪酶3的情况相比，游离脂肪酸(FFA)在消化前期阶段释放出来。这些FFA可与过量的钙(Ca)结合而在肠子中形成皂。于是可供结合植酸(IP6)并形成抗植酸酶的复合物的游离钙变少。最终，与没有添加脂肪酶3的情况相比，更多的IP6被植酸酶降解。这导致磷酸盐(P)释放和随后动物吸收的增加。FFA-Ca复合物之后可在消化道中溶解，导致脂肪和钙吸收增加。如果没有植酸酶存在以水解IP6，这可与FFA-Ca皂复合而形成不溶性的非可降解的IP6-Ca-FFA皂，从而导致脂肪、钙和磷吸收的降低。
具体实施方式
[0145] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，20ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)以及Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了在本公开文本中用到的许多术语的一般词典。
[0146] 本公开文本并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开文本的实施方案的实施或试验。数值范围包括限定该范围的数字。除非另有指明，否则分别地，核酸序列是从左到右以5′-3′取向书写，氨基酸序列是从左到右以氨基到羧基方向书写。
[0147] 本文提供的标题并非对本公开文本的各个方面或实施方案的限制，这些方面或实施方案可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下面就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。
[0148] 氨基酸在本文中用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代。
[0149] 本文所用的术语“同源物”是指与所述氨基酸序列和所述核苷酸序列具有一定的同源性的实体。本文中，术语“同源性”可等同于“同一性”。合适地，“同源(的)”在这个上下文中指两种酶之间在用下文更详细描述的比对算法将它们的序列进行比对后所得的序列同一性百分数。
[0150] 在本发明的上下文中，同源氨基酸序列被认为包括与所述序列可具有至少75、80、81、85或90％同一性，优选至少95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含相同的活性位点等-例如与主题氨基酸序列的相同。尽管同源性可以相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)考虑，但在本发明的语境中优选以序列同一性表达同源性。
[0152] 对于氨基酸序列和核苷酸序列，同源性比较可通过眼睛，或更通常地，借助于易于获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的％同源性。
[0153] ％同源性可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对较短数目的残基上进行。
[0154] 尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
[0155] 然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位打分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，对于氨基酸序列的默认空位罚分为：空位-12，每个空位延伸-4。
[0156] 最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等人1984 Nuc.Acids Research 12第387页)。可进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等人，1999Short Protocols in Molecular Biology，第4版-第18章)、FASTA(Altschul等人，1990 J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具包。BLAST和FASTA二者均可用于离线或在线搜索(参见Ausubel等人，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第7-58至7-60页)。
[0157] 然而，对于某些应用，优选使用GCG Bestfit程序。一种称为BLAST 2Sequences的新工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
[0158] 尽管最终的％同源性可以同一性测量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度相似性打分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见手册)。对于某些应用，优选使用GCG软件包的公共默值，或者在其他软件的情形中，使用默认矩阵，如BLOSUM62。
[0159] 作为另一种选择，百分比同源性可用DNASISTM(Hitachi Software)中的多比对功能，基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene73(1)，237-244)的算法计算。
[0160] 一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分该软件通常进行这些计算，并产生数值结果。
[0161] 在本发明的一个优选方面，使用如下软件和设置来计算序列同源性/同一性百分数。对于氨基酸序列，通过AlignX VectorNTI(Vector NTI Advance9.1，得自Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，USA.)针对每个可能的氨基酸序列对计算同一性(同源性)或“阳性”的百分数。设置值是默认参数(空位开放罚分-10，空位延伸罚分0.1)。
[0162] 对于核酸序列，通过得自Informax Inc.(USA)的AlignX VectorNTI程序针对每个可能的核酸序列对计算同一性(同源性)或“阳性”的百分数。设置值是DNA的默认设置值：空位开放罚分：15，空位延伸罚分：6.66。(与多序列比对的设置值相同)。
[0163] 优选地，计算全长氨基酸序列的氨基酸同一性(同源性)，或者对于核酸而言，编码各自全长氨基酸序列的相应多核苷酸。
[0164] 序列还可具有氨基酸残基的插入或置换，该插入或置换产生了沉默改变和导致功能等价的物质。可根据氨基酸性质(如残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质)的相似性作出有意的氨基酸置换，因此按官能团将氨基酸归类在一起是有用的。氨基酸可单独根据它们的侧链归类在一起。但是，更有用的是也将突变数据包括在内。由此衍生的氨基酸组别由于结构原因很可能是保守的。这些组别可以以Venn图表的形式描述(Livingstone C.D.和Barton G.J.(1993)“Protein sequence alignments：a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation”Comput.Appl Biosci.9：
745-756)(Taylor W.R.(1986)“The classification of amino acid conservation”J.Theor.Biol.119；205-218)。保守置换可例如按照下表作出，该表描述了公认的氨基酸Venn图表归类。
745-756)(Taylor W.R.(1986)“The classification of amino acid conservation”J.Theor.Biol.119；205-218)。保守置换可例如按照下表作出，该表描述了公认的氨基酸Venn图表归类。
[0165]
[0166]
[0167] 本发明还涵盖可能发生的同源置换(置换和取代二者在本文中均用于意指现有的氨基酸残基与备选残基的互换)，即对等置换，如碱性的置换碱性的，酸性的置换酸性的，极性的置换极性的等等。非同源置换也可以发生，即从一类残基置换为另一类，或者作为另一种选择涉及包括非天然的氨基酸如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
[0168] 置换还可通过非天然氨基酸进行。
[0169] 本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
[0170] 术语“与...等同的氨基酸”、“与...相对应的氨基酸”以及其语法上等价的术语在本文中用于指具有与在具体蛋白质的具体氨基酸序列中指出的相似的位置和作用的蛋白质的氨基酸残基。本领域技术人员将会认识到可比蛋白质中指定残基的等同物。
[0171] 如本文所用，在多肽的语境中术语“性质”或其语法上等价的术语指多肽的可被选择或检测的任何特征或属性。这些性质包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、温度和/或pH活性谱、饲料加工稳定性和被分泌的能力。
[0172] 如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
[0173] 氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或者其可通过合成制备或者其可通过利用重组DNA技术制备。
[0174] 术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)的定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。
[0175] 术语“信号序列”或“信号肽”指可参与该蛋白质的成熟形式或前体形式的分泌的核苷酸和/或氨基酸的任何序列。信号序列的这个定义是功能性定义，意在包括所有那些由该蛋白质基因的N末端部分所编码的、参与蛋白质分泌的实现的氨基酸序列。它们往往但并不普遍地结合到蛋白质的N末端部分或者结合到前体蛋白质的N末端部分。
[0176] 所谓“功能性片段”其意指多肽保留该多肽的特征性性质的片段。在本发明的情形中，植酸酶或脂解酶的功能片段为保留整个蛋白质的植酸酶或脂解酶裂解能力的片段。
[0177] 术语“分离的”、“回收的”或“纯化的”指从其原始环境中移除出来的材料。术语“基本上纯化的”意指该材料已被纯化至至少相当大的程度。
[0178] 在一个方面，优选地，核苷酸或氨基酸序列为分离的形式。术语“分离的”意指该序列至少基本上不含与该序列在自然界中天然结合或者在自然界中存在的至少一种其他组分。
[0179] 术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施方案之前，应理解本公开文本并不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体的实施方案的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。
[0180] 在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定的范围中的任何规定值或中间值与该规定的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开文本内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个界限被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开文本中，但依据该规定的范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开文本中。
[0181] 必须指出，本文和所附权利要求书中用到的名词既有单数含义也有复数含义，除非上下文另有清楚规定。因此，例如，提到“基因”则包括多个这种候选物质，而提到“细胞”则包括提到一个或多个细胞以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。
[0183] 用于本发明的酶可通过固体培养或深层培养来产生，包括分批工艺、补料分批工艺和连续流工艺。培养在包含培养基中完成，该培养基包含含水矿物盐培养基、有机生长因子、碳和能源物质、分子氧以及当然还有待使用的一种或多种特定微生物物种的起始种菌。
[0184] 除了碳源和能源、氧气、可同化氮和微生物种菌外，还有必要以恰当比例提供合适量的矿质营养素来确保正常的微生物生长，使微生物转化过程中细胞对碳源和能源的同化最大化，以及在发酵培养基中细胞密度最大的情况下获得最大的细胞收率。
[0185] 部分取决于所采用的微生物和底物，含水矿物质培养基可在宽泛的范围内变化，这是本领域已知的。除了氮以外，该矿物质培养基还应该包括合适的可溶性可同化离子形式和化合形式的合适量的磷、镁、钙、钾、硫和钠，还优选应存在某些痕量元素如酮、锰、钼、锌、铁、硼和碘等等，同样它们也为可溶性可同化形式，这些全部是本领域已知的。
[0186] 该发酵反应是一有氧过程，其中所需的分子氧通过含有分子氧的气体如空气、富氧空气或甚至基本上纯的分子氧提供，只要维持发酵容器的内容物具有可有效用于帮助微生物物种旺盛生长的合适的氧分压。实际上，通过使用含氧烃底物，微生物生长的氧需求得以减少。然而，必须提供分子氧用于生长，因为底物的同化以及微生物的相应生长在一定程度上是燃烧过程。
[0187] 尽管通气速率可在相当宽泛的范围内变化，通气通常以这样的速率进行，该速率在每分钟每发酵罐中的液体体积约0.5至10、优选约0.5至7体积(在所采用的压力以及在25℃下)的含氧气体的范围内。该量是以提供给反应器的常氧含量的空气计的，就纯氧而言，相应的范围将会是每分钟每发酵罐中的液体体积约0.1至1.7，或优选约0.1至1.3体积(在所采用的压力下以及在25℃下)的氧。
[0188] 微生物转化过程所采用的压力可很大变化。压力通常在约0至50psig、本发明优选约0至30psig的范围内，更优选至少稍高于大气压，这要权衡设备和操作费用对所实现的氧溶解度。高于大气压是有利的，因为这种压力的确趋于增加含水发酵物中的溶解氧浓度，其继而可有助于增加细胞生长速率。同时要考虑这样一个事实进行权衡：高大气压显然会增加设备和操作费用。
[0189] 发酵温度可有一定程度变化，但对于丝状真菌如里氏木霉，温度通常将会在约20℃至40℃的范围内，通常优选在约25℃至34℃的范围内，这取决于所选择的微生物菌株。
[0190] 微生物还需要可同化的氮源。可同化的氮源可以是任何含氮化合物或能够释放适于微生物进行代谢利用的形式的氮。虽然可采用多种有机氮源化合物，例如蛋白质水解产物，通常可利用廉价的含氮化合物如氨、氢氧化铵、尿素和多种铵盐如磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵或多种其他氨化合物。氨气本身便于大规模操作，并且可通过鼓泡通过含水发酵物(发酵培养基)以合适的量使用。同时，还可采用这种氨来帮助进行pH控制。
[0191] 含水微生物发酵物(发酵混合物)中的pH范围应该是在约2.0至8.0的示例性范围内。使用丝状真菌时，pH通常在约2.5至8.0的范围内；使用里氏木霉，pH通常在约3.0至7.0的范围内。某些微生物的pH范围偏好在某种程度上取决于所采用的培养基，以及特定的微生物，因而改变pH在一定程度上可由本发明技术人员容易地确定。
[0192] 虽然部分取决于所采用的发酵温度和培养物，发酵罐中的发酵混合物的平均保持时间可有相当大的变化，一般而言其将处于约24至500小时，本发明优选约24至400小时的范围内。优选地，发酵在使得含碳底物可被控制为限制性因素的方式进行，从而为细胞提供了含碳底物的良好转化并避免相当量的未转化底物对细胞的污染。后一种情况对水溶性底物而言没有问题，因为任何剩余的痕量物质均可容易地洗掉。然而，在非水溶性底物的情况下这可能是个问题，需要增加的产物处理步骤如合适的洗涤步骤。如上所述，达到该水平的时间不是关键的，可随特定的微生物和所进行的发酵过程而变化。然而，本领域熟知如何确定发酵培养基中的碳源浓度以及所需的碳源水平是否已经达到。
[0193] 尽管发酵可以分批或连续操作进行，但为了易于控制、产生均一量的产物以及最经济地使用所有设备，分批补料操作是更为优选的。如果需要，可在将含水矿物质培养基供料至发酵罐之前将碳源和能源物质的部分或全部和/或可同化氮源如氨的部分添加至该含水矿物质培养基。优选以预定的速率，或者响应可通过监测例如碳和能量底物的浓度、pH、溶解氧、从发酵罐排出的废气中的氧或二氧化碳而确定的需要来控制引入反应器的每一种料流。多种材料的进料速度可以变化以便获得与碳和能量源的有效利用相一致的尽可能快的细胞生长速率，以相对于底物给料获得尽可能高的微生物细胞产量。
[0194] 在分批操作或优选的分批补料操作中，一开始对所有的设备、反应器或发酵装置、器皿或容器、管线、附带的循环或冷却设备等等进行灭菌，通常通过采用蒸汽例如在约121℃下至少约15分钟。然后在存在所有所需的营养物，包括氧和含碳底物的情况下，用所选微生物的培养物接种灭菌过的反应器。所采用的发酵罐的类型不是关键的，但本发明优选的是在15LBiolafitte(Saint-Germain-en-Laye，France)下操作。
[0195] 从发酵液收集和纯化本发明的酶也可通过本领域本身已知的程序进行。发酵液将通常含有细胞碎屑，包括细胞、多种悬浮固形物和其他生物质污染物，以及所需的本发明酶产物，优选将它们通过本领域已知的手段从发酵液移除。适用于这种移除的方法包括常规的固体-液体分离技术如，例如离心、过滤、透析、微量过滤、旋转真空过滤或其他已知的方法，以产生无细胞滤液。可能优选的是使用诸如超滤、蒸发或沉淀之类的技术进一步浓缩发酵液或无细胞滤液。沉淀上清液或滤液的蛋白质性组分可使用盐，例如硫酸铵来完成。进一步的纯化可任选通过结晶或通过多种色谱分析程序，例如离子交换色谱、亲合色谱或类似的本领域公认的程序来实现。
