对大豆的D-氨基酸选择
阅读：825发布：2023-03-11
专利汇可以提供对大豆的D-氨基酸选择专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及基于D－丙 氨 酸和/或D－丝氨酸选择的、转化大豆(Glycine max)的改进的方法和设备(means)。，下面是对大豆的D-氨基酸选择专利的具体信息内容。
1.产生转基因大豆植物的方法，所述方法包括如下步骤：
a.向大豆细胞或组织引入DNA构建体，所述构建体包含至少一个第 一表达构建体，所述第一表达构建体包含在所述大豆植物中具有活性的启 动子以及与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的 酶的核酸序列，以及
b.在选择培养基上对步骤a)的所述大豆细胞或组织进行至少5天时 间的孵育，所述培养基包含总浓度为大约0.5mM至大约100mM的D-丙 氨酸和/或D-丝氨酸和/或其衍生物，以及
c.将步骤b)的所述大豆细胞或组织转入再生培养基，对包含所述 DNA构建体的大豆植物进行再生和选择。
2.权利要求1的方法，其中，所述在大豆中具有活性的启动子是泛素 启动子或来自双子叶植物物种的肌动蛋白2启动子或p-ScBv或 p-ScBv-iSuc UDP启动子。
3.权利要求2的方法，其中，所述植物泛素启动子是，其中，在共转 化后应用选择压力，这包括下述步骤中的一个或多个：
a.在枝条诱导时首先无选择；
b.在枝条诱导期间选择，
c.在枝条延长期间选择。
4.权利要求2或3的方法，其中，所述在大豆中具有活性的启动子选 自：
a)序列，其包含SEQ ID NO：7或8所示的序列，以及
b)序列，其包含至少一个片段，并且在大豆中具有启动子活性，所述 片段为SEQ ID NO：7或8所示的序列的至少50个连续碱基对，
c)序列，其包含与SEQ ID NO：7或8所示的序列具有至少60％同 一性的序列，并且在大豆中具有启动子活性，
d)序列，其包含能在与下述条件相当或均等的条件下，与SEQ ID NO： 7或8所示的序列杂交的序列，并且在大豆中具有启动子活性，所述条件 是在30％的甲酰胺、1 M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在2×SSC 中于50℃下洗涤。
5.权利要求1至4中任意一项的方法，其中，所述方法包括下述步骤：
(a)提供大豆幼苗初生叶节或更高的叶节的腋生分生组织，以及
(b)将所述腋生分生组织与包含转基因T-DNA的根瘤菌科细菌一起 共培养，所述转基因T-DNA包含下述DNA构建体，所述构建体包含至少 一个第一表达构建体，所述第一表达构建体包含在所述大豆植物中具有活 性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝 氨酸的酶的核酸序列
(c)将所述经共培养的腋生分生组织转移到枝条诱导和选择培养基 上，所述培养基包含：
(i)浓度适于从所述腋生分生组织从头诱导枝条诱导的至少一种植物 生长因子，以及
(ii)总浓度为大约3mM至大约100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸 和/或其衍生物，以及
(iii)任选地，一种或多种适于抑制根瘤菌科细菌生长的抗生素，
以及，在所述培养基上对所述经共培养的腋生分生组织进行至少5天 的培养，直到从其诱导和发育出枝条，并且分离所述枝条，以及
(d)将所述经分离的枝条转移至生根培养基，在所述生根培养基上培 养所述枝条，直到所述枝条形成根，进一步将由此得到的小植物再生为成 熟植物，其包含插入进它们基因组中的所述转基因T-DNA。
6.权利要求1至5中任意一项的方法，其中，所述能代谢D-丝氨酸的 酶选自：
i)表1所示的D-丝氨酸解氨酶，
ii)酶，其具有相同的酶活性，并且与表1所示的D-丝氨酸解氨酶的 氨基酸序列具有至少80％的同一性；
iii)酶，其具有相同酶活性，并且与表1所示的D-丝氨酸解氨酶的核 酸序列具有至少80％的编码核酸序列的同一性；以及
iv)能与编码表1所示的D-丝氨酸解氨酶的序列的互补序列杂交的核 酸序列编码的酶，
并且，其中，选择在包含浓度为3mM至100mM的D-丝氨酸的培养 基上进行；
或者，其中，能代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸的酶选自：
i)表1所示的D-氨基酸氧化酶，以及
ii)酶，其具有相同的酶活性，并且与表1所示的D-氨基酸氧化酶的 氨基酸序列具有至少80％的同一性；
iii)酶，其具有相同酶活性，并且与表1所示的D-氨基酸氧化酶的核 酸序列具有至少80％的编码核酸序列的同一性；以及
iv)能与编码表1所示的D-氨基酸氧化酶的序列的互补序列杂交的核 酸序列编码的酶，
并且，其中，选择在包含总浓度为3mM至100mM的D-丙氨酸和/ 或D-丝氨酸的培养基上进行。
7.权利要求5或6的方法，其中，提供选自下述的形式的初生节或更 高的节的腋生分生组织：
i)由基本上整株幼苗提供的幼苗腋生分生组织，以及
ii)通过以使得腋生分生组织保持与叶的叶柄相连的方式对初生或更高 的叶加以切割，而提供的叶腋生分生组织，
iii)繁殖的腋生分生组织。
8.权利要求5至7中任意一项的方法，其中，步骤(b)和/或(c)的 培养基包含：
a)浓度相当于大约1μM至大约10μM 6-苄氨基嘌呤的细胞分裂素， 和/或
b)大约0.1μM至大约2μM之间的赤霉酸(GA3)，和/或
c)至少一种硫醇化合物。
9.权利要求5至8中任意一项的方法，其中，所述细胞分裂素是浓度 1μM至10μM的激动素。
10.权利要求1至8中任意一项的方法，其中，所述能代谢D-丙氨酸 或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸解氨酶(EC 4.3.1.18)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)和D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。
11.权利要求1至9中任意一项的方法，其中，所述能代谢D-丝氨酸 的酶选自：
i)SEQ ID NO：2编码的大肠杆菌D-丝氨酸解氨酶；和
ii)酶，其具有相同的酶活性并且与SEQ ID NO：2编码的序列具有 至少60％的同一性；以及
iii)下述核酸序列编码的酶，所述核酸序列能在与下述条件相当或均 等的条件下，与SEQ ID NO：1所示的序列的互补序列杂交，所述条件是 在30％的甲酰胺、1 M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在2×SSC中 于50℃下洗涤，
并且，其中，选择在包含浓度为大约0.5mM至大约100mM的D-丝 氨酸的培养基上进行。
12.权利要求1至9中任意一项方法，其中，所述能代谢D-丝氨酸和 D-丙氨酸的酶选自：
i)SEQ ID NO：4或6编码的瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶；和
ii)酶，其具有相同的酶活性并且与SEQ ID NO：4或6编码的序列 具有至少60％的同一性；以及
iii)下述核酸序列编码的酶，所述核酸序列能在与下述条件相当或均 等的条件下，与SEQ ID NO：3或5所示的序列的互补序列杂交，所述条 件是在30％的甲酰胺、1 M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在2×SSC 中于50℃下洗涤，
并且，其中，选择在包含总浓度为大约0.5mM至大约100mM的D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行。
13.权利要求1至11中任意一项的方法，其中，所述选择
i)使用大约3至大约30mM的D-丙氨酸；
ii)使用大约30至50mM的D-丝氨酸，和/或
iii)使用大约1至10mM的D-丝氨酸组合30mM或更少的D-丙氨酸， 优选大约5至7mM的D-丝氨酸，例如7.5mM，和10mM至20mM的 D-丙氨酸，
在去分化条件下进行大约3至4周。
14.权利要求1至12中任意一项的方法，其中，用dsda基因转化后 的选择包含下述步骤：
a.5至10天的枝条诱导，无选择，
b.在含有5mM至10mM，例如7.5mM D-丝氨酸的枝条诱导培养基 上2至4周，
c.2mM至7mM的D-丝氨酸，在枝条延长期间进行。
15.权利要求1至12中任意一项的方法，其中，用dao 1基因转化后 的选择包含下述步骤：
a.5至10天的枝条诱导，无选择，
b.在含有5mM至10mM，例如7.5mM D-丙氨酸的枝条诱导培养基 上2至4周，
c.2mM至7mM的D-丙氨酸，在枝条延长期间进行。
16.权利要求1至12中任意一项的方法，其中，用dao 1基因转化后 的选择包含下述步骤：
a.5至10天，例如，5至7天的枝条诱导，无选择，
b.在含有5mM至10mM，例如7.5mM D-丙氨酸和5mM至10mM， 例如7.5mM D-丝氨酸的枝条诱导培养基上2至4周，例如3周，
c.2mM至7mM，例如5mM的D-丝氨酸和2mM至7mM，例如5 mM的D-丙氨酸，在枝条延长期间进行。
17.权利要求1至15中任意一项的方法，其中，所述DNA构建体的 引入是根瘤菌科细菌介导的转化介导的。
18.权利要求16的方法，其中，所述根瘤菌科细菌是卸甲的根瘤农杆 菌或发根农杆菌细菌。
19.权利要求16或17的方法，其中，所述农杆菌菌株是卸甲的发根 农杆菌K599菌株。
20.产生大豆细胞或植物的方法，其中所述方法包含下述步骤：
i)用第一DNA构建体转化大豆细胞，所述第一DNA构建体包含：
a)至少一个第一表达构建体，其包含在所述大豆植物中具有活性的启 动子以及与所述启动子有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其 中，所述第一表达盒侧翼有允许特异性缺失所述第一表达盒的序列，以及
b)至少一个第二表达盒，其适合向所述植物赋予有农业经济价值的性 状，其中，所述第二表达盒不位于允许特异性缺失所述第一表达盒的所述 序列之间，以及
ii)用以植物毒性浓度的选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的第一 化合物处理步骤i)的所述经转化的大豆植物细胞，选出在其基因组中包含 所述第一DNA构建体的植物细胞，所述第一DNA构建体向所述经转化的 植物细胞赋予通过表达所述D-氨基酸氧化酶而针对所述第一化合物的抗 性，以及
iii)诱导所述第一表达盒从所述经转化的植物细胞的基因组缺失，以 及用对仍包含所述第一表达盒的植物细胞有毒的浓度的选自D-异亮氨酸、 D-缬氨酸及其衍生物的第二化合物来处理所述植物细胞，由此选出包含所 述第二表达盒但是缺少所述第一表达盒的植物细胞。
21.权利要求19的方法，其中：
a)所述启动子如权利要求2至4中任意一项所定义，和/或
b)D-氨基酸氧化酶如权利要求11所定义。
22.异源核苷酸序列，其包含：
a)选自大豆泛素启动子、来自双子叶植物物种的肌动蛋白2启动子和 p-ScBv或p-ScBv-iSuc UDP启动子的启动子，以及与所述启动子有效连接 的
b)编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
其中，所述启动子相对所述核酸序列而言是异源的。
23.异源核苷酸序列，其包含：
a)选自下述的启动子：
i)序列，其包含SEQ ID NO：7或8所示的序列，以及
ii)序列，其包含至少一个片段，并且在大豆中具有启动子活性，所述 片段为SEQ ID NO：7或8所示的序列的至少50个连续碱基对，以及
iii)序列，其包含与SEQ ID NO：7或8所示的序列具有至少60％同 一性的序列，并且在大豆中具有启动子活性，
iv)序列，其包含能在与下述条件相当或均等的条件下，与SEQ ID NO：7或8所示的序列杂交的序列，并且在大豆中具有启动子活性，所述 条件是在30％的甲酰胺、1 M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在 2×SSC中于50℃下洗涤，以及
b)编码根据表1的能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
其中，所述启动子相对所述核酸序列而言是异源的。
24.大豆植物或细胞，其包含下述DNA构建体，所述DNA构建体包 含在所述大豆植物或细胞中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接 的编码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，其中，所述启动子 相对所述酶编码序列而言是异源的。
25.大豆植物或细胞，其包含根据权利要求DNA 18至20中任意一项 的异源核苷酸序列。
26.权利要求21至24中任意一项的大豆植物的部分或种子。
27.将至少两种DNA构建体相继转化进大豆植物的方法，所述方法包 括如下步骤：
a)用第一构建体转化，所述构建体包含至少一个表达构建体，其包含 在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码能 代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，以及
b)用第二构建体转化，所述构建体包含第二选择标记基因，其不赋予 针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
28.权利要求26的方法，其中，所述第二标记基因赋予针对选自膦丝 菌素、麦草畏、草甘膦、磺酰脲型和咪唑啉酮型除草剂或抗生素的至少一 种化合物的抗性。
29.大豆植物，其包含：
a)第一表达构建体，其包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及 与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序 列，以及
b)第二表达构建体，其用于选择标记基因，所述基因不赋予针对D- 丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
30.将至少两种DNA构建体相继转化进大豆植物的方法，所述方法包 括如下步骤：
a)用第一构建体转化，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构 建体包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接 的编码dsdA酶的核酸序列，并且用D-丝氨酸进行选择，以及
b)用第二构建体转化，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构 建体包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接 的编码dao酶的核酸序列，并且用D-丙氨酸进行选择。
31.大豆植物，其包含：
a)第一构建体，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码 dsdA酶的核酸序列，以及
b)第二构建体，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码 dao酶的核酸序列。
32.权利要求1至20中任意一项的方法，其包含下述步骤中的一个或 多个，例如，全部下述步骤：
a.对幼苗进行灭菌；
b.在光下使幼苗进行3至10天，优选5至8天，例如7天的生长；
c.使具有具一小叶的叶的上胚轴生长至子叶的长度或更长；
d.使上胚轴生长至0.5cm至4cm，例如0.7cm或更长，1.0cm或更 长或2cm或更短
e.除去所有预先形成的叶，包括顶端分生组织
f.切几下，使位于在第一组叶子上的节损伤，
g.将受到损伤的节与农杆菌混合物在液体培养基中共培养0.1h至1 h，例如0.5h，
h.将节与农杆菌在黑暗中于固体共培养培养基上共培养3至5天；
i.在18h光照/6h黑暗的周期下，70至100microE/m2s下，对外植 体加以选择，直到在上胚轴以上第一节处腋生分生组织生长；
j.共培养后至多2周，移出转化前形成的枝条，并且任选地，在此期 间将外植体切为小块；
k.共培养后2至4周后，将外植体转入枝条原基延长培养基，除去死 的组织后，每2至3周将外植体转入新鲜的含有选择剂的培养基，直到枝 条延长；
l.从外植体上移出3cm或更长的枝条，将其放进根诱导培养基一周， 直到根开始形成；
m.将生根的枝条转进土壤，使其在生长室中硬化2至3周，之后将生 根的枝条转入温室。
33.用于选择、再生、生长、培养或保持转基因大豆植物细胞、转基 因大豆植物组织、转基因大豆植物器官或转基因大豆植物或其部分的组合 物，其包含有效量的D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物，允许对转基因大豆 植物细胞、大豆植物组织、大豆植物器官或大豆植物或其部分和转基因大 豆生物、转基因大豆细胞、转基因细胞培养物、转基因大豆植物和/或其部 分加以选择。
34.细胞培养物，其包含源自位于第一组叶上的节的一种或多种胚胎 发生愈伤组织，以及总浓度为大约5至10mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨 酸。
35.包含大豆靶组织和以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或 其衍生物的选择培养基。
技术领域
本发明涉及基于D-丙氨酸和/或D-丝氨酸选择的转化大豆(Glycine max)的改进方法。
发明背景
大豆(Glycine max)属于豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))。 大豆被认为起源于中国。野生型大豆在自然界是藤生的，这可以解释为何 大豆最初是作为干草作物被引入美国的。对于美国来说，从中国、满洲、 韩国和日本引种对于发展品种来说很重要。用于改进农艺学性状(例如更 直立的生长、降低的倒伏和增加的种子大小)的现代育种努力是将大豆开 发为全世界重要作物的主要因素。针对谷粒收获的作物面积和比例已稳定 增长，目前大豆是主要的世界商品。
种植的大豆在世界上具有高的商业价值。全世界有超过五千万公顷用 于生产大豆作物，每年超过100公吨，估计价值超过200亿美元。因此， 对用于提高这种作物数量和品质的科学方法的开发有着显著的商业意义。 大豆广泛用作为蛋白、油、调料和化学饲料(feedstock)的来源。已经付 出了显著的努力，用于通过传统植物育种来改进种植的大豆物种的品质， 并且记录了大量重要的成功。但是传统植物育种方法仅限于基因和性状从 一种大豆品种向另一种的移动。
现代生物技术研究和开发已经提供了有用的技术，用于通过植物遗传 工程来改进农业产品。植物遗传工程包括：将想要的一种或多种基因转进 作物植物的可遗传种系，使得这些基因可培育进用于现代农业的优良品种 中或优良品种间。基因转移技术允许开发出具有改进的疾病抗性、除草剂 耐受性和增加的营养价值的优良作物品种的新类。已经开发了多种方法， 用于将基因转进植物组织，所述方法包括：高速微粒发射技术、显微注射、 电穿孔、直接DNA吸收以及农杆菌(农杆菌)介导的基因转化。虽然使 用粒子轰击、电穿孔的DNA递送或农杆菌介导的递送广泛用于双子叶植 物，但递送进大豆被证明是困难的。部分原因在于大豆中已被发现是全能 细胞的细胞数量小(Trick 1997)。常用的两种方法是基于农杆菌的、靶 向子叶节腋生分生组织的方法(Hinchee 1988)和使用对成熟合子胚进行 粒子轰击的方法(Finer 1991)。
缺乏有效的选择性剂是不同大豆转化方法效率的瓶颈之一。组织培养 选择系统的效力取决于很多因素，包括组织类型、外植体大小、可选择剂 的化学特点以及应用的时间和浓度。最常用的选择方法作为阴性选择已知， 其利用赋予针对植物毒性剂(例如除草剂或抗生素)的抗性的选择标记。 目前利用的阴性选择标记主要限于新霉素3’-O-磷酸转移酶(nptII)、膦 丝菌素乙酰转移酶(PAT；也称为抗性；bar；de Block 1987； EP 0333033；US 4,975,374)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS， 赋予对(N-(膦酰甲基)甘氨酸)的抗性)和潮霉素B。近来已有 关于备选的选择标记系统，例如基于D-氨基酸代谢酶(例如，D-氨基酸脱 水酶或氧化酶)的系统的一般性描述(WO 03/060133；Erikson 2004)。 但是，迄今还没有对为用于大豆而采用和/或优化此类系统的报道。因此， 本发明的目的是提供用于基于D-氨基酸选择来转化大豆植物的改进的、高 效的方法。该目的通过本发明实现。
虽然对大豆的转化相关的很多问题已被本领域中描述的方法克服，但 是人们仍显著需要改进，因为目前已知的所有方法都仅具有低至中等的转 化以及尤其是再生效率。虽然在用农杆菌介导的转化方法领域已经取得了 显著的进展，但是仍需要改进的方法，来推动此类方法用于大豆植物转化 的易度、速度和效率。因此，本发明的一个目的是提供改进的方法，所述 方法在产生转基因大豆植物的工艺中具有更高的总体效率。该目的通过本 发明来解决。
种植的大豆在世界上具有高的商业价值。全世界有超过五千万公顷用 于生产大豆作物，每年超过100公吨，估计价值超过200亿美元。因此， 对用于提高这种作物数量和品质的科学方法的开发有着显著的商业意义。 大豆广泛用作为蛋白、油、调料和化学饲料(feedstock)的来源。已经付 出了显著的努力，用于通过传统植物育种来改进种植的大豆物种的品质， 并且记录了大量重要的成功。但是传统植物育种方法仅限于基因和性状从 一种大豆品种向另一种的移动。
现代生物技术研究和开发已经提供了有用的技术，用于通过植物遗传 工程来改进农业产品。植物遗传工程包括：将想要的一种或多种基因转进 作物植物的可遗传种系，使得这些基因可培育进用于现代农业的优良品种 中或优良品种间。基因转移技术允许开发出具有改进的疾病抗性、除草剂 耐受性和增加的营养价值的优良作物品种的新类。已经开发了多种方法， 用于将基因转进植物组织，所述方法包括：高速微粒发射技术、显微注射、 电穿孔、直接DNA吸收以及农杆菌(农杆菌)介导的基因转化。虽然使 用粒子轰击、电穿孔的DNA递送或农杆菌介导的递送广泛用于双子叶植 物，但递送进大豆被证明是困难的。部分原因在于大豆中已被发现是全能 细胞的细胞数量小(Trick 1997)。常用的两种方法是基于农杆菌的、靶 向子叶节腋生分生组织的方法(Hinchee 1988)和使用对成熟合子胚进行 粒子轰击的方法(Finer 1991)。
缺乏有效的选择性剂是不同大豆转化方法效率的瓶颈之一。组织培养 选择系统的效力取决于很多因素，包括组织类型、外植体大小、可选择剂 的化学特点以及应用的时间和浓度。最常用的选择方法作为阴性选择已知， 其利用赋予针对植物毒性剂(例如除草剂或抗生素)的抗性的选择标记。 目前利用的阴性选择标记主要限于新霉素3’-O-磷酸转移酶(nptII)、膦 丝菌素乙酰转移酶(PAT；也称为抗性；bar；de Block 1987； EP 0333033；US 4,975,374)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS， 赋予对(N-(膦酰甲基)甘氨酸)的抗性)和潮霉素B。近来已有 关于备选的选择标记系统，例如基于D-氨基酸代谢酶(例如，D-氨基酸脱 水酶或氧化酶)的系统的一般性描述(WO 03/060133；Erikson 2004)。 但是，迄今还没有对为用于大豆而采用和/或优化此类系统的报道。因此， 本发明的目的是提供用于基于D-氨基酸选择来转化大豆植物的改进的、高 效的方法。该目的通过本发明实现。
虽然对大豆的转化相关的很多问题已被本领域中描述的方法克服，但 是人们仍显著需要改进，因为目前已知的所有方法都仅具有低至中等的转 化以及尤其是再生效率。虽然在用农杆菌介导的转化方法领域已经取得了 显著的进展，但是仍需要改进的方法，来推动此类方法用于大豆植物转化 的易度、速度和效率。因此，本发明的一个目的是提供改进的方法，所述 方法在产生转基因大豆植物的工艺中具有更高的总体效率。该目的通过本 发明来解决。
发明内容
本发明的第一实施方式涉及产生转基因大豆植物的方法，所述方法包 括如下步骤：
a.向大豆细胞或组织引入DNA构建体，所述构建体包含至少一个第 一表达构建体，所述第一表达构建体包含在所述大豆植物中具有活性的启 动子以及与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的 酶的核酸序列，以及
b.在选择培养基上对步骤a)的所述大豆细胞或组织进行至少5天时 间的孵育，所述培养基包含总浓度为大约0.5mM至大约100mM的D-丙 氨酸和/或D-丝氨酸和/或其衍生物，以及
c.将步骤b)的所述大豆细胞或组织转入再生培养基，对包含所述 DNA构建体的大豆植物进行再生和选择。
虽然已知有多种启动子在大豆中具有功能并且适合开展本发明的方 法，但已发现，泛素启动子尤其能导致令人吃惊的高选择效率。因此，在 一种优选的实施方式中，在大豆中具有活性的启动子是来自双子叶植物的 泛素启动子。更优选地，植物泛素启动子是欧芹(欧芹(Petroselinum crispum)或Lomatium foeniculaceum)泛素启动子或大豆(Glycine max) 泛素启动子，最优选地，泛素启动子(或下文所述的其衍生物或片段)。 欧芹泛素和大豆泛素启动子的序列在下文中提供。本领域技术人员已知， 可对启动子序列进行大程度的修饰(例如截短、融合、突变)，而不会显 著改变它们的转录性质。因此，在本发明的一种优选实施方式中，在大豆 中具有活性的启动子选自：
a)序列，其包含SEQ ID NO：7或8所示的序列，以及
b)序列，其包含至少一个片段并且在大豆中具有启动子活性，所述片 段为SEQ ID NO：7或8所示的序列的至少50(优选100或150，更优选 200或250，甚至更优选300或500)个连续碱基对，
c)序列，其包含与SEQ ID NO：7或8所示的序列具有至少60％(优 选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或95％，最优选 98％)同一性的序列，并且在大豆中具有启动子活性，
d)序列，其包含能与SEQ ID NO：7或8所示的序列杂交(优选在 与下述条件相当或均等的条件下，所述条件是用30至(优选)35％的甲酰 胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液于37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优 选1×SSC)中于50至(优选)55℃下洗涤；更优选地，在40至(优选) 45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC (优选0.5×SSC)中于55至(优选)60℃下洗涤，以及最优选地，在50％ 的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60 至(优选)65℃下洗涤)的序列，并且在大豆中具有启动子活性。
优选地，本发明的方法包括下述步骤：
(a)提供大豆幼苗初生叶节或更高叶节的腋生分生组织，以及
(b)将所述腋生分生组织与包含转基因T-DNA的根瘤菌科 (Rhizobiaceae)细菌一起共培养，所述转基因T-DNA包含下述DNA构 建体，所述构建体包含至少一个第一表达构建体，所述第一表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码 能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
(c)将所述经共培养的腋生分生组织转移到枝条诱导和选择培养基 上，所述培养基包含：
(i)浓度适于从所述腋生分生组织从头诱导枝条诱导的至少一种植物 生长因子，以及
(ii)总浓度为大约3mM至大约100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸 和/或其衍生物，以及
(iii)任选地，一种或多种适于抑制根瘤菌科细菌生长的抗生素，
以及，在所述培养基上对所述经共培养的腋生分生组织进行至少5天 的培养，直到从其诱导和发育出枝条，并且分离所述枝条，以及
(d)将所述经分离的枝条转移至生根培养基，在所述生根培养基上培 养所述枝条，直到所述枝条形成根，并且进一步将由此得到的小植物再生 为成熟植物，其包含插入进它们基因组中的所述转基因T-DNA。
在本发明的一种优选的实施方式中，DNA构建体或T-DNA(包含用 于所述能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的所述第一表达盒)还包含至 少一个第二表达构建体，其向所述大豆植物赋予有农业经济价值的性状。
基于腋生分生组织的方法可利用来自多种来源的外植体组织和/或细 胞。优选地，提供选自以下的形式的初生节或更高的节的腋生分生组织：
i)由基本上整株幼苗提供的幼苗腋生分生组织，以及
ii)通过以使得腋生分生组织保持与叶柄相连的方式对初生或更高的叶 加以切割，提供的叶腋生分生组织，
iii)繁殖的腋生分生组织。
在本发明的一种优选的实施方式中(尤其是针对基于腋生分生组织的 方法)，步骤(b)(共培养)和/或(c)(枝条诱导和选择)中至少之一 的培养基包含浓度相当于大约1μM至大约10μM的6-苄氨基嘌呤的浓度 的细胞分裂素。另外，步骤(b)和/或(c)的至少之一的所述培养基还包 含大约0.1μM和大约2μM之间的赤霉酸(GA3)。此外，步骤(b)和/ 或(c)中至少之一的所述培养基还包含至少一种硫醇化合物(例如DTT 或半胱氨酸)。
本领域技术人员已知有多种酶可用作为D-丝氨酸和/或D-丙氨酸代谢 酶。优选地，能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸解氨酶(EC 4.3.1.18)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)和D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。 更优选地，能代谢D-丝氨酸的酶选自：
i)SEQ ID NO：2编码的大肠杆菌(E.coli)D-丝氨酸解氨酶；和
ii)酶，其具有相同的酶活性以及与SEQ ID NO：2编码的序列至少 60％(优选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或95％， 最优选98％)的同一性；以及
iii)下述核酸序列编码的酶，所述核酸序列能与SEQ ID NO：1所示 的序列的互补序列杂交(优选在与下述条件相当或均等的条件下，所述条 件是用30至(优选)35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液于 37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优选1×SSC)中于50至(优选)55℃ 下洗涤；更优选地，在40至(优选)45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS 中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC(优选0.5×SSC)中于55至(优选) 60℃下洗涤，以及最优选地，在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中 于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60至(优选)65℃下洗涤)。
对这些酶而言，选择优选在包含浓度为大约1mM至大约100mM的 D-丝氨酸的培养基上进行。
还更优选地，能代谢D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的酶选自：
i)SEQ ID NO：4或6编码的瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)D- 氨基酸氧化酶；和
ii)酶，其具有相同的酶活性以及与SEQ ID NO：4或6编码的序列 至少60％(优选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或 95％，最优选98％)的同一性；以及
iii)下述核酸序列编码的酶，所述核酸序列能与SEQ ID NO：3或5 所示的序列的互补序列杂交(优选在与下述条件相当或均等的条件下，所 述条件是用30至(优选)35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液 于37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优选1×SSC)中于50至(优选)55℃ 下洗涤；更优选地，在40至(优选)45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS 中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC(优选0.5×SSC)中于55至(优 选)60℃下洗涤，以及最优选地，在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS 中于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60至(优选)65℃下洗涤)。
对这些酶而言，选择优选在包含总浓度为大约1mM至大约100mM 的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行。
有多种途径来进行基于D-氨基酸或下文相关化合物的选择计划 (scheme)。优选地，选择(例如，一般性方法中的步骤b)或基于腋生 分生组织中的方法中的步骤c))这样进行，其中：
i)使用大约3至大约20mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸，和/或
ii)在去分化条件下进行大约3至4周。
优选地，D-丙氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使用)以大约 0.5mM至大约100mM的浓度使用，优选地，大约1mM至大约70mM， 更优选地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3mM至大约20mM。 优选地，D-丝氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使用)以大约0.5mM 至大约100mM的浓度使用，优选地，大约1mM至大约70mM，更优选 地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3mM至大约15mM。
在一种优选的实施方式中，DNA构建体的引入是通过根瘤菌科细菌介 导的转化来介导的。优选地，根瘤菌科细菌是卸甲的(disarmed)根瘤农 杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)细菌。更优选地，农杆菌菌株是卸甲的发根农杆菌K599菌株。
如上文所述，尤其地，使用泛素启动子已经显示出是有好处的。下文 提供的构建体是新颖的，并且尤其有用于开展本发明。此外，它们还可提 供用于其它植物物种中的用途。由此，本发明的另一实施方式涉及异源核 苷酸序列，其包含：
a)选自来自双子叶植物物种的泛素启动子的启动子，以及与其有效连 接的
b)编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
其中，所述启动子相对所述核酸序列而言是异源的。
优选地，泛素启动子是欧芹泛素启动子或大豆泛素启动子。如上文所 述，这些启动子的序列可被修饰，而不会改变它们的转录能力。由此，本 发明的另一实施方式涉及异源核苷酸序列，其包含：
a)选自以下的启动子：
i)序列，其包含SEQ ID NO：7或8所示的序列，以及
ii)序列，其包含至少一个片段并且在大豆中具有启动子活性，所述片 段为SEQ ID NO：7或8所示的序列的至少50(优选100或150，更优选 200或250，甚至更优选300或500)个连续碱基对，
iii)序列，其包含与SEQ ID NO：7或8所示的序列具有至少60％(优 选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或95％，最优选 98％)同一性的序列，并且在大豆中具有启动子活性，
iv)序列，其包含能与SEQ ID NO：7或8所示的序列杂交(优选在 与下述条件相当或均等的条件下，所述条件是用30至(优选)35％的甲酰 胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液于37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优 选1×SSC)中于50至(优选)55℃下洗涤；更优选地，在40至(优选) 45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC (优选0.5×SSC)中于55至(优选)60℃下洗涤，以及最优选地，在50％ 的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60 至(优选)65℃下洗涤)的序列，并且在大豆中具有启动子活性，
以及
b)编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
其中，所述启动子相对所述核酸序列而言是异源的。
本发明的另一实施方式涉及通过下文提供的方法制造的大豆细胞和植 物。因此，另一实施方式涉及包含下述DNA构建体的大豆植物或细胞， 所述DNA构建体包含在所述大豆植物或细胞中具有活性的启动子，以及 与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序 列，其中，所述启动子相对于所述酶编码序列而言是异源的。优选地，启 动子和/或能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶如上文所定义。更优选地，所 述大豆植物或细胞还包含至少一个第二表达构建体，其向所述大豆植物赋 予有农业经济价值的性状。本发明的其它实施方式涉及所述大豆植物的部 分(其包括但不限于大豆种子(大豆))及其用于食物、饲料和工业目的 的用途。