[0196] 植酸酶
[0198] 本文所用的术语“植酸酶”或“植酸酶活性”指能够催化植酸盐水解成(1)肌醇和/或(2)其单磷酸盐、二磷酸盐、三磷酸盐、四磷酸盐和/或五磷酸盐以及(3)无机磷酸盐的蛋白质或多肽。例如，具有如在酶学委员会EC号3.1.3.8或EC号3.1.3.26中定义的催化活性的酶。
[0199] 一些植酸酶除了能够水解植酸盐以外，还能够水解中度磷酸化的肌醇-磷酸中的至少一些。
[0200] 术语“植酸酶变体”或“变体”或“修饰形式”指这样的植酸酶，其氨基酸序列衍生自亲本植酸酶的氨基酸序列，但具有一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失，它们一起称为“突变”。
[0201] 术语“亲本植酸酶”或“亲本酶”指植酸酶变体所衍生自的植酸酶。亲本植酸酶可以是野生型植酸酶或另一种植酸酶变体。具体而言，在本发明中，“亲本植酸酶”可如WO99/08539、US 5876997、US 6190897和AU 735371、EP 1003379以及JP 2001514869中所述衍生自布丘氏菌属或大肠杆菌，将所有这些专利以引用方式并入本文。合适地，“亲本植酸酶”衍生自如WO2006/043178中所述以登录号NCIMB41248保藏的布丘氏菌P1-29株。
[0202] 术语“大肠杆菌植酸酶”和“布丘氏菌属植酸酶”意指所述酶不需要已从大肠杆菌或布丘氏菌属的来源获得。而是，所述酶优选必需具有与大肠杆菌或布丘氏菌属植酸酶相同的功能特性或序列。例如，布丘氏菌属植酸酶可以是衍生自布丘氏菌属、但不在布丘氏菌属中物种中天然存在的变体。
[0203] 术语“布丘氏菌属”指肠杆菌科的革兰氏阴性兼性厌氧细菌属，布丘氏菌属物种包括乡间布丘氏菌(B.agrestis)、B.brennerase、B.ferragutiae、B.gaviniae、B.izardii、诺氏布丘氏菌(B.noackiae)和B.warmboldiae。布丘氏菌的菌株可例如获自美国模式培养物保藏所(ATCC)和德国国家生物材料资源中心(DSMZ)。
[0204] 布丘氏菌植酸酶优选通过WO 2006/043178中所述的方法从布丘氏菌鉴定出来。
[0205] 在一个另选的实施方案中，亲本植酸酶或植酸酶可如WO2006/038062中所述衍生自枸橼酸杆菌属物种(Citrobacter sp.)。
[0206] 本文所用的术语“野生型植酸酶”或“野生型”描述具有在自然界中存在的氨基酸序列的植酸酶。具体而言，野生型布丘氏菌属植酸酶为如SEQ ID.No.1中所示。野生型大肠杆菌植酸酶为如SEQ ID No.13(图27)中所示。
[0207] 本文所用的术语“植酸酶变体”意指这样的植酸酶，其氨基酸序列与SEQ.ID NO：1或SEQ ID No.13的植酸酶的氨基酸序列相比，差别在于至少一个氨基酸置换、插入和/或缺失。本文所用的术语“变体”和“变异”仅仅意指该植酸酶变体的氨基酸序列与SEQ.ID NO：1或13的氨基酸序列之间存在差异，并不意指SEQ.ID NO：1或13或任何其他植酸酶的氨基酸序列以任何方式充当起始材料和/或被物理上改变、突变、修饰或以别的方式变更以产生该变体。简单地说，用于本发明的植酸酶变体可通过任何方法制备，且技术人员会容易地熟悉各种制备植酸酶变体的方法，其中一些方法中本文中有描述。
[0208] 用于本发明的变体植酸酶的实施方案(例如变体布丘氏菌属植酸酶)在WO2006/043178、WO 2008/097619和PCT/US2009/41011中公开，将所有这些专利以引用方式特地并入本文，它们描述了可获自或衍生自亲本布丘氏菌的植酸酶和对应于布丘氏菌植酸酶的植酸酶。具体而言，WO2006/043178描述了具有在其中公开为SEQ ID NO：3的序列的野生型植酸酶的诱变。在WO 2006/043178中教导了许多优选的突变。PCT/US2009/41011教导了另外优选的突变。具体优选的突变在本文中公开为SEQ ID NO：2-6，它们代表：
[0209] 植酸酶BP-11(有时称为BP 11)-其为在至少PCT申请WO2006/043178中描述的植酸酶，且可从Danisco A/S获得。其氨基酸序列在本文中描述为SEQ ID NO：6。植酸酶BP-17(有时称为BP 17)-其为在至少PCT申请WO 2008/097619中描述的植酸酶，且可从Danisco A/S获得。其氨基酸序列在本文中描述为SEQ ID NO：3。
[0210] BP-110(有时称为BP 17 var.110，或者有时它被称为BP17-110或BP17 110)-其为在至少PCT申请PCT/US2009/41011中描述的植酸酶。其氨基酸序列在本文中描述为SEQ ID NO：4。
[0211] BP-111(有时称为BP 17 var.111，或者有时它被称为BP17-111或BP17 111)-其为在至少PCT申请PCT/US2009/41011中描述的植酸酶。其氨基酸序列在本文中描述为SEQ ID NO：5。
[0212] BP-112(有时称为BP 17 var.112，或者有时它被称为BP17-112或BP17 112)-其为在至少PCT申请PCT/US2009/41011中描述的植酸酶。其氨基酸序列在本文中描述为SEQ ID NO：2。
[0213] BP-11(SEQ ID NO：6)、BP-17(SEQ ID NO：3)、BP-110(SEQ ID NO：4)、BP-111(SEQ ID NO：5)和BP-112(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列在图3示出。
[0214] 当提及SEQ ID NO：1-6和包含SEQ ID NO：1-6的多肽时，设想到这也指在表达过程中进行共翻译加工或翻译后加工(例如通过信号肽切割)的多肽。翻译后切割也可出现在C末端。因此，在一个优选的实施方案中，其有效片段(也称为其功能片段)是由天然宿主或合适的适当表达宿主所产生的成熟多肽。
[0215] 在另一个实施方案中，植酸酶的特征在于其衍生自如WO 2006/043178中所述以登录号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌P1-29株。
[0216] 根据本发明的饲料补充物可包括这样的植酸酶，其由于亲本植酸酶的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基的修饰，具有亲本植酸酶的特性的改善。
[0217] 用于本发明的改善的植酸酶优选与SEQ ID NO：3或其有效片段具有超过75％、优选超过80％、更优选超过90％、更优选超过95％、96％、97％、98％、优选超过99％的同一性。然而，还设想到变体可以与SEQ ID No：3异源(即不同源)。例如，通过重组技术(如exo介导的重组)或家族改组所产生的变体，可导致这样的变体，其虽然是用亲本植酸酶制备，但可具有小于75％同源性。
[0218] 合适地，所述变体在如下任一方面显示增强的稳定性特性：热稳定性、热活性、pH范围、胃蛋白酶稳定性、比活性、底物特异性和更宽的底物特异性。适于测定这些特性的方法在本文中公开。
[0219] 在性质(如在较高温度、较低pH下的稳定性等)的语境中，术语“增强的稳定性”指与另一种经确定的植酸酶(如在布丘氏菌的情况中为SEQ ID NO：1)相比，随时间推移保持了较高的酶活性。除非另一种植酸酶得到具体确定，否则术语“增强的稳定性”当在本文中使用时，将指与SEQ ID NO：1的植酸酶相比，随时间推移保持了较高的酶活性。
[0220] 术语“热学上稳定的”和“热稳定的”指本发明的植酸酶在暴露于高温后保持指定量的酶活性。根据本发明的植酸酶变体，如果它在缓冲液中在pH 5.5下暴露于指定的温度10分钟后保持其活性的50％以上，则认为在指定的温度下是热稳定的。
[0221] 指涉本发明的植酸酶变体的术语“增强的热活性”意指该植酸酶变体与另一种经确定的植酸酶(如SEQ ID NO：1)的植酸酶活性相比，在高温下显示出相同量的或提高量的植酸酶活性。除非另一种植酸酶得到具体确定，否则术语“改善的热活性”当在本文中使用时将指与SEQ ID NO：1的植酸酶的热活性相比较的本发明植酸酶变体的热活性。
[0222] 如在WO 2006/043178、WO 2008/097619和PCT/US2009/41011(这些专利的公开内容以引用方式并入本文)中描述的本发明的变体是通过如下命名法来描述：[SEQ.ID NO：1的原始氨基酸残基/SEQ.ID NO：1中的原始氨基酸残基的位置/置换的氨基酸残基]。例如，在SEQ ID NO：2中，苏氨酸(T)置换SEQ ID NO：1的位置89中的原始丙氨酸(A)表示为A89T。当在本文中确定适合置换的位置而又没有提出具体的氨基酸时，应理解任何氨基酸残基都可置换在该位置中存在的氨基酸残基。在变体植酸酶与其他植酸酶相比含有缺失*的情况中，该缺失以“*”表示。例如，在SEQ.ID NO：1的位置A89处的缺失表示为A89。两*
个或多个连续氨基酸的缺失例如表示为(89-91)。
个或多个连续氨基酸的缺失例如表示为(89-91)。
[0223] 术语“衍生自”和“获自”不仅指由所考虑的生物株产生的或可由该生物株产生的植酸酶，而且指由分离自这种生物株的DNA序列编码并在含有这种DNA序列的宿主生物体中产生的植酸酶。另外，所述术语指由合成来源的和/或cDNA来源的DNA序列编码并具有所考虑的植酸酶的鉴别特性的植酸酶。因此，“衍生自”和“获自”另一植酸酶的植酸酶并不一定意指该植酸酶已物理上衍生自或物理上获自该第二植酸酶，而是也可意指所指的该植酸酶已用从该第二植酸酶的知识得出的知识或思路来制备。
[0224] 具体而言，植酸酶特性的改善涉及在食品和饲料加工条件下的酶稳定性，涉及在胃转运过程中的酶稳定性，和涉及在人或动物胃和/或肠道中的酶活性和稳定性，使得所述改善的变体特别适合用作饲料补充物。因此，这种改善包括(除了其他参数的改善之外)在高温下、优选65℃以上的温度下的稳定性提高，对蛋白水解消化、优选消化道的蛋白酶(如胃蛋白酶)的稳定性提高，在低pH下的催化活性、优选在pH 5.5如下的催化活性提高，以及从植酸盐释放磷酸盐基团、优选另外从肌醇磷酸盐释放磷酸盐基团的一般效率。
[0225] 因此，在一些实施方案中，本发明涉及包含植酸酶变体的饲料补充物，所述植酸酶变体当与亲本植酸酶比较时具有改善的特性，所述改善的特性包括在WO 2006/043178、WO2008/097619和PCT/US2009/41011中公开的位置中的一个或多个位置处和/或在与Seq ID No 1的氨基酸序列所示的植酸酶同源的植酸酶中的相应位置处的突变。这些位置的特征在于这些位置的诱变会导致酶特性的改善。
[0226] 具有更高热稳定性(热稳定性差异)的变体优选使用WO 2006/043178中公开的方法来确定。
[0227] 用于本发明的变体植酸酶优选具有至少1.5、更优选2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、最优选至少20的热稳定性差异(T.D)。
[0228] 具有更高蛋白水解稳定性的变体优选使用WO 2006/043178中公开的方法来确定。
[0229] 优选地，用于本发明的植酸酶变体具有至少45％，优选50％、55％，更优选至少60％或65％，最优选至少70％的蛋白水解稳定性(残余活性)。
[0230] 优选地，用于本发明的植酸酶变体在pH 4.0下的比活性大于100％的野生型活性，优选大于105％、110％，更优选大于114％。
[0231] 在一个方面，优选氨基酸序列为纯化的形式。术语“纯化的”意指该序列处于相对纯的状态，至少1％、5％的纯度或10％的纯度，更优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的纯度。在一个优选的实施方案中，当指涉多肽时，以上定义的纯度是就通过SDS-PAGE电泳从其他多肽纯化出来而言确定的。
[0232] 变体/衍生物
[0233] 本发明还涵盖酶的任何氨基酸序列或编码这种酶的任何核苷酸序列的变体、同源物和衍生物。
[0234] 变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
[0235] 其他组分
[0236] 本发明的饲料补充物可与其他的组分或载体组合使用。
[0237] 饲料用酶的合适载体包括麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、消泡剂、Na2SO4、滑石粉、PVA以及它们的混合物。另外，有多种封装技术，包括那些基于脂肪/蜡覆盖、添加植物胶等的技术。
[0238] 其他的组分的实例包括如下中的一种或多者：增稠剂、胶凝剂、乳化剂、粘合剂、晶体改性剂、甜味剂(包括人造甜味料)、流变学改性剂、稳定剂、抗氧化剂、染料、酶、载体、介质、赋形剂、稀释剂、润滑剂、调味剂、着色物质、助悬剂、崩解剂、制粒粘合剂等。这些其他的组分可以是天然的。这些其他的组分可通过使用化学和/或酶学技术来制备。
[0239] 本文所用的术语“增稠剂或胶凝剂”指通过减慢或防止粒子的移动而防止发生分离的产品，所述粒子为不混溶性液体小滴、空气或不溶性固体。
[0240] 本文所用的术语“稳定剂”定义为防止产品(例如食物产品)随时间推移发生变化的成分或成分组合。
[0241] 本文所用的术语“乳化剂”指防止乳液发生分离的成分(例如食物产品成分)。
[0242] 本文所用的术语“粘合剂”指通过物理或化学反应将产品粘合在一起的成分(例如食物成分)。
[0243] 本文所用的术语“晶体改性剂”指影响脂肪或水的结晶的成分(例如食物成分)。
[0244] “载体”或“溶媒”意指适合于化合物施用的材料，包括本领域已知的任何无毒且不会以有害方式与组合物的任何组分发生相互作用的材料，例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等。
[0246] 赋形剂的实例包括如下中的一种或多者：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖(lactose)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、乳糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇。
[0248] 制粒粘合剂的实例包括如下中的一种或多者：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯胶。
[0249] 润滑剂的实例包括如下一种或多者：硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。
[0250] 稀释剂的实例包括如下中的一种或多者：水、乙醇、丙二醇和甘油以及它们的组合。
[0251] 其他的组分可同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同的途径递送)。
[0252] 本文所用的术语“适合动物或人食用的组分”意指这样的化合物，其被添加到或可添加到本发明的组合物作为补充物，该补充物可对食用者有营养好处，可以是纤维替代物，或者对食用者具有一般有益的作用。
[0253] 举个例子，所述组分可以是益生元如藻酸盐、黄原胶、果胶、刺槐豆胶(LBG)、菊粉、瓜尔豆胶、半乳寡聚糖(GOS)、果寡聚糖(FOS)、乳蔗糖、大豆寡糖、帕拉金糖、异麦芽寡聚糖、葡寡聚糖和木寡聚糖。
[0254] 脂解酶
[0255] 脂解酶(EC 3.1.1.3)(可定义为催化酰基甘油水解的羧酸酯酶)是生理上非常重要的酶，是与淀粉酶和蛋白酶一起的三种主要消化酶之一。它们将脂质水解为甘油和脂肪酸，但也可在酯化反应或转酯反应中起作用。
[0256] 在优选的实施方案中，用于本发明的脂解酶是衍生自如WO 98/45453中公开且根据布达佩斯条约在1997年2月24日以登录号40863保藏于NCIMB的丝状真菌塔宾曲霉的脂解酶。应理解，脂解酶可衍生自曲霉属，或者可在另一种生物体如大肠杆菌中重组产生。
[0257] 优选地，脂解酶包含具有SEQ ID NO：7或8所示的氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：7或8所示的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽；或者通过表达包含如下序列的核苷酸序列而产生的多肽：SEQ ID NO：9或10的序列；或者由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：9或10不同的序列；或者与SEQ ID NO：9或10具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。
[0258] 应理解，所公开的与植酸酶有关的特征的任何一般定义都同样适用于脂解酶，为简明起见在这里不作重复。
[0259] 在又一个优选的实施方案中，用于本发明的脂解酶在本文所公开的里氏木霉细胞中产生。
[0260] 产生脂解酶的方法包括如下步骤：
[0261] (i)提供里氏木霉细胞，所述细胞包含：
[0262] a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7或8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或
[0263] b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；和/或
[0264] c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的核苷酸序列或它们任一种的互补序列；和/或[0265] d)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列除了遗传密码的简并性之外与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列相同；以及
[0267] 应理解，本文所定义的术语严格条件指在50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0}下洗涤。