当基于D-氨基酸氧化酶时，本发明的方法可用作为组合的选择/标记缺 失计划。基于所用的D-氨基酸，D-氨基酸氧化酶可作为阴性或反向选择标 记发挥作用。因此，本发明还提供了提供大豆细胞和植物(优选不含标记 的)的方法，所述方法包括下述步骤：
i)用第一DNA构建体转化大豆植物细胞，所述DNA构建体包含：
a)至少一个第一表达构建体，其包含在所述大豆植物中具有活性的启 动子以及与所述启动子有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其 中，所述第一表达盒侧翼有允许特异性缺失所述第一表达盒的序列，以及
b)至少一个第二表达盒，其适合向所述植物赋予有农业经济价值的性 状，其中，所述第二表达盒不处于允许特异性缺失所述第一表达盒的所述 序列之间，以及
ii)用以植物毒性浓度的选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的第一 化合物处理步骤i)的所述经转化的大豆植物细胞，并且选出在其基因组中 包含所述第一DNA构建体的植物细胞，所述构建体向所述经转化的植物 细胞赋予通过表达所述D-氨基酸氧化酶而针对所述第一化合物的抗性，以 及
iii)诱导所述第一表达盒从所述经转化的植物细胞的基因组缺失，以 及用对仍包含所述第一表达盒的植物细胞有毒的浓度的选自D-异亮氨酸、 D-缬氨酸及其衍生物的第二化合物来处理所述植物细胞，由此选出包含所 述第二表达盒但是缺少所述第一表达盒的植物细胞。
优选地，启动子序列和D-氨基酸氧化酶是上文针对一般性方法所定义 的。
针对大豆的有效转化系统以及尤其是选择标记具有缺点。该缺点尤其 涉及依赖多次相继转化的手段。克服该问题的一种方法是上文提供的组合 的选择和标记缺失方法。另一方法是基于对不同选择系统的组合。由此， 本发明的另一实施方式涉及将至少两种DNA构建体相继转化进大豆植物 的方法，所述方法包括如下步骤：
a)用第一构建体转化，所述第一构建体包含至少一个表达构建体，其 包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编 码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，以及
b)用第二构建体转化，所述第二构建体包含第二选择标记基因，其不 赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
优选地，所述第二标记基因赋予针对选自膦丝菌素(phosphinotricin)、 麦草畏、草甘膦、磺酰脲型和咪唑啉酮型除草剂或抗生素的至少一种化合 物的抗性。此外，所述方法的产品相对本领域而言同样是有新颖性和创造 性的。因此，本发明的另一实施方式涉及大豆植物，其包含：
a)第一表达构建体，其包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及 与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序 列，以及
b)第二表达构建体，其用于选择标记基因，所述基因不赋予针对D- 丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
不仅不同的选择标记系统可与下文提供的标记组合。本文提供的不同 的标记还可组合(无先缺失)，以实现随后的多次转化。因此，本发明的 另一实施方式涉及将至少两种DNA构建体相继转化进大豆植物的方法， 所述方法包括如下步骤：
a)用第一构建体转化，所述第一构建体包含下述表达构建体，所述表 达构建体包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效 连接的编码dsdA酶的核酸序列，并且用D-丝氨酸进行选择，以及
b)用第二构建体转化，所述第二构建体包含下述表达构建体，所述表 达构建体包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效 连接的编码dao酶的核酸序列，并且用D-丙氨酸进行选择。
此外，所述方法的产品也被认为是相对本领域有新颖性和创造性的。 因此，本发明的另一实施方式涉及大豆植物，其包含：
a)第一构建体，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码 dsdA酶的核酸序列，以及
b)第二构建体，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码 dao酶的核酸序列。
本发明的其它目的、优点和特征将从下述说明书中显而易见。
附图说明
图1：未经接种的幼苗腋生分生组织外植体上的杀伤曲线(栽培种 98822)。
图2：D-丝氨酸对经农杆菌接种的幼苗腋生分生组织外植体的杀伤曲 线。
图3：在D-丝氨酸上3周的枝条诱导。
A.SHA07/pSB1/ET017；顶部：15mM，中部：30mM；底部：45mM D-Ser
B.SHA07/pSB1/EW008；顶部：15mM，中部：30mM；底部：45mM D-Ser。
一般性定义
国际专利申请WO 03/004659(RECOMBINATION SYSTEMS AND A METHOD FOR REMOVING NUCLEIC ACID SEQUENCES FROM THE GENOME OF EUKARYOTIC ORGANISMS)，WO 03/060133 (SELECTIVE PLANT GROWTH USING D-AMINO ACIDS)、国际专利 申请PCT/EP 2005/002735、国际专利申请PCT/EP 2005/002734(WO 2005/090581)、提交于2004年9月2日的申请No.60/606,789和国际专利 申请PCT/EP2005/009366中使用的和描述的教导、方法、序列等通过引用 并入本文。
缩写：BAP——6-苄氨基嘌呤；2，4-D——2，4-二氯苯氧乙酸； MS——Murashige和Skoog培养基(Murashige T和Skoog F(1962) Physiol.Plant.15，472-497)；NAA——1-萘乙酸；MES，2-(N-吗啉代)乙磺 酸；LAA-吲哚乙酸；IBA：吲哚丁酸；Kan：硫酸卡那霉素；GA3——赤 霉酸；TimentinTM：替卡西林二钠/克拉维酸钾。
应当理解，本发明并不限于本文描述的特定的方法、方案、细胞系、 植物物种或属、构建体和试剂。还应当理解，本文所用的术语仅是为了描 述特定实施方式的目的而用的，而非意欲限制本发明的范围，本发明的范 围将仅由所附权利要求来限制。必须要注意，在本文和所附权利要求中使 用时，单数形式“一种/个”、“这种/个”(“a”、“an”和“the”)也包括复数， 除非上下文清楚地另有指明。因此，例如，提到“一种载体”是指一种或多 种载体，并且包括本领域技术人员已知的其等同形式等。
术语“大约”在本文中用来表示大致、约略、左右或在区域中。当术语“大 约”与数值范围联合使用时，其通过扩展所示数值上下的边界来修饰该范 围。通常，术语“大约”在本文中用于修饰在指出的值之上或之下有上下百 分之20，优选百分之10，更优选百分之5(更高或更低)的变化的数值。
在本文中使用时，“或”这个词表示特定列表中的任何一个成员，并且 包括该列表的成员的任何组合。
“农业经济价值性状”包括植物生物中对食物生产或食品(包括植物的 部分和植物产品)有用或有好处的任何表型。非食物的农业产品，例如， 纸等也包括在内。农业经济价值性状的部分列表包括：有害生物抗性，茁 壮性(vigor)，发育时间(收获的时间)，增强的营养含量，新的生长模 式、味道或颜色，盐、热、旱和冷耐受性等。优选地，农业经济价值性状 不包括可选择标记基因(例如，编码除草剂或抗生素抗性的、仅用于协助 对经转化细胞的检测或选择的基因)、导致植物激素(例如，仅用于选择 的生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯)产生的激素生物合成基 因或者报道基因(例如，荧光素酶、葡糖醛酸糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶 (CAT)等)。此类农业经济价值重要性状可包括对有害生物抗性(例如 Melchers 2000)，茁壮性，发育时间(收获的时间)，增强的营养含量， 新的生长模式、味道或颜色，盐、热、旱和冷耐受性(例如Sakamoto 2000； Saijo 2000；Yeo 2000；Cushman 2000)等的改进。技术人员将认识到，有 大量的多核苷酸可供选择来赋予这些或其它农业经济价值性状。
在本文中使用时，术语“氨基酸序列”指代表氨基酸残基的缩写、字母、 字符或词的列表。氨基酸在本文中可用它们公知的三字母标识或单字母标 识(IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的)来代指。类似地，核苷酸可用它们公认的单字母编 码来代指。本文针对氨基酸使用的缩写是传统的单字母编码：A，丙氨酸； B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸盐、 谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨 酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰 胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y， 酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸(见L.Stryer，Biochemistry，1988，W.H. Freeman and Company，New York)。在本文中，字母“x”在氨基酸序列中 可代表任何氨基酸残基。
术语“核酸”指单链或双链的、正义或反义形式的、脱氧核糖核苷酸或 核糖核苷酸及其聚合物或杂化物。除非另有指明，特定的核酸序列还暗示 性包括经保守修饰的其变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确 指出的序列。术语“核酸”在本文中可与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡 核苷酸”和“多核苷酸”互换。
术语“核酸序列”在本文中指代表核苷酸的缩写、字母、字符或词的连 续列表。在一种实施方式中，核酸可以是“探针”，这是相对较短的核酸， 通常长度小于100个核苷酸。通常，核酸探针大约50个核苷酸长至大约 10个核苷酸长。核酸的“靶区域”是核酸中被认为感兴趣的部分。核酸的“编 码区域”是当置于合适的调控序列控制下时以序列特异性方式转录和翻译 以产生特定多肽或蛋白质的核酸的部分。编码区域被描述为编码此类多肽 或蛋白质。除非另有指明，特定的核酸序列还暗示性包括经保守修饰的其 变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。术语“核酸” 在本文中可与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互 换使用。
术语“感兴趣的核苷酸序列”指下述任何核苷酸序列，对其进行的操作 可被本领域普通技术人员认为是就任何原因而言想要的(例如，赋予改进 的品质)。此类核苷酸序列包括但不限于，结构基因(例如，报道基因、 选择标记基因、癌基因、药物抗性基因、生长因子等)的编码序列和不编 码mRNA或蛋白质产物的非编码调控序列(例如，启动子序列、多聚腺苷 酸化序列、终止序列、增强子序列等)。感兴趣的核酸序列可优选编码农 业经济价值性状。
术语“反义”应当被理解为表示具有与靶序列互补的序列的核酸，例如 信使RNA(mRNA)序列，其表达的阻断被是通过与靶序列杂交来起始的。
术语“正义”应当被理解为表示具有与靶序列同源或相同的序列，例如， 与蛋白质转录因子结合并且涉及给定基因表达的序列。根据优选的实施方 式，核酸包含感兴趣的基因和允许所述感兴趣的基因表达的元件。
在本文中使用时，术语“互补”或“互补性”用来描述通过碱基配对规则 相关的核苷酸序列。例如，序列5’-AGT-3’就与序列5’-ACT-3’互补。互补 性可以是“部分的”或“全部的”。“部分的”互补性是这样的，其中，一个或 多个核酸碱基并不按照碱基配对规则匹配。核酸之间“全部的”或“完全的” 互补性是这样的，其中，各个和每一核酸碱基都按照碱基配对规则与另一 碱基匹配。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度有着 显著的影响。本文所用的核酸序列的“互补序列”指这样的核苷酸序列，其 核酸展示出与所述核酸序列的核酸的全部的互补性。
术语“基因组”或“基因组DNA”表示宿主生物的可遗传的遗传信息。所 述基因组DNA既包含细胞核的DNA(也称作染色体DNA)，也包含质体 (例如叶绿体)和其它细胞器(例如线粒体)的DNA。优选地，术语基因 组或基因组DNA指细胞核的染色体DNA。
术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”应当被理解为独立于细胞周 期状态的细胞核基因组DNA。染色体DNA因此可能是在染色体或染色单 体中组织，它们可以是凝聚的(condensed)或非螺旋的(uncoiled)。染 色体DNA中的插入可以是通过本领域已知的多种方法来展现和分析的， 例如，聚合酶链式反应(PCR)分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交 (FISH)和原位PCR。
术语“经分离的”在本文中使用时表示，材料已经从其最初环境移出。 例如，活的动物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的，但是 与自然系统中共存物质中的一些或全部分开的同样的多核苷酸或多肽是经 分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以 是组合物的一部分，并且因为此类载体或组合物并非其最初环境的一部分， 故而将是经分离的。优选地，当用于与核酸相关时，术语“经分离的”表示 与通常和其在天然来源中相关联的至少一种污染性核酸分离并鉴定的核酸 序列。
在本文中使用时，术语“经纯化的”表示下述分子，其是从其天然环境 移出的核酸或氨基酸序列，是经分离的或分开的。因此，“经分离的核酸序 列”是经纯化的核酸序列。“高度纯化的”分子至少60％不含，优选至少75％ 不含，更优选至少90％不含它们天然相关联的其它组分。
“多核苷酸构建体”指至少部分通过重组方法产生的核酸。术语“DNA 构建体”指脱氧核糖核苷酸构成的多核苷酸构建体。构建体可以是单链或者 优选是双链的。构建体可以是环状或线性的。技术人员熟悉用于获得DNA 构建体之一的多种方法。可通过惯用的重组和克隆技术来制备构建体，例 如Maniatis 1989，Silhavy 1984和Ausubel 1987中描述的。
术语“野生型”、“天然”或“天然来源”的在提到生物、多肽或核酸序列 时表示所述生物是天然存在的或者在至少一种天然存在的未经改变、突变 或人工操作的生物中可获得的。
术语“外来基因”表示通过实验操作引入细胞基因组的任何核酸(例如 基因序列)，其可包括在该细胞中发现的基因序列，只要引入的基因相对 天然存在的基因含有一些修饰(例如，点突变、可选择标记基因的存在等) 即可。
术语“异源核酸序列”或“异源DNA”互换使用，表示这样的核苷酸序 列，其与或被操作为与天然其并不相连的核酸序列或与其于天然状态下在 不同的位置相连的核酸序列相连。异源DNA对其所引入的细胞来说并不 是内源的，其是从另一细胞获得的。通常(但并非一定)，此类异源DNA 编码其表达进的细胞正常情况下并不产生的RNA和蛋白质。如果启动子、 转录调控序列或其它遗传元件和另一序列(例如，编码标记序列或农业经 济相关性状)在它们的天然环境中并非组合的或在它们的天然环境中是以 不同方式有效连接的话，那么所述启动子、转录调控序列或其它遗传元件 就被认为相对所述另一序列而言是“异源的”。优选地，所述序列在它们的 天然环境中并非有效连接的(即来自不同基因)。最优选地，所述调控序 列与其天然环境中并不相邻的核酸共价连结并且相邻。
术语“转基因”在本文中用于表示引入细胞基因组或者经由人工实验操 作操作过的任何核酸序列。优选地，所述序列导致产生与天然存在的生物 不同的基因组(例如，如果所述序列对于所述生物是内源的，其被引入与 其天然位置不同的位置或者其拷贝数增加或减少)。转基因可以是“内源 DNA序列”、“外源DNA序列”(例如外来基因)或“异源DNA序列”。术 语“内源DNA序列”指在引入的细胞中天然发现的核苷酸序列，只要其相 对天然存在的序列而言不含一些修饰(例如，点突变、可选择标记基因的 存在等)即可。
当提到细胞或生物时(例如，关于大豆植物或细胞时)，术语“转基因” 或“重组”表示含有转基因的细胞或生物，或者其基因组已通过引入转基因 而改造过的细胞或生物。转基因生物或组织可包含一个或多个转基因细胞。 优选地，所述生物或组织基本由转基因细胞构成(即，所述生物或组织中 的细胞超过80％，优选90％，更优选95％，最优选99％都是转基因的)。 术语“重组”在关于核酸时表示核酸与其天然环境中不相邻的核酸共价连结 并且相邻。“重组”多肽或蛋白质表示通过重组DNA技术生产的多肽或蛋 白质，即，通过被编码想要的多肽或蛋白质的重组DNA构建体转化的细 胞生产的。重组核酸和多肽还可包含天然状态下并不原样存在而是经过修 饰、改变、突变或人工操作过的分子。
“重组多肽”是序列上与天然存在的多肽至少一个氨基酸残基有所不同 的非天然存在的多肽。用于生产此类多肽和/或核酸的优选方法可包含定点 或非定点诱变、DNA混编或回归重组(recursive reconbination)的其它方 法。
当用于核酸或氨基酸序列相关时，术语“同源性”或“同一性”表示序列 相关性或互补性的程度。下述术语被用于描述两条或多条核酸或氨基酸序 列间的序列相关性：(a)“参照序列”、(b)“比较窗”；(c)“序列同一 性”、(d)“序列同一性百分比”和“高度同一性”。
(a)在本文中使用时，“参照序列”是用作为序列比较基础的给定序列。 参照序列可以是指定序列的亚组或整体，例如，作为全长cDNA或基因序 列的片断，或者完整的cDNA或基因序列。
(b)在本文中使用时，“比较窗”表示多核苷酸序列的连续的指定片断， 其中，为了对两条序列进行最优比对，比较窗中的多核苷酸序列较之参照 序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即，空位)。通常，比 较窗长度为至少20个连续核苷酸，任选地，可以是30、40、50、100或更 长。本领域技术人员理解，为避免由于多核苷酸序列中空位的并入导致的 与参照序列的高相似性，一般要引入空位罚分，其要从匹配数中减去。
为比较而对序列加以比对的方法是本领域中公知的。因此，对任何两 条序列间百分比同一性的测定可以使用数学算法来完成。此类数学算法的 优选的非限制性实例是Myers和Miller，1988的算法；Smith等人1981的 局部同源性算法；Needleman和Wunsch 1970的同源性比对算法；Pearson 和Lipman 1988的搜索相似性方法；Karlin和Altschul，1990的算法，在 Karlin和Altschul，1993中改良过。为比较下文的序列，优选地，针对核 苷酸序列使用算法BLASTN，针对蛋白质使用BLASTX，使用它们各自的 默认参数。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用的字长(W)为11， 期望(E)为10，截止(cutoff)为100，M＝5，N＝-4，对两条链加以比较。 对于氨基酸序列而言，BLASTP程序默认使用的字长(W)为3，期望(E) 为10，以及使用BLOSUM62计分矩阵(见Henikoff&Henikoff，1989)。 见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。比对还可通过观察手动进行。多重比对 (即，超过2条序列)优选使用Clustal W算法(Thompson 1994；例如 在软件VectorNTITM，版本9中；英杰生命科学公司(Invitrogen Inc.)) 来进行，其中使用计分矩阵BLOSUM62MT2，使用默认设置(空位开放 罚分15/19，空位延伸罚分6.66/0.05；空位分开罚分范围(gap separation penalty range)8；针对比对延迟的％同一性(％identity for alignment delay)40；使用残基特异性空位和亲水残基空位)。优选用其默认参数使 用BlastN程序(版本1.4.7或更后出的版本)或任何等同程序来进行比较。 “等同程序”意在表示下述任何序列比较程序，其中针对任何两条待讨论的 序列，较之通过优选程序产生的相应比对而言，所述程序能产生具有相同 的核苷酸或氨基酸残基匹配的比对以及相同的百分比序列同一性。用于进 行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)为公众所获 得。除了计算百分比序列同一性之外，BLAST算法还能进行对两条序列间 相似性的统计学分析(见，例如，Karlin&Altschul(1993))。BLAST算 法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了对两条核苷 酸或氨基酸序列将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸序列 与参照核酸序列比较中的最小总和概率小于大约0.1，更优选小于大约 0.01，最优选小于大约0.001的话，测试核酸序列就被认为是与参照序列相 似的。
术语“杂交”在本文中使用时包括“通过其使得核酸的链经由碱基配对 与互补链相连结的任何过程”(Coombs 1994)。杂交和杂交强度(即，核 酸之间结合的强度)受下述因素影响，例如，核酸间互补性的程度、涉及 的条件的严格性、形成的杂化物的Tm以及核酸内的G∶C比。在本文中使 用时，术语“Tm”用来表示“解链温度”。解链温度是双链核酸分子的群体一 半解离为单链的温度。用于计算核酸Tm的公式是本领域公知的。如标准 参考文献所指出的，当核酸处于1M NaCl的水溶液中时，对Tm值的简 单估计可通过公式Tm＝81.5+0.41(％G+C)来计算(见，例如，Anderson 和Young，(1985))。其它参考文献包括更复杂的计算，其中为了计算Tm 考虑了结构特点和序列特点。
高严格洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl，在72℃进行大约15分 钟。严格洗涤条件的一个实例是0.2×SSC，在65℃洗涤15分钟(关于对 SSC缓冲液的描述见下文Maniatis)。通常，低严格性洗涤优于高严格性 洗涤，以除去背景探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体而言， 示例性中等严格性洗涤是1×SSC于45℃进行15分钟。对于例如超过100 个核苷酸的双链体而言，示例性低严格性洗涤是4至6×SSC于40℃进行 15分钟。对于短探针(例如大约10至50个核苷酸)而言，通常，严格条 件包括小于大约1.5M(更优选地，大约0.01至1.0M)Na离子浓度(或 其它盐)的盐浓度，于pH 7.0至8.3进行，温度通常为至少大约30℃，对 于长探针(例如＞50个核苷酸)而言，至少大约60℃。严格条件还可通过 加入去稳定剂(例如甲酰胺)来获得。通常，在特定杂交测定中信噪比是 用不相关探针观察到的2×(或更高)就表示检测到了特异性杂交。在严格 条件下互相不杂交的核酸如果编码高度相同的话，它们仍是高度相同的。 这例如发生在使用遗传密码允许的最大密码子简并性来制造核酸拷贝时。
非常严格的条件被选为与针对特定探针的Tm相等。在Southern或 Northern印迹的膜上用于有超过100个互补残基的互补核酸杂交的高严格 条件的实例是50％甲酰胺，例如，在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中 于37℃杂交，以及在60至65℃于0.1×SSC中洗涤。示例性的低严格性 条件包括：用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠) 的缓冲溶液在37℃进行杂交以及在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3 M柠檬酸三钠)中于50至55℃洗涤。示例性的适度严格性条件包括：在 40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交以及在0.5×至 1×SSC中于55至60℃洗涤。
当关于感兴趣的杂交条件时提到杂交条件时，术语“相当”表示杂交条 件和感兴趣的杂交条件导致具有相同范围百分比(％)同源性的核酸序列 杂交。例如，如果感兴趣的杂交条件导致第一核酸序列与和第一核酸序列 具有80％至90％同源性的其它核酸序列杂交，那么如果另外的杂交条件也 导致第一核酸序列与和第一核酸序列具有80％至90％同源性的其它核酸 序列杂交的话，这种另外的杂交条件就被认为是与感兴趣的杂交条件相当 的。
当提到核酸杂交使用时，本领域技术人员公知，大量相当条件是可使 用的，以包括低或高严格性条件；因素例如探针的长度和性质(DNA、RNA、 碱基组合物)以及靶的性质(DNA、RNA、碱基组合物，以溶液或被固定 化存在的，等)和盐及其它组分的浓度(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙 二醇的存在与否)被考虑，杂交溶液可变化，以产生与上述条件不同但与 其相当的低或高严格性杂交条件。本领域技术人员知道，虽然较高的严格 性可能是优选的，以降低或消除非特异性结合，但是较低的严格性也可能 是优选的，以检测到更大量的具有不同同源性的核酸序列。
术语“基因”表示与能以一定方式调控多肽表达的合适调控序列有效连 接的编码区域。基因包括编码区域(可读框，ORF)前(上游)和后(下 游)的DNA非翻译调控区域(例如，启动子、增强子、阻遏子等)，以 及在适用的情况下，在各编码区域(即，外显子)之间的间插序列(即， 内含子)。术语“结构基因”在本文中使用时意指转录为mRNA其再翻译为 特定多肽所特有的氨基酸序列的DNA序列。
在本文中使用时，提到结构基因时使用的术语“编码区域”指这样的核 苷酸序列，其编码在新生多肽中发现的氨基酸，所述多肽是mRNA分子翻 译的结果。在真核细胞中，编码区域在5’侧的边界是编码起始子甲硫氨酸 的核苷酸三联体“ATG”，在3’侧的边界是代表终止密码子的三种三联体 (即TAA、TAG、TGA)之一。除了含有内含子之外，基因的基因组形 式还包括位于RNA转录本上呈现的序列5’和3’末端的序列。这些序列被 称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录本上的非翻 译序列的5’或3’)。5’侧翼区域可含有调控序列，例如启动子和增强子， 其控制或影响基因的转录。3’侧翼区域可含有指导转录终止、转录后切割 和多聚腺苷酸化的序列。
术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋 白(质)”在本文中可互换使用，用于表示连续氨基酸残基的多聚物或寡聚 物。
术语“经遗传修饰的生物”或“GMO”指包含转基因DNA的任何生物。 示例性生物包括植物、动物和微生物。
术语“植物”在本文中使用时表示多个植物细胞，它们很大程度上分化 为存在于植物发育任何阶段的结构。此类结构包括一种或多种植物器官， 包括但不限于，果、枝条、茎、叶、花瓣等。
术语“细胞”或“植物细胞”的单数形式在本文中使用时表示单个细胞。 术语“细胞”的复数形式表示细胞的群。该群可以是包含一种细胞类型的纯 的群。类似地，所述群可包含超过一种细胞类型。在本发明中，对于细胞 的群可包含的细胞类型的数量没有限制。细胞可以是同步或不同步的。本 发明该涵义中的植物细胞可被分离(例如，在悬浮培养物中)或可被包含 于植物组织、植物器官或任何发育阶段的植物中。
术语“器官”在提到植物时(或“植物器官”)表示植物的部分，其可包 括(但不限于)例如根、果、枝条、茎、叶、花药、萼片、花瓣、花粉、 种子等。
术语“组织”在提到植物时(或“植物组织”)表示多个植物细胞的排列， 其包括分化的和未分化的植物组织。植物组织可构成植物器官的一部分(例 如植物叶的表皮)，其也可以构成肿瘤组织(例如愈伤组织)和培养物中 的多种类型的细胞(例如，单个细胞、原生质体、胚、愈伤组织、原球茎 样体等)。植物组织可以处于植物中，器官培养物、组织培养物或细胞培 养物中。
术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”应当被理解为独立于细胞周 期状态的细胞核基因组DNA。染色体DNA因此可能是在染色体或染色单 体中组织，它们可以是凝聚的(condensed)或非螺旋的(uncoiled)。染 色体DNA中的插入可以是通过本领域已知的多种方法来展现和分析的， 例如，PCR分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。
术语“结构基因”在本文中使用时意指这样的DNA序列，其转录为 mRNA，所述mRNA之后再翻译为特定多肽所特有的氨基酸序列。
术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表 达包括结构基因向mRNA的转录以及任选地mRNA随后向一种或多种多 肽的翻译。
术语“表达盒”或“表达构建体”在本文中使用时意指将表达的任何核酸 序列的组合，所述核酸序列与启动子序列以及任选地协助所述核酸序列表 达的额外的元件(例如终止子和/或多聚腺苷酸化序列)有效连接。
“启动子”、“启动子元件”或“启动子序列”在本文中使用时表示在核苷 酸序列5’端的核苷酸序列，其指导转录的起始(即，能控制核苷酸序列向 mRNA的转录)。通常但非必须地，启动子位于感兴趣的核苷酸序列的5’ (即，上游)，所述启动子控制所述核苷酸序列向mRNA的转录，并且提 供RNA聚合酶和用于起始转录的其它转录因子特异性结合的位点。启动 子序列是必须的，但并非在所有情况下都足以驱动下游基因的表达。通常， 真核启动子在转录起始(帽)位点的5’大约10-30bp处包括与共有的 5′-TATAAT-3′(TATA)框同源的特征性DNA序列，所述转录起始(帽) 位点按照惯例被编号为+1。相对于帽位点3’的碱基被给出正数编号，而帽 位点5’的碱基则获得负数编号，这反映了它们与帽位点的距离。另一启动 子组分—CAAT框通常被发现于TATA框5’的大约30至70bp处，其 与规范形式5′-CCAAT-3′具有同源性(Breathnach 1981)。在植物中，CAAT 框有时候被已知为AGGA框的序列所替换，所述AGGA框是具有腺嘌呤 残基的区域，对称侧接三联体G(或T)NG(Messing 1983)。赋予对转 录的调控影响的其它序列可被发现于启动子区域中，它们延伸到帽位点5’ 的1000bp那么远或者更远。当提到启动子时术语“组成型”表示，所述启 动子能在不存在刺激(例如，热激、化学物、光等)时指导有效连接的核 酸序列的转录。通常，组成型启动子能指导基本上任何细胞和任何组织中 转基因的表达。
调控控制指主要(但非绝对)位于转录起始位点(5’)上游的DNA序 列元件诱导的对基因表达的调节。调控可导致对环境刺激的全有或全无应 答，或者其可能导致产生基因表达水平的变化。在本发明中，热激调控元 件作用于：应答于突然的温度升高，瞬时增强下游基因表达的水平。
多聚腺苷酸化信号表示能影响mRNA加工的任何核酸序列，其通常特 征在于向mRNA前体的3’端加上了聚腺苷酸段(tract)。多聚腺苷酸化 信号DNA片断自身可以是源自数种来源的片断的混合物，可以是天然存 在的或合成的，并且可以来自基因组DNA或源自RNA的cDNA。多聚腺 苷酸化信号通常由存在与规范形式5′-AATAA-3′的同源性来被识别，虽然 距离的变化、部分“连读”和多串联规范序列也并非不常见(Messing 1983)。 应当认识到，规范的“多聚腺苷酸化信号”事实上可能导致转录终止而并非 多聚腺苷酸化本身(Montell 1983)。
热激元件指应答于突然的温度升高胁迫而调控基因表达的DNA序列。 应答被认为下游基因表达水平的立刻的(虽然是瞬时的)增强。虽然对热 激基因的最初工作是用果蝇进行的，但是很多其它物种(包括植物) (Barnett 1980)展示出对胁迫的类似应答。热激元件的关键主要组分于果 蝇中被描述为具有共有序列5′-CTGGAATNTTCTAGA-3′(其中N＝A、T、 C或G)，并且位于转录起始位点上游残基-66至-47bp之间的区域中 (Pelham 1982)。该共有序列的化学合成的寡核苷酸拷贝可代替天然序列 赋予热激可诱导性。
前导序列指包含大约100个核苷酸的、位于转录起始位点和翻译起始 位点之间的DNA序列。前导序列中包含指定核糖体结合位点的区域。
在这方面的研究中，内含子或间插序列指随着编码序列(外显子)一 起转录但是随后在成熟mRNA形成中被除去的那些DNA序列区域。内含 子可存在于转录的序列中的任何地方——在相同或不同基因的编码序列之 间、在基因编码序列中、打断和分开其氨基酸序列以及在启动子区域中(翻 译起始位点的5’)。初级转录本中的内含子被切掉，编码序列同时精确连 接，形成成熟mRNA。内含子和外显子的连接处形成剪接位点。内含子的 碱基序列以GU起始以AG结尾。在很多高等真核生物中发现了同样的剪 接信号。
术语“有效地相连”或“有效连接”应当被理解为表示：例如，调控元件 (例如启动子)与待表达核酸序列以及根据需要还有其它调控元件(例如 终止子)的顺序排列，排列的方式使得每个调控元件都能达到其意欲的功 能以允许、修饰、协助或者另外影响所述核酸序列的表达。对于正义或反 义RNA，表达可根据核酸序列的排列而产生。为达到此目的，以化学正义 的直接连接并非必需。遗传控制序列，例如，增强子序列也可从更远的位 置或者甚至是来自其它DNA分子的位置对靶序列施加其功能。优选的排 列是这样的，其中，待重组表达的核酸序列位于作为启动子发挥作用的序 列之后，使得两条序列互相共价相连。启动子序列和待重组表达的核酸序 列之间的距离优选小于200个碱基对，尤其优选小于100个碱基对，非常 尤其优选小于50个碱基对。有效连接和表达盒可通过惯用的重组和克隆技 术产生，(例如Maniatis 1989；Silhavy 1984；Ausubel 1987；Gelvin 1990 中)所述的。但是，其它序列，例如作为与针对限制性酶的特异性切割位 点的接头发挥作用的序列，或者作为信号肽发挥作用的序列也可位于两条 序列之间。序列的插入还可能导致融合蛋白的表达。优选地，由启动子和 待表达的核酸的连接构成的表达盒可作为载体整合形式存在，并且可被插 入植物基因组，例如通过转化实现。
术语“转化”在本文中用于表示向细胞中引入遗传材料(例如，转基因)。 细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。术语“瞬时转化”或“经瞬时转化的”指 将一种或多种转基因引入细胞，而所述转基因并不整合进宿主细胞的基因 组。瞬时转化可例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测，其检测转 基因中一种或多种所编码的多肽的存在。备选地，可通过检测转基因(例 如uid A基因)编码的蛋白质(例如β-葡糖醛酸糖苷酶)的活性来检测瞬 时转化，如本文所述(例如，通过用在存在GUS酶时提供蓝色沉淀物的 X-gluc进行染色，来对GUS酶活性进行组织化学测定；以及用GUS-Light 试剂盒(Tropix)来对GUS酶活性进行化学发光测定)。术语“瞬时转化 体”指瞬时掺入了一种或多种转基因的细胞。相反，术语“稳定转化”或“经 稳定转化的”指将一种或多种转基因引入并整合进细胞的基因组，优选产生 染色体整合以及通过减数分裂的稳定可遗传性。可通过用能与转基因中一 种或多种相结合的核酸序列对细胞的基因组DNA进行Southern印迹杂交 分析来检测对细胞的稳定转化。备选地，还可通过对细胞的基因组DNA 进行聚合酶链式反应以扩增转基因序列，来检测对细胞的稳定转化。术语 “稳定转化”指已经向其基因组DNA(包括质体和核DNA，优选整合进核 的染色体DNA)中稳定整合了一种或多种转基因的细胞。因此，稳定转化 体与瞬时转化体的区别在于，来自稳定转化体的基因组DNA含有一种或 多种转基因，而来自瞬时转化体的基因组DNA不含转基因。转化还包括 将遗传材料以植物病毒载体的形式引入植物细胞，包括表染色体复制和基 因表达，其可展示出关于减数分裂稳定性的可变性质。转化还包括将遗传 材料以植物病毒载体的形式引入植物细胞，包括表染色体复制和基因表达， 其可展示出关于减数分裂稳定性的可变性质。优选地，术语“转化”包括将 遗传材料引入植物细胞，导致染色体整合和经由减数分裂的稳定可遗传性。
术语用细菌“感染”的各种词性形式表示：在使得细菌中含有的核酸序 列能被引入靶生物样品的一个或多个细胞中的条件下，将靶生物样品(例 如，细胞、组织等)与细菌共孵育。
术语“农杆菌”表示土传(soil-borne)、革兰氏阴性、杆状致植物病性 细菌，其导致冠瘿。术语“农杆菌”包括但不限于：菌株根瘤农杆菌(通常 在受感染的植物中导致冠瘿)和发根农杆菌(在受感染的宿主植物中导致 发根病)。用农杆菌对植物细胞的感染通常导致受感染的细胞产生冠瘿碱 (例如，胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，导致胭脂碱产生的农杆菌 菌株(例如菌株LBA4301、C58、A208)被称为“胭脂碱型”农杆菌；导致 章鱼碱产生的农杆菌菌株(例如菌株LBA4404、Ach5、B6)被称为“章鱼 碱型”农杆菌；导致农杆碱产生的农杆菌菌株(例如菌株EHA105、EHA101、 A281)被称为“农杆碱型”农杆菌。
术语“轰击”的各种词性形式和“生物射弹轰击”指：将颗粒朝向靶生物 样品(例如，细胞、组织等)加速，以导致靶生物样品的细胞的细胞膜受 损伤和/或使颗粒进入靶生物样品中的过程。用于生物射弹轰击的方法是本 领域已知的(例如US 5,584,807，其内容通过引用并入本文)并且是可商 业获得的(例如，氦气驱动的微粒加速器(PDS-1000/He)(BioRad))。
在提到植物组织时，术语“微损伤”表示在该组织中引入显微损伤。微 损伤可例如通过本文所述的粒子轰击来实现。
本文所用的“转化效率”或“转化频率”可通过在标准实验条件下恢复的 经转化细胞(或从各经转化细胞生长的转基因生物)的数量(即，针对与 外来DNA接触的细胞的量、递送的DNA的量、DNA递送的类型和条件、 一般性培养条件等标准化或归一化的)来测量。例如，当腋生分生组织的 经分离外植体被用作为转化的起始材料时，转化的频率可被表示为从每 100个经分离的经转化外植体获得的转基因植物株系的数量。
术语“分生组织”(“meristem”或“meristematic tissue”)或“分生组织 细胞”可互换使用，它们意指未分化的植物组织，其不断分裂，形成新的细 胞，如在茎尖或根尖发现的那样。术语“节”或“叶节”意指茎上与叶相连或 已相连有叶的点。术语“节间”意指茎上两个节之间的段或部分。术语“叶柄 (petiole)”意指叶与茎相连的柄，也称为“叶柄(leaf-stalk)”。术语“腋芽” 意指茎或枝上的小突起(protuberance)，它们有时是被保护性鳞片 (protective scales)所包裹的，并且含有未发育的枝条、叶或花，也被称 为侧芽。术语“下胚轴(hypocotyl)”意指种子的叶(子叶)和根之间的茎 的部分。术语“叶腋”意指叶和其所生出的茎之间的角度。腋芽存在于叶腋 上。术语“子叶”意指种子植物的胚的叶，其在萌发时或者保留于种子中或 者脱出、变大并变绿；其也被称为子叶(seed leaf)。胚轴位于子叶之间， 其在最接近珠孔的末端与它们相连。
术语“去分化”、“去分化处理”或“去分化预处理”表示获得下述细胞簇 (例如愈伤组织)的过程，所述细胞簇展示出无组织(unorganized)的生 长，所述过程通过在去分化培养基上培养分化的植物组织细胞来实现。更 具体地，术语“去分化”在本文中使用时意指快速分裂的、在植物机体的范 围中没有特定功能的细胞形成的过程。这些细胞通常具有增加的潜力，所 述潜力有发育成多种植物组织的能力。优选地，该术语意指分化的或特化 的(specialized)组织向更多能或全能(例如，胚胎)形式的反转。去分 化可导致植物组织的重编程(首先反转为未分化的、未特化的细胞，然后 进入新的不同的途径)。术语“全能性”在本文中使用时表示含有形成整株 植物所需的所有遗传和/或细胞信息的植物细胞。可通过某些植物生长调控 子(例如生长素和/或细胞分裂素化合物)来启动去分化，尤其是通过其某 些组合和/或浓度来启动。
发明详述
本发明是基于D-氨基酸选择系统对大豆(Glycine max)的品种进行 直接种系遗传转化的方法。本发明的第一种实施方式涉及一种方法，用于 产生转基因大豆植物，所述方法包括步骤：
a.向大豆细胞或组织引入DNA构建体，所述构建体包含至少一个第 一表达构建体，所述第一表达构建体包含在所述大豆植物中具有活性的启 动子以及与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的 酶的核酸序列，以及
b.在选择培养基上对步骤a)的所述大豆细胞或组织进行至少5天时 间的培养，所述培养基包含总浓度为大约3mM至大约100mM的D-丙氨 酸和/或D-丝氨酸和/或其衍生物，以及
c.将步骤b)的所述大豆细胞或组织转入再生培养基，对包含所述 DNA构建体的大豆植物进行再生和选择。
在一种实施方式中，在共培养后施加的选择压力包括下述步骤中的一 种或多种：
a.在枝条诱导时首先无选择；
b.在枝条诱导期间选择，
c.在枝条延长期间选择。
优选地，如果加入培养基，例如SIM培养基等培养基，D-ala浓度为 40mM或更低，更优选30mM或更低。此外，在一种实施方式中，所述 浓度为2mM左右、3mM左右或5mM左右或更高，更优选的是10mM 左右。因此，在一种实施方式中，在用于选择的培养基中，所述浓度为7.5 和20mM D-ala之间。与低于10mM D-丝氨酸的浓度组合，D-ala的浓度 优选为30mM或更低，甚至更优选的是20mM或更低。本领域技术人员 从该数据可以知道如何针对每种单独的选择计划的特定条件来调整D-ala 或D-ala和D-ser浓度，例如，如果使用另外的培养基、另外的枝条龄、 另外的孵育时间或另外的构建体等的话，浓度可以变化。例如，更高的表 达速率或酶活性(例如，由于使用了更强的启动子)允许更高浓度的D-ala 和/或D-ser使用。因此，在一种实施方式中，选择应当以枝条诱导中的5 至20mM D-Ala左右，例如，10至15mM左右，与枝条延长中的1至10 mM，优选低于7.5mM，更优选2至5mM D-Ala，例如3mM左右D-Ala 的组合。因此，在一种实施方式中，选择应当以枝条诱导中的5至20mM D-Ser左右，例如，10至15mM左右，与枝条延长中的1至10mM，优 选低于7.5mM，更优选2至5mM D-Ser，例如3mM左右D-Ser的组合。 因此，在一种实施方式中，选择应当以枝条诱导中的大约5至20mM D-Ser 和D-Ala，例如，10至15mM，组合枝条延长中的1至10mM，优选低 于7.5mM，更优选2至5mM D-Ser和D-Ala，例如3mM左右D-Ser和 D-Ala。例如，选择这样进行，其中：
i)使用大约3至大约30mM的D-丙氨酸；
ii)使用大约30至50mM的D-丝氨酸，和/或
iii)使用大约1至10mM的D-丝氨酸组合30mM或更少的D-丙氨酸， 优选大约5至7mM左右的D-丝氨酸，例如7.5mM，和10mM至20mM 的D-丙氨酸，在去分化条件下进行大约3至4周。因此，在一种实施方式 中，用dsda基因转化后的选择包含下述步骤：
a.5至10天，例如7天的枝条诱导，无选择，
b.2至4周，例如3周，在含有5mM至10mM，例如7.5mM D-丝 氨酸的枝条诱导培养基上进行，
c.2mM至7mM，例如5mM的D-丝氨酸，在枝条延长期间进行。
因此，在另一实施方式中，用dao 1基因转化后的选择包含下述步骤：
a.5至10天，例如，6至7天的枝条诱导，无选择，
b.2至4周，例如3周，在含有5mM至10mM，例如7.5mM D-丙 氨酸的枝条诱导培养基上进行，
c.2mM至7mM，例如5mM的D-丙氨酸，在枝条延长期间进行。
此外，用dao 1基因转化后的选择包含例如下述步骤：
a.5至10天，例如，5至7天的枝条诱导，无选择，
b.2至4周，例如3周，在含有5mM至10mM，例如7.5mM D-丙 氨酸和5mM至10mM，例如7.5mM D-丝氨酸的枝条诱导培养基上进行，
c.2mM至7mM，例如5mM的D-丝氨酸和2mM至7mM，例如5 mM的D-丙氨酸，在枝条延长期间进行。
在一种实施方式中，本发明的方法包括下述步骤中的一种或多种，例 如，全部：
a.对幼苗进行灭菌；
b.在光下使幼苗进行3至10天，优选5至8天，例如7天的生长；
c.使具有具一小叶的叶的上胚轴生长至子叶的长度或更长；
d.使上胚轴生长至0.5cm至4cm，例如0.7cm或更长，1.0cm或更 长或2cm或更短
e.除去所有预先形成的叶，包括顶端分生组织
f.切几下，使位于在第一组叶子(the first set of leaves)上的节损伤，
g.将受到损伤的节与农杆菌混合物在液体培养基中共培养0.1h至1 h，例如0.5h。
h.将节与农杆菌在黑暗中于固体共培养培养基上共培养3至5天；
i.在18h光照/6h黑暗的周期下，70至100microE/m2s下，对外植 体加以选择，直到在上胚轴以上第一节处腋生分生组织生长；
j.共培养后至多2周，移出转化前形成的枝条，并且任选地，在此期 间将外植体切为小块；
k.共培养后2至4周后，将外植体转入枝条原基延长培养基，除去死 的组织后，每2至3周将外植体转入新鲜的含有选择剂的培养基，直到枝 条延长；
l.从外植体上移出3cm或更长的枝条，将其放进根诱导培养基一周， 直到根开始形成；
m.将生根的枝条转进土壤，使其在生长室中硬化(harden)2至3周， 之后将生根的枝条转入温室。
因此，使用dsdA基因的本发明的方法在一个优选的步骤中包括使用 来自大豆的枝条腋生分生组织作为外植体用于转化。特别地，可使用发根 农杆菌SHA017或根瘤农杆菌菌株来进行转化，优选的是使用发根农杆菌 SHA017，例如下文所述的菌株K599。在一种实施方式中，感染在室温， 例如18℃至低于25℃之间，优选20℃至23℃之间进行30分钟左右， 例如，25至35分钟之间。在一种实施方式中，OD可在1.5左右。此外， 共培养优选进行5天左右，例如，3至8天，更优选4或5天，优选在黑 暗中进行，并且在例如23℃至27℃，优选24℃至25℃进行。在一种实 施方式中，经转化外植体的恢复进行5天左右至8天左右，例如，6或7 天，优选在光下进行，并且在例如大约25℃或23℃至27℃，优选地，24℃ 至26℃进行。如上文已经描述的以及下文将要描述的，枝条/愈伤组织启 动期间的选择可在例如3mM至10mM D-ser的浓度下进行，优选地，7.5 mM左右的D-ser，或者在本文描述的其它合适的浓度和组合物下进行， 所述选择进行3周左右，例如15至24天，优选20至22天，优选在光下 进行，并且例如在大约25℃或23℃至26℃，优选地，24℃至25℃进行。 此外，枝条延长/愈伤组织再生期间的选择步骤可在例如3mM至10mM D-ser的浓度下进行，优选地，5mM左右的D-ser，或者在本文描述的其 它合适的浓度和组合物下进行，所述选择进行4至5周左右，例如25至 35天，优选30天左右，优选在光下进行，并且例如在大约25℃或23℃ 至26℃，优选地，24℃至25℃进行。生根步骤可在没有或非常小量的选 择下进行，例如，在0mM左右的D-ser下进行1至2周左右，例如，5 至10天，优选在光下进行，并且例如在23℃至27℃，优选24℃至25℃ 进行。
1.本发明的DNA构建体
1.1本发明的第一表达构建体
第一表达构建体包含在大豆中具有活性的启动子以及与所述启动子有 效连接的编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列。优选地， 所述启动子相对所述酶编码序列来说是异源的。在大豆植物中具有活性的 启动子和D-丙氨酸和/或D-丝氨酸代谢酶如下文所详细定义。
1.1.1能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶
本领域技术人员知道多种适于代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的序列。 术语“能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶”优选表示这样的酶，其能以转化 相应L-氨基酸(即，D-丙氨酸和/或D-丝氨酸)以及更优选地任何其它D- 和/或L-或非手性氨基酸的活性的至少两倍(至少高100％)，优选至少三 倍，更优选至少五倍，甚至更优选至少10倍，最优选至少50倍或100倍 的活性来转化和/或代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸。
优选地，能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自：D-丝氨酸解氨酶(D- 丝氨酸脱水酶；EC 4.3.1.18；以前是EC 4.2.1.14)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)和D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。更优选地，能代谢D-丙氨酸 或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸解氨酶(D-丝氨酸脱水酶；EC 4.3.1.18；以 前是EC 4.2.1.14)和D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)。术语“D-丝氨酸解氨 酶”(D-丝氨酸脱水酶；EC 4.3.1.18；以前是EC 4.2.1.14)表示能催化D- 丝氨酸向丙酮酸盐和氨转化的酶。催化的反应可能包括：最初除去水(因 此该酶原来被分类为EC 4.2.1.14)，接着异构化，以及通过C-N键断裂来 水解产物。关于合适的酶的实例，参见 http://www.expasy.org/enzyme/4.3.1.18。术语“D-丙氨酸转氨酶”(EC 2.6.1.21)表示能催化D-丙氨酸与2-酮戊二酸反应形成丙酮酸盐和D-谷氨 酸盐的反应的酶。D-谷氨酸盐对植物的毒性比D-丙氨酸要小得多。 http://www.expasy.org/enzyme/2.6.1.21。
术语D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3；缩写为DAAO、DAMOX或DAO) 指这样的酶，其能优选通过用氧(O2)作为底物来进行，将D-氨基酸转化 为2-氧代酸，并且产生过氧化氢(H2O2)作为副产物(Dixon 1965a，b，c； Massey 1961；Meister 1963)。DAAO的描述可见国际生物化学和分子生 物学命名协会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)(IUBMB)关于EC(酶协会(Enzyme Commission))编号1.4.3.3的描述。通常，EC 1.4.3.3类的DAAO酶是 FAD黄素酶，其催化中性和碱性D-氨基酸氧化为其对应的酮酸。DAAO 已经在真菌和脊椎动物中被表征和测序过，在真菌和脊椎动物中它们已知 位于过氧化物酶体中。在DAAO中，已经显示(Miyano 1991)，保守的 组氨酸对于酶的催化活性来说是重要的。在本发明的一种优选的实施方式 中，DAAO指包含下述共有基序的蛋白质： [LIVM]-[LIVM]-H＊-[NHA]-Y-G-x-[GSA]-[GSA]-x-G-x5-G-x-A，其中，括 号中给出的氨基酸残基代表对各位置的备选残基，x代表任何氨基酸残基， 指数数字表示各连续氨基酸残基的数量。对于各氨基酸残基而言，缩写具 有其标准IUPAC含义，如上文所定义。D-氨基酸氧化酶(EC编号1.4.3.3) 可分离自多种生物，包括但不限于：猪、人、大鼠、酵母、细菌或真菌。 示例性生物是热带假丝酵母(Candida tropicalis)、三角酵母(Trigonopsis variabilis)、粗糙麦孢菌(Neurospora crassa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和瘦弱红酵母。合适的D-氨基酸代谢多肽可以是真核生物酶， 例如，来自酵母(例如，瘦弱红酵母)、真菌或动物，或者其可以是原核 生物酶，例如，来自细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)。关于合适 的酶的实例，见http://www.expasy.org/enzyme/1.4.3.3。
能代谢D-氨基酸的合适的多肽的实例如表1所示。编码所述酶的核酸 序列可从数据库(例如，在Genbank登录号No.U60066、A56901、 AF003339、Z71657、AF003340、U63139、D00809、Z50019、NC_003421、 AL939129、AB042032下)获得。如上文所述，来自数种不同物种的DAAO 已被表征过，它们显示了略有不同的底物亲和性(Gabler 2000)，但是一 般而言，它们都展示广谱底物特异性，对所有D-氨基酸都能氧化性脱氨。
表1：适于代谢D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的酶。尤其优选的酶以黑体 表示。
酶 EC 编 号 示例性来源生物 底物 D-丝氨酸脱水酶(D- 丝氨酸解氨酶，D- 丝氨酸脱氨酶) EC 4.3.1.18 (最初 是EC 4.2.1.14) P54555枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) P00926大肠杆菌.DSDA Q9KL72霍乱弧菌(Vibrio cholera.)VCA0875 Q9KC12 Bacillus halodurans. D-Ser D-Thr D-别苏氨酸 (D-allothreonine) D-氨基酸氧化酶 EC 1.4.3.3 JX0152腐皮镰孢(Fusarium solani) O01739漂亮新小杆线虫 (Caenorhabditis elegans.) O33145麻疯分枝杆菌 (Mycobacterium leprae.)AAO. O35078大鼠(Rattus norvegicus)(大鼠) O45307漂亮新小杆线虫 P00371猪(Sus scrofa)(猪) P14920人(Homo sapiens)(人) P14920人(人) P18894小鼠(Mus musculus) (小鼠) P22942穴兔(Oryctolagus cuniculus)(兔) P24552腐皮镰孢(pisi亚种) (Fusarium solani(subsp.pisi))(Nectria haematococca) P80324红冬孢酵母 (Rhodosporidium toruloides)(酵母) (瘦弱红酵母) Q19564漂亮新小杆线虫 大多数D-氨基 酸
酶 EC编 号 示例性来源生物 底物 Q28382猪(猪) Q7SFW4粗糙麦孢菌 Q7Z312人(人) Q82MI8阿佛曼菌(Streptomyces avermitilis) Q8P4M9野油菜黄单胞菌 (Xanthomonas campestris) Q8PG95地毯草黄单胞菌 (Xanthomonas axonopodis) Q8R2R2小鼠(小鼠) Q8SZN5黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) Q8VCW7小鼠(小鼠) Q921M5 Cavia parcellus(豚鼠) Q95XG9漂亮新小杆线虫 Q99042三角酵母 Q9C1L2粗糙麦孢菌 Q9JXF8脑膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseria meningitidis)(血清群B) NMB2068 Q9V5P1黑腹果蝇 Q9VM80黑腹果蝇 Q9X7P6天蓝色链霉菌 (Streptomyces coelicolor) Q9Y7N4粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)(裂殖 酵母)SPCC1450 Q9Z1M5 Cavia porcellus(豚鼠) Q9Z302田鼠(Cricetulus griseus) U60066红冬孢酵母，(瘦弱红酵 母)菌株TCC 26217 D-丙氨酸转氨酶 2.6.1.21 P54692地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) P54693球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus) P19938芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)(菌株YM-1) 007597枯草芽孢杆菌 085046单核细胞增生利斯特氏菌 (Listeria monocytogenes) P54694溶血性葡萄球菌 D-Ala D-Arg D-Asp D-Glu D-Leu D-Lys D-Met D-Phe D-正缬氨酸
酶 EC编 号 示例性来源生物 底物 (Staphylococcus haemolyticus)
本文上下文中，尤其优选的是来自酵母瘦弱红酵母(红冬孢酵母)的 dao1基因(EC：1.4.3.3；GenBank登录号：U60066)和大肠杆菌基因dsdA (D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)[EC：4.3.1.18；GenBank登录号： J01603])。dao1基因特别有好处，因为其可用作为双功能标记(见国际 专利申请PCT/EP 2005/002734；WO 2005/090581)。
合适的D-氨基酸催化酶还包括上文例示的多肽的片段、突变体、衍生 物、变体和等位体。合适的片段、突变体、衍生物、变体和等位体是保留 有上文定义的D-氨基酸代谢酶的功能特点的那些。对序列的改变以产生突 变体、变体或衍生物可能是通过核酸中一个或多个核苷酸的添加、插入、 缺失或取代的一种或多种造成的，这导致编码的多肽中一个或多个氨基酸 的添加、插入、缺失或取代。当然，不造成编码氨基酸序列差异的核酸改 变也包括在内。
对本发明的方法而言更优选地，能代谢D-丝氨酸的酶选自：
i)SEQ ID NO：2编码的大肠杆菌D-丝氨酸解氨酶；和
ii)酶，其与SEQ ID NO：2编码的序列具有相同酶活性并且具有至 少60％(优选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或95％， 最优选98％)的同一性；以及
iii)下述核酸序列编码的酶，所述核酸序列能与SEQ ID NO：1所示 的序列的互补序列杂交(优选在与下述条件相当或均等的条件下，所述条 件是用30至(优选)35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液于 37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优选1×SSC)中于50至(优选)55℃ 下洗涤；更优选地，在40至(优选)45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS 中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC(优选0.5×SSC)中于55至(优选) 60℃下洗涤，以及最优选地，在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中 于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60至(优选)65℃下洗涤)，
并且，其中，选择在包含浓度为大约0.5mM至大约100mM的D-丝 氨酸的培养基上进行，所述浓度优选地，大约1mM至大约70mM，更优 选地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3mM至大约15mM。 在去分化条件下进行的总的选择时间优选为大约1至10周，优选2至8 周，更优选3至4周。
因此，在一种实施方式中，在本发明的方法中，能代谢D-丝氨酸的酶 选自：
i)表1所示的D-丝氨酸解氨酶，
ii)酶，其具有相同的酶活性，并且与表1所示的D-丝氨酸解氨酶的 氨基酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优 选至少95％，最优选至少98％)的同一性；以及
iii)酶，其具有相同的酶活性，并且与表1所示的D-丝氨酸解氨酶的 核酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选 至少95％，最优选至少98％)的编码核酸序列的同一性；以及
iv)能与编码表1所示的D-丝氨酸解氨酶的序列的互补序列杂交的核 酸序列编码的酶，
并且，其中，选择在包含浓度为3mM至100mM的D-丝氨酸的培养 基上进行，优选地，4至10mM；
或者，其中，能代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸的酶选自：
i)表1所示的D-氨基酸氧化酶，
ii)酶，其具有相同的酶活性，并且与表1所示的D-氨基酸氧化酶的 氨基酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优 选至少95％，最优选至少98％)的同一性；以及
iii)酶，其具有相同酶活性，并且与表1所示的D-氨基酸氧化酶的核 酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至 少95％，最优选至少98％)的编码核酸序列的同一性；以及
iv)能与编码表1所示的D-氨基酸氧化酶的序列的互补序列杂交的核 酸序列编码的酶，
并且，其中，选择在包含总浓度为3mM至100mM的D-丙氨酸和/ 或D-丝氨酸的培养基上进行，优选地，4至10mM。
在关于D-丝氨酸解氨酶的上下文中，“相同活性”表示能代谢D-丝氨 酸的能力，优选地，D-丝氨酸作为最优选的底物。代谢表示上文所指出的 裂合酶反应。
此外，对本发明的方法而言更优选地，能代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸 的酶选自：
i)SEQ ID NO：4或6编码的瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶；和
ii)酶，其具有相同的酶活性并且与SEQ ID NO：4或6编码的序列 具有至少60％(优选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％ 或95％，最优选98％)的同一性；以及
iii)下述核酸序列编码的酶，所述核酸序列能与SEQ ID NO：3或5 所示的序列的互补序列杂交(优选在与下述条件相当或均等的条件下，所 述条件是用30至(优选)35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液 于37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优选1×SSC)中于50至(优选)55℃ 下洗涤；更优选地，在40至(优选)45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS 中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC(优选0.5×SSC)中于55至(优选) 60℃下洗涤，以及最优选地，在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中 于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60至(优选)65℃下洗涤)，
并且，其中，选择在包含总浓度为大约0.5mM至大约100mM的D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行，所述浓度优选地，大约1mM至 大约70mM，更优选地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3mM 至大约15mM。优选地，D-丙氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使 用)以大约0.5mM至大约100mM的浓度使用，优选地，大约1mM至 大约70mM，更优选地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3mM 至大约20mM。优选地，D-丝氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使 用的话)以大约0.5mM至大约100mM的浓度使用，优选地，大约1mM 至大约70mM，更优选地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3 mM至大约15mM。去分化条件下进行的总的选择时间优选为大约1至10 周，优选2至8周，更优选3至4周。
在关于D-氨基酸氧化酶的上下文中，“相同活性”表示能代谢广谱D- 氨基酸的能力(优选地，至少D-丝氨酸和/或D-丙氨酸)。代谢表示上文 所指出的氧化酶反应。
指出的序列的突变体和衍生物还可包含一种或多种特点(Ki、底物特 异性等)有所改进但仍包含关于D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的代谢活性的酶。 此类序列和蛋白质还包括源自诱变和重组流程(例如DNA混编)的序列 和蛋白质。使用此类流程，可对一种或多种不同的编码序列加以操作，以 产生新的具有想要的性质的多肽。以这种方式，从相关序列多核苷酸的群 中产生重组多核苷酸文库，所述相关序列多核苷酸的群包含具有高度序列 同一性并且可被体外或体内同源重组的序列区域。可例如用DNA混编方 案来调节编码候选酶的多核苷酸。DNA混编是在DNA分子中迅速、容易 且高效引入突变或重排(优选随机地)或在两个或多个DNA分子间产生 DNA序列的交换(优选随机地)的方法。DNA混编产生的DNA分子是经 改组的DNA分子，其是源自至少一种模板DNA分子的非天然存在的DNA 分子。经改组的DNA编码相对于模板DNA编码的酶而言经修饰的酶，其 优选具有相对于模板DNA编码的酶而言改变的生物学活性。DNA混编可 基于回归重组和突变的过程，这通过对相关基因的库进行随机片段化接着 通过聚合酶链式反应类似的过程对片段加以重新装配来实现。见，例如， Stemmer 1994 a，b；Crameri 1997；Moore 1997；Zhang 1997；Crameri 1998；US 5,605,793、US 5,837,458、US 5,830,721和US 5,811,238。通过经 改组的DNA得到的dsdA样或dao样的酶具有与酶的原始版本不同的氨基 酸序列。序列同一性的示例性范围如上文所述。
本发明的D-氨基酸代谢酶可在植物细胞的细胞溶胶、过氧化物酶体或 其它细胞内区室中表达。对D-氨基酸代谢酶的区室化可通过将编码DAAO 多肽的核酸序列与编码转运肽的序列融合产生融合蛋白来实现。没有此类 转运肽时表达的基因产物通常积累于细胞溶胶中。
1.1.2用于大豆植物的启动子
1.1.2.1一般性启动子
术语“启动子”在本文中使用时意指指导DNA序列(例如，结构基因) 转录的DNA序列。通常，启动子位于基因的5’区域，接近于结构基因的 转录起始位点。如果启动子是可诱导启动子，那么转录速率应答于诱导剂 而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，那么转录的速率不受诱导试 剂的调控。此外，可以以组织特异性或组织优选型方式对启动子加以调控， 使得其仅对在特定组织类型(例如叶、根或分生组织)中转录相关编码区 域有活性。
术语“在大豆植物中具有活性的启动子”表示下述任何启动子，无论是 否源自植物，所述启动子能在发育中或在去分化条件下于至少一个时间点 诱导有效连接的核苷酸序列在至少一种大豆细胞、组织、器官或植物中发 生转录。此类启动子可以是非植物启动子(例如，源自植物病毒或农杆菌) 或植物启动子，优选地，双子叶植物启动子。本领域技术人员知道可能适 用于大豆植物的数种启动子。在本文上下文中，表达可以是，例如，组成 型的、可诱导的或发育依赖性的。下述启动子是优选的：
a)组成型启动子
“组成型”启动子指：在植物发育的大量时期，优选在植物发育期间的 所有时间，在大量组织，优选所有组织中都确保表达实现的那些启动子。 实例包括：CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子(Franck 1980；Shewmaker 1985；Gardner 1986；Odell 1985)、19S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey 1989)、Rubisco小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、 豆球蛋白B启动子(GenBank登录号No.X03677)、来自农杆菌的胭脂 碱合酶的启动子、TR双启动子、来自农杆菌的OCS(章鱼碱合酶)启动 子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、液泡ATPase亚基的启动子、 pEMU启动子(Last 1991)、MAS启动子(Velten 1984)、拟南芥 (Arabidopsis thaliana)腈水解酶-1基因的启动子(GenBank登录号No.： U38846，核苷酸3862至5325或5342)以及在植物中组成型表达的基因的 其它启动子。
其它合适的组成型启动子是肌动蛋白启动子。来自双子叶植物的数种 肌动蛋白启动子的序列可从Genbank公开的基因组序列(例如：AY063089 (拟南芥肌动蛋白8基因)；AY096381(拟南芥肌动蛋白2基因)； AY305730：(陆地棉(Gossypium hirsutum)肌动蛋白8基因)；AY305724 (陆地棉肌动蛋白2基因)；AF111812(欧洲油菜(Brassica napus)肌 动蛋白基因))获得。它们的启动子在异源表达中的使用被针对香蕉肌动 蛋白启动子描述过(US20050102711)。An等人[Plant J 199610(1)：107-121] 报道过：Act2和Act8mRNA在叶、根、茎、花、花粉和长角果中强烈表 达。嵌合GUS构建体在植物组织的大多数中表达，但是在种皮、下胚轴、 雌蕊或花粉囊中几乎没有检测到表达。
b)组织特异性或组织优选型启动子
还优选对于种子具有特异性的启动子，例如，菜豆蛋白启动子(US 5,504,200；Bustos 1989；Murai 1983；Sengupta-Gopalan 1985)、2S清蛋白 基因的启动子(Joseffson 1987)、legumine启动子(Shirsat 1989)、USP (未知的种子蛋白)启动子(1991a)、油菜籽蛋白基因启动子 (US 5,608,152；Stalberg 1996)、蔗糖结合蛋白的启动子(WO 00/26388) 和豆球蛋白B4启动子(LeB4；1991b；Becker 1992)、拟南芥属 (Arabidopsis)油质蛋白启动子(WO 98/45461)和芸苔属(Brassica) Bce4启动子(WO 91/13980)。还优选的是叶特异性和光诱导启动子，例 如，来自cab或Rubisco的(Simpson 1985；Timko 1985)；花药特异性启 动子，例如来自LAT52的(Twell 1989b)和小孢子优选型启动子，例如 来自apg的(Twell 1983)。
c)化学可诱导型启动子
表达盒还可含有化学可诱导型启动子(综述文章：Gatz 1997)；外源 基因在植物中的表达可于特定时间点受其控制。同样可使用此类启动子， 例如，PRP1启动子(Ward 1993)、水杨酸可诱导启动子(WO 95/19443)、 苯磺酰胺可诱导启动子(EP 0388186)、四环素可诱导启动子(Gatz 1991； Gatz 1992)、脱落酸可诱导启动子(EP 0335528)或乙醇-环已酮可诱导 启动子(WO 93/21334)。谷胱甘肽-S转移酶同种型II基因(GST-II-27) 的启动子也是合适的，其可被外源应用的安全剂(例如，二烯丙基-2，2-二 氯乙酰胺)活化(W093/01294)，并且其在单子叶植物和双子叶植物的大 量组织中都是有效的。可用于本发明的其它示例性可诱导启动子包括来自 ACE1系统的应答于铜的启动子(Mett 1993)，或来自玉米的应答于苯磺 酰胺除草剂安全剂的In2启动子(Hershey 1991；Gatz 1994)。应答于植 物正常情况下不应答的诱导剂的启动子也可使用。示例性的可诱导启动子 是来自类固醇激素基因的可诱导启动子，其转录活性受糖皮质类固醇激素 的诱导(Schena 1991)。
特别优选的是组成型启动子。此外，启动子可与待表达的核酸序列有 效连接，启动子使得所述序列在其它植物组织或其它生物(例如，大肠杆 菌细菌)中的表达成为可能。合适的植物启动子原则上包括上文描述的所 有启动子。
1.1.2.2优选的启动子序列
虽然已知有多种启动子在大豆中具有功能并且适合开展本发明的方 法，但已发现，泛素启动子(尤其是欧芹泛素启动子)尤其能导致令人吃 惊的高选择效率。因此，在一种优选的实施方式中，在大豆中具有活性的 启动子是植物泛素启动子。更优选地，植物泛素启动子是欧芹(欧芹 (Petroselinum crispum)或Lomatium foeniculaceum)泛素启动子或大豆 泛素启动子，更优选地，欧芹泛素启动子。如上文所述，尤其是欧芹泛素 启动子已经显示为获得的，并且产生持续高的转化效率。这些启动子优秀 表现的原因尚不可知。但是已知，最优选择需要选择标记在靶组织的相关 细胞(其随后去分化并再生为转基因植物)、在正确时间、至正确浓度(足 够高以确保高效选择但不能过高以防止对细胞造成的可能的负面影响)的 表达。泛素启动子(特别是欧芹泛素启动子)的优秀功能和有效性还可表 明对大豆细胞具有足够数量的、对大豆来说外源的(非天然的)D-丙氨酸 和/或D-丝氨酸代谢酶(例如DSDA或DAO蛋白)的需要，以能够在施加 于其上的选择压力下存活。这些效果可以是启动子和/或标记依赖性的，从 而启动子和标记的某些组合胜过其它一些。泛素启动子因此可用作为驱动 D-氨基酸代谢酶在大豆中表达的标准启动子。
下文提供的构建体是新颖的，并且尤其有用于进行本发明。此外，它 们还可用于其它植物物种。由此，本发明的另一实施方式涉及异源核苷酸 序列，其包含：
a)来自双子叶植物物种的泛素启动子，以及与其有效连接的
b)编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
其中，所述启动子相对所述核酸序列而言是异源的。
数种来自双子叶植物的泛素启动子已被描述过(Callis 1989，1990)。 描述了来自双子叶植物的启动子，例如，马铃薯(Garbarino 1992)、烟 草(Genschick 1994)、番茄(Hoffman 1991))、欧芹(Kawalleck 1993； WO03/102198，其通过引用并入本文)、拟南芥(Callis 1990；Holtorf 1995；UBQ8，GenBank登录号No：NM_111814；UBQ1，GenBank登录号No： NM_115119；UBQ5，GenBank登录号No：NM_116090)。
通常，术语“泛素启动子”在本文中使用时表示泛素或泛素样基因起始 密码子或图谱上的转录起始位点上游多至5000个碱基对(bp)的基因组 DNA区域。泛素是所有真核细胞中发现的丰富的76个氨基酸的多肽。有 数种不同的基因编码泛素，它们氨基酸水平上的同源性相当高。例如，人 和小鼠具有很多不同的编码泛素的基因，每个都位于不同的染色体基因座 上。功能上，所有泛素基因都是细胞泛素依赖性蛋白水解机制的关键作用 者。每个泛素基因与驱动其表达的启动子相关联。泛素启动子是泛素或泛 素样基因起始密码子或图谱上的转录起始位点上游多至5000个bp的基因 组DNA区域。术语“植物泛素调控系统”指植物(优选地，欧芹)泛素基 因翻译起始位点5’的大约2kb的核苷酸序列，并且包含指导转录启动、调 控转录、控制表达水平、诱导胁迫基因和增强应答于胁迫的表达的序列。 包含启动子和调控功能的调控系统是提供对基因表达的调控控制或调节的 DNA序列。因此，来自本发明的双子叶植物的泛素启动子是DNA片段(优 选地，大约0.5至2kb长)，所述DNA片段包含植物泛素调控系统，其 中，所述调控系统含有启动子(所述启动子包含转录起始位点)，以及， 优选地，位于所述转录起始位点5’的一个或多个热激元件，以及，优选地， 位于所述转录起始位点3’的内含子，其中，所述调控系统能调控在大豆中 的表达。