[0268] 应理解，这些条件还可以是高严格条件，高严格条件在本文中定义为在65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0}下洗涤。
[0269] 作为另一个选择，提供了包括如下步骤的产生脂解酶的方法：
[0270] (i)用如下序列转染或转化里氏木霉细胞：
[0271] a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7或8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或
[0272] b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；和/或
[0273] c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的核苷酸序列或它们任一种的互补序列；和/或[0274] d)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列除了遗传密码的简并性之外与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列相同；以及
[0275] (ii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下培养该细胞。
[0276] 还提供了包括如下步骤的产生脂解酶的方法：
[0277] (i)用如下序列转染或转化里氏木霉细胞：
[0278] a)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，所述脂解酶包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7或8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或
[0279] b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；和/或
[0280] c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的核苷酸序列或它们任一种的互补序列；和/或[0281] d)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列除了遗传密码的简并性之外与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列相同；以及
[0282] (ii)在该细胞上重复步骤(i)以依序用至少一条(i)(a)、(i)(b)或(i)(c)中所定义的额外异源核苷酸序列(例如，如编码脂解酶的异源核苷酸序列，该脂解酶包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7或8具有至少40％序列同一性的氨基酸序列)转染或转化该细胞；以及
[0283] (iii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下培养该细胞。
[0284] 里氏木霉能够以显著高的产量产生脂解酶。
[0285] 此外，通过本文所公开的方法产生的脂解酶不是过度糖基化的，因此具有良好的酶活性。
[0286] Bradner等人(Current Genetics，44：224-230，(2003))在他们寻找此前未知的脂解酶时将里氏木霉用作表达宿主生物体。在里氏木霉中克隆并表达了来自蒜青霉(Penicillium allii)的南极分离株的脂解酶。Bradner等人推断，所描述的方法将可用于寻找潜在新颖的脂解酶基因，但没有提出里氏木霉可用于蛋白质的过表达。
[0287] 在另一个方面还公开的是产生脂解酶的方法，该方法包括如下步骤：
[0288] (i)提供转化的或转染的里氏木霉细胞，该细胞包含至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列；
[0289] (ii)在允许编码所述脂解酶的所述异源核苷酸序列表达的条件下于pH4至pH5.5下培养该细胞；
[0290] (iii)在pH 5.5至pH 6.5的培养基中分离、纯化或浓缩所述酶。
[0291] 在该方面，优选脂解酶：
[0292] a)包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：7或8具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或
[0293] b)由包含如下序列的核苷酸编码：SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示序列或包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；和/或[0294] c)由包含在严格条件下杂交至如下序列的核苷酸序列的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的核苷酸序列或它们任一种的互补序列；和/或
[0295] d)包含至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列除了遗传密码的简并性之外与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列相同。
[0296] 合适地，在里氏木霉细胞中可存在至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列。在里氏木霉细胞中可存在两个或更多个拷贝(即多拷贝)的所述或每一种根据本发明的编码脂解酶的异源核苷酸序列。每一条异源核苷酸序列与启动子相关联或处于启动子的控制下。合适地，每一条异源核苷酸序列可具有与之相关联的独立启动子或可处于该启动子的控制下。所述启动子可以相同或这不同。
[0297] 因而，里氏木霉细胞可包含或转染有或转化有至少2条编码脂解酶的异源核苷酸序列。
[0298] 合适地，所述(或每一条)异源核苷酸序列可包含编码信号肽的核苷酸序列，该编码所述信号肽的核苷酸序列可操作地连接至编码所述脂解酶的所述核苷酸序列。如果有多条异源核苷酸序列并且其中不止一条具有与之关联的信号序列，则该信号序列可以相同或不同。
[0299] 合适地，脂解酶可包含内源或外源信号肽。当信号肽是内源的时，其意指该信号肽是当天然产生时与该脂解酶天然连接的信号肽。例如，信号肽可以是塔宾曲霉中的信号肽，该信号肽在存在于塔宾曲霉中时与脂解酶天然连接。
[0300] 本文所用的术语“异源”意指在天然情况下其不会出现在里氏木霉细胞中。换句话讲，其对里氏木霉细胞而言是外来的。例如，本文所用的术语“异源核苷酸序列”意指在天然情况下该核苷酸序列不会出现在里氏木霉细胞中。换句话讲，该核苷酸序列对里氏木霉细胞而言是外来的。该术语还包括多个拷贝的天然存在的序列，照此而言额外的多拷贝将会是异源的。
[0301] 异源核苷酸序列可以是获自于微生物(特别是真菌)的，或者可从微生物(特别是真菌)获得。
[0302] 异源核苷酸序列可以是获自于曲霉属特别是塔宾曲霉的，或者是可从曲霉属特别是塔宾曲霉获得的。
[0303] 在以上各方面的优选实施方案中，所述里氏木霉细胞具有至少两种编码非脂解酶的基因受抑制。
[0304] 还提供的是可通过本发明的方法获得的脂解酶。
[0305] 还提供的是经转化或转染的包含如下序列的里氏木霉细胞：
[0306] a)至少一条编码与SEQ ID NO：7或8具有至少70％序列同一性的脂解酶蛋白的异源核苷酸序列；和/或
[0307] b)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；和/或
[0308] c)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含在严格条件下与如下序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少70％序列同一性的核苷酸序列或它们任一种的互补序列；和/或[0309] d)至少一条编码脂解酶的异源核苷酸序列，其中所述核苷酸序列除了遗传密码的简并性之外与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列相同；并且
[0310] 其中所述里氏木霉细胞具有至少两种编码非脂解酶的基因受抑制。
[0311] 优选地，根据前述各方面中任一种的所述里氏木霉细胞具有至少三种编码非脂解酶的基因受抑制。
[0312] 优选地，根据前述各方面中任一种的所述里氏木霉细胞具有至少四种编码非脂解酶的基因受抑制。
[0313] “受抑制”意指细胞表达的相关非脂解酶的水平与非转化/转染细胞的水平不相同。在一些实施方案中，“受抑制”意指细胞不表达相关的非脂解酶。该抑制可通过本领域已知的技术(例如通过缺失)引起。
[0314] 优选地，受到抑制的编码非脂解酶的基因中的至少一种是纤维素酶基因。
[0315] 优选地，受到抑制的编码非脂解酶的基因中的至少两种是纤维素酶基因。
[0316] 受到抑制的编码非脂解酶的基因中的至少一种的实例是编码纤维二糖水解酶的基因(例如CBHI或CBHII)。
[0317] 受到抑制的编码非脂解酶的基因中的至少一种的另一个实例是编码内葡聚糖酶的基因(例如EGI和EGII)。
[0318] 在一些实施方案中，里氏木霉细胞是其中编码一种或两种纤维二糖水解酶的内源基因(CBHI和CBHII)和/或编码内葡聚糖酶的内源基因(EGI和EGII)中的一种或二者缺失或被破坏的细胞。合适地，里氏木霉细胞可以是非GMM细胞或其衍生物，例如RL-P37株的衍生物。合适地，里氏木霉细胞可以是用实施例7所述的方法产生的RL-P37株的衍生物。
[0319] 在一些实施方案中，该异源核苷酸序列可编码包含与SEQ ID NO：7或SEQ ID No.8具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的氨基酸序列的脂解酶。
[0320] 在一些实施方案中，该异源核苷酸序列可编码脂解酶且包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID No.10具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的核苷酸序列。
[0321] 优选地，该异源核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO：7或SEQ ID No.8具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的氨基酸序列的脂解酶。
[0322] 优选地，该异源核苷酸序列编码脂解酶且包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID No.10具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的核苷酸序列。
[0323] 在下表1中显示了多种脂解酶与来自塔宾曲霉的具有SEQ ID NO：9所示序列的脂解酶(在本文中也称为脂肪酶3)的氨基酸序列同一性。
[0324] 表1-与来自塔宾曲霉的脂解酶(脂肪酶3)具有序列同一性的脂解酶。
[0325]
[0326] 里氏木霉宿主细胞可以是任何里氏木霉细胞。该细胞可考虑为野生型里氏木霉细胞。里氏木霉细胞可以为编码一种或多种分泌性纤维二糖水解酶的基因(CBHI或CBHII)已从该细胞缺失或被破坏而使得它们不被表达的细胞。合适地，里氏木霉细胞可以是非遗传修饰细胞或其衍生物，例如RL-P37株的衍生物。合适地，里氏木霉细胞可以是使用实施例10中列出的方法产生的RL-P37株的衍生物。
[0327] 该酶可在可包含约3升至约20升培养基的发酵罐中产生。在另一个实施方案中，本发明以10-16升，优选14升的发酵规模进行。在一个实施方案中，优选发酵以超过约12升，优选超过约14升进行。
[0328] 里氏木霉宿主细胞优选适用于大规模发酵。
[0329] 在优选的实施方案中，脂解酶生产以商业规模来进行。就此而言，发酵以超过约50,000升的规模、优选超过约80,000升的规模、优选超过约200,000升的规模的发酵来进行。
[0330] 在一个实施方案中，该方法产生的总蛋白质完全超过约20g/升。
[0331] 在所产生的总蛋白质中，大部分是所需的脂解酶。在一个实施方案中，所产生的总分泌蛋白质包含至少50％的所需脂解酶。在一个实施方案中，所产生的总分泌蛋白质包含至少60％的所需脂解酶。在一个实施方案中，所产生的总分泌蛋白质包含至少70％的所需脂解酶。在一个实施方案中，所产生的总分泌蛋白质包含至少80％的所需脂解酶。
[0332] 合适地，该方法可包括选择已针对该脂解酶的产生进行过筛选的转化体(优先选择该所需酶的高产者)。
[0333] 在一个实施方案中，合适的是本方法可包括：第一转化步骤，其中用至少一条本文所定义的编码脂解酶的异源核苷酸序列转化里氏木霉细胞；对已针对脂解酶的产生进行了筛选的转化体的选择(优先选择所需酶的高产量者)；和用至少一种本文所定义的编码脂解酶的异源核苷酸序列进行的所选择的转化体的第二转化步骤(即再转化步骤)；随后对已针对脂解酶的产生进行了筛选的新转化体的进一步选择(优先选择所需酶的高产量者)。
[0334] 在一些实施方案中，用于本发明的脂解酶可以是糖基化的。在一些实施方案中，脂解酶可在N32(当用SEQ ID NO：8编号时)处或在根据本发明的其他脂解酶的等同位置处被N-糖基化。该方面可赋予显著的优点，因为该酶的活性不被该酶的糖基化破坏或降低。不希望受理论的限制，当脂解酶在其他宿主例如塔宾曲霉中产生时可见到该酶的活性降低并据认为是由于该酶在至少N242位点处过糖基化。
[0335] 通过本文所公开的方法产生的脂解酶，由于其糖基化程度特别是在N32位点的糖基化程度，因此可与在其他宿主(例如塔宾曲霉)中产生的脂解酶相区别。在本发明的一些实施方案中，该酶在至少N32位点具有糖基化。
[0336] 合适地，可产生具有信号的肽脂解酶。换句话讲，本发明中使用的异源核苷酸序列包含其编码信号肽的部分。
[0337] 该信号肽可用于指导该脂解酶分泌透过特定的细胞膜。该信号肽序列对脂解酶编码序列而言可以是内源性的或外源性的。例如，该信号肽可以是对塔宾曲霉的脂解酶而言是内源性的信号肽。或者，该信号肽的编码序列可以获自于里氏木霉的纤维二糖水解酶基因(或者可从该基因获得)。
[0338] 但是，任何能够将所表达的脂解酶导入特选的里氏木霉细胞的分泌途径的信号肽编码序列都可使用。
[0339] 当我们提及改善如下中的一种或多者时：脂解酶的表达、脂解酶的糖基化、酶活性和/或产量，这是与表达该脂解酶的常规方法相比较。例如，与脂解酶在另一种宿主生物体(即里氏木霉以外的宿主生物体)中的产生相比较而言，提供了改善了的脂解酶表达、脂解酶糖基化、酶活性和/或产量。具体而言，与塔宾曲霉细胞中相同脂解酶的表达(例如，如WO98/45453中所教导的，以引用的方式将其并入本文)相比，通过本发明(即在里氏木霉细胞中产生)存在着改善的脂解酶的表达、脂解酶的糖基化、脂解酶的酶活性和/或产量。
[0340] 本文所用的术语“改善的糖基化”意指，优选地，糖基化发生在N32处(当用SEQ ID NO：8编号时)。不希望受理论的限制，但还是认为在一些情况下，在除里氏木霉外的宿主细胞中(特别是在塔宾曲霉中(如WO98/45453中所教导的))产生的脂解酶可被糖基化(或过糖基化)，特别是在N242处。因而，在除里氏木霉外的宿主细胞中并且特别是在塔宾曲霉中(如WO98/45453中所教导的)产生的脂解酶可在N32和N242两个位置处均被糖基化。然而，并且不希望受理论的限制，N242位点在SEQ ID No.8的活性位点残基其中之一(即His258)的附近。因此，据信在N242位点处的糖基化(或过糖基化)可导致该酶的活性(即脂肪酶活性)降低。
[0341] 本发明的脂解酶不具有降低的活性。本发明的脂解酶的糖基化可在N32位点处发生，该位点远离活性位点残基，如His258。
[0342] 本文所用的术语“改善的酶活性”意指活性与塔宾曲霉天然产生的脂解酶的脂肪酶活性相同或高于该活性。
[0343] 所谓酶活性，我们意指至少一种脂肪酶活性。酶活性(例如脂肪酶活性)可用下面实施例部分中列出的相关规程测量。
[0344] 已出人意料地发现，根据本文所公开的方法产生的脂解酶易于从其已分泌于其中的培养基(即培养(发酵)液)分离，因为获得了高表达水平。
[0345] 因此，该方法可涉及针对在培养细胞后脂解酶已分泌于其中的培养基进行如下步骤中的一个或多个：稀释该培养基(优选用水稀释)；将细胞从该培养基中分离出来；浓缩该培养基(优选其中所述培养基是无细胞的)；将所述培养基制粒(优选其中所述培养基是无细胞的)。
[0346] 该方法还可涉及针对在培养细胞后该酶已分泌于其中的培养基进行如下步骤：稀释该培养基(优选用水稀释)；将细胞从该培养基中分离出来；浓缩该培养基(优选其中所述培养基是无细胞的)；和任选地将所述培养基制粒(优选其中所述培养基是无细胞的)。
[0347] 该方法还任选地涉及针对在培养细胞后该酶已分泌于其中的培养基进行如下步骤：稀释该培养基(优选用水稀释)；将细胞从该培养基中分离出来；浓缩该培养基(优选其中所述培养基是无细胞的)；和将所述培养基制粒(优选其中所述培养基是无细胞的)。
[0348] 优选地，该方法涉及针对在培养细胞后该酶已分泌于其中的培养基进行如下步骤：用水稀释该培养基；将细胞从该培养基中分离出来；浓缩该培养基(其中所述培养基是无细胞的)；和任选地将所述培养基制粒(其中所述培养基是无细胞的)。
[0349] 在一个优选的方面，该方法涉及针对在培养细胞后该酶已分泌于其中的培养基进行如下步骤：用水稀释该培养基；将细胞从该培养基中分离出来；浓缩该培养基(其中所述培养基是无细胞的)；和将所述培养基制粒(其中所述培养基是无细胞的)。
[0350] 优选地，脂解酶在发酵液中从溶液中沉淀出来。优选地，脂解酶沉淀物通过pH调整而再溶解。优选地，将pH调整至发酵液pH以上的pH。
[0351] 除了以上提到的优点之外，通过该方法产生的酶的另一个优点是它使得能够进行商业规模的脂解酶生产。该方法使得脂解酶可以以高产量生产。