优选地，泛素启动子是欧芹泛素启动子或大豆(Glycine max)泛素启 动子。欧芹和大豆泛素的序列在下文中提供(分别是SEQ ID NO：5和6)。 公开的序列包含
本领域技术人员已知，启动子序列可被很大程度地修饰(例如，截短、 融合、突变)，而不会显著改变它们的转录性质。由此，本发明的另一实 施方式涉及包含欧芹泛素或大豆泛素启动子片段或衍生物的异源核苷酸序 列。它们可以是合成序列(即，不存在于自然界中)或来自其它植物物种 的直向同源序列。因此，本发明的另一实施方式涉及异源核苷酸序列，其 包含：
a)选自下述的启动子：
i)序列，其包含SEQ ID NO：7或8所示的序列，以及
ii)序列，其包含至少一个片段并且在大豆中具有启动子活性，所述片 段为SEQ ID NO：7或8所示的序列的至少50(优选100或150，更优选 200或250，甚至更优选300或500)个连续碱基对，
iii)序列，其包含与SEQ ID NO：7或8所示的序列具有至少60％(优 选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或95％，最优选 98％)同一性的序列，并且在大豆中具有启动子活性，
iv)序列，其包含能与SEQ ID NO：7或8所示的序列杂交(优选在 与下述条件相当或均等的条件下，所述条件是用30至(优选)35％的甲酰 胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液于37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优 选1×SSC)中于50至(优选)55℃下洗涤；更优选地，在40至(优选) 45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC (优选0.5×SSC)中于55至(优选)60℃下洗涤，以及最优选地，在50％ 的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60 至(优选)65℃下洗涤)的序列，并且在大豆中具有启动子活性，以及
b)编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
其中，所述启动子相对所述核酸序列而言是异源的。
在大豆植物中的“启动子活性”表示在大豆植物或源自大豆植物的至少 一个细胞或组织中实现有效连接的核酸序列的转录的能力。优选地，其表 示组成型转录活性，允许在大多数组织和大多数发育阶段表达。
因此，本发明利用的泛素启动子还可以是SEQ ID NO：7或8所示的 启动子的片段或其衍生物。片段可包括SEQ ID NO：7或8所示的启动子 的截短版本，其中，非必要序列已被除去。缩短的启动子序列是高度有好 处的，因为它们更易于操作，并且有时在其基因表达方面是经过优化的。 制备缩短或截短的启动子的一种高效的靶向方法依赖于对启动子序列中假 定调控元件的鉴定。这可通过与已知以相似组织特异性方式或以发育独特 方式待表达的启动子序列进行比较来启动。具有相似表达模式的启动子共 享的序列是用于转录因子结合的可能候选者，因此可能是赋予表述模式的 元件。对这些假定调控元件的验证可这样进行：对每种假定调控区域进行 缺失分析，接着通过报道基因(其与每种构建体功能性相连)测定对每种 缺失构建体进行功能分析。同样，一旦提供了起始启动子序列，那么就可 以容易地制备起始启动子的多种不同缺失突变体中的任何一种。泛素启动 子(例如，SEQ ID NO：7或8所示)的功能等价片段还可通过除去或缺 失非必要序列而不缺失必要序列来获得。将转录调控核苷酸序列缩小到其 必要转录介导元件可通过尝试法(trial-and-arrow)缺失突变来体外实现， 或者使用启动子元件搜索途径以计算机方式实现。对于启动子活性来说必 要的区域通常展示出某些已知启动子元件的簇。此类分析可使用可获得的 计算机算法，例如PLACE(“Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements”； Higo 1999)、BIOBASE数据库“Transfac”(Biologische Datenbanken GmbH，Braunschweig；Wingender 2001)或数据库PlantCARE(Lescot 2002)来进行。优选地，本发明的转录调控核苷酸序列之一的功能等价片段 包含SEQ ID NO：7或8所示的转录调控核苷酸序列的至少100个碱基对， 优选至少200个碱基对，更优选至少500个碱基对。更优选地，该片段从 指出的序列的3’端开始。
尤其优选的是转录调控核苷酸序列的下述等价片段，它们是通过缺失 掉编码mRNA 5’-非翻译区域的区域由此仅提供(不转录的)启动子区域 来获得的。可通过本领域已知的方法(例如5’-RACE分析)容易地确定5’- 非翻译区域。
除了泛素启动子之外，还有其它启动子也已显示为适于获得大豆中的 D-氨基酸抗性，它们包括拟南芥肌动蛋白2启动子和nos启动子。但是， 转化效率显著低于泛素启动子。
1.1.3其它元件
本发明的表达盒(或包含它们的载体)除了包含在大豆植物中具有活 性的启动子(例如泛素启动子)之外，还可包含其它功能性元件和遗传控 制序列。术语“功能性元件”或“遗传控制序列”应当被理解为广义的，是指 对根据本发明的表达盒的功能或实体化(materialization)具有影响的所有 序列。例如，遗传控制序列能修饰转录和翻译。遗传控制序列已被描述过 (例如，Goeddel 1990；Gruber 1993及其中提到的参考文献)。
优选地，根据本发明的表达盒包括位于核酸序列(例如编码D-氨基酸 代谢酶的)5’-上游的、在大豆植物中具有活性的启动子(例如泛素启动子) 以及3’-下游的终止子序列和多聚腺苷酸化信号，以及如果合适的话，还有 其它惯用的调控元件，在每种情况下它们可与待表达的核酸序列有效连接。
此外，遗传控制序列和功能性元件还包括基因的5’-非翻译区域、内含 子或非编码3’-区域，例如，肌动蛋白-1内含子或Adh1-S内含子1、2和6 (一般性文献：The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot，编著， Springer，New York(1994))。已经阐述过：它们可在对基因表达的调控中 发挥显著作用。因此，已经描述过：5’-非翻译序列可增强异源基因的瞬时 表达。可被论及的翻译增强子的实例是烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie 1987)等。此外，它们可促进组织特异性(Rouster 1998)。
适合作为遗传控制序列的多聚腺苷酸化信号是植物多聚腺苷酸化信 号，优选地，基本上对应于来自根瘤农杆菌的T-DNA多聚腺苷酸化信号 的那些。特别合适的终止子序列的实例是OCS(章鱼碱合酶)终止子和 NOS(胭脂碱合酶)终止子。
本发明的遗传组分和/或表达盒可包含其它功能性元件。功能性元件可 包括，例如(但不限于)可选择或可筛选标记基因(除了D-丙氨酸或D- 丝氨酸代谢酶之外)。可选择和可筛选标记可包括：
a)阴性选择标记，即，赋予对杀生物化合物的抗性的标记，所述杀生 物化合物例如，代谢抑制剂(例如，2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐，WO 98/45456)、 抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(例如，膦 丝菌素或草甘膦)。尤其优选的阴性选择标记是赋予对除草剂的抗性的那 些(细节见下文的共转化章节)。
b)阳性选择标记，即，向经转化的植物赋予较之未经转化的植物而言 生长优势的标记，例如，Ebinuma等人2000a，b和EP-A 0601092中描述 的基因和方法。
c)反向选择标记，即，适于选择具有给定的、缺失的、包含所述标记 的生物的标记(Koprek 1999)。实例包含胞嘧啶脱氨酶codA(Schlaman 1997)。
d)报道基因，即，编码易于被定量(通过颜色或酶活性；Schenborn 1999)的蛋白质的标记。优选的是绿色荧光蛋白(GFP)(Sheen 1995； Haseloff 1997；Reichel 1996；Tian 1997；WO 97/41228；Chui 1996；Leffel 1997)和尤其优选的葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Jefferson 1987a，b)。
可包含在本发明的载体中的功能性元件包括：
i)复制起点，其确保根据本发明的载体或表达盒在例如大肠杆菌中能 够复制。可被论及的实例是ORI(DNA复制起点)、pBR322ori或P15A ori(Maniatis，1989)，
ii)多克隆位点(MCS)，其使得一种或多种核酸序列的插入可行， 并且协助这种插入，
iii)使得同源重组、标记缺失以及向宿主生物基因组中的插入成为可 能的序列。基于cre/lox(Sauer 1998；Odell 1990；Dale 1991)、FLP/FRT (Lysnik 1993)或Ac/Ds系统(Wader 1987；US 5,225,341；Baker 1987； Lawson 1994)的方法允许——(根据需要)组织特异性和/或可诱导的—— 从宿主生物的基因组除去特定的DNA序列。控制序列在这方面表示特定 的侧翼序列(例如，lox序列)，其之后允许被除去(例如通过cre重组酶) (还见，国际专利申请PCT/EP 2005/002734；WO 2005/090581)，
iv)元件，例如边界序列，其使得农杆菌介导的在植物细胞中的转移 (用于转移和整合进植物基因组)成为可能，例如，T-DNA或vir区域的 左或右边界。
1.2第二表达盒
优选地，插入靶植物基因组的DNA构建体包含至少一个第二表达盒， 其向大豆植物赋予农业经济相关性状。这可通过表达选择标记、性状基因、 反义RNA或双链RNA来实现。本领域技术人员知道可用于这方面的大量 序列，例如，以增加食物和饲料的品质，以生产化学品、精细化学品或药 物(例如，维生素、油、碳水化合物；Dunwell 2000)，赋予对除草剂的 抗性，或赋予雄性不育。此外，可增强生长、产量和针对非生物和生物胁 迫因素(例如，真菌、病毒或昆虫)的抗性。可通过过量表达蛋白质或通 过减少内源蛋白的表达(通过，例如表达相应的反义(Sheehy 1988；US 4,801,340；Mol 1990)或双链RNA(Matzke 2000；Fire 1998；Waterhouse 1998；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914； WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)来实现)来赋予有好处的性质。
对这些序列的表达而言，可以使用适合在大豆中的基因表达的所有启 动子。优选地，所述第二表达构建体并不包含与用于表达D-氨基酸代谢酶 的启动子相同的启动子。表达可例如是组成型、可诱导或发育依赖性的。 本领域已知有多种启动子用于在双子叶植物(例如大豆中)表达(细节见 上文)。
2.本发明的转化和选择方法
2.1植物材料的来源和制备
多种植物材料可用于本文公开的转化流程。此类植物材料可包括但不 限于，例如，叶、根、未成熟和成熟的胚、花粉、分生组织、花序、愈伤 组织、原生质体或植物细胞的悬浮液。
用于转化的植物材料可从基本上任何大豆品种或大豆植物中获得或分 离。尤其优选的是选自Jack、Resnik、Williams 82、Corsoy、Crawford、 Hutcheson、Kunitz和Champ的大豆植物。其它合适的大豆品种可从研究 和商业机构获得，例如，University of Guelph(Ontario Agricultural College；例如大豆品种RCAT Staples、Westag 97、RCAT Bobcat、OAC Prudence、OAC Woodstock、OAC 9908)；或来自Daryland或Soygenetics 的大豆品种。其它合适的品种是PI548402(Peking)、PI437654(Er-hejjan)、 PI438489(Chiquita)、PI507354(Tokei 421)、PI548655(Forrest)、 PI548988(Pickett)、PI88788、PI404198(Sun Huan Do)、PI404166 (Krasnoaarmejkaja)、Hartwig、Manokin、Doles、Dyer和Custer。
虽然本领域描述了基于不同大豆外植体的数种转化和再生方法(例如， 基于子叶节的)(它们都是本领域技术人员已知的)，但是本发明的方法 优选基于腋生分生组织，其更优选是源自大豆植物第一或更高的叶节的。 初生或更高的节的腋生分生组织可由幼苗腋生分生组织提供，并被用于随 后的转化(例如，农杆菌共转化)步骤。
优选地，本发明的方法包括下述步骤：
(a)提供大豆幼苗初生叶节或更高的叶节的腋生分生组织，以及
(b)将所述腋生分生组织与包含转基因T-DNA的根瘤菌科细菌一起 共培养，所述转基因T-DNA包含下述DNA构建体，所述构建体包含至少 一个第一表达构建体，所述第一表达构建体包含在所述大豆植物中具有活 性以及与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶 的核酸序列，
(c)将所述经共培养的腋生分生组织转移到枝条诱导和选择培养基 上，所述培养基包含：
(i)浓度适于从所述腋生分生组织从头诱导枝条诱导的至少一种植物 生长因子，以及
(ii)总浓度为大约3mM至大约100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸 和/或其衍生物，以及
(iii)任选地，一种或多种适于抑制根瘤菌科细菌生长的抗生素，
以及，在所述培养基上对所述经共培养的腋生分生组织进行至少5天 的培养，直到从其诱导和发育出枝条，并且分离所述枝条，以及
(d)将所述经分离的枝条转移至生根培养基，在所述生根培养基上培 养所述枝条，直到所述枝条形成根，进一步将由此得到的小植物再生为成 熟植物，其包含插入进它们基因组中的所述转基因T-DNA。
基于腋生分生组织的方法可利用来自多种来源的外植体组织和/或细 胞，优选地，来自初生或更高的叶节。初生叶节是当从根到叶的方法移动 时直接紧随子叶节(即，茎上与子叶相连或已连有子叶的点)的节(即， 茎上与叶相连或已连有叶的点)。更高的叶节是在初生叶节之后的所有叶 节，例如，第二、第三、第四等叶节。优选的是初生叶结的腋生分生组织。
优选地，初生或更高的节的腋生分生组织以选自下述的形式提供：
i)由基本上整株幼苗提供的幼苗腋生分生组织，以及
ii)通过以使得腋生分生组织保持与叶的叶柄相连的方式对初生或更高 的叶加以切割，而提供的叶腋生分生组织，
iii)繁殖的腋生分生组织。
初生或更高的节的腋生分生组织可以于随后的农杆菌共培养步骤中以 多种形式提供并利用：
a)方法A：幼苗腋生分生组织：整株幼苗或其相当大的部分(例如幼 苗去掉根或者没有一片或两片子叶的幼苗)可被使用，将其用农杆菌接种， 并被放到枝条诱导培养基(SIM)上。优选地，基本上整株幼苗选自下述 材料：
i)整株幼苗，和
ii)根被去除的幼苗，以及
iii)一片或两片子叶被去除的幼苗，以及
iv)根和一片或两片子叶被去除的幼苗，以及
v)根、两片子叶和上胚轴的一部分被去除，但留有与上胚轴的部分相 连的腋生分生组织的幼苗。
b)方法B：叶腋生分生组织：以使得腋生分生组织保持与叶柄相连的 方式对初生或更高的叶加以切割，将其浸于农杆菌溶液中(用该溶液接种)， 在共培养培养基上进行共培养，并放到枝条诱导培养基(SIM)上。外植 体的小尺寸以及枝条的茁壮生长对于选择经转化细胞来说是有利的，所述 对经转化细胞的选择是目前的转化方法的难题。
c)方法C：繁殖的腋生分生组织：从萌发的(优选大约)7天龄幼苗 的每株幼苗去除下胚轴和两片子叶的一片半或一片和一部分。然后将幼苗 放到繁殖培养基上2至4周。幼苗产生数条分支的枝条，由此获得外植体。 可以切下从第一至第四叶节的腋生节。从每株幼苗平均获得三至四个外植 体。
除了上文指出的来源之外，其它来源也可能适合腋生分生组织。这些 来源可以例如是源自大豆幼苗的更受限的(restricted)外植体，例如，仅 上胚轴和初生叶节。明显地，此类受限(即，小)的外植体既可从初生节 获得，也可从更高的节(例如，第二或更高的节)获得。
较之农杆菌介导的其它转化方案，该方法需要的时间大大降低。从流 程启动后4至6周，可收集可变的表型阳性大豆枝条。此外，本发明的方 法是高度独立于基因型和栽培种的。
用于转化工艺的起始材料通常是大豆种子。种子首先被灭菌，任选地， 浸泡以软化。然后将种子放到萌发培养基上，进行大约4至10天的萌发， 优选进行大约5至8天，最优选进行大约7天。对于繁殖的腋生分生组织 和叶腋生分生组织方法而言，在该时间点上胚轴优选大约0.5cm，对于幼 苗腋生分生组织方法而言，所述上胚轴在该时间点上通常是0.5至2cm。 优选地，萌发在高光照条件下(＞100μMm-2s-1)于25℃进行。
2.2转化流程
2.2.1一般性技术
可使用DNA构建体被插入的载体，将根据本发明的DNA构建体有利 地引入细胞。载体的实例可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒、逆转录病毒 或农杆菌。在一种有利的实施方式中，通过质粒载体来引入表达盒。优选 的载体是能使得表达盒稳定整合进宿主基因组的那些。
可通过本领域技术人员已知的数种手段中的任何手段来将DNA构建 体引入靶植物细胞和/或生物，这种流程被称为转化。适于大豆的数种转化 流程已经被描述过。
例如，可使用射弹方法，例如DNA粒子轰击来将DNA构建体直接引 入植物细胞，或者可使用例如对细胞进行的电穿孔和显微注射的技术，来 引入DNA构建体。颗粒介导的转化技术(还被称为“射弹”)被描述于， 例如EP-A1270,356、US 5,100,792、EP-A-444882、EP-A-434616、Klein 1987、Vasil 1993和Becker 1994中。这些方法包括：通过用在小珠粒或颗 粒的基质中或表面上具有核酸的小颗粒来穿透细胞。射弹PDS-1000Gene Gun(百奥雷得公司(Biorad)，Hercules，CA)使用了氦压力，以加速DNA 包覆的金或钨微载剂冲向靶细胞。该工艺可应用于来自生物(包括植物) 的宽范围的组织和细胞。其它转化方法也是本领域技术人员已知的。
其它技术包括显微注射(WO 92/09696，WO 94/00583，EP-A 331083， EP-A 175966，Green 1987)、聚乙二醇(PEG)介导的转化(Paszkowski 1984；Lazzeri 1995)、基于脂质体的基因递送(WO 93/24640；Freeman 1984)、电穿孔(EP-A 290395，WO 87/06614；Fromm 1985；Shimamoto 1992)。
在将DNA注射或电穿孔进植物细胞的情况下，待转化的DNA构建体 无需达到任何特定要求(事实上，“裸”表达盒就可使用)。可以使用简单 的质粒，例如，pUC系列的那些。
2.2.2土传细菌介导的转化(共培养)
除了这些“直接”转化技术之外并且对其优选的，还可通过土传细菌， 例如，根瘤农杆菌或发根农杆菌进行细菌感染，来开展转化。
2.2.2.1对菌株、载体和共培养条件的选择
用于将DNA(例如T-DNA)转入大豆基因组的土传细菌可以是根瘤 菌科的任何物种。根瘤菌科包含农杆菌属，根瘤菌属(Rhizobium)、大 豆根瘤菌属(Sinorhizobium)和茎瘤菌属(Allorhizobium)，是该细菌科 中的属，它们已基于核糖体特点被包括进了蛋白菌(Proteobacteria)的α-2 亚组。该家族的成员是需氧的革兰氏阴性的。细胞通常是杆状的(0.6-1.0μm ×1.5-3.0μm)，单独或成对存在，没有内生孢子，通过一至六条周鞭毛来 运动。在含碳水化合物的培养基上生长期间，通常产生相当多的细胞外多 糖黏质。尤其优选的是根瘤菌科，例如草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、快生型大豆根瘤 菌(Sinorhizobium fredii)、根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)NGR234、 根瘤菌属物种BR816、根瘤菌属物种N33、根瘤菌属物种GRH2、萨赫尔 中华根瘤菌(Sinorhizobium saheli)、热带树中华根瘤菌(Sinorhizobium terangae)、豌豆根瘤菌(三叶草生物型)(Rhizobium leguminosarum biovar trifolii)、豌豆根瘤菌(蚕豆生物型)(Rhizobium leguminosarum biovar viciae)、豌豆根瘤菌(菜豆生物型)(Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、 Rhizobium galegae、Rhizobium gallicum、Rhizobium giardinii、海南根瘤 菌(Rhizobium hainanense)、Rhizobium mongolense、羽扇豆根瘤菌 (Rhizobium lupini)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华 癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌 (Mesorhizobium ciceri)、Mesorhizobium mediterraneium、 Mesorhizobium tianshanense、Bradyrhizobium elkanni、大豆慢生根瘤菌 (Bradyrhizobium japonicum)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、 Allobacterium undicola、Phyllobacterium myrsinacearum、根瘤农杆菌、 放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)、发根农杆菌、Agrobacterium vitis和悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)。优选的还有Broothaerts(2005) 中描述的菌株和方法。
农杆菌、茎瘤菌属和根瘤菌属的单源性质以及它们共有的表型分类界 限支持它们被合并进单独的属——根瘤菌属。对农杆菌菌株的归类和表征， 包括区分开根瘤农杆菌和发根农杆菌以及它们的若干种冠瘿碱型的类是本 领域公知的实践(见，例如，Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria，第3版.(2001)Schaad，Jones和Chun(编著)ISBN 0890542635，例如其中公开的Moore等人的文章)。近来的研究表明，通 过其植物-致病性质进行的归类可能并不恰当。因此，基于基因组分析和比 较的更为先进的方法(例如16S rRNA测序、RFLP、Rep-PCR等)被用 来阐释多种菌株之间的关系(见，例如，Young 2003，Farrand 2003，de Bruijn 1996，Vinuesa 1998)。通过展示了农杆菌菌株K599的关系的两种 方法，获得的农杆菌属的成员的系统发生关系展示于Llob 2003中。
本领域已知，不仅农杆菌能介导T-DNA转移，还有其它土传细菌也 可以，只要它们具有用于对Ti或Ri质粒进行T-DNA转移的相关功能元 件即可(Klein&Klein 1953；Hooykaas 1977；van Veen 1988)。
优选地，土传细菌是农杆菌属的。术语“农杆菌”在本文中使用时表示 土传的、革兰氏阴性的、杆状的植物致病性细菌。基于比较性16S rDNA 分析，农杆菌的物种，根瘤农杆菌(同义：放射性农杆菌)、发根农杆菌、 悬钩子农杆菌和Agrobacterium vitis，和Allorhizobium undicola一起，与 根瘤菌属所有的种形成了单源组(Sawada 1993，Young 2003)。农杆菌是 包含植物致病性物种的人造属。
术语Ti质粒在本文中使用时指可在农杆菌中复制的质粒，其在天然状 况下是“带甲”(armed)形式，其能在受农杆菌感染的植物中介导冠瘿。 用农杆菌的Ti质粒的天然“带甲”形式对植物细胞的感染通常导致受感染 的细胞产生冠瘿碱(例如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，导致胭脂 碱产生的农杆菌菌株(例如菌株LBA4301、C58、A208)被称为“胭脂碱 型”农杆菌(Agrobacteria)；导致章鱼碱产生的农杆菌菌株(例如菌株 LBA4404、Ach5、B6)被称为“章鱼碱型”农杆菌；导致农杆碱产生的农杆 菌菌株(例如菌株EHA105、EHA101、A281)被称为“农杆碱型”农杆菌。 卸甲Ti质粒应当被理解为，丢失了其冠瘿介导性质但是仍能提供植物感染 功能的Ti质粒。优选地，以下述方式来修饰所述“卸甲”质粒的T-DNA区 域，所述方式使得除了边界序列外，没有功能性的内部Ti序列被转入植物 基因组。在一种优选的实施方式中(当使用二元载体系统时)，整个T-DNA 区域(包括T-DNA边界)缺失。
术语Ri质粒在本文中使用时指可在农杆菌中复制的质粒，在其天然状 况下是“带甲”形式，其能在受农杆菌感染的植物中介导发根病。用农杆菌 的Ri质粒的天然“带甲”形式对植物细胞的感染通常导致受感染的细胞产 生冠瘿碱(在经转基因的植物细胞中产生的特定氨基糖衍生物，例如农杆 碱、黄瓜碱、章鱼碱、米奇矛碱(mikimopine)等)。传统上，按照与根 瘤农杆菌菌株相同的方式，将发根农杆菌菌株分为亚类。最常见的菌株是 农杆碱型菌株(例如，特征在于Ri质粒pRi-A4)、甘露碱型菌株(例如， 特征在于Ri质粒pRi8196)和黄瓜碱型菌株(例如，特征在于Ri质粒 pRi2659)。一些其它菌株是米奇矛碱型(例如，特征在于Ri质粒pRi1723)。 米奇矛碱和黄瓜碱是立体异构体，但是在核苷酸水平上没有在pRi质粒之 间发现同源性(Suzuki 2001)。卸甲Ri质粒应当被理解为，丢失了其发 根病介导性质但是仍能提供植物感染功能的Ri质粒。优选地，以下述方式 来修饰所述“卸甲”Ri质粒的T-DNA区域，所述方式使得除了边界序列外， 没有功能性的内部Ri序列被转入植物基因组。在一种优选的实施方式中 (当使用二元载体系统时)，整个T-DNA区域(包括T-DNA边界)缺失。
根瘤农杆菌和发根农杆菌各自的Ti和Ri携带有负责对植物遗传转化 的基因(Kado 1991)。载体基于农杆菌的Ti或Ri质粒，并且利用将DNA 转移进植物基因组的天然系统。作为这种被高度开发的寄生情况的一部分， 农杆菌将其基因组信息的给定部分(T-DNA；侧翼有大约25bp的重复， 被称为左边界和右边界)转入植物细胞的染色体DNA(Zupan 2000)。所 述DNA转移是所谓的vir基因(原来的Ti质粒的一部分)的组合作用介 导的。为利用该天然系统，开发了缺少原本的肿瘤诱导基因的Ti质粒(“卸 甲”载体)。在另一实施方式中，所谓的“二元载体系统”中，T-DNA与Ti 质粒的其它功能性元件(例如vir基因)通过并入进穿梭载体而被物理分 离，这允许更容易的操作(EP-A 120516；US 4,940,838)。这些二元载体 包含(除了具有其边界序列的卸甲T-DNA之外)用于在农杆菌和大肠杆 菌中都能复制的原核序列。农杆菌介导的转化的优点是，通常仅边界侧翼 的DNA被转入基因组，优先仅插入一个拷贝。对农杆菌载体系统和用于 农杆菌介导的基因转移的方法的描述是本领域已知的(Miki 1993；Gruber 1993；Moloney 1989)。
因此，为进行农杆菌介导的转化，遗传组合物(例如，包含表达盒) 被整合进特定的质粒，进入穿梭或中间载体，或者进入二元载体。如果将 要用Ti或Ri质粒进行转化，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右边界(但 是在大多数情况下是右边界和左边界)以侧翼区域的形式与待引入的表达 盒相连。二元载体是优选使用的。二元载体在大肠杆菌和农杆菌中都能复 制。它们可包含选择标记基因和在右和左T-DNA边界序列侧翼的接头或 多聚接头(为了插入，例如，待被转移的表达盒的接头或多聚接头)。它 们可被直接转入农杆菌(Holsters 1978)。选择标记基因允许对经转化的 农杆菌加以选择，是例如，nptII基因，其赋予了对卡那霉素的抗性。在这 种情况下，作为宿主生物发挥作用的农杆菌应当已经含有了具有vir区域 的质粒。后者是将T-DNA转移进植物细胞所需要的。以这种方式转化的 农杆菌可用于转化植物细胞。T-DNA用于转化植物细胞的用途已被研究并 深入描述过(EP 120516；Hoekema 1985)。
常见的二元载体基于“宽宿主范围”质粒，例如，源自P型质粒RK2 的pRK252(Bevan 1984)或pTJS75(Watson 1985)。这些载体中的大 多数是pBIN19(Bevan 1984)的衍生物。多种二元载体是已知的，其中一 些是商业可获得的，例如，pBI101.2或pBIN19(克隆技术实验室(Clontech Laboratories)，Inc.USA)。在尺寸和操作性的方面对其它载体进行了改 进(例如，pPZP；Hajdukiewicz 1994)。改进的载体系统还被描述于WO 02/00900中。
优选地，土传细菌是属于农杆菌科的细菌，更优选地，卸甲根瘤农杆 菌或发根农杆菌菌株。在一种优选的实施方式中，用于实践本发明的农杆 菌菌株包括章鱼碱菌株，例如，LBA4404或农杆碱菌株，例如EHA101或 EHA105。用于DNA转移的合适的根瘤农杆菌的菌株是，例如， EHA101[pEHA101](Hood 1986)、EHA105[pEHA105](Li 1992)、 LBA4404[pAL4404](Hoekema 1983)、C58C1[pMP90](Koncz&Schell 1986)和C58C1[pGV2260](Deblaere 1985)。其它合适的菌株是根瘤农 杆菌C58，这是胭脂碱菌株。其它合适的菌株是根瘤农杆菌C58C1(Van Larebeke 1974)、A136(Watson 1975)或LBA4011(Klapwijk 1980)。 在另一优选的实施方式中，土传细菌是发根农杆菌菌株K599的卸甲菌株 变体(NCPPB 2659)。此类菌株被描述于2004年9月2日提交的美国临 时申请No.60/606,789和国际申请PCT/EP2005/009366中，它们通过引用 整体并入本文。
可通过常用的DNA重组技术来修饰二元载体或任何其它载体，在大 肠杆菌中倍增，通过例如电穿孔或其它转化技术(Mozo 1991)引入农杆 菌。
按照本领域已知的方式来培养和使用农杆菌。包含农杆菌菌株的载体 可例如在补充有合适的抗生素(例如，50mg/l壮观霉素)的YEP培养基 (5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl、15g/l琼脂，pH 6.8；见实 施例2)上生长3天。用环从固体培养基收集细菌，并对其进行重新悬浮。 在本发明的一种优选的实施方式中，通过使用冷冻于-80℃的等分试样来 开始农杆菌培养。为进行对多种大豆腋生分生组织外植体组织的农杆菌处 理，优选将细菌重新悬浮于共培养培养基(CCM)中。用于感染的农杆菌 的浓度、直接接触时间和共培养可能需要改变。因此，通常农杆菌浓度的 范围是OD6000.1至3.0。优选地，对于多种腋生分生组织外植体而言，使 用下述浓度的农杆菌悬浮液：
a)方法A(幼苗腋生分生组织)：大约的OD600＝0.5至大约3，优选 地大约OD600＝1至2。
b)方法B(叶腋生分生组织)：大约OD600＝0.1至大约1，优选地大 约OD600＝0.125至0.5。
c)方法C(繁殖的腋生分生组织)：大约OD600＝0.2至大约1.5，优 选地大约OD600＝0.5至0.8。
然后用农杆菌培养物对外植体进行数分钟至数小时的接种，通常，大 约10分钟至3小时，优选地，大约0.5小时至1小时。过量的培养基被排 出，农杆菌被允许与分生组织共培养大约1至大约6天，优选大约3至大 约5天(对根瘤农杆菌菌株而言)，以及大约2至大约3天(对发根农杆 菌菌株而言)，优选在黑暗中进行。在该步骤期间，农杆菌将外来遗传构 建体转移进大豆腋生分生组织的一些细胞中。通常在该步骤期间不存在选 择化合物。
2.2.2.2用于增强转化效率的修饰
将能减少由于植物防御应答(例如，酚氧化)导致的组织坏死的乙烯 抑制剂(例如，硝酸银)、酚吸收化合物(例如聚乙烯吡咯烷酮，Perl 1996) 或抗氧化剂(例如硫醇化合物，例如，二硫代苏糖醇、L-半胱氨酸，Olhoft 2001)补充给共培养培养基可进一步提高农杆菌介导的转化的效率。
将能减少由于植物防御应答(例如，酚氧化)导致的组织坏死的抗氧 化剂(例如，二硫苏糖醇)或硫醇化合物(例如，L-半胱氨酸，Olhoft 2001； US2001034888)补充给共培养培养基可进一步提高农杆菌介导的转化的效 率。在另一优选的实施方式中，共培养培养基包含至少一种硫醇化合物， 优选选自硫代硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)和半胱氨酸。优选地，浓度在 大约1mM至10mM的L-半胱氨酸、0.1mM至5mM DTT和/或0.1mM 至5mM的硫代硫酸钠之间。
可在农杆菌共培养之前或期间，用酚化合物对靶组织和/或农杆菌进行 处理。适于本发明的范围的“植物酚化合物”或“植物酚”是经分离的被取代 的酚分子(它们能诱导阳性趋化性应答)，特别是能在含Ti质粒的农杆菌 属物种(Agrobacterium sp.)中，特别是含Ti质粒的根瘤农杆菌中诱导增 加的vir基因表达的那些。优选的植物酚化合物是乙酰丁香酮(3，5-二甲氧-4- 羟基苯乙酮)。某些化合物，例如渗透保护剂(例如，L-脯氨酸，优选地， 大约200-1000mg/L的浓度或甜菜碱)、植物激素(NAA等)、冠瘿碱或 糖，与植物酚化合物组合加入时能协同作用。
对于根瘤农杆菌来说特别合适的诱导条件已被描述过(Vernade 1988)。可通过本领域已知的多种其它方法来增强用农杆菌进行的转化的 效率，例如，真空渗入(WO 00/58484)、热激和/或离心、加入硝酸银、 超声波处理等。
优选地，本发明的方法包括选自以下的一个或多个额外的步骤：
(a1)在共培养前、期间或之后立即损伤外植体，以及
(b1)步骤(b)后，将所述经共培养的腋生分生组织转进下述培养 基，该培养基包含至少一种适合抑制农杆菌生长的抗生素以及任选地，至 少一种植物生长因子，其中，所述培养基优选缺乏以植物毒性浓度的D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物，以及，
(b2)在步骤(b)以及任选地(b1)后，在枝条诱导培养基(SIM) 上进一步孵育所述腋生分生组织，所述培养基包含至少一种植物生长因子， 其中，所述枝条诱导培养基优选缺乏以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D- 丝氨酸或其衍生物，以及，
(c1)在步骤(c或b2)后，将所述枝条转进枝条延长培养基，其包 含：
(i)浓度适于允许枝条延长的至少一种植物生长因子，以及
(ii)任选地，总浓度为大约3至大约100mM的的D-丙氨酸和/或 D-丝氨酸或其衍生物，
以及，在所述枝条延长培养基上培养所述经转移的枝条，直到所述枝 条延长至至少大约2cm的长度。
在本发明的一种优选的实施方式中，腋生分生组织是受到损伤的(步 骤(a1))。损伤看起来对本发明的方法具有至少两种增强效果：
(i)损伤协助了农杆菌感染和基因转移效率，
(ii)损伤增强了从头枝条诱导的效率，这假设是通过破坏了分生组织 连接从而显著增加了从外植体组织发育的枝条数量来实现的。
损伤可以在用农杆菌接种(共培养)之前、接种期间或接种之后发生。 为获得两种有益效果，优选在共培养之前或期间进行损伤，更优选在共培 养之前。可以使用很多损伤方法，包括，例如，切割、研磨(abrading)、 刺穿(piercing)、戳捅(piking)、用精细颗粒或加压液体穿透、等离子 体损伤(plasma wounding)、应用高压(hyperbaric pressure)或超声波 处理。损伤可用器件来进行，例如但不限于，解剖刀、剪刀、针、研磨器 件、喷枪、颗粒、电基因枪或声波。增强共转化步骤效率的另一备选方法 是真空渗入(Bechtold 1998；Trieu 2000)。
2.3共培养后处理
在共培养之后，优选通过洗涤和/或用合适的抗生素处理来除去土传细 菌。由此，在共培养步骤之后使用的培养基，例如，在步骤(b1)、(b2) 和/或(c1)中使用的培养基优选含有杀菌剂(抗生素)。该步骤意欲用于 终止或者至少延迟未经转化的细胞的生长以及杀死剩余的农杆菌细胞。因 此，本发明的方法优选包括如下步骤：
(b1)步骤(b)后，将所述经共培养的腋生分生组织转进下述培养 基，该培养基包含至少一种适合抑制农杆菌生长的抗生素以及任选地，至 少一种植物生长因子，其中，所述培养基优选缺乏以植物毒性浓度的D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物，以及，
优选的待使用抗生素是，例如，羧苄青霉素(500mg/L或者优选地， 100mg/L)或者TimentinTM(GlaxoSmithKline；优选以大约250-500mg/L 的浓度使用；TimentinTM是替卡西林二钠和克拉维酸钾的混合物；0.8g的 TimentinTM含有50mg克拉维酸和750mg的替卡西林。化学上，替卡西 林二钠是N-(2-羧基-3，3-二甲基-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]已-6-基)-3- 硫-苯丙酰胺酸(phenemalonamic acid)二钠盐。化学上，克拉维酸钾是 (Z)-(2R，5R)-3-(2-羟基亚乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚烷-2- 羧酸钾)。
2.4选择