[0352] 本文公开的脂解酶的一个优点是，出乎意料地发现，有可能直接从转化和筛选步骤(即比方说从微量滴定板)开始直接转到大规模发酵(例如至少14升发酵)。出人意料的是这是有可能的，因为筛选步骤(特别是微量滴定板结果)高度可预测大规模发酵中的良好性能。这与常规方法形成了对照，在常规方法中通常需要在烧瓶中培养菌株，然后转移至大规模发酵。这在缩短生产实践和/或简化整体程序和/或减少成本方面具有显著的优势。
[0353] 另一个优点是，本文所述的方法相比于表达该脂解酶的常规方法，能提供增强的/提高的脂解酶表达和/或改善的产量。例如，相比于在另一种宿主生物体(即里氏木霉之外的宿主生物体)中生产脂解酶而言，提供了增强的/提高的脂解酶表达和/或改善的产量。具体而言，与同一脂解酶在塔宾曲霉细胞中的表达(例如如WO98/45453中所教导，将该专利以引用方式并入本文)相比，该脂解酶(即在里氏木霉细胞中产生)的表达提高和/或产量改善。
[0354] 又一个优点是，按照本文公开的方法生产的脂解酶容易生产和分离和/或纯化和/或浓缩。
[0355] 又一个优点是，按照所公开的方法生产的脂解酶容易再溶解。
[0356] 又一个优点是，按照所公开的方法生产的脂解酶可作为粒料或作为溶液使用。
[0357] 脂解酶
[0358] 本文所用的术语“脂解酶”意指具有三酰基甘油水解活性的酶(分类为E.C.3.1.1.3)。
[0359] 合适地，用于本发明的脂解酶可显示出如下额外活性中的一种或多种：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)、磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)、磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)或磷脂酶B活性(E.C.3.1.1.5)。本文所用的术语“糖脂酶活性”涵盖“半乳糖脂酶活性”。
[0360] 分离的
[0361] 在一个方面，优选地用于本发明的脂解酶是分离的形式。术语“分离的”意指脂解酶至少基本上不含与该脂解酶在自然界中天然结合或者在自然界中存在的至少一种其他组分。术语“分离的”可意指脂解酶是至少基本上无至少一种该脂解酶在其中产生的培养基中的其他组分。本发明的脂解酶可以基本上无一种或多种污染物的形式提供，所述污染物可能原本与该脂解酶相关联或该酶可与所述污染物质一起产生。
[0362] 因而，例如，其可能基本上无细胞或一种或多种潜在污染性多肽和/或核酸分子。可通过在发酵期间或发酵后从发酵液分离出细胞使得脂解酶保留在发酵液中来分离脂解酶。可通过使发酵液接受通过真空过滤进行的细胞分离来分离脂解酶。
[0363] 纯化的
[0364] 在一个方面，优选地用于本发明的脂解酶是纯化的形式。术语“纯化的”意指给定组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％的水平存在，所述水平是就所考虑的总组合物以干重/干重计来测定。对于一些实施方案，该量是至少约85％，所述水平是就所考虑的总组合物以干重/干重计来测定。
[0365] 浓缩物
[0366] 在一个方面，优选地用于本发明的脂解酶是作为浓缩物使用。浓缩物可以是该酶已分泌进其中的培养基的浓缩形式。优选地，浓缩物可以是该酶已分泌进其中并且其中已移除细胞的培养基的浓缩形式。
[0367] 材料和方法
[0368] 1.pH 5.5下的脂肪酶测定
[0369] 本文所用的1LIPU(脂肪酶单位)定义为在下文所述的条件下每分钟释放1μmol+的H 的酶量。
[0370] 通过将15.00ml甘油三丁酸酯、50.00ml乳化剂和235ml蒸馏水在匀化器中混合20秒钟，制备5％(v/v)甘油三丁酸酯底物。用0.5M NaOH将底物的pH调至大约5.4。
[0371] 乳化剂是通过将17.9g NaCl、0.41g KH2PO4、400ml蒸馏水和450ml甘油在2000ml烧杯中混合来制备。在剧烈搅拌下加入6.0g阿拉伯树胶，继续搅拌直到阿拉伯树胶完全溶解。将溶液转移到1000ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。
[0372] 对于干样品：在容量瓶中溶解经计算能在最终稀释度的一半下得到大约3.5LIPU/ml的最终溶液的酶量，并进行磁力搅拌20分钟。
[0373] 搅拌后，用蒸馏水调整至最终稀释度。任何进一步的稀释应当用蒸馏水进行。将溶液中的样品直接在蒸馏水中稀释。
[0374] 将25.00ml的底物调整至30.0℃。
[0375] 用NaOH/HCl将底物pH调至5.50。
[0376] 在搅拌的同时，加入2.00ml样品，并立即开动恒PH滴定仪。
[0377] 6分钟后停止滴定。
[0378] 计算滴定曲线的斜率。滴定曲线的斜率是从3至6分钟之间的数据计算。斜率必须在0.1-0.2ml/min的区间。
[0379] 用如下公式计算该酶的活性(LIPU/g)：
[0380]
[0381] ml/min.：滴定曲线的斜率
[0382] N：NaOH的当量浓度
[0383] F：样品的稀释度
[0384] A：称得的样品克数
[0385] 2：样品毫升数
[0386] 2.pH 3.5下的脂肪酶测定
[0387] 1LPLU(低pH脂肪酶单位)定义为在下文所述的条件下每分钟产生1微当量的游离脂肪酸的酶量。
[0388] 三辛酸酯底物：0.15％三辛酸甘油酯、13％Triton X-100、0.3％NaCl和120mM甘氨酸-HCL，pH 3.5。通过混合所有组分然后搅拌一小时来制备底物。
[0389] 将酶样品溶液在50mM甘氨酸-HCl，pH 3.5中稀释。
[0390] 测定是用Konelab分析机器人(Thermo，Vantaa，芬兰)进行。将50μl三辛酸酯底物在30℃下平衡3分钟，然后与10μl酶样品溶液混合，并在30℃下温育6分钟。用NEFA-HR(2)试剂盒(WAKO Chemicals GmbH)测量反应混合物中的游离脂肪酸。将110μl NEFA试剂R1加到反应混合物，在30℃下温育3分钟，然后加入55μl NEFA试剂R2。在30℃下继续温育4.5分钟，然后测量OD520nm。从由NEFA标准品(WAKO Chemicals GmbH)制备的标准曲线计算游离脂肪酸的含量。
[0391] 1LPLU对应于塔宾曲霉脂肪酶的0.24LIPU(图5，SEQ ID No.7)。
[0392] 2.植酸酶测定。
[0393] 本文所用的1FTU(植酸酶单位)定义为在本文所定义的反应条件下在一分钟内从底物释放1μmol的无机正磷酸盐所需的酶量。
[0394] 原理：
[0396] 用磷酸盐标准曲线通过绝对法对活性进行定量。
[0397] 试剂：
[0398] 1.1乙酸盐缓冲液(pH 5.5)0.25M 1000ml
[0399] 溶解：
[0400] 30.02g乙酸钠-三水合物(18,10g乙酸钠-脱水)、
[0401] 0.147g氯化钙-二水合物、
[0402] 1.76g 100％乙酸(＝1.677ml，密度＝1.0498g/mL)于大约900ml水中，[0403] 用4M乙酸(22.9ml浓乙酸于100.0ml去离子水中)调pH至5.5，然后将溶液转移到1000ml容量瓶。
[0404] 加入1ml 10％吐温20并通过加入去离子水将溶液调整至1000ml。
[0405] 1.2磷酸二氢钾18mM 1000mL
[0406] 用于标准曲线的原液
[0407] 将KH2PO4在加热柜中60℃下干燥过夜。
[0408] 称取2.45g干KH2PO4并稀释于乙酸盐缓冲液中(1.1)。调至1000.0ml。
[0409] 1.3植酸盐溶液(底物)7.5mM 250ml
[0410] 溶解：
[0411] 2.10g(±0.05g)植酸钠十水合物(植酸)于200ml乙酸盐缓冲液中。
[0412] 将溶液在水浴中恒温至37℃。
[0413] 在37℃下，通过加入4M乙酸(24g＝22.9mL浓乙酸于100.0mL去离子水中)将pH调至pH 5.5。
[0414] 通过加入乙酸盐缓冲液调至250.0mL。
[0415] 当转换到另一批植酸时，可能需要底物校正系数。
[0416] 植酸Sigma P0109批次057K0049的校正系数定义为1,00
[0417] 1.4硝酸溶液24.5％ 200ml
[0418] (用于钒酸铵溶液)
[0419] 在连续搅拌下将75ml硝酸(65％)加到100ml水。
[0420] 将溶液转移至200ml容量瓶并用去离子水调整。
[0421] 1.5铵溶液25％ 50ml
[0422] (用于七钼酸铵溶液)
[0423] 用水将40ml的32％铵溶液调至50ml。
[0424] 1.6七钼酸铵溶液10％ 250ml
[0425] (用于着色/终止试剂)
[0426] 溶解：
[0427] 25g七钼酸铵-四水合物于225ml水中。在加入铵溶液之前，溶液需要进行加热以溶解七钼酸铵。
[0428] 加入2.5ml铵溶液(25％)(参见1.5)，关闭热源，留在搅拌器上直到完全溶解。
[0429] 当冷却时，将溶液转移至250ml容量瓶，用去离子水调整并混合。
[0430] 1.7钒酸铵溶液0.24％ 250ml
[0431] (用于着色/终止试剂)
[0432] 将0.5875g钒酸铵溶解于预热至60℃的100ml水。在连续搅拌下缓慢加入5ml24.5％硝酸溶液。
[0433] 当冷却时，将溶液转移至250ml容量瓶，用去离子水调整并混合。
[0434] 1.8着色/终止试剂 200ml
[0435] 应在临用前制备。
[0436] 将50ml七钼酸铵溶液(10％)分配于200ml容量瓶中，然后分配50ml钒酸铵溶液(0.24％)。在连续搅拌下分配33ml 65％硝酸。通过加入去离子水调整至200.0ml并混合。
[0437] 反应条件
[0438]
[0439] 磷酸盐标准曲线的制备(绝对法)
[0440] 用KH2PO4缓冲液(1.2)制备了标准曲线。将标准品用乙酸盐缓冲液稀释。
[0441] C稀释＝0.0mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、4.0mM[0442] 使用如下公式：C原液*V原液＝C稀释*V稀释
[0443] V原液＝(C稀释*V稀释)/C原液
[0444] 其中C＝浓度，V＝体积
[0445]
[0446] 将1.00ml的标准曲线样品与2.00ml着色/终止试剂混合，然后与2.00ml植酸盐溶液混合。将样品在室温下温育5-10分钟，测量OD(在温育后对样品测量)。
[0447] 样本制备：
[0448] 1A：液体产品(大约5500FTU/g)：称取1g样品到100ml容量瓶中，记录重量，用乙酸盐缓冲液充满容量瓶。
[0450] 1C：干产品(涂覆有疏水外层的颗粒)：干产品：称取1g产品到玻璃烧杯中。用分配器或量筒加入100ml乙酸盐缓冲液。将样品在磁力搅拌器上搅拌20分钟。让提取物沉降，经涂覆的产品不得滤过玻璃过滤器。
[0451] 2：制备该样品的进一步稀释液。优选的OD范围为0.4-1.6。如果样品的浓度未知，如下显示使活性落入该测定范围的典型稀释水平。
[0452] 样品中的活性应为大约0.0300U/mL。
[0453] 稀释液应在即将进行测定之前制备。
[0454] 活性的测定：
[0455] 所有样品均同时分析-对照、空白和样品。测定运行必须以连续流进行。
[0456] 所有测定均以两次重复或三次重复测定作出。
[0457] 在每个系列的开始包括空白。
[0458] 在每个系列的管中包括对照(已知活性的植酸酶对照或Phyzyme XP样品)。
[0459] 盲样：将1.00ml的每种样品与2.00ml着色/终止试剂混合，然后与2.00ml植酸盐溶液混合。将样品在室温下温育60分钟，离心，用样品的剩余部分测量。
[0460] 样品：
[0461] 1.在塑料管中汲取1.00ml的稀释样品或对照2或3次。对于空白，汲取1.00ml的乙酸盐缓冲液。
[0462] 2.将植酸盐溶液(底物)放在37.0℃水浴中至少5分钟，直到平衡至37℃。
[0463] 3.将样品在37.0℃水浴中温育正好5分钟。
[0464] 4.以正好5秒钟的时间间隔将2.00ml的经平衡的植酸盐溶液加到样品。
[0465] 5.在37.0℃水浴中温育正好60分钟。
[0466] 6.同样是以5秒钟的时间间隔加入2.00ml着色/终止试剂，盖上盖子并上下翻转5次。
[0467] 7.在3500rpm下离心10分钟。
[0468] 8.在415nm处测量。用去矿物质水将分光光度计调零。
[0469] 活性的计算
[0470] 空白的OD必须≤0.13；否则必须重复进行分析。
[0471] 将数据记录在Excel表格中
[0472] 在Excel中制作标准曲线和趋势线。
[0473] a)y轴＝OD415
[0474] b)x轴＝mM磷酸盐
[0475] c)斜率(α)必须在0.36-0.38范围内
[0476] d)截距(β)必须不超过|0.02|
[0477] e)相关系数(R2)应为≥0.99
[0478] 如下计算植酸酶活性：
[0479]
[0480] OD样品＝酶样品的平均吸光度
[0481] OD空白＝酶空白的平均吸光度
[0482] DF＝样品的稀释倍数
[0483] 温育时间＝60分钟
[0484] W样品＝样品或对照的重量
[0485] α＝标准曲线的斜率
[0486] β＝标准曲线的截距
[0487] pH 3.5下的植酸酶测定：
[0488] 这与pH 5.5下植酸酶相同，但有如下变换：
[0489] 1.1测定缓冲液，甘氨酸-HCL缓冲液pH 3.5(取代1.1乙酸盐缓冲液pH 5.5)[0490] 将250ml 0.2M甘氨酸与130ml 0.2M HCl和大约500ml去离子水混合。用0.5M HCl或0.5M NaOH调pH至3.5。将溶液转移至1000ml容量瓶，加入去离子水将溶液调整至1000mL
[0491] 1.3植酸盐溶液(底物)7.5mM(总共250ml)
[0492] 溶解2.10g(±0.05g)植酸钠十水合物(植酸)于200ml测定缓冲液(甘氨酸HCl缓冲液pH 3.5)中。
[0493] 将溶液在水浴中恒温至37℃。
[0494] 在37℃，加入4M HCl或4M NaOH将pH调整至pH 3.5。
[0495] 加入测定缓冲液(pH 3.5)调整至250.0mL。含有该溶液的瓶子需要用箔包装。
[0496] 贮藏期：两个星期
[0497] 当转换到另一批植酸时，可能需要底物校正系数。
[0498] 植酸批次128H1234(Sigma P-3168)的校正系数定义为1,00
[0499] 在该方法中酶和磷酸盐的所有稀释都是用甘氨酸-HCl测定缓冲液pH3.5取代乙酸盐缓冲液pH 5.5作出。
[0500] 实施例
[0501] 实施例1-导言
[0502] 为了能有效作为食品或动物饲料的酶添加剂，植酸酶必需兼有多种不同的性质。为了能够在动物的胃的酸性环境中降解植酸，其必须在低pH下、优选在宽广的pH值范围内具有活性。另外，它必须具有高特异性活性，优选具有高热稳定性，以使得它这种蛋白质能够承受在饲料(如颗粒饲料)的制备中常见的高温。
[0503] 还重要的是，该酶具有宽广的底物特异性，使得它能不仅水解植酸盐，而且能水解植酸盐降解的中间产物，如肌醇五磷酸、四磷酸和三磷酸。对植酸盐在猪中的降解的研究显示，若没有该酶则这些肌醇寡磷酸在小肠和大肠中保持基本上不可溶，从而难以接触动物和肠道微生物群落所产生的碱性磷酸酶。已鉴别了不同的酶的底物特异性谱的变化。例如，枯草芽孢杆菌的植酸酶所产生的肌醇三磷酸基本上抵抗此酶的进一步水解。
[0504] 合适地，这些变体在如下任何一方面显示改善的特性：温度稳定性、pH范围、胃蛋白酶稳定性、比活性、底物特异性和更宽的底物特异性。测定这些特性的合适方法在本文中公开。
[0505] 具体而言，植酸酶特性的改善涉及在食品和饲料加工条件下的酶稳定性，涉及在胃转运过程中的酶稳定性，和涉及在人或动物胃和/或肠道中的酶活性和稳定性，使得所述改善的变体特别适合用作饲料补充物。因此，这种改善包括(除了其他参数的改善之外)在高温下、优选65℃以上的温度下的稳定性的提高，对蛋白水解消化、优选消化道的蛋白酶(如胃蛋白酶)的稳定性的提高，在低pH下的催化活性、优选在pH 5.5如下的催化活性的提高，以及从植酸盐释放磷酸盐基团、优选另外从肌醇磷酸盐释放磷酸盐基团的一般效率。
[0506] 植酸酶特性的改善涉及在食品和饲料加工中的使用以及涉及作为食品和饲料产品的添加剂的用途。具体而言，改善涉及在食品和饲料加工条件下的稳定性，涉及在胃转运过程中的稳定性，和涉及在人或动物胃和/或肠道中的活性和稳定性。这种改善包括(除了其他参数的改善之外)在高温下、优选65℃以上的温度下的稳定性的提高，对蛋白水解消化、优选消化道的蛋白酶的稳定性的提高，在低pH下的催化活性、优选在pH 5.5如下的催化活性的提高，以及从植酸盐释放磷酸盐基团的一般效率。
[0507] 高温稳定性的提高是通过该酶的失活温度来定量。失活温度定义为这样的温度，在该温度下温育一定时间长度并随后冷却到室温后植酸酶的残余活性为在室温下相同条件下温育相同时间长度的同一酶的残余活性的50％。热稳定性差异为两种酶的失活温度之间的差值(单位℃)。
[0508] 实施例2胃蛋白酶稳定性
[0509] 布丘氏菌属的植酸酶变体BP-17、BP-110、BP-111、BP-112和Phyzyme XP与相比较的Natuphos(BASF)和Ronozyme P(Novozymes/DSM)在pH 2下的胃蛋白酶抗性。
[0510] 材料和方法
[0511] 缓冲液：
[0512] 胃蛋白酶温育缓冲液：0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.0、3mg/ml BSA、2.9mg无水氯化钠/mL、0.73mg氯化钙/mL。对于含胃蛋白酶的溶液，将温育缓冲液制备成分别含有500、1000、3000、6000或10000U/ml胃蛋白酶(SigmaP-7000，10000U/mg对应于27mg/ml)。一胃蛋白酶单位定义为在pH 2.0、37℃下每分钟将产生0.001的ΔOD280的酶量，其用血红蛋白作为底物以TCA可溶性产物测量(美国食品化学法典)。
[0513] 植酸酶测定缓冲液：乙酸盐缓冲液250mM，pH 5.5
[0514] 含BSA的植酸酶测定缓冲液：乙酸盐缓冲液250mM，pH 5.5，含3mg/ml BSA[0515] 对渐增的胃蛋白酶浓度的抗性：
[0516] 所有酶的设置都是相同的：制备了六份含酶的样品(一式两份)：四份样品含缓冲液(pH 2)中的渐增量的胃蛋白酶，一份样品不含胃蛋白酶但在温育缓冲液(pH 2)中，一份阳性对照样品含具有BSA的测定缓冲液(pH 5.5)中的酶。
[0517] 对于每个份样品，将没有或有渐增量的胃蛋白酶的900μl温育缓冲液或将900μl测定缓冲液与100μl酶溶液混合，然后在40℃下温育。经过120分钟温育后，取
100μl与900μl测定缓冲液混合。立即如ISO国际标准草案ISO/DIS 30024所述对比磷酸盐标准曲线分析样品的pH 5.5下的植酸酶。
100μl与900μl测定缓冲液混合。立即如ISO国际标准草案ISO/DIS 30024所述对比磷酸盐标准曲线分析样品的pH 5.5下的植酸酶。
[0518] 结果
[0519] 胃蛋白酶抗性
[0520] 在pH 2下布丘氏菌变体都显示出对胃蛋白酶的优异稳定性。相比之下，Natuphos的活性在500U/ml的胃蛋白酶浓度下已经大大下降，活性进一步下降至在3000U/ml的胃蛋白酶浓度下达到约45％回收率的稳定水平。Ronozyme P的回收率更差，在仅仅500U/mg的胃蛋白酶浓度下就下降至回收率小于20％(图9A)。
[0521] 图9显示源自布丘氏菌变体BP-17、BP-110、BP-111和BP-112的植酸酶以及Phyzyme XP、Natuphos和Ronozyme P对渐增浓度的胃蛋白酶的抗性。数据是相对于没有胃蛋白酶情况下在pH 2下的温育。A：所有数据点，B：相同的数据，但仅显示超过70％回收率。
[0522]
[0523] 表1.图9中所示的相同数据
[0524] 布丘氏菌各变体之间存在轻微的差异，其中变体BP-17var.110显示最佳的稳定性，在最高的胃蛋白酶浓度10000U/ml下温育两小时后活性剩余95％(图9B)。相比之下，BP-17在两小时的温育后显示大约85％的回收率。
[0525] 布丘氏菌植酸酶还显示优异的酸稳定性。比较在pH 2或pH 5.5下温育两小时后在pH 5.5下测量的活性，显示出所有四种布丘氏菌植酸酶在pH 2下温育2小时后都没有失去活性，而Phyzyme XP、Natuphos和新型的Ronozyme P则显示出轻微到显著的活性下降(表2)。
[0526]
[0527] 表2.在pH 2或pH 5.5缓冲液中温育两小时后在pH 5.5下测量的活性。数字是相对于在pH 5.5下温育的样品的活性。
[0528] 数据汇总
[0529] 根据本发明的布丘氏菌植酸酶变体在pH 2、37℃、10000U/ml的胃蛋白酶下温育2小时后，相比于在相同条件但不存在胃蛋白酶的情况下温育的样品的活性，显示出超过
75％的回收率。
75％的回收率。
[0530] 实施例3.酶活性的回收率
[0531] 酶活性的回收率的评价
[0532] 材料和方法
[0533] 这里，我们评价了在粒化小麦配制的酶后的酶活性回收率。将酶喷在颗粒状小麦上并干燥，然后与饲料混合，接着进行粒化处理。
[0534] 将液体酶配制在全磨小麦上并干燥至大约90％的干物质含量。在Technological Institute in Kolding用粒化装置(图10中示意性示出)测试在粒化处理中的热胁迫期间酶的失活。将试验样品加至10kg预混物并混合10分钟。然后将10kg预混物加至150kg饲料(大的卧式混合机)并混合15分钟，然后进行调理/汽蒸。将饲料在90℃/95℃下处理30秒钟，然后粒化。在阶式混合机的出口中测量温度。粒料在离开压粒机后立即将其冷却至室温。
[0535] 根据本文所述的方法测量植酸酶活性。
[0536] 粒化前的饲料糊料中的植酸酶活性为5单位/克。
[0537] 结果
[0538] 结果在图11-13中示出。
[0539] 在图11中，公开了根据本发明的三种植酸酶B变体的粒化试验的结果。将酶配制在全磨小麦上并干燥至大约10％的含水量。这里，粒化后植酸酶活性的回收率，BP 17 var111在90℃下为90％，相比之下BP 17在90℃下回收率为19％。
[0540] 作为参考，将Phyzyme XP(大肠杆菌植酸酶)配制在全磨小麦上。结果示于图12中。这里，三批配制在全磨小麦上的Phyzyme XP在90℃下粒化后植酸酶活性的回收率为47％。
[0541] 还测试了Ronozyme。这个产品是以带涂层形式出售，以保护酶不受粒化处理中热量的影响。在该试验中，从带涂层的产品中提取植酸酶，配制在全磨小麦上，以研究该植酸酶分子在没有保护的情况下的热稳定性。结果示于图13中。
[0542] 数据汇总
[0543] 配制在小麦上的本发明的布丘氏菌植酸酶变体在90℃下粒化后显示出超过70％的回收率。
[0544] 实施例4.植酸降解
[0545] 植酸酶降解植酸的研究的结果
[0546] 溶液
[0547] 在温育中使用了三种不同的缓冲液。它们如下：
[0548] 250mM乙酸盐pH 5.5；
[0549] 250mM乙酸盐M pH 3.5；和
[0550] 250mM HCl甘氨酸pH 2.5。
[0551] 将所温育上所有的所有植酸酶在测定缓冲液中稀释至1U/ml的酶水平。
[0552] 温育中使用的植酸盐底物溶液是植酸盐1％(1g/100ml缓冲液)。
[0553] 将底物在与用于植酸酶的稀释相同的缓冲液中制备，以在反应中保持pH水平恒定。
[0554] 通过1M HCl终止反应。
[0555] 温育
[0556] 温育体积为：1.5或3.0ml植酸盐+0.25ml酶+3.25或1.75ml缓冲液(37℃)，总体积为5.0ml。
[0557] 在不同的时间点(0、30、60和90分钟)取0.5ml的分样(sub-sample)。
[0558] 在去分样(sub-sampling)之前，为每份分样准备装有0.2ml 1M HCl的Eppendorf管。通过将温育过的次级样品与HCl混合，终止酶反应。每份分样取0.7ml保藏于4℃以备HPLC分析。
[0559] HPLC方法
[0560] 通过高效离子色谱(HPIC)进行的植酸盐和肌醇异构体分析。该方法已由Skoglund和Carlsson等人描述(J.Agric.Food Chem.，45(1997)，451-436 5.J.Agric.Food Chem.，46(1998)，1877-1882；和J.Agric.Food Chem.，49(2001)，11695-1701)。所用的柱子是来自Dionex的强阴离子交换柱(4×250mm)，带4×50mM的预柱。在水中制备溶剂A(MilliQ水)、溶剂B(1NHCl)。梯度为30分钟内2.5％-49％B，然后50％等度洗脱3分钟，2.5％等度洗脱2分钟，流速0.8ml/分钟。每次运行为35分钟。有可能将运行降低到总共25分钟，因为植酸酶不会产生如此多的理论上可能的IP异构体。洗脱液用流速为0.4ml/分钟的含有0.1％Fe(NO3)3·9HO2和2％过氯酸、高氯酸(HClO4)的水溶液进行在线
3+ -
衍生化。植酸盐和IP异构体在290nm处检测为正峰。这是由于植酸盐-Fe -ClO4 复合物的形成。60％的过氯酸溶液购自Sigma。
3+ -
衍生化。植酸盐和IP异构体在290nm处检测为正峰。这是由于植酸盐-Fe -ClO4 复合物的形成。60％的过氯酸溶液购自Sigma。
[0561] 结果
[0562] 结果在图14-17中示出。
[0563] 数据汇总
[0564] 所有本发明的酶都显示出有利的特性。
[0565] 本发明的植酸酶在所有测试的pH水平下都降解植酸盐。
[0566] 本发明的酶在pH 5.5下活性非常高。
[0567] BP 110和BP 111在pH 2.5和3.5下显示类似的活性。
[0568] BP 110和BP 111在pH 2.5和pH 3.5下90分钟后降解所有加到温育的植酸盐。
[0569] BP112在pH 2.5和pH 3.5下90分钟后降解加到温育的植酸盐的75％。
[0570] 本发明的酶在pH 2.5下显示比Ronozyme和Natuphos更好的特性(参见至少图17)(酶浓度高于图14-16所见的浓度，因此布丘氏菌BP17在那里作为参考)。
[0571] 实施例5.植酸在液化物(liquefact)中的水解
[0572] 植酸测定：
[0573] 植酸含量：通过将5％浆料(如果它是干样品的话)的pH调至pH 10从样品提取植酸，然后用离子交换柱通过HPLC方法进行测定。用NaOH梯度系统从柱子洗脱植酸。然后通过与植酸标准品比较计算液体中的植酸含量。
[0574] 结果
[0575] 通过不同的热稳定性BP变体植酸酶即BP110、BP111和BP112，研究了温度对得自常规干法碾压液化工艺(来源：Illinois River Energy，Monroe，Illinois)的全磨玉米液化物的植酸的水解的影响。将32％ds(“干固形物”)全磨玉米ds玉米液化物的pH调整至pH 5.0，并放在维持于85℃和89℃下的水浴中。达到温度平衡后，加入BP-植酸酶，加入量为4.0FTU/gds.玉米然后在20分钟取样，通过加入10mM氢氧化钠终止酶反应(稀释1-10倍)。然后将稀释的样品过滤，通过HPLC分析它们的植酸盐衍生物谱(IP1-IP6)。图18和19中的HPLC色谱图清楚表明，来自所有三种变体的植酸酶在高于85℃的温度下催化了植酸的水解。全磨玉米液化物中的植酸含量(植酸(IP6)和中间体IP1-IP5)为大约1.7％ds.玉米，而图18中的数据显示超过95％的植酸在本液化条件下被热稳定性植酸酶水解。
明显地，在89℃下温育的样品的HPLC图谱显示，BP-111植酸酶变体与来自其他两种变体的植酸酶(参见图19；BP-110和BP-112)相比呈现出更高的热稳定性。
明显地，在89℃下温育的样品的HPLC图谱显示，BP-111植酸酶变体与来自其他两种变体的植酸酶(参见图19；BP-110和BP-112)相比呈现出更高的热稳定性。
[0576] 实施例6
[0577] 塔宾曲霉脂肪酶3在里氏木霉中的表达
[0578] 1.用于转化的表达构建体和菌株
[0579] 获自Invitrogen(目录号12536-017)的pDONRTM221质粒DNA用作供体载体。将含有塔宾曲霉脂肪酶3基因组DNA的pDONR221::lip 3(图20)重组到里氏木霉gateway目的载体pTrex3G(在WO 05/001036中详细描述)中，得到最终的表达构建体ATlipase3Trex(图21)。
[0580] 该表达盒含有里氏木霉纤维二糖水解酶1(cbh1)基因的启动子和终止子区。其还含有构巢曲霉乙酰胺酶amdS基因作为用于里氏木霉的转化的选择性标志物。
[0581] 塔宾曲霉脂肪酶3基因组DNA编码具有SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的脂肪酶3脂解酶。
[0582] 当在本文中使用时，术语“脂肪酶3”指包含SEQ ID No.8中所示的氨基酸序列(如SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列)的脂解酶。Seq.ID No.7含有信号序列，而seq.ID No.8是不含信号序列的成熟脂肪酶蛋白。
[0583] 用于转化的菌株为里氏木霉，其为非GMM菌株RL-P37的衍生物，编码两种分泌性纤维二糖水解酶的基因CBHI和CBHII，以及编码分泌性内葡聚糖酶的基因中的两种EGI和EGII已从其中缺失。
[0584] 表达载体pTrex3g。
[0585] 下面描述了载体pTrex3g的构建，该载体可用于表达本发明的基因。
[0586] 这个载体是基于大肠杆菌载体pSL1180(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ，USA)，后者是基于pUC118噬菌粒的载体(Brosius，J.(1989)DNA8：759)，其具有包含64个六碱基限制性酶识别序列的延长多克隆位点。将其命名为Gateway目的载体(Hartley，J.L.，Temple，G.F.和Brasch，M.A.(2000)Genome Research 10：1788-1795)以允许利用Gateway技术(Invitrogen)在里氏木霉cbhl基因的启动子和终止子区之间插入任何所需的开放阅读框。其还含有构巢曲霉amdS基因以在里氏木霉的转化中用作选择性标志物。
[0587] 关于pTrex3g的细节如下。该载体大小为10.3kb。
[0588] 插入pSL1180的多聚接头区中的是如下DNA片段：
[0589] 1.来自里氏木霉cbh1基因的启动子区的2.2bp DNA片段
[0590] 2.从lnvitrogen获得的1.7kb Gateway阅读框A盒，其在氯霉素抗性基因(CmR)和ccdB基因旁侧的任一端包含attR1和attR2重组位点
[0591] 3.来自里氏木霉cbh1基因的终止子区的336bp DNA片段
[0592] 4.含有具有其天然启动子和终止子区的构巢曲霉amdS基因的2.7kbDNA片段。
[0593] 2.里氏木霉四基因缺失宿主菌株的转化
[0594] 采用电穿孔或基因枪转化(通过使用PDS-1000 Helium系统(BioRad，目录号为No.165-02257)粒子轰击)将表达构建体ATlipase3Trex(含有塔宾曲霉脂肪酶3基因)转化进里氏木霉菌株中。通过基因枪转化和电穿孔将仅含有真菌DNA的PCR产物或整个表达质粒用于产生转化体。
[0595] A.通过电穿孔的转化
[0596] 将待转化的里氏木霉宿主菌株在PDA板上培养至完全孢子形成5天。用1.2M山梨醇收获来自2个板的孢子并滤过miracloth以除去琼脂。将孢子转移至50ml falcon管并通过用50ml水反复离心5-6次来洗涤。用1.2M山梨醇溶液将孢子再悬浮于小体积(少于2x片状沉淀物体积)中。然后将孢子悬浮液保持在冰上。将90ul的孢子悬浮液等分至电穿孔杯(E-shot，得自Invitrogen的0.1cm标准电穿孔杯)。将10-20ul DNA构建体(质粒图4或PCR产物)添加至该孢子悬浮液并将电穿孔设置为16kV/cm，25μF，50Ω。电穿孔后，让孢子悬浮液留在冰上，再悬浮于5份1.0M山梨醇和1份YEPD中，并通过在28C下伴随250rpm振荡温育过夜让其萌发。第二天，将萌发幼体接种至含有乙酰胺的琼脂板中。分选转化体并将其单独转移至乙酰胺琼脂板。
[0597] B.通过粒子轰击的转化(基因枪转化)
[0598] 制备来自里氏木霉的四基因缺失菌株的孢子的悬浮液。将200ul孢子悬浮液铺展至基本培养基(MM)乙酰胺板的中央。(MM乙酰胺板具有如下组成：0.6g/l乙酰胺；1.68g/l CsCl；20g/l葡萄糖；20g/l KH2PO4，0.6g/l CaCl22H20；1ml/l 1000x痕量元素溶液；20g/l Noble琼脂，pH5.5。1000x痕量元素溶液含有5.0g/l FeSO4 7H2O；1.6g/l MnSO4；1.4g/l ZnSO4 7H2O和1.0g/lCoCl2 6H2O。在无菌通风柜中让孢子悬浮液在MM乙酰胺培养基的表面上干燥1小时。转化按照生产商的指导。将60mg钨粒子置于微量离心管中。添加1ml乙醇并让其静置15秒。除去乙醇并用无菌dH2O洗涤三次，然后添加250ul 50％(v/v)无菌甘油。将25ul钨粒子悬浮液置于微量离心管上。在连续涡旋的同时，添加如下物质：
5ul(100-200ng/ul)的质粒DNA、25ul的2.5M CaCl2和10ul的0.1M亚精胺。将粒子离心
3秒。移除上清液，用200ul的100％乙醇洗涤粒子并离心3秒。除去上清液。添加24ul
100％乙醇并通过吸液混合，然后移出8ul粒子等分试样并置于保持在干燥器中的微载体盘的中心。一旦钨/DNA溶液已干燥则将微载体盘连同带有孢子的MM乙酰胺板置于轰击室中，根据生产商的指导进行轰击处理。在用钨DNA粒子轰击接种的孢子后，将板在28℃下温育。将转化的菌落转移到新鲜的MM乙酰胺培养基板，在28℃下温育。
5ul(100-200ng/ul)的质粒DNA、25ul的2.5M CaCl2和10ul的0.1M亚精胺。将粒子离心
3秒。移除上清液，用200ul的100％乙醇洗涤粒子并离心3秒。除去上清液。添加24ul
100％乙醇并通过吸液混合，然后移出8ul粒子等分试样并置于保持在干燥器中的微载体盘的中心。一旦钨/DNA溶液已干燥则将微载体盘连同带有孢子的MM乙酰胺板置于轰击室中，根据生产商的指导进行轰击处理。在用钨DNA粒子轰击接种的孢子后，将板在28℃下温育。将转化的菌落转移到新鲜的MM乙酰胺培养基板，在28℃下温育。
[0599] 3.转化体在微量滴定板中的生长
[0600] 在MM乙酰胺板上生长5天后，将通过电穿孔或通过基因枪转化获得的并且显示出稳定形态的转化体接种进96孔微量滴定板中的200ul带有葡萄糖/槐糖的成分确定的培养基。带有葡萄糖/槐糖的成分确定的培养基(每升)由如下物质组成：NH42SO4 5g，PIPPS缓冲液33g，酪蛋白氨基酸9g，KH2PO4 4.5g，CaCl2(无水)1g，MgSO4.7H2O 1g，用50％NaOH将pH调节至5.50，用milli-Q H2O定容至966.5mL。灭菌后，添加如下物质：Mazu5mL，葡萄糖/槐糖60％26mL和400X里氏木霉痕量金属2.5mL。将微量滴定板在28℃的氧气生长室中温育5天。
[0601] 实施例7
[0602] 适用于本发明的表达宿主细胞可以是其中编码纤维二糖水解酶I的基因(CBHI，Cel7a)、编码纤维二糖水解酶II的基因(CBHII，Cel6a)、编码内葡聚糖酶I的基因(EGI，Cel7b)和编码内葡聚糖酶II的基因(EGII，Cel5a)已通过使用分子遗传技术进行缺失或破坏而失活的里氏木霉的菌株。该菌株(四基因缺失菌株)可用作宿主，用于编码其他里氏木霉分泌的蛋白质的基因的过表达。
[0603] 优选地，适用于本发明的宿主细胞可使用WO 2005/001036和US28026376A1中描述的方法衍生自菌株RL-P37的里氏木霉细胞。
[0604] 适用于本发明的里氏木霉菌株可源于可公开获得的里氏木霉RL-P37菌株。可如WO 05/001036中所述修饰里氏木霉菌株RL-P37以形成里氏木霉菌株1A52。可如US20080026376中所述修饰里氏木霉菌株1A52以形成可用于本发明的里氏木霉细胞。
[0605] 可如下所述修饰RL-P37以形成里氏木霉菌株1A52。