农杆菌介导的技术通常导致基因递送进靶组织的非常有限的细胞中。 尤其是对于大豆而言，转化效率(没有选择)通常非常低。该问题通过本 文提供的基于D-丙氨酸和/或D-丝氨酸代谢酶的选择方案来解决。因此， 在共培养以及任选地恢复步骤(见下文)后，靶组织(例如腋生分生组织) 被转入选择培养基，并在其上孵育。
优选地，在共培养(步骤(b)或(b1))之后，在缺乏选择化合物 (以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物)的培养基上， 对新鲜经转化(共培养)的外植体进行大约1小时至大约10天的时间，优 选1天至8天，更优选大约4至大约7天的孵育。针对所述选择化合物的 可靠抗性水平的建立需要一定时间，以防止选择化合物甚至对经转化细胞 和组织造成不想要的损伤。因此，本发明的方法可包含共培养和选择之间 的步骤，其在没有选择化合物的情况下进行。在该恢复期间，枝条诱导(见 下文)可能已经启动。
选择培养基包含以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生 物(即，能终止或至少延迟未经转化细胞的生长的浓度)。术语“毒害植物”、 “植物毒性”或“植物毒性效果”在本文中使用时意指对植物或植物细胞生理 学的任何可测量到的负面影响，它们导致下述症状，包括(但不限于)例 如：降低的或受损的生长、降低的或受损的光合作用、降低的或受损的细 胞分裂、降低的或受损的再生(例如，从细胞培养物、愈伤组织或枝条等 的成熟植物再生)、降低的或受损的能育性等。植物毒性还可包括下述影 响，例如，坏死或凋亡。在一种优选的实施方式中，较之未用所述植物毒 性化合物处理的植物而言，导致生长或再生能力降低至少50％，优选至少 80％，更优选至少90％。
用于选择的特定化合物是根据表达何种标记蛋白质来选择的。例如， 当使用大肠杆菌D-丝氨酸解氨酶时，选择在包含D-丝氨酸的培养基上进 行。当使用瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶时，选择在包含D-丙氨酸和/或D- 丝氨酸的培养基上进行。
使用D-氨基酸的事实并不排除L-氨基酸结构或L-氨基酸的存在。对 于一些应用而言，应用D-氨基酸和L-氨基酸的外消旋混合物(或具有丰富 的D-氨基酸含量的混合物)可能是优选的(例如，就成本原因考虑)。优 选地，D-氨基酸与相应的L-对映异构体的比例为至少1∶1，优选2∶1，更优 选5∶1，最优选10∶1或100∶1。使用D-丙氨酸具有如下优点：D-丙氨酸和 L-丙氨酸的外消旋混合物可使用，而没有L-对映异构体的干扰或有害影 响。因此，在一种改进的实施方式中，使用D/L-丙氨酸的外消旋混合物作 为化合物。
术语“衍生物”在关于D-丙氨酸或D-丝氨酸的方面表示这样的化学化 合物，其包含D-丙氨酸或D-丝氨酸的各D-氨基酸结构，但是是经过化学 修饰的。在本文中使用时，术语“D-氨基酸结构”(例如，“D-丝氨酸结构”) 意欲包括D-氨基酸以及D-氨基酸的保持了化合物功能活性的类似物、衍 生物和模拟物。在本文中使用时，“衍生物”还表示D-丝氨酸或D-丙氨酸 的下述形式，其中，化合物上一个或多个反应基团被取代基衍生化。使用 的D-氨基酸可被氨基末端或羧基末端修饰基团修饰，或者通过对侧链的修 饰来修饰。氨基末端修饰基团可以，例如，选自苯乙酰基、二苯乙酰基、 三苯乙酰基、丁酰基、异丁酰基、已酰基、丙酰基、3-羟基丁酰基、4-羟 基丁酰基、3-羟基丙酰基(propionoyl)、2，4-二羟基丁酰基(butyroyl)、1-金 刚烷羰基、4-甲基戊酰基、2-羟基苯乙酰基、3-羟基苯乙酰基、4-羟基苯乙 酰基、3，5-二羟基-2-萘甲酰基、3，7-二羟基-2-萘甲酰基(napthoyl)、2-羟基 肉桂酰基、3-羟基肉桂酰基、4-羟基肉桂酰基、氢化肉桂酰基、4-甲酰基肉 桂酰基、3-羟基-4-甲氧基肉桂酰基、4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基、2-羧基肉 桂酰基、3，4，-二羟基氢化肉桂酰基、3，4-二羟基肉桂酰基、反式-肉桂酰基、 (±)-杏仁酰基(mandelyl)、(±)-杏仁酰基-(±)-杏仁酰基、乙醇酰基、3-甲酰基 苯甲酰基、4-甲酰基苯甲酰基、2-甲酰基苯氧基乙酰基、8-甲酰基-1-萘甲 酰基(napthoyl)、4-(羟甲基)苯甲酰基、3-羟基苯甲酰基、4-羟基苯甲酰 基、5-乙内酰脲基乙酰基、L-氢化乳清酰基(orotyl)、2，4-二羟基苯甲酰基、 3-苯甲酰基丙酰基(propanoyl)、(±)-2，4-二羟基-3，3-二甲基丁酰基、DL-3-(4- 羟基苯基)乳酰基、3-(2-羟基苯基)丙酰基、4-(2-羟基苯基)丙酰基、D-3-苯 基乳酰基、3-(4-羟基苯基)丙酰基、L-3-苯基乳酰基、3-吡啶基乙酰基、4- 吡啶基乙酰基、异烟酰基、4-喹啉羧基、1-异喹啉羧基和3-异喹啉羧基。 羧基末端修饰基团可以，例如，选自酰胺基团、烷基酰胺基团、芳基酰胺 基团和羟基基团。“衍生物”在本文中使用时意欲包括模拟各D-氨基酸的结 构并且保留了D-氨基酸结构的功能性质的分子。用于设计氨基酸或肽类似 物、衍生物和模拟物的手段是本领域已知的(例如，见，Farmer 1980；Ball 1990；Morgan 1989；Freidinger 1989；Sawyer 1995；Smith 1995；Smith 1994；Hirschman 1993)。其它可能的修饰包括N-烷基(或芳基)取代或 主链交联以构建内酰胺和其它环状结构。其它衍生物包括C-末端羟甲基衍 生物、O-修饰的衍生物(例如C-末端羟甲基二苄醚)、N-末端修饰的衍生 物，包括经取代的酰胺，例如，烷基酰胺和酰肼。此外，可以使用包含除 草剂化合物的D-氨基酸结构。此类化合物例如US 5,059,239中所述的，其 包括(但不限于)N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-DL-丙氨酸、N-苯甲酰基 -N-(3-氯-4-氟苯基)-DL-丙氨酸甲基酯、N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-DL- 丙氨酸乙基酯、N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-D-丙氨酸、N-苯甲酰基-N-(3- 氯-4-氟苯基)-D-丙氨酸甲基酯或N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-D-丙氨酸 异丙基酯。
选择化合物(以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物) 可与其它物质组合使用。就本申请的目的而言，选择化合物还可与传统上 用于配制领域的佐剂一起使用，因此，它们被以已知的方式配制为可乳化 的浓缩物、可包覆的糊剂、可直接喷雾或稀释的溶液、稀释乳剂、可润湿 的粉末、可溶的粉末、粉尘(dust)、颗粒以及在例如，聚合物物质中胶 囊化。根据待使用的组合物的性质，根据想要的目的和主要的环境，来选 择应用的方法(例如喷雾、雾化(atomising)、撒粉(dusting)、分散、包 覆或灌注)。但是，更优选地，将选择化合物直接应用到培养基。选择化 合物的贮液可在室温下制造和贮藏延长的时间而没有选择效率的损失是优 点所在。
选择化合物(即，D-丙氨酸、D-丝氨酸、其衍生物或其任何组合)的 最优浓度可根据用于转化的靶组织来变化，但是通常(以及，优选地，对 腋生分生组织的转化而言)，D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的总浓度(即， 当是混合物时，总和)在大约0.5mM至大约100mM的范围内。例如， 当使用大肠杆菌D-丝氨酸解氨酶时，选择在包含D-丝氨酸(例如，并入 经琼脂固化的MS培养基平板中)的培养基上进行，优选地，D-丝氨酸浓 度为大约0.5mM至大约100mM，优选大约1mM至大约70mM，更优 选大约2mM至大约50mM，最优选大约3mM至大约15mM。当使用 瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶时，选择在包含D-丙氨酸和/或D-丝氨酸(例 如，并入经琼脂固化的MS培养基平板中)的培养基上进行，优选地，D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸总浓度为大约0.5mM至大约100mM，优选大约1 mM至大约70mM，更优选大约2mM至大约50mM，最优选大约3mM 至大约15mM。优选地，D-丙氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使 用的话)以大约0.5mM至大约100mM的浓度使用，优选大约1mM至 大约70mM，更优选大约2mM至大约50mM，最优选大约3mM至大 约20mM。优选地，D-丝氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使用的 话)以大约0.5mM至大约100mM的浓度使用，优选大约1mM至大约 70mM，更优选大约2mM至大约50mM，最优选大约3mM至大约15 mM。
此外，选择时间也可以根据所用的靶组织和所采用的再生方案而变化。 选择压力(选择化合物的存在造成的)可被保持于整个再生过程(包括枝 条诱导、枝条延长和生根)中。
通常，选择时间为至少大约5天，优选至少大约14天。更特别地，在 去分化条件(即，愈伤组织或枝条诱导)下的总选择时间为大约1至大约 10周，优选大约3至7周，更优选大约3至4周。但是，优选地，在去分 化条件下的选择不超过70天。优选地，选择使用大约3至大约20mM D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸在去分化条件下进行大约3至4周。选择期之间，外 植体可被转移到新鲜的选择培养基中，这可发生一次或多次。对于本文提 供的特定方案而言，优选地，使用两次选择培养基步骤(例如，向新的选 择培养基中转移一次)。优选地，选择步骤以两步进行，第一选择步骤进 行大约14至20天，然后将存活的细胞或组织转移至与第一选择培养基具 有基本相同组成的第二选择培养基中，再培养额外的14至20天。但是， 也可以只应用单步骤的选择。D-氨基酸代谢酶的存在并不排除使用其它标 记。
2.5可育大豆植物的再生
共培养步骤(以及任选的恢复步骤)之后，在包含至少一种植物生长 因子的枝条诱导培养基上孵育经共培养的外植体。在枝条诱导培养基上进 行的所述孵育可在共培养步骤后立即开始(即，平行于用于抑制农杆菌生 长的步骤(b1))或在其它中间步骤，例如，(b1)(抑制农杆菌的生长) 和/或(b2)(没有选择化合物时的再生；见下文)之后开始。
用于枝条诱导(和/或枝条延长)的培养基优选补充有一种或多种植物 生长调控子，例如，细胞分裂素化合物(例如，6-苄氨基嘌呤)和/或生长 素化合物(例如，2，4-D)。术语“植物生长调控子”(PGR)在本文中使用 时表示：能调控植物生长和发育的天然存在的或合成的(非天然存在的) 化合物。PGR可单独作用，或与另一种一起作用，或与其它化合物(例如 糖、氨基酸)一起作用。术语“生长素”或“生长素化合物”包含刺激细胞延 长和分裂、维管组织分化、果实发育、不定根形成、乙烯产生和以高浓度 诱导去分化(愈伤组织形成)的化合物。最常用的天然存在的生长素是吲 哚乙酸(IAA)，其被指导转运进根和茎中。合成的生长素在现代农业中 广泛使用。合成的生长素化合物包含吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA) 和2，4-二氯苯氧乙酸(例如，2，4-D)。诱导枝条形成的化合物包括但不限 于IAA、NAA、IBA、细胞分裂素、生长素、激动素(kinetins)、草甘膦 和噻苯隆(thiadiazuron)。术语“细胞分裂素”或“细胞分裂素化合物”包含 刺激细胞分裂、子叶扩展和侧芽生长的化合物。它们延缓分离的叶的衰老， 并且与生长素(例如IAA)组合，可能影响根和枝条的形成。细胞分裂素 化合物包含，例如，6-异戊烯腺嘌呤(IPA)和6-苄基腺嘌呤/6-苄氨基嘌 呤(BAP)。
在本发明的一个实施方式中(尤其是对基于腋生分生组织的方法而 言)，步骤(b)(共培养)和/或(c)(枝条诱导和选择)中的至少一个 的培养基包含细胞分裂素(例如，6-苄氨基嘌呤(BAP))，优选浓度相 当于大约1μM至大约10μM 6-苄氨基嘌呤的浓度。对于枝条诱导培养基 而言，大约1至大约3μM的BAP浓度是优选的。优选地，BAP浓度不超 过5μM。
因此，在一种实施方式中，在共培养期间向培养基中加入一种或多种 植物激素或细胞分裂素。优选地，植物激素或细胞分裂素的浓度在0.1至 20微摩尔(microMolar)之间，更优选地，在1至10微摩尔之间。但是， 本领域技术人员知道，如何根据提供的数据来改变浓度以适应进行实验的 特定条件，例如，所用的培养基，孵育时间、温度、外植体的性质等。在 一种实施方式中，BAP具有例如在1左右至10左右的微摩尔范围内的浓 度，例如，7.5微摩尔左右。在一种实施方式中，使用激动素，优选地，1 微摩尔左右至10微摩尔左右的范围，例如1、3、5或7.5微摩尔左右。优 选的是1至8微摩尔的激动素，例如7.5微摩尔。
在另一优选的实施方式中，步骤(b)、(b1)、(b2)和/或(c)中 的至少一个的培养基包含细胞分裂素。
此外还尤其优选地，步骤(b)、(b1)、(b2)、(c)和/或(c1) 中至少一个，优选地，至少(b)和(c1)的培养基包含大约0.1μM至大 约2μM的赤霉酸(GA3)。
在另一优选的实施方式中，步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)中的 至少一个的培养基包含至少一种硫醇化合物，优选选自硫代硫酸钠、二硫 苏糖醇(DTT)和半胱氨酸。优选地，浓度为大约1mM至10mM L-半 胱氨酸、0.1mM至5mM DTT和/或0.1mM至5mM硫代硫酸钠之间。
在所述枝条诱导培养基上孵育外植体，直到枝条发育出来。形成的枝 条原基通常不超过0.3cm的尺寸。枝条原基的形成开始于在枝条诱导培养 基上1周左右，平均来说，此类枝条启动持续大约3至4周达到最大尺寸。 因此，经共培养的外植体在所述枝条诱导培养基上孵育大约2至6周，优 选大约3至4周。
如上文所讨论地，枝条诱导和随后的再生步骤优选在选择性条件(例 如，用大约3至100mM浓度的D-丝氨酸或D-丙氨酸补充枝条诱导培养 基、枝条延长培养基、生根培养基)下进行。
组织在该培养基中生长大约1至大约4周的时间，优选地，大约7天， 直到枝条发育出来。枝条形成开始于大约1至大约2周，这取决于处理和 共培养条件。
在一种优选的实施方式中，在转化前形成的所有枝条原基都将在共培 养后至多大约1周被除去，以刺激从分生组织进行新的生长。这有助于降 低初级转化体中的嵌合状态，以及增加转基因分生组织细胞的扩增 (amplification)。在该时期内，外植体可或可不被切为较小的块(即， 通过切上胚轴使得节与外植体分开)。
在SIM培养基(优选地，有选择)上2至4周后(或直到形成大量枝 条)，将外植体转移至枝条延长(SEM)培养基，其将刺激(枝条原基的) 枝条延长。该培养基可或可不含选择化合物，但是优选含选择化合物(例 如，大约3至大约20mM浓度的D-丝氨酸)。该组织在该培养基上生长 大约1至大约8周的时期。延长的枝条的频率和长度受SEM中激素水平， 特别是GA的影响。
在本发明的另一优选的实施方式中，步骤(c1)和/或(d)中至少一 个的培养基包含大约0.01mg/l(0.057M)至大约1mg/l(5.7μM)的吲哚 乙酸(IAA)和/或大约0.1μM至大约4μM的赤霉酸(GA3)和/或大约 0.5μM至大约6μM的反式-玉米素核苷酸(trans-zeatin riboside acid)。
优选地，每2至3周后，小心地除去死的组织后，将外植体转移至新 鲜的SEM培养基(优选地，含有选择化合物)。外植体应当保持在一起， 而不片段化为块，并且保持一定的健康。优选地，外植体将被继续转移， 直到外植体死亡或枝条延长。
转移至枝条延长培养基后大约4至8周，延长的枝条可被收获。可针 对表型规则性(regularity)和健康来对枝条进行评估，仅具有延长的茎(大 约1英寸或2cm)并且形成完整的具有三叶的叶的枝条才被收获。
将收集的枝条放到生根培养基上，以诱导根的形成。根的形成发生大 概1至4周，之后植物被转移至土壤，生长至完全成熟。生根培养基还可 (非排他性优选地)含有选择化合物。优选地，延长的枝条(长度大于3cm) 被除去，并被在根开始形成的时间放进生根培养基(RM)中大约1周(方 法B)，或者根据栽培种大约2至4周(方法C)。在具有根的外植体的 情况下，将它们直接转移进土壤。生根的枝条被转移至土壤，并在转入温 室前在生长室中硬化2-3周。使用该方法获得的再生的植物是可育的，每 株植物平均产生500粒种子。
通过该技术制造的T0植物是转基因植物，其通常以相当合理的产量被 回收。对于方法C而言，使用繁殖的腋生分生组织方案，大豆小植物的平 均再生时间为从外植体接种开始14周。因此，该方法具有快速的再生时间， 产生可育的、健康的大豆植物。
经转化的、表达标记基因的植物材料(例如细胞、组织或小植物)能 在存在能遏制未经转化的野生型组织生长的浓度的相应选择化合物时发 育。得到的植物可被用于育种，并以惯用的方式杂交。应当培养两代或更 多代，以确保基因组整合稳定并且是遗传性的。本发明的其它重要方面包 括通过公开的方法制备的转基因植物的后代以及源自此类后代的细胞和从 此类后代获得的种子。
本发明的另一实施方式涉及通过下文提供的方法制造的大豆细胞和植 物。因此，另一实施方式涉及包含下述DNA构建体的大豆植物或细胞， 所述DNA构建体包含在所述大豆植物或细胞中具有活性的启动子以及与 所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列， 其中，所述启动子相对所述酶编码序列来说是异源的。优选地，启动子和/ 或能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶如上文所定义。更优选地，所述大豆 植物或细胞还包含至少一个第二表达构建体，其向所述大豆植物赋予有农 业经济价值的性状。本发明的其它实施方式涉及所述大豆植物的部分，这 包括但不限于大豆种子(大豆)，以及涉及它们用于食物、饲料和工业目 的的用途。
在一种优选的实施方式中，大豆植物选自Jack、Resnik、Williams 82、 Corsoy、Crawford、Hutcheson、Kunitz和Champ。其它合适的大豆品种 可从研究和商业机构获得，例如，University of Guelph(Ontario Agricultural College；例如大豆品种RCAT Staples、Westag 97、RCAT Bobcat、OAC Prudence、OAC Woodstock、OAC 9908)；或来自Daryland 或Soygenetics的大豆品种。其它合适的品种是PI548402(Peking)、 PI437654(Er-hejjan)、PI438489(Chiquita)、PI507354(Tokei 421)、 PI548655(Forrest)、PI548988(Pickett)、PI88788、PI404198(Sun Huan Do)、PI404166(Krasnoaarmejkaja)、Hartwig、Manokin、Doles、Dyer 和Custer。
本发明的其它一些实施方式涉及本发明的大豆植物的部分、器官、细 胞、果实和其它繁殖材料。优选的部分选自组织、细胞、花粉、胚珠、根、 叶、种子、小孢子和营养部分。
得到的转基因植物可自花授粉或可与其它大豆植物杂交。收获T1种 子，干燥并适当贮藏，种子袋上加上适当的标签。应当培养两代或更多代， 以确保基因组整合稳定并且可遗传。例如，T1或T2代中的转基因事件应 当包括预先育种杂交程序，用于组合不同的转基因(基因堆积)。本发明 的其它重要方面包括通过公开的方法制备的转基因植物的后代以及源自此 类后代的细胞和从此类后代获得的种子。
2.6产生子代
转基因植物(包含本发明的DNA构建体)转化、选择和再生之后， 产生子代，因为切割启动子的活性，其经历切割，不包含标记序列和针对 内切核酸酶的表达盒。
子代可通过性繁殖或非性繁殖来产生。非性繁殖可通过本领域公知的 技术引入体细胞胚胎发生来实现。优选地，通过性繁殖/受精来产生子代。 受精可通过自交(自花授粉)或与其它转基因或非转基因植物杂交来实现。 本发明的转基因植物在本文中可作为母本或父本植物发挥作用。受精过程 后，收获种子，萌发，并生长为成熟植物。对子代的分离和鉴定(经历切 割过程)可在植物发育的任何阶段进行。用于此类鉴定的方法是本领域内 公知的，其可包含例如PCR分析、Northern印迹、Southern印迹或表型 筛选(例如，针对阴性选择标记)。
子代可包含农业经济价值性状基因的一个或多个拷贝。优选地，分离 仅包含一个拷贝的所述性状基因的子代。
此外，根据本发明还有源自上述转基因生物的细胞、细胞培养物、部 分(例如，在转基因植物生物的情况下，根、叶等)以及转基因繁殖材料 (例如种子或果实)。
根据本发明的经遗传修饰的、可被人或动物消耗的植物可用作为食物 或饲料，例如直接使用或对其进行本身已知的后续加工。在这方面，为了 消费者接受以及产品安全的理由，缺失例如对抗生素和/或除草剂的抗性 (产生转基因植物中通常引入的)。
本发明的另一主题涉及根据本发明的上述转基因生物和源自它们的细 胞、细胞培养物、部分(例如，在转基因植物生物的情况下，根、叶等) 以及转基因繁殖材料(例如种子或果实)用于生产食物或饲料、药物或精 细化学品的用途。精细化学品应当被理解为表示，酶、维生素、氨基酸、 糖、脂肪酸、天然和合成的香料(flavor)、芳香剂和着色剂。尤其优选的 是对生育酚或生育三烯酚的生产和对类胡萝卜素的生产。通过技术人员已 知的方法来进行对经转化的宿主生物的培养以及从宿主生物或从培养基分 离。药物(例如抗体或疫苗)的生产被描述过(例如，Hood 1999；Ma 1999)。
3.其它修饰
3.1反向选择和随后的标记缺失
优选地，可以以允许随后标记缺失的方式来构建D-氨基酸代谢酶的第 一表达构建体，尤其是当所述酶是D-氨基酸氧化酶时，其可被用于阴性选 择和反向选择(即，作为双功能标记)。当基于D-氨基酸氧化酶时，本发 明的方法可用作为组合的选择/标记缺失计划。基于所用的D-氨基酸，D- 氨基酸氧化酶可作为阴性或反向选择标记发挥作用。此类方法在PCT/EP 2005/002734(WO 2005/090581)中有详细描述，该文献通过引用整体并入本 文。
就此目的而言，第一表达盒优选侧翼有允许对所述第一表达盒加以特 异性缺失的序列。本发明的该实施方式利用D-氨基酸氧化酶(DAAO)作 为双功能标记发挥作用的性质，即，作为既允许(取决于所用的底物)作 为阴性选择标记又允许作为反向选择标记的标记。与D-氨基酸，例如D- 丝氨酸和D-丙氨酸(它们对植物具有高度的植物毒性，被D-氨基酸氧化 酶“去毒性”)相反，D-缬氨酸和D-异亮氨酸对野生型植物无毒，但是可被 表达D-氨基酸氧化酶DAAO的植物转化为毒性化合物。DAAO表达减轻 D-丝氨酸和D-丙氨酸的毒性但诱导使得D-异亮氨酸和D-缬氨酸具有毒性 的代谢变化这一发现表明在植物中该酶提供底物依赖性的、双功能可选择 标记。
因此，本发明的另一实施方式涉及一种方法，用于提供大豆细胞和植 物(优选不含标记)，所述方法包含下述步骤：
i)用第一DNA构建体转化大豆植物，所述DNA构建体包含：
a)至少一个第一表达构建体，其包含在所述大豆植物中具有活性的启 动子以及与所述启动子有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其 中，所述第一表达盒侧翼有允许特异性缺失所述第一表达盒的序列，以及
b)至少一个第二表达盒，其适合向所述植物赋予农业经济价值性状， 其中，所述第二表达盒不处于允许特异性缺失所述第一表达盒的所述序列 之间，以及
ii)用以植物毒性浓度的选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的第一 化合物处理步骤i)的所述经转化的大豆植物细胞，选出在其基因组中包含 所述第一DNA构建体的植物细胞，所述构建体向所述经转化的植物细胞 赋予通过表达所述D-氨基酸氧化酶的针对所述第一化合物的抗性，以及
iii)诱导所述第一表达盒从所述经转化的植物细胞的基因组缺失，以 及用对仍包含所述第一表达盒的植物细胞有毒的浓度的选自D-异亮氨酸、 D-缬氨酸及其衍生物的第二化合物来处理所述植物细胞，由此选出包含所 述第二表达盒但是缺少所述第一表达盒的植物细胞。
优选的启动子和D-氨基酸氧化酶序列如上文所述。
优选地，对第一表达盒的缺失可通过本领域已知的多种方法来实现， 这包括但不限于下述方法中的一种或多种：
a)序列特异性重组酶诱导的重组，其中，所述第一表达盒侧翼有相应 的重组位点，所述侧翼方式使得所述侧翼重组位点之间的重组导致其中间 的序列从基因组缺失；
b)所述第一表达盒侧翼的同源序列A和A’之间的同源重组，优选地， 通过序列特异性内切核酸酶导致的所述同源序列间的序列特异性双链断裂 (break)来诱导，其中，所述同源序列A和A’具有足够的长度和同源性， 以确保A和A’之间的同源重组，并且具有这样的定向，所述定向使得当A 和A’之间重组时，导致将所述第一表达盒从所述植物的基因组上切下来。
对于本领域技术人员来说，有多种手段可将缺失/切割诱导机制与本发 明的包含D-氨基酸氧化酶双功能选择标记的DNA构建体组合起来。优选 地，可用于本发明方法中的重组酶或内切核酸酶可由选自下述的方法来表 达：
a)将用于表达与植物启动子有效连接的重组酶或序列特异性内切核酸 酶的第二表达盒并入所述DNA构建体，优选地，与侧翼有允许特异性缺 失的所述序列的所述第一表达盒一起并入，
b)将用于表达与植物启动子有效连接的重组酶或序列特异性内切核酸 酶的第二表达盒并入用作为转化靶材料的植物细胞或植物中，由此产生主 细胞系(master cell line)或细胞，
c)将用于表达与植物启动子有效连接的重组酶或序列特异性内切核酸 酶的第二表达盒并入单独的DNA构建体，通过与所述第一DNA构建体共 转化进所述植物细胞的方式来对其进行转化，
d)将用于表达与植物启动子有效连接的重组酶或序列特异性内切核酸 酶的第二表达盒并入随后与包含本发明DNA构建体的植物杂交的植物或 植物细胞中。
在另一优选的实施方式中，可以以防止双功能标记被成熟前缺失/切割 的方式来诱导或活化缺失/切割诱导机制。优选地，因此，优选使用的序列 特异性重组酶或内切核酸酶的表达和/或活性可被诱导和/或活化，优选通过 选自下述的方法进行：
a)可诱导的表达，通过将编码所述重组酶或内切核酸酶的序列与可诱 导启动子有效连接来进行，
b)可诱导的活化，通过用包含配体结合结构域的经修饰重组酶或内切 核酸酶来进行，其中，可通过用与所述配体结合结构域有结合活性的化合 物进行处理来修饰所述经修饰的重组酶或内切核酸酶的活性。
优选地，本发明的方法因此产生不含选择标记的植物细胞或植物。
本发明的另一主题涉及适合用于本发明方法的DNA构建体。适合用 于本发明的DNA构建体优选包含：
a)第一表达盒，其包含与在大豆植物中具有活性的启动子(如上文所 定义；优选地，泛素启动子)有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列， 其中，所述第一表达盒侧翼有允许对所述第一表达盒进行特异性缺失的序 列，以及
b)至少一个第二表达盒，其适合用于向所述植物赋予有农业经济价值 的性状，其中，所述第二表达盒不位于允许对所述第一表达盒进行特异性 缺失的所述序列之间。
优选的启动子和D-氨基酸氧化酶序列如上文所描述。
为确保标记缺失/切割，本发明的DNA构建体中包含的针对D-氨基酸 氧化酶的表达盒(第一表达构建体)侧翼有针对序列特异性重组酶的重组 位点，所述侧翼方式使得所述侧翼重组位点之间诱导的重组导致所述第一 表达盒从基因组中缺失。优选地，允许对所述第一表达盒进行特异性缺失 的所述序列选自下述序列：
a)以一定方式排列的针对序列特异性重组酶的重组位点，所述排列方 式使得所述侧翼重组位点之间的重组导致其间的序列从基因组缺失，以及
b)同源序列A和A’，其具有足够的长度和同源性，以确保A和A’ 之间的同源重组，并且具有这样的定向：当在A和A’之间重组时，导致其 间的序列从基因组缺失。
优选地，构建体包含位于所述序列之间的针对序列特异性核酸酶的至 少一个识别位点，其允许对所述第一表达盒的特异性缺失(尤其对于上文 中的变体b而言)。
本领域已知多种重组位点和相应的序列特异性重组酶，它们可用于本 发明的目的。本领域技术人员已知用于定点去除重组引入的核酸序列的数 种系统。它们主要基于使用序列特异性重组酶来实现。多种序列特异性重 组系统已经被描述过，例如，噬菌体P1的Cre/lox系统(Dale1991；Russell 1992；Osborne 1995)、酵母FLP/FRT系统(Kilby 1995；Lyznik 1996)、 Mu噬菌体Gin重组酶、大肠杆菌Pin重组酶或质粒pSR1的R/RS系统 (Onouchi 1995；Sugita 2000)。基于attP位点和噬菌体λ重组酶的系统也 可使用(Zubko 2000)。此外，适于与本文公开的方法组合的方法被描述 于WO 97/037012和WO 02/10415中。
在一种优选的实施方式中，通过序列特异性双链断裂诱导的同源重组， 来进行双标记序列的缺失/切割。基本原理公开于WO 03/004659中，其通 过引用并入本文。就此目的而言，第一表达构建体(编码双功能标记)侧 翼有同源序列A和A’，其中，所述同源序列具有足够的长度和同源性，以 确保A和A’之间的同源重组，并且具有这样的定向：当在A和A’之间重 组时，导致第一表达盒从基因组切下。此外，所述同源序列侧翼的序列还 包含至少10个碱基对的至少一种识别序列，用于通过序列特异性的DNA 双链断裂诱导酶(优选地，序列特异性DNA内切核酸酶，更优选地，回 归内切核酸酶，最优选地，选自I-SceI、I-CeuI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI 和I-ChuI或其与配体结合结构域的嵌合体的内切核酸酶)定点引入DNA 双链断裂。
针对内切核酸酶或重组酶的表达盒(包含与植物启动子有效连接的序 列特异性重组酶或内切核酸酶)可被包括进本发明的DNA构建体。优选 地，所述第二表达盒与侧翼有允许特异性缺失的所述序列的所述第一表达 盒在一起。
在另一优选的实施方式中，所述序列特异性重组酶或内切核酸酶的表 达和/或活性可被诱导和/或活化，以避免在仍需要其作为阴性选择标记发挥 作用期间对双功能标记的成熟前缺失/切割。优选地，诱导/活化可通过选自 下述的方法来进行：
a)可诱导的表达，通过将编码所述重组酶或内切核酸酶的序列与可诱 导启动子有效连接来进行，
b)可诱导的活化，通过用包含配体结合结构域的经修饰重组酶或内切 核酸酶来进行，其中，可通过用与所述配体结合结构域具有结合活性的化 合物进行处理来修饰所述经修饰的重组酶或内切核酸酶的活性。
本发明的其它一些实施方式涉及包含本发明DNA构建体的转基因载 体。转基因细胞或非人生物包含本发明的DNA构建体或载体。优选地， 所述细胞或非人生物是具有农业用途的植物细胞或植物，优选地，植物。
本发明能够以可精确预测的方式、以高效率产生不含标记的转基因细 胞和生物，优选地，植物。
在上文关于一般性选择计划的上下文中，关于对化合物，浓度，应用 D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的模式的选择对反向选择步骤(ii)的优 先选择进行了描述。
为进行反向选择步骤(iii)，化合物选自包含D-异亮氨酸或D-缬氨酸 结构的化合物。更优选地，化合物选自D-异亮氨酸和D-缬氨酸。最优选 地，用于反向选择的化合物或组合物包含D-异亮氨酸。当通过细胞培养基 来应用时(例如，并入经琼脂固化的培养基平板中)，D-异亮氨酸可以以 大约0.5mM至大约100mM的浓度被使用，优选大约1mM至大约50 mM，更优选大约10mM至大约30mM。当通过细胞培养基来应用时(例 如，并入经琼脂固化的培养基平板中)，D-缬氨酸可以以大约1mM至大 约100mM的浓度被使用，优选大约5mM至大约50mM，更优选大约15 mM至大约30mM。
因此，使用上文所述的方法，可制造不含标记的大豆植物。术语“不含 标记”或“不含选择标记”在本文中关于细胞或生物的方面使用时意指不能 表达功能性选择标记蛋白(表达盒b编码的；如上文所定义的)的细胞或 生物，所述功能性选择标记蛋白与编码农业经济价值性状的基因组合插入 所述细胞或生物中。编码所述选择标记蛋白的序列可部分不存在，或者优 选整体不存在。此外，与其有效连接的启动子可通过部分或整体不存在来 失去功能。但是得到的植物可能包含可用作为选择比标记发挥功能的其它 序列。例如，植物可包含作为农业经济价值性状的除草剂抗性赋予基因。 但是，最优选地，得到的植物不包含任何选择标记。
本领域技术人员将从本文公开的内容显而易见本发明的多个其它方面 和实施方式。本申请文件中提到的所有文献都通过引用整体并入本文。下 面将举例并参照附图来阐述本发明的某些方面和实施方式。
3.2基因堆积
针对大豆的高效转化系统以及尤其是选择标记具有缺点。该缺点尤其 涉及依赖多次相继转化的手段。克服该问题的一种方法是上文提供的组合 的选择和标记缺失方法。另一方法基于对不同选择系统的组合。本发明的 方法和组合物允许相继转化。D-丝氨酸和/或D-丙氨酸代谢酶是相容的， 并且不干扰其它选择标记和选择系统。因此，可用本发明的构建体转化包 含另一选择标记的已有的转基因植物，或者随后用另一标记来转化通过本 发明的方法获得的植物(其包含D-丝氨酸和/或D-丙氨酸代谢酶的表达构 建体)。由此，本发明的另一实施方式涉及将至少两种DNA构建体相继 转化进大豆植物的方法，所述方法包括如下步骤：
a)用第一构建体转化，所述构建体包含至少一个表达构建体，其包含 在所述大豆植物中具有活性的启动子(优选地，上文定义的泛素启动子) 以及与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核 酸序列，以及
b)用第二构建体转化，所述构建体包含第二选择标记基因，其不赋予 针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
优选地，所述第二标记基因是阴性选择标记，其赋予对杀生物化合物 的抗性，所述杀生物化合物例如，(非D-氨基酸)代谢抑制物(例如，2- 脱氧葡萄糖-6-磷酸盐，WO 98/45456)、抗生素(例如卡那霉素、G418、 博来霉素或潮霉素)或除草剂(例如，膦丝菌素、磺酰脲型和咪唑啉酮型 除草剂或草甘膦)。实例是：
-膦丝菌素乙酰转移酶(PAT；也称为抗性；bar；de Block 1987；Vasil 1992，1993；Weeks 1993；Becker 1994；Nehra 1994；Wan& Lemaux 1994；EP 0333033；US 4,975,374)
-5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS) (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)，其赋予对 (N-(膦酰甲基)甘氨酸)的抗性(Shah 1986；Della-Cioppa 1987a，b)
降解酶(氧化还原酶；gox)
失活脱卤素酶(deh)
-磺酰脲型和/或咪唑啉酮型失活乙酰乳酸合酶(ahas或ALS；例如， 具有例如S4、XI12、XA17和/或Hra突变的突变的ahas/ALS变体)
降解腈水解酶(bxn)
-卡那霉素或遗传霉素(G418)抗性基因(NPTII；NPTI)，其编码 例如新霉素磷酸转移酶(Fraley 1983；Nehra 1994)
-潮霉素磷酸转移酶(HPT)，其介导对潮霉素的抗性(Vanden Elzen 1985)
-二氢叶酸还原酶(Eichholtz 1987)
多种时间计划可被用于多种阴性选择标记基因。当使用抗体基因(例 如，针对除草剂的)的情况下，优选地，在愈伤组织诱导期期间应用选择 大约4周，并且超过至少4周进入再生。此类选择计划可用于所有选择方 案。此外，还可(虽然并非排他性地优选地)在整个再生计划(包括生根) 期间保持选择。例如，用膦丝菌素抗性基因(bar，PAT)作为选择性标记 时，可在培养基中包括浓度为大约1至50mg/l的膦丝菌素或双丙氨膦。
优选地，所述第二标记赋予针对选自膦丝菌素、麦草畏、草甘膦、磺 酰脲型和咪唑啉酮型除草剂的至少一种化合物的抗性。
此外，所述方法的产物相对本领域本身就有新颖性和创造性。因此， 本发明的另一实施方式涉及大豆植物，其包含：
a)第一表达构建体，其包含在所述大豆植物中具有活性的启动子(优 选地，上文定义的泛素启动子)以及与所述启动子有效连接的编码能代谢 D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，以及
b)针对选择标记基因的第二表达构建体，所述选择标记基因不赋予针 对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
优选地，所述第二标记基因如上文所定义，其最优选赋予针对选自膦 丝菌素、麦草畏、草甘膦、磺酰脲型和咪唑啉酮型除草剂的至少一种化合 物的抗性。
下述组合是尤其优选的：
-用赋予针对膦丝菌素的抗性的选择标记进行第一次转化，接着用 dsdA选择标记基因进行第二次转化；
-用赋予针对膦丝菌素的抗性的选择标记进行第一次转化，接着用 dao1选择标记基因进行第二次转化；
-用dsdA选择标记基因进行第一次转化，接着用赋予针对膦丝菌素的 抗性的选择标记进行第二次转化；
-用dao1进行第一次转化，接着用赋予针对膦丝菌素的抗性的选择标 记进行第二次转化。
除了与用于不赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性的选择标记基因 的第二表达构建体堆积之外，此外还可堆积dsdA和dao1基因。例如，可 使用dsdA基因以及D-丝氨酸作为选择剂来进行第一次选择，随后可使用 dao1基因以及D-丙氨酸作为选择剂来进行第二次选择。因此，本发明的 另一实施方式涉及一种方法，所述方法用于将至少两种DNA构建体相继 转化进大豆植物，所述方法包括如下步骤：
a)用第一构建体转化，所述构建体包含表达构建体，其包含在所述大 豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码dsdA酶的 核酸序列，并且用D-丝氨酸进行选择，以及
b)用第二构建体转化，所述构建体包含表达构建体，其包含在所述大 豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码dao酶的核 酸序列，并且用D-丙氨酸进行选择。