[0606] 所用的里氏木霉宿主菌株可源于可公开获得的菌株RL-P37，该菌株已由Genencor International，Inc.用于生产商业纤维素酶制备物。该菌株的衍生和鉴定先前已有公开(Sheir-Neiss，G.和Montenecourt，B.S.(1 984)Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53；美国专利4,797,361)。其为过量产生纤维素酶的突变菌株，该菌株已由野生型菌株(QM6a)通过若干诱变步骤而获得。
[0607] 1)pyr4突变株的分离。
[0608] 为了制备用来用质粒DNA转化的菌株RL-P37，有必要分离在pyr4基因中具有无效突变的衍生物。
[0609] 该pyr4基因编码乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶，该酶是尿苷生物合成所需的。野生型细胞将毒性抑制剂5-氟乳清酸(FOA)掺入尿苷中，因而毒害该细胞。然而，pyr4基因缺陷的细胞对该抑制剂有抗性但需要尿苷用于生长。因而，有可能使用FOA选择pyr4突变株。在实施过程中，将里氏木霉菌株RL-P37铺展在含有2mg/ml尿苷和1.2mg/ml FOA的固化培养基的表面。在三至四天内出现自发的FOA抗性菌落。鉴定了需要尿苷用于生长的FOA抗性突变体。为了鉴定特定地具有缺陷pyr4基因那些突变体，产生原生质体并用含有野生型pyr4基因的质粒进行转化(Smith，J.L.，Bayliss，F.T.和Ward，M.(1991)Curr.Genet.19：27-33)。转化后，将原生质体涂布接种于缺少尿苷的培养基中。转化的菌落的随后生长证明质粒携带的pyr4基因补足了缺陷的pyr4基因。以这种方式，菌株GC69被鉴别为菌株RL-P37的pyr4突变体。
[0610] 2)设计用于缺失CBH1编码基因的质粒的构建。
[0611] 通过与根据该基因的公开序列设计的寡核苷酸探针杂交，从菌株RL-P37的基因组DNA克隆cbhl基因(编码CBHI蛋白)(Shoemaker，S.，Schweickart，V.，Ladner，M.，Gelfand，D.，Kwok，S.，Myambo，K.和Innis，M.(1983)Biotechnology 1：691-696)。该cbhl基因处于一6.5kb Pstl片段上，将其插入至pUC4K(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ，USA)的Pstl位点，替代该载体的卡那霉素抗性基因。然后将所得的质粒pUC4K::cbh1用Hindlll酶切，分离较大的片段并再连接得到pUC4K::cbh1ΔH/H。该程序移除了整个cbhl编码序列和大约1.2kb的5′和1.5kb的3′旁侧序列。从初始Pstl片段的任一末端保留了大约1kb的旁侧DNA。将里氏木霉pyr4基因作为基因组DNA的6.5kb Hindlll片段克隆进pUC18中以形成pTpyr2(Smith，J.L.，Bayliss，F.T.和Ward，M.(1991)Curr.Genet.19：27-33)。将质粒pUC4K::cbh1ΔH/H用Hindlll酶切并用牛小肠碱性磷酸酶使末端脱磷酸。
将该DNA与含有pyr4基因的6.5kb Hindlll片段连接以得到pΔCBH1pyr4。
将该DNA与含有pyr4基因的6.5kb Hindlll片段连接以得到pΔCBH1pyr4。
[0612] 用EcoR1消化pΔCBH1pyr4释放一较大片段，其由在任一端的cbh1基因座的旁侧区与中间的替换cbh1基因的pyr4基因组成。该片段上不源于里氏木霉的唯一DNA是源于pUC4K的多克隆位点的21bp片段。
[0613] 3)里氏木霉的cbhl基因的缺失。
[0614] 使用Smith等人，1991概述的方法，用EcoR1消化的质粒pΔCBH1pyr4转化分离自菌株GC69的菌丝的原生质体。获取稳定的转化体并如下鉴别cbh1基因已从其中缺失的那些突变体。
[0615] 从所述转化体分离总DNA，用Pstl消化，经受琼脂糖凝胶电泳并印记至膜过滤器。32
然后使该过滤器与P 标记的pΔCBH1pyr4杂交，通过放射自显影观察杂交图案。该探针与未转化的菌株中的天然cbh1和pyr4基因杂交。在一个转化体(菌株P37PΔCBHI)中，观察到一种杂交图案，在已发生了双交换整合事件时将可预测到该图案。也就是说，cbh1基因已通过在菌株RL-P37的cbhl基因座处整合单个拷贝的从pΔCBH1pyr4获得的较大EcoR1片段而被缺失。
然后使该过滤器与P 标记的pΔCBH1pyr4杂交，通过放射自显影观察杂交图案。该探针与未转化的菌株中的天然cbh1和pyr4基因杂交。在一个转化体(菌株P37PΔCBHI)中，观察到一种杂交图案，在已发生了双交换整合事件时将可预测到该图案。也就是说，cbh1基因已通过在菌株RL-P37的cbhl基因座处整合单个拷贝的从pΔCBH1pyr4获得的较大EcoR1片段而被缺失。
[0616] 还如上进行DNA印迹分析，不同的是所用的探针为放射性标记的plntCBHI。该质粒由在pUC4K::cbh1ΔH/H中被缺失的区域内含有来自cbh1基因座的2kb Bglll片段的pUC载体组成。该质粒杂交至菌株GC69的cbh1基因座，但不杂交至来自菌株P37PΔCBHI的DNA。这确认cbh1基因已被缺失并且来自pΔCBH1pyr4的pUC DNA片段还未被该缺失型菌株所掺入。
[0617] 通过在等电聚焦凝胶上分离来分析分泌的蛋白质显示，CBH1蛋白未由菌株P37PΔCBHI产生。
[0618] 4)P37PΔCBHI的pyr4无效突变体的产生。
[0619] 将cbhl基因被缺失的转化体(P37PΔCBHI)的孢子铺展于含有FOA的培养基上。随后使用上面部分中描述的方法获得该转化体的pyr4缺陷型衍生物。将该pyr4缺陷型菌- -
株命名为P37PΔCBHIPyr26。DNA印记分析已显示，当选择菌株P37PΔCBHIPyr26时已经发生自发的缺失。该缺失完全移除了已在菌株P37PΔCBHI中的cbh1基因座处整合的pyr4基因，以及超出初始克隆的基因组DNA的6.5kb Pstl片段的长度的来自cbh1基因座的旁侧DNA。
株命名为P37PΔCBHIPyr26。DNA印记分析已显示，当选择菌株P37PΔCBHIPyr26时已经发生自发的缺失。该缺失完全移除了已在菌株P37PΔCBHI中的cbh1基因座处整合的pyr4基因，以及超出初始克隆的基因组DNA的6.5kb Pstl片段的长度的来自cbh1基因座的旁侧DNA。
[0620] 5)设计用于缺失cbh2基因的载体的构建。
[0621] 里氏木霉的cbh2基因(编码CBHll蛋白)已作为基因组DNA的4.1kbEcoR1片段得以克隆(Chen等人，1987，Biotechnology 5：274-278)。将该4.1kb片段插入在pUC4XL的EcoR1位点之间。后一种质粒为pUC衍生物(由R.M.Berka，Genencor International Inc.构建)，其含有具有以这里所示的次序排列的限制性内切核酸位点的对称模式的多克隆位点。EcoRI、BamHI、Sacl、Smal、Hindlll、Xhol、Bglll、Clal、Bglll、Xhol、Hindll I、Smal、Sacl、BamHI、EcoRI。构建质粒pPΔCBHll，其中在该cbh2克隆在Hindlll位点(在CBHll翻译起始位点3′的74bp处)和ClaI位点(在最后的CBHII密码子3′的265bp处)之间的1.7kb中间区已被移除并替换为如下获得的含有里氏木霉pyr4基因的1.6kb Hindlll-Clal DNA片段。从1.6kb Nhel-Sphl片段上的pTpyr2切取里氏木霉pyr4基因并插入在pUC219(通过扩展多克隆位点来包括Bglll、Clal和Xhol限制性位点而衍生自pUC119；Wilson等人，1989，Gene 77：6978)的Sphl和Xbal位点之间，以产生p219M(Smith等人，1991，Curr.Genet.19：27-33)。然后可将pyr4基因作为在一端具有7bp的DNA且在另一端具有6bp的DNA(衍生至pUC219多克隆位点)的Hindlll-Clal片段移出并插入cbh2基因的Hindlll和Clal位点中以形成质粒pPΔCBHII。
[0622] 用EcoR1消化该质粒释放一个片段，该片段在一端具有来自cbh2基因座的0.7kb旁侧DNA，在另一端具有来自cbh2基因座的1.7kb旁侧DNA以及在中间具有里氏木霉pyr4基因。该片段中不是衍生自里氏木霉的唯一DNA是在pyr4基因任一端的pUC219多克隆位点的6bp和7bp片段。
[0623] 6)从菌株P37PΔCBHIPyr-26缺失cbh2基因
[0624] 根据上面3中概述的方法，产生菌株P37PΔCBHIPyr-26的原生质体并用EcoR1消化的pPΔCBHII转化。将稳定的转化体在摇瓶中培养，通过等点聚焦法检验培养物上清液中的蛋白质。鉴定了不产生任何CBHll(也不产生CBHI)蛋白的一个转化体(命名为P37PΔΔCBH67)。
[0625] 从菌株P37PΔΔCBH67提取DNA，用EcoR1和Asp718消化，并将其进行琼脂糖凝胶32
电泳处理。将来自该凝胶的DNA印记至膜过滤器并与 P标记的pPΔCBHII杂交。在来自未转化的对照菌株的DNA中观察到含有野生型cbh2基因的4.1kb EcoR1片段。相比之下，在菌株P37PΔΔCBH67中，单个4.1kb带被消除取而代之的是大约0.9和3.1kb的两条带。
如果单个拷贝的来自pPΔCBHll的较大EcoR1片段已精确地整合在cbh2基因座处并缺失了cbh2基因，则这是预期的模式。
电泳处理。将来自该凝胶的DNA印记至膜过滤器并与 P标记的pPΔCBHII杂交。在来自未转化的对照菌株的DNA中观察到含有野生型cbh2基因的4.1kb EcoR1片段。相比之下，在菌株P37PΔΔCBH67中，单个4.1kb带被消除取而代之的是大约0.9和3.1kb的两条带。
如果单个拷贝的来自pPΔCBHll的较大EcoR1片段已精确地整合在cbh2基因座处并缺失了cbh2基因，则这是预期的模式。
[0626] 将相同DNA样品也用EcoR1消化并如上所述进行DNA印记分析。在该实施例中，32
探针为 P标记的plntCBHII。该质粒含有cbh2基因编码序列的一部分，在质粒pPΔCBHII中该cbh2 DNA片段被缺失。与来自菌株P37PΔCBH67的DNA未见杂交，从而确认cbh2基因被缺失并且pPΔCBHlI的pUC质粒片段尚未被该菌株掺入。
探针为 P标记的plntCBHII。该质粒含有cbh2基因编码序列的一部分，在质粒pPΔCBHII中该cbh2 DNA片段被缺失。与来自菌株P37PΔCBH67的DNA未见杂交，从而确认cbh2基因被缺失并且pPΔCBHlI的pUC质粒片段尚未被该菌株掺入。
[0627] 7)菌株P37PΔΔCBH67的pyr4无效突变体的选择。
[0628] 将缺失cbhl和cbh2基因二者的转化体(P37PΔΔCBH67)的孢子铺展在含有FOA的培养基上。随后使用上面部分1中描述的方法获得该转化体的pyr4缺陷型衍生-物。将该pyr4缺陷型菌株命名为P37PΔΔCBH67Pyr1。DNA印记分析已显示，当选择菌株-
P37PΔΔCBH67Pyr1时已经发生自发的缺失。该缺失完全移除了已在菌株P37PΔCBH67中的cbh2基因座处整合的pyr4基因，以及超出初始克隆的基因组DNA的4.1kb EcoR1片段的长度的来自cbh2基因座的旁侧DNA。存在于pyr4基因任一端的衍生自pUC219多克隆位点的短(6bp和7bp)DNA片段也将通过该缺失从基因组移除。
P37PΔΔCBH67Pyr1时已经发生自发的缺失。该缺失完全移除了已在菌株P37PΔCBH67中的cbh2基因座处整合的pyr4基因，以及超出初始克隆的基因组DNA的4.1kb EcoR1片段的长度的来自cbh2基因座的旁侧DNA。存在于pyr4基因任一端的衍生自pUC219多克隆位点的短(6bp和7bp)DNA片段也将通过该缺失从基因组移除。
[0629] 8)设计用于破坏egl2基因的质粒的构建。
[0630] 已从里氏木霉克隆了编码EGll(此前一些人称之为EGlll)的egl2基因并公布了DNA序列(Saloheimo等人，1988，Gene 63：11-21)。我们已获得了来自菌株RL-P37的该基因，其为插入在pUC219的Pstl和Xhol位点之间的基因组DNA大约4kb的Pstl-Xhol片段。将里氏木霉pyr4基因(存在于从pTpyr2获得的基因组DNA的2.7kb SalI片段上)插入EGll编码序列内的Sall位点中以产生质粒pEGII::P-1。这导致EGll编码序列的破坏但没有任何序列的缺失。可用Hindlll和BamHl消化质粒pEGII::P-1以产生除了在一端的
5bp和另一端的16bp(这二者均衍生自pUC219的多克隆位点)外唯一衍生自里氏木霉的DNA线性片段。
5bp和另一端的16bp(这二者均衍生自pUC219的多克隆位点)外唯一衍生自里氏木霉的DNA线性片段。
[0631] 9)菌株P37PΔCBH67Pyr-1的egl2基因的破坏。
[0632] 用先前用Hindlll和BamHl消化的pEGII::P-1转化菌株P37PΔΔCBH67Pyr-1并选择稳定的转化体。从转化体分离总DNA并将DNA印记分析用于鉴定其中含有pyr4和egl2基因的质粒DNA片段已在egl2基因座处整合并因此破坏EGll编码序列的菌株。使用探针进行DNA印记分析，该探针为大约4kb的里氏木霉DNA含有egl2基因的Pstl片段。当用-Pstl消化从菌株P37PΔΔ67P1分离的DNA用于DNA印记分析时，egl2基因座随后在放射自显影照片上显影为单条4kb带。然而，对于对egl2基因进行破坏的转化体，正如所料该带消失并被两条新带所替代。当用Bglll或EcoRV消化该DNA时，该带的大小对应于egl2-
基因，在未转化的P37PΔΔ67P1菌株和egl2被破坏的转化体之间该基因的大小增加大约
2.7kb(插入的pyr4片段的大小)。将该后一种转化体(现在缺失cbhl、cbh2和egl2基因)命名为菌株B31。进一步的DNA印记分析确认，pEGII::P-1的pUC DNA片段未掺入该菌株中。
基因，在未转化的P37PΔΔ67P1菌株和egl2被破坏的转化体之间该基因的大小增加大约
2.7kb(插入的pyr4片段的大小)。将该后一种转化体(现在缺失cbhl、cbh2和egl2基因)命名为菌株B31。进一步的DNA印记分析确认，pEGII::P-1的pUC DNA片段未掺入该菌株中。
[0633] 10)菌株B31的pyr4无效突变体的选择。
[0634] 将缺失cbhl、cbh2和egl2基因的转化体(B31)的孢子铺展在含有FOA的培养基上。随后使用上面部分1中描述的方法获得该转化体的pyr4缺陷型衍生物。将该pyr4缺陷型菌株命名为B31 P6。DNA印记分析已显示，当选择菌株B31P6时已经发生自发的缺失。该缺失除去了已在菌株B31中的egl2基因座处整合的pyr4基因的大部分，但是没有扩展至egl2基因座的旁侧DNA。
[0635] 11)设计用于缺失egl1基因的质粒的构建。
[0636] 已克隆了里氏木霉的egl1基因并且该基因的DNA序列已公布(Penttila等人，1986，Gene 45；253-263；van Arsdell等人，1987，Biotechnology 5：60-64)。我们已从里氏木霉菌株RL-P37获得了该基因，其作为在pUC100(pUC18的衍生物，在多克隆位点中插入了寡核苷酸，从而添加了Bglll、Clal和Xhol的限制性位点)的Hindlll位点处插入的基因组DNA的4.2kbHindlll片段，以得到pUCEGI。从接近EGI编码序列的中间的位置延伸至超过该编码序列的3′端的位置的大约1kb EcoRV片段被移除并替换为含有从pTpyr2获得的pyr4基因的里氏木霉DNA的3.5kb Scal片段。将所得的质粒称为pPΔEGI。
[0637] 可用Hindlll消化质粒pPΔEG1以释放一DNA片段，该DNA片段仅包含在任一端具有egl1基因的片段和在中间具有替换部分EGI编码序列的pyr4基因的里氏木霉基因组DNA。
[0638] 12)菌株B31P6中的eal1基因的缺失。
[0639] 构造了两种pPΔEG1形式，这两种形式不同之处仅在于pyr4基因相对于egl1旁侧区的取向。在已用Hindlll消化菌株B31P6后将它们用所述质粒的两种形式的混合物进行转化。从稳定转化体提取总DNA，用Hindlll消化并进行DNA印记分析。所用的探针为放射标记的pUCEGI。来自菌株B31P6的DNA的4.2kb片段观察到杂交，代表了未缺失的egl1基因。鉴定了一转化体(菌株1A52)，在该转化体中该4.2kb不再存在而是已替换为大约6.8kb的片段。如果来自pPΔEGI的较大Hindlll片段已如预测的精确地在egl1基因座处整合，从而导致EGI编码序列的部分缺失以及pyr4在该位置插入的话，这是预期的模式。使用pUC质粒作为探针用于DNA印记分析，确认pPΔEGI的pUC DNA片段还未掺入菌株1A52中。
[0640] 可修饰里氏木霉菌株1A52以形成可用于本发明的里氏木霉细胞。
[0641] 实施例8补充有植酸酶和脂肪酶以及淀粉酶和木聚糖酶的组合的饮食在插导管的小猪中的营养物消化率。
[0642] 本试验在美国伊利诺伊大学(University of Illinois，USA)进行。
[0643] 材料和方法
[0644] 评价了基于玉米/大豆粉的在植酸酶、淀粉酶和木聚糖酶的组合上补充有脂肪酶的饮食在手术插导管的小猪中的回肠能量和蛋白质消化率、总能量消化率和总管道钙和磷保持率。处理组由如下组成：
[0645] ●阳性对照。营养物充足的饮食。
[0646] ●阴性对照。与阳性对照相比减少150kcal的DE/kg饲料、0.15％钙和0.12％可用磷。
[0647] ●植酸酶(500FTU/kg).
[0648] ●植酸酶(500FTU/kg)、淀粉酶(1800u/kg)和木聚糖酶(2000u/kg).
[0649] ●植酸酶(500FTU/kg)、淀粉酶(1800u/kg)、木聚糖酶(2000u/kg)和脂肪酶(3000LIPU/kg).
[0650] 将十二头阉过的公猪随机分配到一式两份的6×6拉丁方阵设计，每个方阵为6种饮食和6个周期。各头猪通过耳朵标签识别。
[0651] 阳性对照和阴性对照的饮食配方和算出的组成在表3中显示。通过将酶产品替代玉米淀粉补充到阴性对照(NC)，将饮食混合。基础饮食是基于玉米、大豆粉和玉米DDGS。向饮食加入0.4％的氧化铬作为不可消化的标志物。
[0652] 表3.饮食配方和营养明细
[0653]
[0654]
[0655] 1每公斤完全饮食提供如下量的维生素：维生素A，10,990IU；维生素D3，1,648IU；维生素E，55IU；维生素K，4.4mg；硫胺素，3.3mg；核黄素，9.9mg；吡哆辛，3.3mg；维生素B12，0.044mg；D-泛酸，33mg；烟酸，55mg；叶酸，1.1mg；生物素，0.17mg；Cu，16mg(以硫酸铜计)；Fe，165mg(以硫酸铁计)；I，0.36mg(以碘酸钾计)；Mn，44mg(以硫酸锰计)；Se，
0.3mg(以亚硒酸钠计)；和Zn，165mg(以氧化锌计)。
0.3mg(以亚硒酸钠计)；和Zn，165mg(以氧化锌计)。
[0656] 本研究所用的猪均源自品系337未阉公猪和C22母猪(Pig Improvement Company，Franklin，KY)的交配。使用平均初始体重为12.5kg(SD＝2.15)的阉过的公猪。通过手术给猪回肠远端装上T导管。术后，将各头猪圈养在单独的围栏里。给猪饲喂常规的断奶后饮食，直到开始实验为止。饲料以估计的能量维持需求量的三倍的日水平提供(即
106kcal ME/kg体重0.75)。在记录猪体重的每个周期的开始时，调整饲料配给量。
106kcal ME/kg体重0.75)。在记录猪体重的每个周期的开始时，调整饲料配给量。
[0657] 在每个周期将酶产品与饮食混合经口施用7天：4天适应，1天收集粪便，2天收集回肠消化物。在第6和第7天，收集回肠消化物样品8小时。简单地讲，用缆线打结将塑料袋连接到导管筒，收集流到袋中的消化物。当袋子充满消化物时或者至少每30分钟一次将袋子取走。将收集的样品保藏在-20℃下，以防止消化物中的氨基酸被细菌降解。在实验结束时，让冷冻的回肠样品在室温下解冻，在动物和饮食中混合，收集分样以供化学分析。在化学分析前，将回肠消化物样品冻干并细磨。
[0658] 分析回肠样品的干物质(AOAC，2005；方法930.15)。用弹式量热法(Parr 6300热量计，Parr Instruments Co.，Moline，IL)测量回肠样品中的总能量浓度。在硝酸-过氯酸湿灰样品制备(AOAC，2005；方法968.088D)后，用ICP方法(AOAC，2005；方法990.08)测量饮食和回肠消化物样品中的铬含量。这些数值用来计算回肠消化系数。在分析前，将粪便样品在鼓风烘箱中干燥，然后细磨。分析这些样品的干物质、总能量、粗蛋白、钙和磷。
[0659] 数据用SAS的PROC MIXED方法(SAS Institute Inc.，Cary，NC)按拉丁方阵设计来分析。该模型包括饮食处理、动物周期和区组。用配对t检验分离平均值。每只动物认为是所有计算的实验单元。采用0.05的α水平来确定统计学显著性。
[0660] 结果
[0661] 回肠能量消化率(图23A)在添加植酸酶的情况下与阴性对照相比没有提高，但在添加植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶和植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶+脂肪酶的情况下分别提高2.95％和9.28％。这些变化表明，单纯由于添加脂肪酶对植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶背景所致的影响为6.3％。类似地，粗蛋白质的回肠消化率在补加植酸酶的情况下与阴性对照饮食相比没有提高(图23B)，但补加植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶则相比于阴性对照(+5.6％)和植酸酶补加(+4.0％)显著提高了粗蛋白消化率。在植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶上另外补加脂肪酶，与阴性对照(+10.7％)、植酸酶补加(+9.1％)和植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶(+4.9％)相比进一步提高了粗蛋白消化率。
[0662] 在总管道水平(图24)下，添加植酸酶和添加植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶都没有影响能量消化率。在添加植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶的情况下从回肠水平到粪便水平的差异的减少并不出乎意料，因为大肠中的微生物活性趋向于消除在猪中的能量消化率的初始差异。相比之下，向这个组合添加脂肪酶较之其他的处理显示出了更大的粪便能量消化系数，这提示了本来甚至不会被大肠中的微生物消化的营养物的释放和吸收。植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶+脂肪酶的组合与阴性对照饲料相比提高了总管道能量消化率达4.7％。
[0663] 在本研究中，与阴性对照饮食相比，含有植酸酶、植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶和植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶+脂肪酶的饮食的总钙(图25A)和磷保持率(图25B)的相对增加也是明显的，分别为植酸酶(+32％和+293％)、植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶(+36％和+323％)和植酸酶+木聚糖酶+淀粉酶+脂肪酶(+45％和334％)。虽然在添加植酸酶的情况下钙和磷消化率的改变是预期到的，但在添加木聚糖酶+淀粉酶+脂肪酶的情况下的另外的增加则表明了脂肪酶在提高含植酸酶、淀粉酶和木聚糖酶的饮食的钙和磷保持率方面的主要作用。与对照饲料和植酸酶本身相比，这些增加显著地更大，这证明脂肪酶对钙和磷保持率的相加作用。
[0664] 总之，在植酸酶+淀粉酶+木聚糖酶上添加脂肪酶，与阴性对照、添加植酸酶和添加植酸酶+淀粉酶+木聚糖酶相比，在回肠水平提高了能量和蛋白质消化率，并在总管道水平提高了能量消化率。类似地，在植酸酶+淀粉酶+木聚糖酶上添加脂肪酶，与阴性对照和添加植酸酶的饮食相比，提高了总管道钙和磷保持率。本专利中所包括的体外实施例表明，由脂肪酶的添加造成的这些消化率的增加，主要是由于脂肪酶对饮食钙的竞争所促进的植酸酶活性增加导致的。
[0665] 实施例9在酸性条件下玉米-大豆饮食中的游离脂肪酸产生
[0666] 玉米-大豆饮食中通过脂肪酶的游离脂肪酸产生的研究结果
[0667] 将饲料样品与脂肪酶和植酸酶的不同组合在～pH 2.8下于40℃温育。
[0668] 试剂：
[0669] 适当的试剂及它们的浓度如下。植酸酶测定缓冲液：0.25M乙酸钠，1mM CaCl2，0.01％吐温20，pH 5.5。胃蛋白酶溶液：含有2000U/ml胃蛋白酶的0.75M HCl(Sigma P7000)。所用的饲料样品为基础玉米-大豆饮食，含有60.01％玉米、31.52％大豆粉48，4％大豆油、0.4％盐、0.2％DL-甲硫氨酸、1.16％石灰石、1.46％磷酸二钙和1.25％VIT/MIN混合物。
[0670] 酶：
[0671] 如本文所述的脂肪酶3。如本文所述的Phyzyme。TfuIII脂肪酶是在枯草芽孢杆菌中表达的来自嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的细菌角质酶(Tfu_0883；NCBI登录号为YP_288944.1)。使用如材料和方法中描述的脂肪酶测定法分析TfuIII。另外，用同一测定法分析该酶，但pH条件变为pH 7.0而不是pH 5.5。在pH 7.0下测量的脂肪酶活性描述为LIP7U，其使用与材料和方法中的脂肪酶测定法中描述的相同的定义。发现在pH 5.5下测量的脂肪酶活性(LIPU)与在pH 7.0下测量的脂肪酶活性(LIP7U)之间的比率为1∶1.4。
[0672] Ronozyme P-CT和Natuphos是市售的真菌植酸酶。以干产品获得该样品。将1g样品最初再悬浮于50ml植酸酶测定缓冲液中并用磁力搅拌器提取20分钟。将提取混合物用植酸酶测定缓冲液注满至最终100ml并滤过玻璃纤维过滤器。根据“材料和方法”中描述的植酸酶测定法测量最终提取物的植酸酶活性。
[0673] 将脂肪酶样品稀释进H2O中至酶活性对脂肪酶3而言为30LIPU/ml而对TfuIII而言为30LIPU/ml。
[0674] 将植酸酶样品稀释进植酸酶测定缓冲液中至酶活性为5FTU/ml。
[0675] 酸性pH下的体外温育：
[0676] 在体外温育中评价如下酶组合：脂肪酶3、脂肪酶3+Ronozyme P、脂肪酶3+Natuphos、 脂 肪 酶 3+Phyzyme、TfuIII、TfuIII+Ronozyme P、TfuIII+Natuphos、TfuIII+Phyzyme和无脂肪酶或植酸酶。
[0677] 对于每次温育，将1g饲料样品称量进50ml螺旋盖试管中。将100μl各酶溶液添加至各自的试管，然后添加H2O至总共1ml。接着，将0.5ml的胃蛋白酶溶液添加至各试管并小心混合内容物。添加5颗玻璃球，然后将样品在振荡水浴中在40℃下温育45分钟。温育后将试管以3500rpm离心10分钟。测量“无脂肪酶和无植酸酶”温育物的上清液的pH。最后，将样品在液氮中冷冻并置于冷冻干燥器中过夜。所有的温育均一式二份进行。
[0678] 游离脂肪酸测量：
[0679] 用NEFA-HR(2)试剂盒(WAKO Chemicals GmbH)测量温育期间产生的游离脂肪酸的量。将样品置于室温下并添加20ml 96％乙醇。手动使样品再悬浮，然后在室温下在转轮上混合1小时。混合后，将样品在3500rpm下离心10分钟。将上清液在96％乙醇中5倍稀释，然后测量样品中的游离脂肪酸。将110μl NEFA试剂R1在37℃下平衡5分钟，然后添加15μl稀释的样品，将反应混合物在37℃下温育10分钟。添加55μl NEFA试剂R2并在37℃下继续另外温育10分钟，然后测量OD520nm。从由NEFA标准品(WAKO Chemicals GmbH)制备的标准曲线计算游离脂肪酸的含量。
[0680] 结果：
[0681] 游离脂肪酸测量的结果在图29中给出。该图示出来玉米-大豆饮食中的游离脂肪酸产量。针对未添加脂肪酶或植酸酶的空白值校正所产生的游离脂肪酸(FFA)的量。没有脂肪酶且没有植酸酶的温育物的pH测量为pH 2.8，并假定代表该实施例中的所有温育物。这展示温育在十分酸性的条件下进行。单独的脂肪酶3或与Phyzyme、Natuphos或Ronozyme P组合显示与具有TfuIII(单独的或与Phyzyme、Natuphos或Ronozyme P组合)的所有样品相比FFA释放显著。这清楚地显示，脂肪酶3在猪胃或鸡砂囊中的酸性环境中在脂肪水解方面将十分有效。
[0682] 实施例10.添加钙至测定混合物对植酸酶活性的影响以及添加游离脂肪酸至含有CaCl2的测定物的影响
[0683] 使用渐增浓度的钙时植酸-钙复合物形成的研究结果和通过添加游离脂肪酸恢复植酸酶活性。
[0684] 背景：
[0685] 植酸可溶液与二价金属如钙形成螯合物。该植酸-矿物质复合物可作为不溶性沉淀物存在或作为可溶性复合物存在，并且潜在地对植酸酶进行的水解有抗性。游离脂肪酸通过形成Ca-皂可潜在地起到竞争性螯合剂的作用，从而导致植酸的抗植酸酶形式形成降低和所释放的植酸-P的伴随增加。
[0686] 试剂：
[0687] 适当的试剂及它们的浓度如下。测定缓冲液：0.25M乙酸钠，3％Triton X-100(w/v)，pH 5.5。植酸盐溶液：测定缓冲液中的9.1mM植酸钠盐水合物(Sigma P0109)。CaCl2溶液：测定缓冲液中的0.3M CaCl2。FFA溶液：溶解于96％乙醇中的40.8mg/ml棕榈酸-硬脂酸混合物(Sigma 09586)。乙醇：96％乙醇。
[0688] 酶：
[0689] 如本文所述的Phyzyme。Ronozyme P-CT和Natuphos为市售的真菌植酸酶。如本文所述的BP17。样品作为干产品获得。将1g样品最初再悬浮于50ml的0.25M乙酸钠、1mM CaCl2、0.01％吐温20、pH 5.5中，用磁力搅拌器提取20分钟。将提取混合物用0.25M乙酸钠、1mM CaCl2、0.01％吐温20，pH 5.5充满至最终100ml并滤过玻璃纤维过滤器。根据“材料和方法”中描述的植酸酶测定法测量最终提取物的植酸酶活性。
[0690] 将植酸酶样品稀释于0.25M乙酸钠、1mM CaCl2、0.01％吐温20，pH5.5中至酶活性为0.3FTU/ml。
[0691] 植酸酶进行的植酸水解：
[0692] 将0.5ml乙醇与1.4ml测定缓冲液和1ml植酸盐溶液在12ml试管中混合。将混合物在37℃水浴中平衡5分钟，然后通过添加0.1ml植酸酶溶液开始反应。对于空白测量，添加0.1ml测定缓冲液而不是植酸酶溶液。在37℃下温育1小时后，通过添加0.75ml 2.5M HCl终止反应。所有的温育均一式二份进行。
[0693] 使用渐增浓度的CaCl2时植酸酶进行的植酸水解：
[0694] 将适当体积的CaCl2溶液在12ml试管中与0.5ml乙醇、1ml植酸盐溶液和测定缓冲液混合至最终测定体积为3ml。将混合物在37℃水浴中平衡5分钟，然后通过添加0.1ml植酸酶溶液开始反应。对于空白测量，添加0.1ml测定缓冲液而不是植酸酶溶液。在37℃下温育1小时后，通过添加0.75ml2.5M HCl终止反应。所有的温育均一式二份进行。
[0695] 在存在15mM CaCl2的情况下和使用渐增浓度的FFA时植酸酶进行的植酸水解：
[0696] 将适当体积的FFA溶液在12ml试管中与乙醇混合至体积为0.5ml。添加0.15ml钙溶液、1ml植酸盐溶液和测定缓冲液至最终测定体积为3ml。将混合物在37℃水浴中平衡5分钟，然后通过添加0.1ml植酸酶溶液开始反应。对于空白测量，添加0.1ml测定缓冲液而不是植酸酶溶液。在37℃下温育1小时后，通过添加0.75ml 2.5M HCl终止反应。所有的温育均一式二份进行。
[0697] 植酸酶活性的测量：
[0698] 在Konelab分析仪上用Phosphorus试剂(Thermo Scientific)测量水解样品中的无机磷酸盐浓度。将180μl Phosphorus试剂与5μl样品混合并在37℃下温育4分钟，然后测量OD340nm。用sCal Konelab校准剂和Nortrol Konelab对照(Thermo Scientific)计算磷酸盐的含量。通过从结果减去空白测量值将植酸酶活性测量为所释放的无机磷酸盐。所有活性均相对于无CaCl2存在的样品进行计算。
[0699] 结果
[0700] 图30示出了抗植酸酶的植酸和钙复合物的产生以及通过添加游离脂肪酸进行的逆转。图30A示出了渐增的CaCl2浓度对植酸酶活性的影响。图30B示出了向含有15mM的反应混合物添加游离脂肪酸对植酸酶活性的影响。
[0701] 使用渐增浓度的CaCl2时植酸水解的结果在图30A中给出。对于所有四种植酸酶均观察到使用渐增的CaCl2浓度植酸酶活性逐渐降低。对于Phyzyme、BP17和Ronozyme P，活性降低始于5mM CaCl2，而Natuphos在5mM时具有增加的活性并且活性降低始于15mM CaCl2。在20mM CaCl2时，对于Phyzyme、BP17和Ronozyme P未观察到植酸酶活性，从而表明在高于20mM的CaCl2浓度下所有植酸结合在抵抗至少Phyzyme、BP17和Ronozyme P水解的复合物中。对于Natuphos，在30mM CaCl2下观察到植酸酶活性显著降低，但60mM的CaCl2浓度看起来是使植酸结合在抵抗Natuphos水解的复合物中所必需的。添加游离脂肪酸至含有15mM CaCl2的反应混合物时Phyzyme、BP17和Ronozyme P的植酸酶活性的结果在图30B中给出。当添加游离脂肪酸至含有15mM CaCl2的反应混合物时，随着游离脂肪酸的量逐渐增加植酸酶恢复越来越多的活性。观察到三种植酸酶之间响应游离脂肪酸浓度有小的差别，但在25mM游离脂肪酸时所有三种均恢复了100％活性。这清楚地展示，游离脂肪酸可竞争性地结合钙，从而具有防止形成抗植酸酶的植酸-钙复合物的能力。可如这里所展示的将游离脂肪酸作为单一组分添加或可通过脂肪酶对甘油三酯底物的作用而形成。