此外，所述方法的产品被认为相对于本领域而言是具有新颖性和创造 性的。因此，本发明的另一实施方式涉及大豆植物，其包含：
a)第一构建体，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子(优选地，上文定义的泛素启动子) 以及与所述启动子有效连接的编码dsdA酶的核酸序列，以及
b)第二构建体，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子(优选地，上文定义的泛素启动子) 以及与所述启动子有效连接的编码dao酶的核酸序列。
更优选地，用于所述第一和所述第二表达构建体的启动子不相同或相 同。在包含两种表达盒的上述构建体中，优选地，在大豆植物中具有活性 的两种启动子不相同。优选地，一种启动子(例如，用于表达D-丙氨酸和 /或D-丝氨酸代谢酶的启动子)是上文定义的泛素启动子，而另一种启动子 是肌动蛋白启动子。
在本文公开的内容教导下，本文公开和要求保护的所有组合物和方法 都可以在不进行过度实验的情况下产生和执行。虽然本发明的组合物和方 法是以优选实施方式的形式被描述的，但是本领域技术人员显而易见：可 对本文所述的组合物、方法以及方法的步骤或步骤顺序加以变化，而并不 偏离本发明的概念、宗旨和范围。更具体地，显而易见：本文所述的物质 可被化学和生理学上相关的某些物质取代，但仍获得相同或相似的结果。 对于本领域技术人员而言显而易见的所有此类相似取代和修饰都落在由所 附权利要求界定的本发明的宗旨、范围和概念中。本申请文件中提到的所 有出版物和专利申请都代表了本发明所属领域技术人员的技术水平。所有 出版物和专利申请都通过引用并入本文，这与每篇单独的出版物或专利申 请被特别地、单独地指示为通过引用并入的程度是一样的。
此外，本发明涉及用于选择、再生、生长、培养或保持转基因大豆植 物细胞、转基因大豆植物组织、转基因大豆植物器官或转基因大豆植物或 其部分的组合物，其包含有效量的D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物，允许 对转基因大豆植物细胞、大豆植物组织、大豆植物器官或大豆植物或其部 分和转基因大豆生物、转基因大豆细胞、转基因细胞培养物、转基因大豆 植物和/或其部分加以选择，本发明还涉及包含源自位于第一组叶上的节的 一种或多种胚胎发生愈伤组织的细胞培养物，其包含总浓度为大约5mM 至10mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸。
本发明还涉及包含大豆靶组织和以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D- 丝氨酸或其衍生物的选择培养基。
本文中展示的启动子数据表明，欧芹泛素工作良好(2％TE)，ScBV 和具有内含子的ScBV(即，p-ScBV-iSuc UDP)以相似的效率(1.4％) 工作。大豆泛素也显示出好的效率(构建体RLM434；5％的转化效率；仅 60个外植体)。因此，例如，强组成型启动子与dsda或dao1组合使用。 强组成型启动子例如肌动蛋白2启动子、35S或19S启动子以及上文描述 的泛素启动子(例如，PcUbi或GmUbi启动子)或p-ScBV或p-ScBv-iSuc UDP启动子。nos或“超级启动子”也可能是合适的，特别是对于一些组织 特异性表达而言。因此，在一种实施方式中，本发明涉及下述构建体，其 包含与dsda或dao1基因有效连接的PcUbi启动子和/或包含与dsda或 dao1基因有效连接的p-ScBV或p-ScBv-iSuc UDP启动子。
序列
1.SEQ ID NO：1编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]的核苷酸 序列
2.SEQ ID NO：2编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]的氨基酸 序列
3.SEQ ID NO：3编码瘦弱红酵母(红冬孢酵母)D-氨基酸氧化酶的 核苷酸序列
4.SEQ ID NO：4编码瘦弱红酵母(红冬孢酵母)D-氨基酸氧化酶的 氨基酸序列
5.SEQ ID NO.5经密码子优化的、编码瘦弱红酵母(红冬孢酵母) D-氨基酸氧化酶的核苷酸序列
6.SEQ ID NO.6编码瘦弱红酵母(红冬孢酵母)D-氨基酸氧化酶的 氨基酸序列
7.SEQ ID NO：7欧芹(Petroselinum crispum)UBI4-2启动子，其 包含具有内部内含子(406-993)的5′非翻译区域的部分，总共996bp长。
8.SEQ ID NO：8大豆(Glycine max)泛素启动子，其包含具有内部 内含子(1519-2031)的5′非翻译区域的部分，总共2031bp长。
9.SEQ ID NO：9人工构建体：Bar-Selda二元载体RLM407：LB＞ ＜p-NOS::c-BAR::t-NOS p-PcUBI4-2::c-dsdA/na::t-NOS＞RB＞。
10.SEQ ID NO：10人工构建体：RLM274的T-DNA插入片段， RLM407-型Bar-GUS二元载体：LB＞＜p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
11.SEQ ID NO：11人工构建体：RLM254T-DNA插入片段， RLM407-型Selda-GUS二元载体的：LB＞＜p-sTPT::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
12.SEQ ID NO：12人工构建体：REW008的T-DNA插入片段， Bar-GUS二元载体：LB＞＜p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
13.SEQ ID NO：13人工构建体：RET063的T-DNA插入片段， RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞＜p-AtAct2i::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
14.SEQ ID NO：14人工构建体：RET019的T-DNA插入片段， RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞＜p-AtAct2i::c-dao1/pa::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
15.SEQ ID NO：15人工构建体：RET017的T-DNA插入片段， RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞＜p-NOS:c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
16.SEQ ID NO：16人工构建体：RET015的T-DNA插入片段， RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞＜p-NOS:c-dao1/ko::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
17.SEQ ID NO：17拟南芥肌动蛋白2启动子区域，其具有第一内含 子(955-1397)；总长度：1408个核苷酸。
实施例
除非另有指明，所有化学物都来自贝克梅林克罗克公司(Mallinckrodt Baker，Inc.)(Phillipsburg，NJ，USA)、植物技术实验室(Phytotechnology Laboratories)(Shawnee Mission，KS，USA)、EMD化学公司(EMD Chemicals，Inc.)(Gibbstown，NJ，USA)、阿尔法伊萨和西格玛公司(Alfa Aesar and Sigma)(St.Louis，MO，USA)。
A.用于培养基的贮液：
1.B5主要盐(10×贮液)
a.0.25M KNO3(硝酸钾)
b.0.01M CaCl2＊2H2O(氯化钙)
c.0.01M MgSO4＊7H2O(硫酸镁)
d.0.01M(NH4)2SO4(硫酸铵)
e.0.01M NaH2PO4＊H2O(磷酸钠)
2.B5次要盐(100×贮液)
a.5mM H3BO3(硼酸)
b.10mM MnSO4＊H2O(硫酸镁)
c.0.7mM ZnSO4＊7H2O(硫酸锌)
d.0.45mM KI(碘化钾)
e.0.1mM Na2MoO4＊2H2O(钼酸)
f.0.01mM CuSO4＊5H2O(硫酸铜)
g.0.01mM CoCl2＊6H2O(氯化钴)
3.B5维生素(100×贮液)
a.0.055M肌醇
b.0.8mM烟酸
c.0.5mM吡哆醇-HCl
d.3mM硫胺素-HCl
4.MS主要盐(10×贮液)
a.0.2M NH4NO3(硝酸铵)
b.0.2M KNO3(硝酸钾)
c.30mM CaCl2＊2H2O(氯化钙)
d.15mM MgSO4＊7H2O(硫酸镁)
e.12.5mM KH2PO4(磷酸钾)
5.MS次要盐(100×贮液)
a.10mM H3BO3(硼酸)
b.13mM MnSO4＊H2O(硫酸镁)
c.3mM ZnSO4＊7H2O(硫酸锌)
d.0.5mM KI(碘化钾)
e.0.1mM Na2MoO4＊2H2O(钼酸)
f.0.01mM CuSO4＊5H2O(硫酸铜)
g.0.01mM CoCl2＊6H2O(氯化钴)
6.MSIII铁(100×贮液)
a.10mM FeSO4＊7H2O(硫酸亚铁)
b.10mM C10H14O8Na2N2＊2H2O(NaEDTA)
B.培养基组成
除非下文另有指明，培养基可用于本发明方法的所有三种优选外植体 组织。
1.萌发培养基GM(固体)，在25×100mm培养皿或PlantconTM(西 格玛公司(Sigma))培养箱中：
a.1×B5主要盐，
b.1×B5次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.2％蔗糖，
e.1×B5维生素，
f.5uM BAP(任选的)，
g.0.8％经纯化的琼脂(西格玛公司(Sigma))；
h.pH 5.8。
2.YEP培养基(固体和液体)，在锥形瓶中，或15×100mm培养皿中：
a.10g/L细菌用蛋白胨(蒂夫科公司(Difco)；贝克特迪克森公司 (Becton Dickinson & Co.)，Cockeysville，MD，USA)，
b.5g/L酵母提取物(蒂夫科公司(Difco))，
c.5g/L NaCl，
d.用于选择的合适抗生素，
e.1.2％颗粒化琼脂(蒂夫科公司(Difco))仅固体；
f.pH 7.0。
3.繁殖培养基MODPROP(固体)，在25×100mm培养皿中(方法 C)
a.1×MS主要盐，
b.1×MS次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.1×B5维生素，
e.3％蔗糖
f.0.22至1.12mg/L(1μM至5μM)BAP(优选大约1μM)
g.0.8％经纯化的琼脂(西格玛公司(Sigma))
h.pH 5.8。
4.共培养培养基CCM(液体)：
a.1/10×B5主要盐，
b.1/10×B5次要盐，
c.1/10×MSIII铁，
d.1×B5维生素
e.3％蔗糖，
f.20mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES；MW＝213.26g/Mol)，
g.200μM乙酰丁香酮(AS)，
h.0.72μM至1.44μM GA3(赤霉酸；Mw＝346.38g/Mol)
i.BAP(6-苄氨基嘌呤；MW＝225.25g/mol)：7.5μM，
j.仅方法C：400mg/L L-半胱氨酸(3.3mM)(西格玛公司(Sigma))
k.pH 5.4。
5.共培养培养基CCM(固体)，在15×100mm的培养皿中：
a.1/10×B5主要盐，
b.1/10×B5次要盐，
c.1/10×MSIII铁，
d.1×B5维生素，
e.3％蔗糖，
f.20mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)
g.200μM乙酰丁香酮AS，
h.0.72μM至1.44μM GA3(赤霉酸；Mw＝346.38g/Mol)
i.BAP(6-苄氨基嘌呤；MW＝225.25g/mol)：7.5μM，
j.硫醇化合物，
(i).100至1000g/L L-半胱氨酸(MW＝121.16g/Mol；西格玛公司 (Sigma))；优选地：方法B和C：400mg/L L-半胱氨酸(3.3mM)； 方法A：1g/l(8.25mM)L-半胱氨酸
(ii).0至1mM或154.2mg/L DTT(费舍科学公司(Fisher Scientific)， Fair Lawn，NJ，USA)，
(iii).0至1mM无水硫代硫酸钠(158.1mg/L)或五水合硫代硫酸钠 245mg/L(梅林可多公司(Mallinckrodt)，Paris，KY，USA)，方法A：1 mM二硫苏糖醇，1mM硫代硫酸钠
k.0.5％经纯化的琼脂；
l.pH 5.4。
6.洗涤培养基Modwash(液体)：
a.1×B5主要盐，
b.1×B5次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.3％蔗糖，
e.1×B5维生素
f.30mM MES，
g.350mg/L TimentinTM
h.pH 5.6。
6.枝条诱导培养基SIM(液体)：
a.1×B5主要盐，
b.1×B5次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.1×B5维生素，
e.3％蔗糖，
f.3mM MES，
g.1μM至7.5μM(优选地1μM)BAP
h.250mg/L TimentinTM
i.0.8％经纯化的琼脂)
j.pH 5.6。
5.枝条诱导培养基SIM(固体)，在20×100mm培养皿中：
a.1×B5主要盐，
b.1×B5次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.1×B5维生素，
e.3％蔗糖，
f.3mM MES，
g.1μM至7.5μM(优选大约1μM)BAP
h.5μM激动素
i.250mg/L TimentinTM
j.合适的话，选择化合物，
k.0.8％经纯化的琼脂；
l.pH 5.6。
7.枝条延长培养基SEM(固体)，在20×100mm培养皿中，
a.1×MS主要盐，
b.1×MS次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.1×B5维生素，
e.3％蔗糖，
f.3mM MES，
g.50mg/L L-天冬酰胺(0.378mM)，
h.100mg/L L-焦谷氨酸(0.775mM)，
i.0.1mg/L IAA(0.57μM)，
j.0.5mg/L GA3(1.44μM)，
k.1mg/L反式玉米素核苷(2.85μM)，
l.250mg/L TimentinTM
m.合适的话，选择化合物，
n.0.8％经纯化的琼脂；
o.pH 5.6。
7.生根培养基RM(固体)，在25×100mm培养皿中或PlantconTM (西格玛公司(Sigma))培养箱中：
a.1/2×B5主要盐，
b.1/2×B5次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.2％蔗糖，
e.3mM MES，
f.1mg/L(5μM)吲哚丁酸(IBA，Mw＝203.24g/Mol)
g.0.8％经纯化的琼脂；仅方法C：250mg/L Timentin
h.pH 5.6。
实施例1：大豆种子的灭菌和萌发
几乎任何大豆品种的任何种子都可用于本发明的方法。数种大豆栽培 种(包括Jack、Williams 82和Resnik)对于大豆转化来说都是合适的。 在具有氯气的室中对大豆种子加以灭菌，所述氯气是通过向具有紧密盖紧 的瓶盖的干燥器中100ml漂白剂(5.25％次氯酸钠)滴加3.5ml 12N HCl 来产生的。在室中24至48小时后，移出种子，将大约18至20粒种子放 到固体GM培养基上，该培养基处于25×100mm培养皿中，其中有或没 有5μM 6-苄氨基嘌呤(BAP)。没有BAP的幼苗更加延长，根发育，尤 其是次生根和侧根形成。BAP通过形成更短矮粗的幼苗使得幼苗增强。
将在25℃光照(＞100μM/m2s)下生长的7天龄的幼苗用于三种外植 体类型的外植体材料。在该时间，种皮已裂开，具有具一小叶的叶的上胚 轴最小也生长到了子叶的长度。上胚轴应当至少0.5cm，以避免子叶节组 织(因为大豆栽培种和种子批次发育时间有变化，对萌发阶段的描述比对 特定萌发时间的描述更为精确)。
实施例2：农杆菌培养物的生长和制备
通过以下所述来制备农杆菌培养物：将携带想要的二元载体的农杆菌 (例如，根瘤农杆菌或发根农杆菌)划线到固体YEP生长培养基上，并在 25℃进行孵育，直到菌落出现(大约2天)。根据在Ti或Ri质粒、二元 载体和细菌染色体上存在的可选择标记基因，将使用不同的选择化合物来 用于YEP固体和液体培养基中进行根瘤农杆菌和发根农杆菌的选择。多种 农杆菌菌株可用于转化方法。
大致2天后，挑取单个菌落(用灭菌牙签进行)，接种50ml含抗生 素的液体YEP，在175rpm(25℃)下振荡，直到达到0.8-1.0的OD600 (大致2天)。制备用于转化的工作甘油贮液(15％)，将1ml的农杆菌 贮液装入1.5ml Eppendorf管作为等分试样，然后贮藏于-80℃。
外植体接种前一天，用5μl至3ml工作农杆菌贮液在500ml锥形瓶 中接种200ml YEP。在25℃振荡该瓶过夜，直到OD600在0.8至1.0之间。 在制备大豆外植体之前，通过在5500×g于20℃离心10分钟来沉淀农杆 菌。将沉淀重新悬浮于液体CCM中，至想要的密度(OD6000.5-2.0)，在 使用前放在室温下至少30分钟。
实施例3：外植体制备和共培养(接种)
幼苗在该时间已将上胚轴延长了至少0.5cm，但是通常在0.5至2cm 之间。已经成功使用了长至4cm的延长的上胚轴。然后制备外植体，其：
i)有或没有一些根，
ii)有部分、一片或两片子叶，所有预先形成的叶都被除去，包括顶端 分生组织，使用锋利的解剖刀切数下来损伤位于第一组叶(the first set of leaves)的节。
在所述节处进行的切割不仅诱导农杆菌感染，还使得腋生分生组织细 胞分散，以及破坏了预先形成的枝条。在损伤和制备之后，将外植体从培 养皿取出，随后与液体CCM/农杆菌混合物共培养30分钟。然后从液体 培养基中移出外植体，放到具有固体共培养培养基的15×100mm培养板上 的灭菌滤纸顶部。受到损伤的靶组织以使得它们与培养基直接接触的方式 被放置。
实施例4：枝条诱导
在黑暗下于25℃共培养3至5天后，将外植体用液体SIM培养基漂 洗(以除去过量的农杆菌)，之后放到固体SIM培养基上。放置大约5个 外植体，使得靶组织与培养基直接接触。在开始两个星期期间，可用或不 用选择性培养基来培养外植体。优选地，将外植体转移到无选择的SIM上 一周。
用3M微孔胶带(3M公司(3M)，St.Paul，Minnesota，USA)封住平 板，将其放进生长室中2周，温度平均为25℃，在70-100μE/m2s下以18 小时光照/6小时黑暗周期进行。针对该外植体已经测试了数种光强度和波 长、选择方案和SIM。外植体将在有或无选择的SIM培养基上保持，直到 在靶区域(例如，在上胚轴以上第一个节处的腋生分生组织)发生了从头 枝条生长。可在该时期内转移到新鲜的培养基上。大约一周之后，将外植 体从有或无选择的SIM转移到有选择的SIM上。在该时间，在幼苗外植 体的初生节上有相当的从头枝条发育。
优选地，在转化前形成的所有枝条都在共培养后至多2周被移出，以 刺激从分生组织的新的生长。这有助于降低初级转化体中的嵌合状态，以 及增加转基因分生组织细胞的扩增。在该时间期间，外植体可或可不被切 为更小的块(即，通过切上胚轴将节与外植体分开)。
实施例5：枝条延长
在SIM培养基(优选具有选择)上2至4周后(或者直到形成了大量 的枝条后)，将外植体转移进SEM培养基，这将刺激枝条原基的枝条延 长。该培养基可以含有或者可以不含选择化合物。
每2至3周后，在小心地除去死的组织之后，将外植体转移至新鲜的 SEM培养基(优选含有选择)。外植体应当保持到一起，不被片段化为小 块，并且保留一定的健康。外植体将被继续转移，直到外植体死亡或枝条 延长。＞3cm的延长的枝条被移出，并且放进RM培养基大约1周，此时 根开始形成。在具有根的外植体的情况下，将它们直接转移进土壤。生根 的枝条被转移至土壤，并在转入温室前在生长室中硬化2-3周。使用该方 法获得的再生的植物是可育的，每株植物平均产生500粒种子。
与根瘤农杆菌一起共培养5天后，在幼苗腋生分生组织外植体上广泛 分布有瞬时GUS表达，尤其是在外植体制备期间损伤的区域中。将外植体 放进没有选择的枝条诱导培养基中，以观察初生节是怎样应答枝条诱导和 再生的。目前为止，超过70％的外植体在该区域形成了新的枝条。在SIM 上14天之后，GUS基因的表达是稳定的，这暗示了T-DNA整合进了大豆 基因组。此外，初步实验在SIM上3周之后导致了GUS阳性枝条形成。
实施例6：在未经接种的幼苗腋生分生组织外植体上的杀伤曲线
在腋生分生组织外植体上进行D-丝氨酸对未经农杆菌感染的大豆组 织的毒性的杀伤曲线。按照实施例1所述制备三十个外植体，在含有0mM、 3μM、30μM、300μM、3mM、30mM或60mM D-丝氨酸的SIM上培 养总共4周。该时间后，对具有新的枝条原基(即，多条根的出现)的外 植体的百分比加以计算。在该实验中，观察到了3至30mM之间出现的再 生的降低，以及暴露给60mM D-丝氨酸时外植体的仅30％再生(图1)。
实施例7：D-丝氨酸对经农杆菌接种的幼苗腋生分生组织外植体的杀 伤曲线
在枝条诱导水平上，有或没有农杆菌感染的情况下，针对三种大豆栽 培种来进行D-丝氨酸选择幼苗腋生分生组织(SAM)的杀伤曲线。对于每 种栽培种而言，切下10个外植体并且用根瘤农杆菌菌株AGL1/pREW008 (没有dsdA基因对照)接种，用AGL1/pRET017(nosP-dsda-nosT)接 种10个外植体，5个外植体不予接种。共培养之后，将SAM外植体转移 到具有0、10、30、50或70mM D-丝氨酸的枝条诱导培养基上。枝条诱导 4周后，观察外植体的存活，发现D-丝氨酸的合适的选择水平为30至50 mM(图2)。
实施例8a：用D-丝氨酸对经接种的腋生分生组织外植体建立杀伤曲线
为建立枝条诱导和延长期间的有效选择水平，最初使用宽范围的D- 丝氨酸浓度。按照实施例1和3所述，从来自Dairyland栽培种98043的7 天龄的幼苗制备大豆腋生分生组织外植体。
按照实施例2所述，制备具有Super Vir pSB1质粒和含有二元质粒 pRET017或pREW008的发根农杆菌菌株SHA017。pRET017含有 nosP-c-dsdA/na-nosT和pPcUBI-gusINT-nosT(实施例9)。pREW008 含有nosP-bar-nosT和pPcUBI-gusINT-nosT，其被用作为对照载体(实施 例9)。
按照上文的实施例4所述来操作外植体。在没有选择的枝条诱导培养 基(SIM)上一周之后，将外植体转移至含有范围从0至15至30至45mM 的多种浓度的D-丝氨酸的SIM培养基中。孵育3和6周后，所有再生外 植体(枝条垫(shoot pad))被转移至含有3mM D-丝氨酸的枝条延长培 养基(SEM)。延长中的枝条被转移至生根培养基(RM)，通过GUS表 达和Taqman分析进行筛选。
表1：在枝条诱导(SIM)培养基中3周之后，在多种D-丝氨酸浓度 上再生的每个构建体的外植体百分比
SIM 中的 0mM 15mM 30mM 45mM
D-Ser REW008 79.0 76.9 55.3 21.9 RET017 74.4 78.1 61.2 25.5
表2：在枝条延长(SEM)+3mM D-丝氨酸中3周之后，存活的每个 构建体的外植体的百分比
SIM 中的 D-Ser 0mM 15mM 30mM 45mM REW008 94.7 72.1 34.5 2.6 RET017 82.8 74.1 33.6 4.9
枝条诱导培养基中D-丝氨酸的增加水平减少了再生和形成枝条垫的 外植体的百分比(图3)。形成的枝条垫的大小随着D-丝氨酸水平的增加 而减少。此外，棕色易碎愈伤组织的形成随着增加D-丝氨酸浓度而增加。 在枝条诱导期间，枝条垫形态在含dsdA(RET017)和对照(REW008) 构建体之间几乎观察不到区别(图3)。在枝条诱导期间，来自30或45mM D-Ser的这些外植体上在3mM D-Ser时没有枝条延长。枝条诱导期间，少 数枝条从暴露给15mM D-Ser的外植体延长(数据未示出)。在实验期间 进行的GUS测定显示了在枝条诱导培养基中3周后，从pRET017和 pREW008产生的枝条垫中的GUS阳性片区(sector)。在枝条诱导期间 于15mM D-丝氨酸上形成的并在枝条延长时被转至3mM D-丝氨酸的少 数延长的枝条上，GUS测定和Taqman(uidA和dsdA)分析都是阴性的。 在枝条诱导期间以比15mM D-丝氨酸更高的浓度孵育后没有观察到延长 的枝条。
实施例8b：使用初生节外植体的D-丙氨酸和D-丙氨酸/D-丝氨酸杀伤 曲线
使用dao1作为可选择标记基因，进行更多的实验来研究具有和不具有 7.5mM D-丝氨酸时D-丙氨酸选择的杀伤曲线。还针对代谢D-丙氨酸和 D-丝氨酸的dao1基因，用D-丙氨酸和D-丝氨酸的组合来进行研究。用二 元质粒RET019(Pactin-dao1，Pubi-gus)和REW008(Pnos-bar，Pubi-gus) 分别作为阳性和阴性对照，使用发根农杆菌菌株SHA017pSB1，将T-DNA 移到大豆中。
用农杆菌接种外植体，共培养5天，然后移到有或没有选择的枝条诱 导培养基上一周。在该时间后，将外植体转移到新的具有选择的SIM上。
在实验1中，向SIM培养基中加入下述浓度的D-丙氨酸：0、3、7.5、 10、20、30和50mM。
在实验2中，加入相同浓度的D-丙氨酸和7.5mM的D-丝氨酸。
实验设计如下所示：T(处理)1：用REW008接种且1周恢复的7 个外植体；T2：用REW008接种且无恢复的7个外植体；
实验结果示于表2b中。再生频率不会下降70％以下，直到外植体在 共培养之后立即暴露给30mM D-丙氨酸。这种降低在具有恢复的外植体上 看不到，直到使用了20mM的D-丙氨酸。当与D-丝氨酸组合时，外植体 在更低的浓度——7.5至10mM之间再生确实降低。
表2b：采用相应处理时，基于在SIM上3周后的再生的D-丙氨酸杀 伤曲线的结果。
实验1：在SIM上3周后，D-丙氨酸杀伤曲线——再生(％)
实施例9：用于评估dsdA和dao1基因的转化载体
制造数种含有dsdA或dao1基因的转化载体。包含bar选择标记的构 建体在转化实验中被用作为对照(表3)。使用pSUN3二元载体作为背景， 开发大多数载体(除了pLM407和pLM274，它们具有Gateway背景)(表 3)。DSDA蛋白质仅用D-丝氨酸作为底物，而DAO1蛋白质能酶促氧化 更宽范围的D-氨基酸，例如D-Ser和D-Ala。
表3：在建立用dsdA和dao1基因作为选择标记的转化中，对用于实 验的转化载体的描述。EcdsdA＝大肠杆菌dsdA；dao 1＝D-氨基酸氧化 酶基因；bar＝膦丝菌素乙酰转移酶；p-PcUbi4-2＝欧芹ubi启动子； STPT＝来自拟南芥的丙糖磷酸易位蛋白；pNos＝胭脂碱合酶启动子； p-AtACT＝拟南芥肌动蛋白启动子；t-OCS3′＝OCS3′终止子；t-NOS＝nos 终止子。
载体 SEQ ID NO： LB-选择标记 报道基因/选择标记-RB pRET017 15 p-Nos::EcdsdA::t-NOS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS pRLM407 9 p-PcU bi4-2::EcdsdA::t- OCS p-Nos::bar::t-NOS pRET063 13 p-AtAct::EcdsdA::t-OCS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS pET019 14 p-AtAct::dao 1/ko::t-OCS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS RET015 16 p-Nos::dao1/ko p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS pLM254 11 p-STPT::EcdsdA::t-OCS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS pLM274 10 p-Nos::bar::t-NOS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS pREW008 12 p-Nos::bar::t-NOS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS
对于pRLM407(gateway背景)而言，pRLM274是对照，而对于所 有其余构建体(pSUN3背景)而言，pREW008是对照。
实施例10a：当在不同启动子下使用dsdA或dao1基因时D-丝氨酸选 择的影响。
按照实施例1和3所述，从来自Dairyland栽培种93061的7天龄的 幼苗制备大豆腋生分生组织外植体。
按照实施例2所述，制备具有Super Vir pSB1质粒和含有表3所述的 二元质粒的发根农杆菌菌株SHA017。
按照实施例4所述来操作外植体。在没有选择的枝条诱导培养基 (SIM)上一周之后，将外植体转移至含有7.5mM的D-丝氨酸的SIM中。 孵育3和6周后，所有再生外植体(枝条垫)被转移至含有5mM D-丝氨 酸的枝条延长培养基(SEM)。延长中的枝条被转移至生根培养基(RM)， 通过GUS表达和/或Taqman分析进行筛选。
如表4所示，欧芹泛素启动子驱动dsdA基因的表达更为高效。基于 对uidA报道基因的基因表达分析已知，欧芹泛素启动子在大豆腋生幼苗 中是高度组成型的启动子。当使用dsdA基因时，拟南芥肌动蛋白启动子 也能向大豆细胞赋予表达抗性水平，但是效率要比欧芹泛素启动子低得多 (表4)。当使用在NOS或STPT启动子控制下的dsdA基因时，没有获 得转基因枝条。当使用dao1/ko基因时，拟南芥肌动蛋白和NOS启动子能 向大豆细胞赋予抗性水平。在该情况下，NOS启动子和dao1/ko基因的组 合看起来较之At肌动蛋白::dao1/ko有高两倍的效率。
表4对在D-丝氨酸选择下对用不同启动子驱动dsdA和dao1基因的 构建体进行评估的转化实验的概括
载体 SEQ ID NO： 标记描述 #外植体 #延长的 枝条 阳性 枝条的#* RET017 15 p-Nos::EcdsdA 455 17 0 RLM407 9 p-PcU bi4-2::EcdsdA 672 38 24 RET063 13 p-AtAct::EcdsdA 268 29 1 RET019 14 p-AtAct::dao 1/ko 597 58 4 RLM254 11 p-STPT::EcdsdA 306 44 0 RET015 16 p-Nos::dao 1/ko 284 N/A 4 REW008 12 p-Nos::bar 426 5 0 RLM274 10 p-Nos::bar 228 0 0
＊基于GUS或dsdA Taqman分析的阳性枝条
对于RLM407(gateway背景)而言，RLM274是对照，而对于所有 其余构建体(pSUN3背景)而言，pREW008是对照。
看起来大豆需要高度组成型启动子，以用dsdA选择系统来选择转基 因植物。欧芹泛素启动子的使用导致产生了比通常用于双子叶植物的其它 启动子(例如拟南芥肌动蛋白或STP启动子)一致更高的转化效率。较之 这些启动子，欧芹泛素启动子的转化效率显著更高。已知，最优选择需要 选择标记在靶组织(其之后去分化，再生为转基因植物)的相关细胞中在 正确的时间以正确的浓度表达。
实施例10b：SELDA选择和启动子-dsda组合
在转化方案中测试了驱动dsda基因的启动子对转化效率的影响。用4 种启动子-dsda组合(处理)，RLM407，RLM431，RLM432，RLM433 来完成具6次重复随时间进行的实验(2位研究者来进行切割实验)，每 种处理最少50个外植体(表4a)。在2份重复中，包括RLM254，在一 份重复中，包括RLM434。制备外植体，将其随机分进6种处理之一(发 根农杆菌菌株SHA017/pSB1中携带的质粒)，进行30分钟。接种之后， 将外植体在固体共培养培养基(含有5μM激动素)上于黑暗中共培养5 天。按照上文所述，采用D-丝氨酸选择方案进行流程：无选择的枝条诱导 一周，在具有7.5mM D-丝氨酸的枝条诱导培养基上3周，然后在枝条延 长期间5mM D-丝氨酸。每个外植体仅一个枝条被移出，以消除克隆的再 生。使用定量PCR(TaqMan)针对dsda基因的存在对假定转化体加以验 证，使用下式计算转化效率(TE)：[(dsda阳性的、TaqMan验证的独立 事件的数量/接种的外植体的总数(n))＊100]。
从测试的所有启动子-dsda组合恢复转基因事件(表4b)。含有泛素 -dsda组合，RLM407和RLM434的构建体在该研究中给出了最高的转化 效率。
表4a.用于在6个构建体中驱动dsda基因的启动子
表4b.用不同启动子-dsda组合和D-丝氨酸选择接种的外植体的转化 效率。
实施例11：比较两种可选择标记：dsdA和bar
进行转化实验，以比较采用两种转化系统的转化效率，所述系统即 dsdA/D-丝氨酸、bar/膦丝菌素(表5)。二元载体LM407携带两种可选 择标记dsdA和bar，它们分别受到pPcUbi和pNos启动子下。载体LM274 具有受到pNos启动子控制下的bar基因，并且其已经成功地与膦丝菌素 选择组合与大豆腋生转化方法一起使用。
按照实施例1和3所述，从来自Dairyland栽培种93061的7天龄的 幼苗制备大豆腋生分生组织外植体。
按照实施例2所述，制备具有Super Vir pSB1质粒和含有表3所述的 二元质粒的发根农杆菌菌株SHA017。
按照实施例4所述来操作外植体。在没有选择的枝条诱导培养基 (SIM)上一周之后，将外植体转移至含有从7.5mM的D-丝氨酸或3mg/l 膦丝菌素的SIM中。在SIM中孵育3周后，所有再生外植体(枝条垫) 被转移至含有5mM D-丝氨酸或5mg/l膦丝菌素的枝条延长培养基(SEM) 中。延长中的枝条被转移至生根培养基(RM)，通过Taqman分析进行 筛选。
表5：比较评估两种构建体和两种选择系统
载体 标记描述 感染 的外 植体 选择 独立+ 延长的枝 条 GH中 的独立 事件 TE (％) pRLM407 (SEQ ID NO：9) p-PcUbi4-2::EcdsdA /pNos::bar 220 D-丝 氨酸 10 8 3.6 pRLM407 p-PcUbi4-2::EcdsdA /pNos::bar 170 PPT 5 2 1.2
当使用D-丝氨酸选择，使用相同的构建体pRLM407时，获得转化效 率两倍的增加。但是，值得注意，这代表小量的用于转化的外植体。
实施例11：SELDA选择和共培养激素
在第一项实验中，实验设计包括随着时间的10份重复(3位研究者来 进行切割实验)，其中每份重复采用4种不同的共培养培养基(处理)， 每种处理最少50个外植体。按照前文所述来制备固体共培养，除了用下述 四种激素之一来代替激素BAP：7.5μM BAP、1.0μM激动素、5.0μM激 动素或7.5μM激动素。
在第二项实验中，实验设计包括随着时间的3份重复(1位研究者来 进行切割实验)，其中每份重复采用5种不同的共培养培养基(处理)， 每种处理最少50个外植体。通过用下述五种激素之一来代替BAP：7.5μM BAP、1.0μM激动素、3μM激动素、5μM激动素或7μM激动素，来制 备固体共培养。
对于两项实验，制备外植体，用50ml液体共培养培养基(含有携带 载体RLM407的SHA017/pSB1)接种30分钟，然后将其分别随机放到4 或5种固体共培养培养基处理之一上。按照上文所述，采用D-丝氨酸选择 方案进行流程：无的枝条诱导一周，在具有7.5mM D-丝氨酸的枝条诱导 培养基上3周，然后在枝条延长期间5mM D-丝氨酸。每个外植体仅一个 枝条被移出，以消除克隆的再生。使用定量PCR(TaqMan)针对dsda 基因的存在对假定转化体加以验证，使用下式计算转化效率(TE)：[(dsda 阳性的、TaqMan验证的独立事件的数量/接种的外植体的总数(n))＊100]。
在两项实验中，从测试的所有处理恢复转基因事件(表6和7)。此 外，激动素在共培养培养基中的存在导致产生比在存在BAP时共培养外植 体的情况更高的平均转化效率。
表6：在含有4种不同激素方案的共培养培养基上共培养的外植体的 转化效率。
表7：在含有5种不同激素方案的共培养培养基上共培养的外植体的 转化效率。
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169.US 5,059,239
170.US 5,100,792
171.US 5,225,341
172.US 5,352,605
173.US 5,510,474
174.US 5,605,793
175.US 5,608,152；
176.US 5,683,439
177.US 5,811,238
178.US 5,830,721
179.US 5,837,458
180.US2001034888
181.US2005102711
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208.WO 91/13980
209.WO 92/09696
210.WO 93/01294
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224.WO 99/32619
225.WO 99/53050
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序列表
<110>巴斯福植物科学有限公司(BASF Plant Science GmbH)
<120>对大豆的D-氨基酸选择
<130>AE 20051280/PF 57689
<160>17
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>1329
<212>DNA
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<220>
<221>CDS
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<400>1
atg gaa aac gct aaa atg aac tcg ctc atc gcc cag tat ccg ttg gta 48
Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val
1 5 10 15
aag gat ctg gtt gct ctt aaa gaa acc acc tgg ttt aat cct ggc acg 96
Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr
20 25 30
acc tca ttg gct gaa ggt tta cct tat gtt ggc ctg acc gaa cag gat 144
Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp
35 40 45
gtt cag gac gcc cat gcg cgc tta tcc cgt ttt gca ccc tat ctg gca 192
Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala
50 55 60
aaa gca ttt cct gaa act gct gcc act ggg ggg att att gaa tca gaa 240
Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu
65 70 75 80
ctg gtt gcc att cca gct atg caa aaa cgg ctg gaa aaa gaa tat cag 288
Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln
85 90 95
caa ccg atc agc ggg caa ctg tta ctg aaa aaa gat agc cat ttg ccc 336
Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro
100 105 110
att tcc ggc tcc ata aaa gca cgc ggc ggg att tat gaa gtc ctg gca 384
Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala
115 120 125
cac gca gaa aaa ctg gct ctg gaa gcg ggg ttg ctg acg ctt gat gat 432
His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp
130 135 140
gac tac agc aaa ctg ctt tct ccg gag ttt aaa cag ttc ttt agc caa 480
Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln
145 150 155 160
tac agc att gct gtg ggc tca acc gga aat ctg ggg tta tca atc ggc 528
Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly
165 170 175
att atg agc gcc cgc att ggc ttt aag gtg aca gtt cat atg tct gct 576
Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala
180 185 190
gat gcc cgg gca tgg aaa aaa gcg aaa ctg cgc agc cat ggc gtt acg 624
Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr
195 200 205
gtc gtg gaa tat gag caa gat tat ggt gtt gcc gtc gag gaa gga cgt 672
Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg
210 215 220
aaa gca gcg cag tct gac ccg aac tgt ttc ttt att gat gac gaa aat 720
Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn
225 230 235 240
tcc cgc acg ttg ttc ctt ggg tat tcc gtc gct ggc cag cgt ctt aaa 768
Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys
245 250 255
gcg caa ttt gcc cag caa ggc cgt atc gtc gat gct gat aac cct ctg 816
Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu
260 265 270
ttt gtc tat ctg ccg tgt ggt gtt ggc ggt ggt cct ggt ggc gtc gca 864
Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala
275 280 285
ttc ggg ctt aaa ctg gcg ttt ggc gat cat gtt cac tgc ttt ttt gcc 912
Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala
290 295 300
gaa cca acg cac tcc cct tgt atg ttg tta ggc gtc cat aca gga tta 960
Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu
305 310 315 320
cac gat cag att tct gtt cag gat att ggt atc gac aac ctt acc gca 1008
His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala
325 330 335
gcg gat ggc ctt gca gtt ggt cgc gca tca ggc ttt gtc ggg cgg gca 1056
Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala
340 345 350
atg gag cgt ctg ctg gat ggc ttc tat acc ctt agc gat caa acc atg 1104
Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met
355 360 365
tat gac atg ctt ggc tgg ctg gcg cag gaa gaa ggt att cgt ctt gaa 1152
Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu
370 375 380
cct tcg gca ctg gcg ggt atg gcc gga cct cag cgc gtg tgt gca tca 1200
Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser
385 390 395 400
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Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn
405 410 415
acc act cat ctg gtg tgg gcg acg gga ggt gga atg gtg ccg gaa gaa 1296
Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu
420 425 430
gag atg aat caa tat ctg gca aaa ggc cgt taa 1329
Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Arg
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<213>大肠杆菌
<400>2
Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val
1 5 10 15
Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr
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Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp
35 40 45
Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala
50 55 60
Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu
65 70 75 80
Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln
85 90 95
Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro
100 105 110
Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala
115 120 125
His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp
130 135 140
Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly
165 170 175
Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala
180 185 190
Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr
195 200 205
Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg
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Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn
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Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys
245 250 255
Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu
260 265 270
Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala
275 280 285
Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala
290 295 300
Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu
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His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala
325 330 335
Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala
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Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met
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Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu
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Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser
385 390 395 400
Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn
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Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu
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<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1107)
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<400>3
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Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
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Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
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cca tgg gct ggc gcg aat tgg acg cct ttc atg acg ctt aca gac ggt 192
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50 55 60
cct cga caa gca aaa tgg gaa gaa tcg act ttc aag aag tgg gtc gag 240
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cca aat tac cgc ccc ctc cca tct tcc gaa tgt cca cct ggc gct atc 384
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Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
225 230 235 240
gga gac tgg gac ttg tct gtc aac cca gag acg gtc cag cgg atc ctc 768
Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
245 250 255
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tag 1107
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<400>4
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Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
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<210>5
<211>1104
<212>DNA
<213>红冬孢酵母
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1104)
<223>红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶[dao1]cds，
[Genbank#U60066].最优密码子
<400>5
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Met His Ser Gln Lys Arg Mal Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly
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ctt tct tct gct ctt ata ctt gca cgc aag ggc tat tct gtt cat att 96
Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
20 25 30
ttg gca cgc gat ctc cca gag gac gta tct agc caa act ttc gct tcc 144
Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
35 40 45
ccc tgg gct ggt gcg aat tgg aca cca ttt atg aca ttg act gac ggc 192
Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly
50 55 60
cct aga cag gca aaa tgg gaa gag agt acc ttt aaa aaa tgg gtt gag 240
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
65 70 75 80
ttg gtc cct acc gga cat gct atg tgg ctg aag gga act cgt cgc ttt 288
Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
85 90 95
gca cag aat gaa gac ggc ttg ctt gga cat tgg tac aaa gat ata acc 336
Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr
100 105 110
ccg aat tac cgc ccc ctt ccc tcg tct gaa tgt cca cca ggc gca att 384
Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
115 120 125
ggc gtg act tat gac aca ctc tct gta cac gct cct aaa tat tgt cag 432
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln
130 135 140
tat ctt gcc aga gaa ctt cag aaa ctc ggt gca act ttt gaa aga cgg 480
Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg
145 150 155 160
acg gtt acc tca ctg gaa cag gca ttc gac ggt gca gac ctc gtg gtg 528
Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val
165 170 175
aat gca aca gga ctg gga gca aag agc ata gca ggc ata gat gat caa 576
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln
180 185 190
gct gcg gag cca att aga ggc cag acc gtg ctg gta aaa tca cca tgc 624
Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys
195 200 205
aaa aga tgt acg atg gat agt agt gac cca gcg agt cca gct tat att 672
Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile
210 215 220
ata ccg aga ccg ggt ggc gaa gtt ata tgc gga gga act tac gga gtg 720
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
225 230 235 240
ggt gat tgg gat ctt agc gtt aac ccc gaa aca gtc caa cgg att ctg 768
Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
245 250 255
aag cat tgc ctc cgc ctt gac cca acc ata tca tct gac gga acc att 816
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
260 265 270
gag gga atc gaa gta ctt agg cat aat gtt ggt ctt agg ccc gct cgt 864
Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
275 280 285
aga gga gga cca cgt gta gaa gct gag aga att gta ttg ccc ctc gat 912
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp
290 295 300
aga acc aaa agc ccc ctt tcg ctt gga aga gga agc gca cgt gca gct 960
Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala
305 310 315 320
aag gaa aaa gaa gtc aca ctg gta cat gca tat ggt ttt agt agt gcc 1008
Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala
325 330 335
gga tat cag caa tca tgg ggt gct gca gaa gat gtt gct cag ttg gtg 1056
Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val
340 345 350
gac gag gca ttc caa aga tac cac ggt gca gcg aga gag tca aaa ctt 1104
Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu
355 360 365
<210>6
<211>368
<212>PRT
<213>红冬孢酵母
<400>6
Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly
1 5 10 15
Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
20 25 30
Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
35 40 45
Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly
50 55 60
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
65 70 75 80
Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
85 90 95
Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr
100 105 110
Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
115 120 125
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln
130 135 140
Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg
145 150 155 160
Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln
180 185 190
Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys
195 200 205
Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile
210 215 220
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
225 230 235 240
Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
245 250 255
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
260 265 270
Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
275 280 285
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp
290 295 300
Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala
325 330 335
Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val
340 345 350
Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu
355 360 365
<210>7
<211>996
<212>DNA
<213>欧芹(Petroselinum crispum)
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(996)
<223>具有内部内含子的MTX欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白的#PCCUBI42欧芹(P.crispum)基因
Pcubi4-2有99％同源。
<220>
<221>内含子
<222>(406)..(993)
<223>MTX欧芹UBI4-2启动子的内部内含子；与多聚遍在蛋白的#PCCUBI42欧芹(P.crispum)基因
Pcubi4-2有99％同源。
<400>7
cttgactaga gaattcgaat ccaaaaatta cggatatgaa tataggcata tccgtatccg 60
aattatccgt ttgacagcta gcaacgattg tacaattgct tctttaaaaa aggaagaaag 120
aaagaaagaa aagaatcaac atcagcgtta acaaacggcc ccgttacggc ccaaacggtc 180
atatagagta acggcgttaa gcgttgaaag actcctatcg aaatacgtaa ccgcaaacgt 240
gtcatagtca gatcccctct tccttcaccg cctcaaacac aaaaataatc ttctacagcc 300
tatatataca accccccctt ctatctctcc tttctcacaa ttcatcatct ttctttctct 360
acccccaatt ttaagaaatc ctctcttctc ctcttcattt tcaaggtaaa tctctctctc 420
tctctctctc tctgttattc cttgttttaa ttaggtatgt attattgcta gtttgttaat 480
ctgcttatct tatgtatgcc ttatgtgaat atctttatct tgttcatctc atccgtttag 540
aagctataaa tttgttgatt tgactgtgta tctacacgtg gttatgttta tatctaatca 600
gatatgaatt tcttcatatt gttgcgtttg tgtgtaccaa tccgaaatcg ttgatttttt 660
tcatttaatc gtgtagctaa ttgtacgtat acatatggat ctacgtatca attgttcatc 720
tgtttgtgtt tgtatgtata cagatctgaa aacatcactt ctctcatctg attgtgttgt 780
tacatacata gatatagatc tgttatatca ttttttttat taattgtgta tatatatatg 840
tgcatagatc tggattacat gattgtgatt atttacatga ttttgttatt tacgtatgta 900
tatatgtaga tctggacttt ttggagttgt tgacttgatt gtatttgtgt gtgtatatgt 960
gtgttctgat cttgatatgt tatgtatgtg cagccc 996
<210>8
<211>2031
<212>DNA
<213>大豆(Glycine max)
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(999)
<223>大豆遍在蛋白基因的假定启动子区域TATA框：950-964
<220>
<221>TATA_signal
<222>(950)..(964)
<223>假定TATA框
<220>
<221>内含子
<222>(1519)..(2031)
<223>位于5’UTR内的第一内含子
<400>8
aaatgaaaga aaaaggtatt cacgctctta aaataaatta gtaagcagaa attccaaaat 60
tttcagttag tccttactaa ttattaaatt atagtattaa tccaatgtga ttgcggttac 120
atcatgtacg gaaaaataat tctaatcctt gatttaaatt tgatcttgac tatttattta 180
ttctttattt cattttgtaa atcattttat gtatctcctg gcaagcaatt ttatccacct 240
tgcaccaaca ccttcgggtt ccataatcaa accaccttaa cttcacacca tgctgtaact 300
cacaccgccc agcatctcca atgtgaaaga agctaaaatt taataaacaa tcatacgaag 360
cagtgacaaa ataccagatg gtattaatgc tttgataaaa ttaattggaa agtataaaat 420
ggtagaaaat aataaattat aattaattta aataagataa aaaataatta aaaactaaaa 480
tgttaaaatt ttaaaaaaat tattttaaat aatatttaaa aacattaaaa atcattttaa 540
aaaatttatt tatagaacaa ttaaataaat atttcagcta ataaaaaaca aaagcttacc 600
tagccttaga agacaacttg tccaacaatt agatgatacc cattgccctt acgttttctt 660
taacatcaat tattgttttt gtcaacaagc tatcttttag ttttatttta ttggtaaaaa 720
atatgtcgcc ttcaagttgc atcatttaac acatctcgtc attagaaaaa taaaactctt 780
ccctaaacga ttagtagaaa aaatcattcg ataataaata agaaagaaaa attagaaaaa 840
aataacttca ttttaaaaaa atcattaagg ctatattttt taaatgacta attttatata 900
gactgtaact aaaagtatac aatttattat gctatgtatc ttagagaatt acttataaaa 960
atctacggaa gaatatctta caaagtgaaa aacaaatgag aaagaattta gtgggatgat 1020
tatgatttta tttgaaaatt gaaaaaataa ttattaaaga ctttagtgga gtaagaaagc 1080
tttcctatta gtcttttctt atccataaaa aaaaaaaaaa aaatctagcg tgacagcttt 1140
tccatagatt ttaataatgt aaaatactgg tagcagccga ccgttcaggt aatggacact 1200
gtggtcctaa cttgcaacgg gtgcgggccc aatttaataa cgccgtggta acagataaag 1260
ccaagcgtga agcggtgaag gtacatctct gactccgtca agattacgaa accgtcaact 1320
acgaaggact ccccgaaata tcatctgtgt cataaacacc aagtcacacc atacatgggc 1380
acgcgtcaca atatgattgg agaacggttc caccgcatat gctataaaat gcccccacac 1440
ccctcgaccc taatcgcact tcaattgcaa tcaaattagt tcattctctt tgcgcagttc 1500
cctacctctc ctttcaaggt tcgtagattt cttctgtttt tttttcttct tctttattgt 1560
ttgttctaca tcagcatgat gttgatttga ttgtgttttc tatcgtttca tcgattataa 1620
attttcataa tcagaagatt cagcttttat taatgcaaga acgtccttaa ttgatgattt 1680
tataaccgta aattaggtct aattagagtt tttttcataa agattttcag atccgtttac 1740
agcaagcctt aattgttgat tctgtagtcg tagattaagg tttttttcat gaactacttc 1800
agatccgtta aacaacagcc ttatttgttg atacttcagt cgtttttcaa gaaattgttc 1860
agatccgttg ataaaagcct tattcgttga ttctgtatgg tatttcaaga gatattgctc 1920
aggtccttta gcaactacct tatttgttga ttctgtggcc atagattagg attttttttc 1980
acgaaattgc ttcttgaaat tacgtgatgg attttgattc tgatttatct t 2031
<210>9
<211>10096
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>Bar-Selda二元载体RLM407：LB＞＜p-NOS::c-BAR::t-NOS
p-PcUBI4-2::c-dsdA/na::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1Ti质粒(来自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界
(完全)。
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316pCambia2301bin载体类似
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(527)..(1078)
<223>BAR基因CDS的互补序列；与膦丝菌素乙酰转移酶的#SHBARPA吸水链霉菌(Streptomyces
hygroscopicus)bar基因100％同源。
<220>
<221>启动子
<222>(1092)..(1379)
<223>来自胭脂碱合酶基因的启动子的互补序列(Depicker等人1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)
EMBL no：V00087.