[0702] 实施例11脂肪酶温育和随后的植酸酶测定-添加钙至测定混合物对植酸酶活性的影响和添加脂肪酶反应混合物至含有CaCl2的测定物的影响
[0703] 使用渐增浓度的钙时植酸-钙复合物形成的研究结果和通过添加由脂肪酶3产生的游离脂肪酸恢复植酸酶活性。
[0704] 背景技术：
[0705] 在实施例11中，描述了添加游离脂肪酸至含有15mM CaCl2的植酸酶反应混合物时对植酸酶活性的影响。在该实施例中，进行相似的实验，但游离脂肪酸由脂肪酶3产生。将甘油三酯乳液与脂肪酶3温育，将该混合物的一小部分随后添加至含有30mM CaCl2的植酸酶反应混合物，观察对植酸酶活性的影响。
[0706] 试剂：
[0707] 适当的试剂及它们的浓度如下。脂肪酶样品缓冲液：50mM乙酸钠，pH 5.0，0.1％BSA(w/v)，1.2％NaCl(w/v)。甘油三酯底物：2％三辛酸甘油酯(v/v)，0.3％NaCl(w/v)，13％Triton X-100(w/v)，120mM乙酸钠，pH5.0。植酸酶测定缓冲液：0.25M乙酸钠，pH 5.5。
植酸盐溶液：测定缓冲液中的9.1mM植酸钠盐水合物(Sigma P0109)。CaCl2溶液：测定缓冲液中的0.3M CaCl2。乙醇：96％乙醇。
植酸盐溶液：测定缓冲液中的9.1mM植酸钠盐水合物(Sigma P0109)。CaCl2溶液：测定缓冲液中的0.3M CaCl2。乙醇：96％乙醇。
[0708] 酶：
[0709] 如本文描述的脂肪酶3和Phyzyme。将脂肪酶3样品稀释进脂肪酶样品缓冲液中至酶活性为10LIPU/ml。将植酸酶样品稀释于0.25M乙酸钠、1mMCaCl2、0.01％吐温20，pH5.5中至酶活性为0.3FTU/ml。
[0710] 脂肪酶反应混合物：
[0711] 将5ml甘油三酯底物与1.0ml脂肪酶溶液在12ml试管中混合。对于空白混合物，添加1.0ml脂肪酶样品缓冲液而不是脂肪酶溶液。将混合物伴随连续搅拌在30℃水浴中温育120分钟。将混合物分别直接作为脂肪酶反应混合物或空白反应混合物用于如下植酸酶测定法中。
[0712] 使用空白反应混合物和渐增浓度的CaCl2时植酸酶进行的植酸水解：
[0713] 将适当体积的CaCl2溶液在12ml试管中与1.3ml空白反应混合物、1ml植酸盐溶液和测定缓冲液混合至最终测定体积为3ml。将混合物在37℃水浴中平衡5分钟，然后通过添加0.1ml植酸酶溶液开始反应。对于空白测量，添加0.1ml测定缓冲液而不是植酸酶溶液。在37℃下温育1小时后，通过添加0.75ml 2.5M HCl终止反应。
[0714] 在存在30mM CaCl2和脂肪酶反应混合物的情况下植酸酶进行的植酸水解：
[0715] 将1.3ml空白反应混合物或脂肪酶反应混合物在12ml试管中与0.3ml钙溶液、1ml植酸盐溶液和测定缓冲液混合至最终测定体积为3ml。将混合物在37℃水浴中平衡5分钟，然后通过添加0.1ml植酸酶溶液开始反应。在37℃下温育1小时后，通过添加0.75ml
2.5M HCl终止反应。
2.5M HCl终止反应。
[0716] 植酸酶活性的测量：
[0717] 在Konelab分析仪上用Phosphorus试剂(Thermo Scientific)测量水解样品中的无机磷酸盐浓度。将180μl Phosphorus试剂与5μl样品混合并在37℃下温育4分钟，然后测量OD340nm。用sCal Konelab校准剂和Nortrol Konelab对照(Thermo Scientific)计算磷酸盐的含量。通过从结果减去空白测量值将植酸酶活性测量为所释放的无机磷酸盐。所有活性均相对于无CaCl2存在的样品进行计算。
[0718] 结果
[0719] 图31示出了抗植酸酶的植酸和钙复合物的产生以及通过添加包含脂肪酶的脂肪酶反应混合物进行的逆转。图31A示出了渐增的CaCl2浓度对植酸酶活性的影响，图31B示出了向含有30mM CaCl2的植酸酶反应混合物添加脂肪酶反应混合物对植酸酶活性的影响。
[0720] 在存在空白脂肪酶反应混合物(不存在脂肪酶)的情况下使用渐增浓度的CaCl2时植酸水解的结果在图31A中给出。观察到使用渐增的CaCl2浓度时植酸酶活性逐渐下降，在30mM CaCl2下植酸酶活性显著降低，在40mM CaCl2下不残余活性。该钙抑制谱不同于实施例11中所示的相应曲线。原因是施加用于乳化脂肪酶反应混合物中的甘油三酯底物的Triton X-100量，其导致与实施例11中描述的实验相比多至两倍的Triton X-100存在于植酸酶反应混合物中。Triton X-100浓度的变化改变了植酸和钙之间复合物形成的性质。
[0721] 添加脂肪酶反应混合物至含有30mM CaCl2的植酸酶反应混合物的结果在图31B中给出。添加包含脂肪酶的脂肪酶反应混合物，导致与无添加的脂肪酶的样品相比植酸酶活性显著增加。
[0722] 这清楚地展示，由作用于甘油三酯底物的脂肪酶活性产生的游离脂肪酸可竞争性地结合钙，从而具有防止形成抗植酸酶的植酸-钙复合物。当植酸-钙复合物未形成时，较大量的植酸更易于由植酸酶降解，从而导致植酸酶活性增加。
[0723] 在动物中，由脂肪酶活性引起的植酸酶活性的这种增加将导致P和C保持率增加以及表观氨基酸消化率增加(Ravindran，V.等人，Br.Poult.Sci.，41，193-200(2000)和Selle，P.H.等人，Livestock Science，124，126-141(2009))。当在植酸酶基础上不补充脂肪酶的动物相比时，这将导致增加的P和Ca保持率以及增加的能量可代谢性和表观氨基酸消化率。
[0724] 实施例12饲料中脂肪酶的pH谱
[0725] 饲料中脂肪酶3和胰脂肪酶的pH谱的研究结果
[0726] 使用不同的pH缓冲液将饲料样品在40℃下与脂肪酶3和胰脂肪酶温育以显示脂肪酶3和胰脂肪酶的pH谱。
[0727] 酶：
[0728] 如本文所述的脂肪酶3。作为来自猪胰腺的胰液素(Sigma P7545)中的形式的胰脂肪酶。将脂肪酶3样品稀释进H2O中至酶活性为300LIPU/ml。将胰液素样品稀释进H2O中至2mg/ml的浓度。
[0729] 试剂：
[0730] 适当的缓冲液及它们的浓度如下。0.25M HCl；0.5M甘氨酸-HCl，pH2.5；0.5M甘氨酸-HCl，pH 3.5；0.5M磷酸钠，pH 6.5；0.5M磷酸钠，pH7.5；0.5M Tris，pH 8.5；1M NaHCO3，pH 10。其他试剂如下。TDC溶液：将牛磺脱氧胆酸钠(Sigma T0875)稀释进H2O中至80mM。所用的饲料样品为基础玉米-大豆饮食，含有60.01％玉米、31.52％大豆粉48，4％大豆油、
0.4％盐、0.2％DL-甲硫氨酸、1.16％石灰石、1.46％磷酸二钙和1.25％VIT/MIN混合物。
0.4％盐、0.2％DL-甲硫氨酸、1.16％石灰石、1.46％磷酸二钙和1.25％VIT/MIN混合物。
[0731] 与不同pH缓冲液的体外温育：
[0732] 对于每次温育，将1g饲料样品称量进50ml螺旋盖试管中。将0.1ml酶溶液及随后的0.1ml TDC溶液和1.8ml各自的缓冲液添加至各个试管中。添加5颗玻璃球，然后将样品在40℃下在振荡水浴中温育120分钟。温育后，将试管在3500rpm下离心10分钟，测量上清液的pH。随后，将样品在液氮中冷冻并置于冷冻干燥器中过夜。所有的温育均一式二份进行。
[0733] 游离脂肪酸测量：
[0734] 用NEFA-HR(2)试剂盒(WAKO Chemicals GmbH)测量温育期间产生的游离脂肪酸的量。将样品置于室温下并添加20ml 96％乙醇。手动使样品再悬浮，然后在室温下在转轮上混合1小时。混合后，将样品在3500rpm下离心10分钟。将上清液在96％乙醇中5倍稀释，然后测量样品中的游离脂肪酸。将110μl NEFA试剂R1在37℃下平衡5分钟，然后添加15μl稀释的样品，将反应混合物在37℃下温育10分钟。添加55μl NEFA试剂R2并在37℃下继续另外温育10分钟，然后测量OD520nm。从由NEFA标准品(WAKO Chemicals GmbH)制备的标准曲线计算游离脂肪酸的含量。
[0735] 结果：
[0736] 图32示出了在玉米-大豆饮食中测量的脂肪酶3和胰腺脂肪酶的pH谱。饲料的脂肪酶3的浓度为30LIPU/g，饲料的胰脂肪酶的浓度为0.2mg/ml。相对于所产生的游离脂肪酸的最高测量量显示活性。
[0737] 对于脂肪酶3和胰脂肪酶不同缓冲液中的pH分别如下：0.25M HCl提供pH 3.41和pH 3.02；0.5M甘氨酸-HCl，pH 2.5提供pH 3.99和pH 3.76；0.5M甘氨酸-HCl，pH 3.5提供pH 4.93和pH 5.18；0.5M磷酸钠，pH 6.5提供pH 6.45和pH 6.45；0.5M磷酸钠，pH7.5提供pH 7.26和pH 7.22；0.5MTris，pH 8.5提供pH 8.33和pH 8.18；1M NaHCO3，pH
10提供pH 9.95和pH 10.07。对于脂肪酶3，饲料中最佳的pH发现为pH 4.0，在更低和更高pH二者下活性均降低。pH 3.4为所评价的最低pH，进一步降低pH时活性将可能继续降低。对于胰脂肪酶，饲料中最佳的pH发现为pH 8.2，在更低和更高pH二者下活性均降低结论是，脂肪酶3具有与胰脂肪酶的pH谱十分不同的pH谱。另外，脂肪酶3的pH谱表明，脂肪酶3在猪胃或鸡砂囊中的酸性环境中在脂肪水解方面将十分有效。
10提供pH 9.95和pH 10.07。对于脂肪酶3，饲料中最佳的pH发现为pH 4.0，在更低和更高pH二者下活性均降低。pH 3.4为所评价的最低pH，进一步降低pH时活性将可能继续降低。对于胰脂肪酶，饲料中最佳的pH发现为pH 8.2，在更低和更高pH二者下活性均降低结论是，脂肪酶3具有与胰脂肪酶的pH谱十分不同的pH谱。另外，脂肪酶3的pH谱表明，脂肪酶3在猪胃或鸡砂囊中的酸性环境中在脂肪水解方面将十分有效。
[0738] 实施例13补充有脂肪酶、植酸酶和脂肪酶+植酸酶组合的饮食相对于对照饮食在肉用仔鸡中的回肠消化率和磷和钙的总管道保持率。
[0739] 材料和方法
[0740] 进行实验来评价用补充有单独的脂肪酶或植酸酶以及脂肪酶和植酸酶组合的饮食相对于用阴性对照饮食饲养的肉用仔鸡中的回肠消化率和磷和钙的总管道保持率。饮食(表4)是基于玉米-大豆粉，含有玉米DDGS、玉米蛋白粉和大豆油。
[0741] 表4饮食的组成和计算分析(饲养时的g/kg)
[0742]
[0743] 该实验设计由6个膳食处理组成，如下将每个处理随机地分配至6个相同笼子(每个笼子8只小鸡)：
[0744] 1.阴性对照(NC)
[0745] 2.NC+脂肪酶(1,000LIPU/kg)
[0746] 3.NC+脂肪酶(3,000LIPU/kg)
[0747] 4.NC+植酸酶(500FTU/kg)
[0748] 5.NC+植酸酶(500FTU/kg)+脂肪酶(1,000LIPU/kg)
[0749] 6.NC+植酸酶(500FTU/kg)+脂肪酶(3,000LIPU/kg)
[0750] 将初生肉鸡随机分配至环境控制室内的电加热层迭式育雏笼中。小鸡接受恒定的荧光照明并让其自由获得饮食和水。小鸡接受开食料饮食直至第14天。在该天龄，根据体重将小鸡分配至膳食处理，并转移至中鸡笼。从第14天直至第21天给小鸡喂养实验饮食。第一周温度保持在31℃，然后逐渐降低到第三周时的22℃。
[0751] 从孵化后第17-20天测量每只笼子的饲料摄取和总排泄物输出。收集每只笼子的排泄物，在共混机中混合并取分样。将分样冷冻干燥，研磨以通过0.5mm筛，在-4℃的密封塑料容器中保存直到分析。分析饮食和排泄物样品的干物质(DM)、钙(Ca)和磷(P)。
[0752] 在第21天，从每一相同笼子选择两只小鸡并通过心脏内注射戊巴比妥钠实施安乐死。立即暴露小肠并将回肠下半部的内容物通过用蒸馏水轻轻地冲洗进塑料容器中来收集。回肠定义为小肠从卵黄管憩室延伸至接近回-盲接头40mm的点的部分。汇集一个笼子的消化物并冷冻干燥，研磨通过0.5-mm筛，并在-4℃下在密封容器中保存直至针对DM、钛、Ca和P的实验室分析。
[0753] 使用SAS的PROC MIXED程序(SAS Institute Inc.，Cary，NC)通过ANOVA分析数据。该模型包括膳食处理的固定效应和区组的随机效应。用配对t检验分离平均值。每个围栏认为是所有计算的实验单元。采用0.05的α水平来确定统计学显著性。
[0754] 结果
[0755] 图33显示，与阴性对照相比植酸酶没有显著增加磷的回肠消化率，但正如所料产生了6.0％的数值增量。与阴性对照相比脂肪酶(1,000和3,000LIPU/kg时)对回肠磷消化率不产生影响。相比之下，与阴性对照相比脂肪酶+植酸酶能够显著增加回肠磷消化率，在添加脂肪酶时1,000LIPU/kg下增加14.3％，在3,000U/kg下增加10.6％。仅在以1,000u/kg包括脂肪酶时，与植酸酶处理相比，脂肪酶+植酸酶的组合显著增加回肠磷消化率，差值为7.8％。
[0756] 图34显示，与阴性对照饮食相比任何酶处理对回肠钙消化率没有显著影响。然而，使用植酸酶+脂肪酶时获得了数值最高的Ca消化率值，当脂肪酶分别以1,000u/kg和3,000u/kg包括在内时，该组合获得的值为用阴性对照饮食获得的值的118.3％和115.6％。
[0757] 图35显示，与阴性对照相比添加脂肪酶和添加植酸酶均不导致总管道磷保持率有任何显著差异。然而，与阴性对照相比植酸酶产生9.7％的磷保持率的数值增量。当脂肪酶以1,000和3,000LIPU/kg补充时，与阴性对照相比脂肪酶+植酸酶的组合显著增加了磷保持率，分别增加13.4％和16.0％。
[0758] 图36显示，与阴性对照相比添加脂肪酶和添加植酸酶均不导致总管道钙保持率有任何显著差异。然而，与阴性对照相比植酸酶和3,000LIPU/kg的组合显著增加了Ca保持率，增加了17.7％。
[0759] 在合成时，在本研究中脂肪酶和植酸酶均不产生对P和Ca消化率的显著影响。然而，与阴性对照相比植酸酶和1,000LIPU/kg的脂肪酶的组合增加了回肠和总管道磷保持率，以及与添加植酸酶相比增加了回肠磷消化率。与阴性对照相比植酸酶和3,000LIPU/kg的脂肪酶的组合增加了回肠和总管道磷保持率和总管道Ca保持率。除植酸酶之外添加脂肪酶在钙和磷的吸收和利用方面的这种增加效果看起来主要是与胃肠道中通过脂肪酶产生游离脂肪酸相关，游离脂肪酸的产生促进对钙的竞争并改善植酸酶活性，如在本文所描述的体外实施例中确证的。
[0760] 国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
[0761]
[0762] 1适用细则6/4(d)的情况下，该日期即是国际保藏单位状态得到的日期表格BP/4(单独页)
[0763] 国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
[0764]1
[0765] 指初始保存的日期或，在已进行新的保存或移交的情况下，指最近的相关日期(新保存的日期或移交的日期)2
[0766] 在细则10.2(a)(ii)和(iii)中提及的情况中，指最近的存活力测试3
[0767] 在适用的框中用叉号标记
[0768] 表BP/9(第一页)
[0769]
[0770] 4在要求该信息以及在测试的结果为阴性时填写
[0771] 表格BP/9(第二页并且是最后一页)
[0772] 国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
[0773] Danisco Biotechnology，
[0774] Langebrogade 1，
[0775] PO Box 17，国际表格
[0776] DK-1001 Copenhagen
[0777] Denmark. 由该页底部确定的国际保存单位遵循细
[0778] 则7.1发出的在初始保存情况下的存单
[0779]
[0780] 1适用细则6/4(d)的情况下，该日期即是国际保藏单位状态得到的日期表格BP/4(单独页)
[0781] 国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
[0782]
[0783]
[0784] 1指初始保存的日期或，在已进行新的保存或移交的情况下，指最近的相关日期(新保存的日期或移交的日期)
[0785] 2在细则10.2(a)(ii)和(iii)中提及的情况中，指最近的存活力测试
[0786] 3在适用的框中用叉号标记
[0787] 表BP/9(第一页)
[0788]4
[0789] 在要求该信息以及在测试的结果为阴性时填写
[0790] 表格BP/9(第二页并且是最后一页)
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