<220>
<221>启动子
<222>(1746)..(2741)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(2826)..(4154)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶[dsdA]基因/CDS；来自QC78-6/SUH405.
[GenBank J01603]
<220>
<221>终止子
<222>(4230)..(4482)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4564)..(4710)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4647)..(4670)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4875)..(5669)
<223>nptII基因/CDS；赋予卡那霉素抗性；与#AY181092合成构建体S1启动子-nptII基因-S3终止子
盒99％同源。
<220>
<221>复制起点
<222>(5967)..(6648)
<223>ColEI复制起点
<220>
<221>复制起点
<222>(7057)..(9651)
<223>pVS1复制起点
<400>9
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggtcaa atctcggtga 540
cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt 600
catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga 660
gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct 720
tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg 780
tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc 840
gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga 900
gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg 960
gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg 1020
ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggctcatgg 1080
cgcgccagat ctggattgag agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta 1140
tggaacgtca gtggagcatt tttgacaaga aatatttgct agctgatagt gaccttaggc 1200
gacttttgaa cgcgcaataa tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa 1260
acccgcggct gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc 1320
ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatct 1380
tgatcccctg cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg 1440
cttcccaacc ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa 1500
aaccgcccag tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc 1560
gcttgcgttt tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg 1620
tttctgcgga ctggctttct acgtgttccg cttcctttag cagcccttgc gccctgagtg 1680
cttgcggcag cgtgaagctt gctatcaact ttgtatcgaa aagttggctc cgaattcgcc 1740
cttagcttga ctagagaatt cgaatccaaa aattacggat atgaatatag gcatatccgt 1800
atccgaatta tccgtttgac agctagcaac gattgtacaa ttgcttcttt aaaaaaggaa 1860
gaaagaaaga aagaaaagaa tcaacatcag cgttaacaaa cggccccgtt acggcccaaa 1920
cggtcatata gagtaacggc gttaagcgtt gaaagactcc tatcgaaata cgtaaccgca 1980
aacgtgtcat agtcagatcc cctcttcctt caccgcctca aacacaaaaa taatcttcta 2040
cagcctatat atacaacccc cccttctatc tctcctttct cacaattcat catctttctt 2100
tctctacccc caattttaag aaatcctctc ttctcctctt cattttcaag gtaaatctct 2160
ctctctctct ctctctctgt tattccttgt tttaattagg tatgtattat tgctagtttg 2220
ttaatctgct tatcttatgt atgccttatg tgaatatctt tatcttgttc atctcatccg 2280
tttagaagct ataaatttgt tgatttgact gtgtatctac acgtggttat gtttatatct 2340
aatcagatat gaatttcttc atattgttgc gtttgtgtgt accaatccga aatcgttgat 2400
ttttttcatt taatcgtgta gctaattgta cgtatacata tggatctacg tatcaattgt 2460
tcatctgttt gtgtttgtat gtatacagat ctgaaaacat cacttctctc atctgattgt 2520
gttgttacat acatagatat agatctgtta tatcattttt tttattaatt gtgtatatat 2580
atatgtgcat agatctggat tacatgattg tgattattta catgattttg ttatttacgt 2640
atgtatatat gtagatctgg actttttgga gttgttgact tgattgtatt tgtgtgtgta 2700
tatgtgtgtt ctgatcttga tatgttatgt atgtgcagcc cggatcaagg gcgaattcga 2760
cccaagtttg tacaaaaaag caggctggcg cgccggatcc tcatctaagc gcaaagagac 2820
gtactatgga aaacgctaaa atgaactcgc tcatcgccca gtatccgttg gtaaaggatc 2880
tggttgctct taaagaaacc acctggttta atcctggcac gacctcattg gctgaaggtt 2940
taccttatgt tggcctgacc gaacaggatg ttcaggacgc ccatgcgcgc ttatcccgtt 3000
ttgcacccta tctggcaaaa gcatttcctg aaactgctgc cactgggggg attattgaat 3060
cagaactggt tgccattcca gctatgcaaa aacggctgga aaaagaatat cagcaaccga 3120
tcagcgggca actgttactg aaaaaagata gccatttgcc catttccggc tccataaaag 3180
cacgcggcgg gatttatgaa gtcctggcac acgcagaaaa actggctctg gaagcggggt 3240
tgctgacgct tgatgatgac tacagcaaac tgctttctcc ggagtttaaa cagttcttta 3300
gccaatacag cattgctgtg ggctcaaccg gaaatctggg gttatcaatc ggcattatga 3360
gcgcccgcat tggctttaag gtgacagttc atatgtctgc tgatgcccgg gcatggaaaa 3420
aagcgaaact gcgcagccat ggcgttacgg tcgtggaata tgagcaagat tatggtgttg 3480
ccgtcgagga aggacgtaaa gcagcgcagt ctgacccgaa ctgtttcttt attgatgacg 3540
aaaattcccg cacgttgttc cttgggtatt ccgtcgctgg ccagcgtctt aaagcgcaat 3600
ttgcccagca aggccgtatc gtcgatgctg ataaccctct gtttgtctat ctgccgtgtg 3660
gtgttggcgg tggtcctggt ggcgtcgcat tcgggcttaa actggcgttt ggcgatcatg 3720
ttcactgctt ttttgccgaa ccaacgcact ccccttgtat gttgttaggc gtccatacag 3780
gattacacga tcagatttct gttcaggata ttggtatcga caaccttacc gcagcggatg 3840
gccttgcagt tggtcgcgca tcaggctttg tcgggcgggc aatggagcgt ctgctggatg 3900
gcttctatac ccttagcgat caaaccatgt atgacatgct tggctggctg gcgcaggaag 3960
aaggtattcg tcttgaacct tcggcactgg cgggtatggc cggacctcag cgcgtgtgtg 4020
catcagtaag ttaccaacag atgcacggtt tcagcgcaga acaactgcgt aataccactc 4080
atctggtgtg ggcgacggga ggtggaatgg tgccggaaga agagatgaat caatatctgg 4140
caaaaggccg ttaataacgt ttcaacgcag catggatcgt accgagctcc tgcagggggg 4200
acccagcttt cttgtacaaa gtggagctcg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct 4260
taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 4320
ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 4380
ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 4440
aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcggccggcc aactttatta 4500
tacatagttg ataagcgatc gcagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctactag 4560
atctgattgt cgtttcccgc cttcagttta aactatcagt gtttgacagg atatattggc 4620
gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt agaataatcg gatatttaaa agggcgtgaa 4680
aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtc catgtgtttt atggacagca agcgaaccgg 4740
aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg 4800
ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag atctgatcaa gagacaggat 4860
gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg 4920
tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg 4980
tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg 5040
ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc 5100
cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 5160
aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatccc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 5220
tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 5280
aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg 5340
atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg 5400
cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 5460
tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 5520
accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 5580
gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 5640
tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttgaaaaagg aagaatgcat gaccaaaatc 5700
ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5760
tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5820
ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5880
ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5940
ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 6000
gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 6060
aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 6120
acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 6180
gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 6240
gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 6300
cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 6360
aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 6420
gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 6480
cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg 6540
atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc 6600
agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg 6660
actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 6720
gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 6780
agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcaggg tgccttgatg tgggcgccgg 6840
cggtcgagtg gcgacggcgc ggcttgtccg cgccctggta gattgcctgg ccgtaggcca 6900
gccatttttg agcggccagc ggccgcgata ggccgacgcg aagcggcggg gcgtagggag 6960
cgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgc agctcttcgg ctgtgcgctg gccagacagt 7020
tatgcacagg ccaggcgggt tttaagagtt ttaataagtt ttaaagagtt ttaggcggaa 7080
aaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtc acttacatgt gtgaccggtt cccaatgtac 7140
ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt acggctttgg gttcccaatg 7200
tacgtgctat ccacaggaaa gagacctttt cgaccttttt cccctgctag ggcaatttgc 7260
cctagcatct gctccgtaca ttaggaaccg gcggatgctt cgccctcgat caggttgcgg 7320
tagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgc cccgcctcct ccttcaaatc gtactccggc 7380
aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga acttcttgaa ctctccggcg 7440
ctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaac aaccatctgg cttctgcctt gcctgcggcg 7500
cggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccg atgccgggat cgatcaaaaa gtaatcgggg 7560
tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct cgcggtacat ccaatcagct 7620
agctcgatct cgatgtactc cggccgcccg gtttcgctct ttacgatctt gtagcggcta 7680
atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt tcttggcctt cttcgtacgc 7740
tgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccga atgcaggttt ctaccaggtc gtctttctgc 7800
tttccgccat cggctcgccg gcagaacttg agtacgtccg caacgtgtgg acggaacacg 7860
cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca tggattcggt tagatgggaa 7920
accgccatca gtaccaggtc gtaatcccac acactggcca tgccggccgg ccctgcggaa 7980
acctctacgt gcccgtctgg aagctcgtag cggatcacct cgccagctcg tcggtcacgc 8040
ttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatg atgctgcgac tatcgcgggt gcccacgtca 8100
tagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgc tcgtcgccct tgggcggctt cctaatcgac 8160
ggcgcaccgg ctgccggcgg ttgccgggat tctttgcgga ttcgatcagc ggccgcttgc 8220
cacgattcac cggggcgtgc ttctgcctcg atgcgttgcc gctgggcggc ctgcgcggcc 8280
ttcaacttct ccaccaggtc atcacccagc gccgcgccga tttgtaccgg gccggatggt 8340
ttgcgaccgc tcacgccgat tcctcgggct tgggggttcc agtgccattg cagggccggc 8400
agacaaccca gccgcttacg cctggccaac cgcccgttcc tccacacatg gggcattcca 8460
cggcgtcggt gcctggttgt tcttgatttt ccatgccgcc tcctttagcc gctaaaattc 8520
atctactcat ttattcattt gctcatttac tctggtagct gcgcgatgta ttcagatagc 8580
agctcggtaa tggtcttgcc ttggcgtacc gcgtacatct tcagcttggt gtgatcctcc 8640
gccggcaact gaaagttgac ccgcttcatg gctggcgtgt ctgccaggct ggccaacgtt 8700
gcagccttgc tgctgcgtgc gctcggacgg ccggcactta gcgtgtttgt gcttttgctc 8760
attttctctt tacctcatta actcaaatga gttttgattt aatttcagcg gccagcgcct 8820
ggacctcgcg ggcagcgtcg ccctcgggtt ctgattcaag aacggttgtg ccggcggcgg 8880
cagtgcctgg gtagctcacg cgctgcgtga tacgggactc aagaatgggc agctcgtacc 8940
cggccagcgc ctcggcaacc tcaccgccga tgcgcgtgcc tttgatcgcc cgcgacacga 9000
caaaggccgc ttgtagcctt ccatccgtga cctcaatgcg ctgcttaacc agctccacca 9060
ggtcggcggt ggcccatatg tcgtaagggc ttggctgcac cggaatcagc acgaagtcgg 9120
ctgccttgat cgcggacaca gccaagtccg ccgcctgggg cgctccgtcg atcactacga 9180
agtcgcgccg gccgatggcc ttcacgtcgc ggtcaatcgt cgggcggtcg atgccgacaa 9240
cggttagcgg ttgatcttcc cgcacggccg cccaatcgcg ggcactgccc tggggatcgg 9300
aatcgactaa cagaacatcg gccccggcga gttgcagggc gcgggctaga tgggttgcga 9360
tggtcgtctt gcctgacccg cctttctggt taagtacagc gataaccttc atgcgttccc 9420
cttgcgtatt tgtttattta ctcatcgcat catatacgca gcgaccgcat gacgcaagct 9480
gttttactca aatacacatc acctttttag acggcggcgc tcggtttctt cagcggccaa 9540
gctggccggc caggccgcca gcttggcatc agacaaaccg gccaggattt catgcagccg 9600
cacggttgag acgtgcgcgg gcggctcgaa cacgtacccg gccgcgatca tctccgcctc 9660
gatctcttcg gtaatgaaaa acggttcgtc ctggccgtcc tggtgcggtt tcatgcttgt 9720
tcctcttggc gttcattctc ggcggccgcc agggcgtcgg cctcggtcaa tgcgtcctca 9780
cggaaggcac cgcgccgcct ggcctcggtg ggcgtcactt cctcgctgcg ctcaagtgcg 9840
cggtacaggg tcgagcgatg cacgccaagc agtgcagccg cctctttcac ggtgcggcct 9900
tcctggtcga tcagctcgcg ggcgtgcgcg atctgtgccg gggtgagggt agggcggggg 9960
ccaaacttca cgcctcgggc cttggcggcc tcgcgcccgc tccgggtgcg gtcgatgatt 10020
agggaacgct cgaactcggc aatgccggcg aacacggtca acaccatgcg gccggccggc 10080
gtggtggtaa cgcgtg 10096
<210>10
<211>6600
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RLM274的T-DNA，RLM407-型Bar-GUS二元载体：LB＞
＜p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316 pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(527)..(1078)
<223>BAR基因/CDS的互补序列；与膦丝菌素乙酰转移酶的#SHBARPA吸水链霉菌bar基因99％同源；来
自QC25-3/EW105。
<220>
<221>启动子
<222>(1092)..(1379)
<223>来自胭脂碱合酶基因的启动子的互补序列(Depicker等人1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)
EMBL no：V00087.
<220>
<221>启动子
<222>(1822)..(2817)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(2843)..(4843)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(4914)..(5166)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(5252)..(5397)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(5292)..(5315)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>10
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggaatc ccgccctaca 540
acttcgactc ccgcgccgcg ccgtggtacc gctggaacgc ctcgtcgacg agctgcgcga 600
catcctccgc cgcgccccaa ctctgctggt atcccgcact cgagaagcca tacgcatgca 660
caagcgtgac ctccttctcc ttcgccgctc gtgcgctgcc cctgccgagc gagaggggcg 720
actttgtccg gtcgagaggc aggacgatcc gttctgcctc aacgcggggt ccgcctcgtc 780
gtgcaggtcg caagccgacg ttgtggcgga ggacctcgat gccttcgatc gttccgtcgc 840
tcgagatggt cgggtcgagg cgcaagcagt gcttgaggat ccgctggacc gtctctgggt 900
tgacagacaa gtcccagtct cccacgccgt acgtcccgcc gcagatgact tcgccacctg 960
gtcggggaat gatgtaggcg ggagaagcgg ggtcggacga gtccatcgtg catcgcttgc 1020
atggggactt gacgaggacg gtttgcccgc ggattggctc ggcggcttgg tcgtcgatgc 1080
ccgcaatcga cttggcgcca agtcccgtag cgttgaccac caaatccgca ccgtcgaacg 1140
cctgctcaag cgacgtaacg gtccgtctct caaacgtcgc gccgagcttc tgcagctctc 1200
ttgcaaggta ctggcagtac tttggtgcgt ggacggagag ggtgtcgtag gttacgccga 1260
tagcgccagg tggacattcg gaagatggga gggggcggta atttggcgtg atgtccttgt 1320
accagtgccc gagcaagccg tcttcgttct gcgcgaaccg cctcgtcccc ttgagccaca 1380
tggcatggcc cgtcgggacc aactcgaccc acttcttgaa agtcgattct tcccattttg 1440
cttgtcgagg accgtctgta agcgtcatga aaggcgtcca attcgcgcca gcccatggtg 1500
aagcgaaagt ctggctcgag acgtcctccg gcaagtcgcg cgcgagaata tgcacgctgt 1560
agcccttccg agcgaggatg agggcgctgc tcagaccgat aacgcctgat ccgaggacaa 1620
cgacgcgctt ctgcgagtgc atggtggccc gggatccggc gcgccttttt tttatgagct 1680
gcaaacacac aaaaagagtt caatacagtc aaataaaccc tgattgaatc agaaatagct 1740
ttctgttcaa cgtacgacac tacaaatcct aaagtttcga agaatctata cacaaacttc 1800
atctaacctt aaacagtgtt cagattcaat ctaacattga cagtgttcag attcaatcta 1860
acttcaacag ttcagatttc aattcacata tacaaatcat ttcccaggta acatgaacat 1920
ggatctctcc atcaaggtca agccaaattc tggtagctat aatcgagcta actgatcggt 1980
caacttagat cgattctagt aaaaccaaaa gatttagtgg aggttcacag atccaaatta 2040
aacgaattcc agatctcaag gaaattgaga aaacaagatc gagatccagc aaataaagta 2100
gatccagaaa gttcctatta ccttggaaag aaagagcgga agaagatgag attgaggaag 2160
attcaaaacg gagaatgaat ctcctggatt atctcttact ttctctctta gtcttcttcc 2220
ttgttcttct ctgtcaagtc gccggagatt caaaacggct gatgaaagtg aggaggacaa 2280
cgagacaatt caaagcggag aggaaaatat atgaatttat ataggcgggt ttatctctta 2340
caactttatt ttcggccttt caaaaaaata attaaaatcg acagacacga atcatttcga 2400
ccacaggtaa agataacgtg acctggctgt cagacagcct tttccctcgt gttaactaat 2460
ttttaaacta attaatcatc tcagcccttg gattagttct tttgctttga tggcttcatg 2520
actgtgacct gctcgatccg cgtgttacat gacagctccg tttttttagt ggttaactta 2580
aaccgagtca atccaggcaa cgttagtcgt cgtcgtggtt ggcttgttca attagatttc 2640
atacaattca acgtaattta attcgttttc tattagaatt gtatcataat taattcagac 2700
cgtgaaagaa agtgtctttc atgatgtgtt tatggatatt tatacaataa gatacaatgt 2760
ttcatcatat tcactattca cgattagtat gtacattaaa taatggctac tactacatcc 2820
gaactcgtca aaacgattct gaatcaatta tacatatgct gactcttgca tacataaaaa 2880
atagttgttt aaattttgtc taactaatgt ttggtataag tataatgttg agttgagata 2940
ccaattacat cgagtctagc cattttgtcg tgccatattc gtcaaaactt tcttacataa 3000
tgataaccta gatctagatg agatatgtat caatgtattt gagatcataa ttaagttcgt 3060
tctaaatttt gtcgaaacca acgcaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg 3120
atatgaatat aggcatatcc gtatccgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac 3180
aattgcttct ttaaaaaagg aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca 3240
aacggccccg ttacggccca aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact 3300
cctatcgaaa tacgtaaccg caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcaccgcct 3360
caaacacaaa aataatcttc tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt 3420
ctcacaattc atcatctttc tttctctacc cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc 3480
ttcattttca aggtaaatct ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta 3540
ggtatgtatt attgctagtt tgttaatctg cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc 3600
tttatcttgt tcatctcatc cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct 3660
acacgtggtt atgtttatat ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt 3720
gtaccaatcc gaaatcgttg atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca 3780
tatggatcta cgtatcaatt gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac 3840
atcacttctc tcatctgatt gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt 3900
tttttattaa ttgtgtatat atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt 3960
tacatgattt tgttatttac gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga 4020
cttgattgta tttgtgtgtg tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag 4080
cccggatctc cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga 4140
aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg 4200
tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt 4260
taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg 4320
cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt 4380
cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta 4440
tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt 4500
tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta atataatatt 4560
tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagttta 4620
taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc 4680
aggtatcacc gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt 4740
gattaccgac gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc 4800
cggaatccat cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac 4860
cgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc 4920
caatggtgat gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca 4980
aggcactagc gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta 5040
tctctatgaa ctgtgcgtca cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg 5100
cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt 5160
ctactttact ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa 5220
cgtgctgatg gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac 5280
ctcgcattac ccttacgctg aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt 5340
gattgatgaa actgctgctg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg 5400
caacaagccg aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca 5460
cttacaggcg attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg 5520
gagtattgcc aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact 5580
ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt 5640
ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta 5700
ttacggatgg tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga 5760
acttctggcc tggcaggaga aactgcatca gccgattatc atcaccgaat acggcgtgga 5820
tacgttagcc gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc 5880
atggctggat atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg gtgaacaggt 5940
atggaatttc gccgattttg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gtaacaagaa 6000
agggatcttc actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaacgctg 6060
gactggcatg aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa tcaacaactc 6120
tcctggcgca ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg 6180
atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 6240
tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca 6300
tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 6360
cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta 6420
tgttactaga tcgggaattg gcgatcgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 6480
tactagatct gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat 6540
attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg 6600
<210>11
<211>6820
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RLM254的T-DNA，RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞
＜p-sTPT::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(561)..(1329)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶CDS的互补序列；GenBank Acc.-No.：J01603.
<220>
<221>启动子
<222>(1913)..(3230)
<223>短丙糖磷酸易位体[sTPT]启动子的互补序列。
<220>
<221>启动子
<222>(3273)..(4268)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4294)..(6294)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(6365)..(6617)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(6676)..(6820)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(6758)..(6781)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>11
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggagct cggtacgatc 540
catgctgcgt tgaaacgtta ttaacggcct tttgccagat attgattcat ctcttcttcc 600
ggcaccattc cacctcccgt cgcccacacc agatgagtgg tattacgcag ttgttctgcg 660
ctgaaaccgt gcatctgttg gtaacttact gatgcacaca cgcgctgagg tccggccata 720
cccgccagtg ccgaaggttc aagacgaata ccttcttcct gcgccagcca gccaagcatg 780
tcatacatgg tttgatcgct aagggtatag aagccatcca gcagacgctc cattgcccgc 840
ccgacaaagc ctgatgcgcg accaactgca aggccatccg ctgcggtaag gttgtcgata 900
ccaatatcct gaacagaaat ctgatcgtgt aatcctgtat ggacgcctaa caacatacaa 960
ggggagtgcg ttggttcggc aaaaaagcag tgaacatgat cgccaaacgc cagtttaagc 1020
ccgaatgcga cgccaccagg accaccgcca acaccacacg gcagatagac aaacagaggg 1080
ttatcagcat cgacgatacg gccttgctgg gcaaattgcg ctttaagacg ctggccagcg 1140
acggaatacc caaggaacaa cgtgcgggaa ttttcgtcat caataaagaa acagttcggg 1200
tcagactgcg ctgctttacg tccttcctcg acggcaacac cataatcttg ctcatattcc 1260
acgaccgtaa cgccatggct gcgcagtttc gcttttttcc atgcccgggc atcagcagac 1320
atatgaactg tcaccttaaa gccaatgcgg gcgctcataa tgccgattga taaccccaga 1380
tttccggttg agcccacagc aatgctgtat tggctaaaga actgtttaaa ctccggagaa 1440
agcagtttgc tgtagtcatc atcaagcgtc agcaaccccg cttccagagc cagtttttct 1500
gcgtgtgcca ggacttcata aatcccgccg cgtgctttta tggagccgga aatgggcaaa 1560
tggctatctt ttttcagtaa cagttgcccg ctgatcggtt gctgatattc tttttccagc 1620
cgtttttgca tagctggaat ggcaaccagt tctgattcaa taatcccccc agtggcagca 1680
gtttcaggaa atgcttttgc cagatagggt gcaaaacggg ataagcgcgc atgggcgtcc 1740
tgaacatcct gttcggtcag gccaacataa ggtaaacctt cagccaatga ggtcgtgcca 1800
ggattaaacc aggtggtttc tttaagagca accagatcct ttaccaacgg atactgggcg 1860
atgagcgagt tcattttagc gttttccatg gtacccagac gtcgactcta gatgaaatcg 1920
aaattcagag ttttgatagt gagagcaaag agggacggac ttatgaggat ttcgagtatt 1980
tcaagagatg gtacttgttg atcggacggc tacgatgatc tcgatttggt taatccagta 2040
tctcgcggtg tatggagtta tggtagggtt aatggtcaat ttcatctaac ggtagagaat 2100
gatgtaatta gataagaatc ttgagatact ggtttagatt ggatgagtgt agggtccatc 2160
ttatcttgat aagtggatgg tttttagaga cacagtgaat attagccaat cgaagttcca 2220
tatcaccatc atcatctgta taattttgtt tttttggaag ataataatga ttgaaatttt 2280
ggtagatttt atttttcatt atttaccttg tatgttgagt ggtcttcaaa ttattgaacg 2340
tgacagattc acaagaaagt agatttttta taaatgaaat tttacttatt ttaaaggtat 2400
ctctatttaa tttcttttgt ttatggttgt ctgtcagcat ttgacttgca gtttcatgct 2460
catagtcata tacgttattc taggcttttt tgaatatctt attacttttt tcgtaataca 2520
attttataat tttatcaaag ttatacaact ataactaaaa ttagggtttt ctacaaaaca 2580
aaaaaatctt ctaatttttt ttgttgtagc cagtttactc gtaagttaca aaaaaataca 2640
aatgaaccca catgtattat gcgtttaact aggattacca tgtactttca tgtactcaat 2700
tcaccctata ctcttttttt ttttttttct agttccaccc aatctataaa attctgtcca 2760
tttgaccaaa ttcaattaat ttctgtaatt gcgatttaaa attaatatta catgttcact 2820
atttctcgat ttgagggaac ccgagtttaa atatgataaa aatgttgacc catcactaca 2880
aatatgttat agtttatact taatagtggt gtttttgggg ataattgatg aattaagtaa 2940
acatgattct tcttatgaag ttgattgagt gattattgta tgtaaaccta tgtgattgat 3000
gttattggtt gattgagtga ttattgtatt agtatgtaag caaagatgat tgttcttatg 3060
aggtaatttg ttactcattc atccttttgc atatgagaaa ttgtgttagc gtacgcaaaa 3120
caatagagaa cataaaagat atgtgtattt atttaaggtg acttttgtta atgatattgt 3180
agtatctata catttatata taacttgttg aatttgagta taagctatca ggatccgggg 3240
gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttgacta gagaattcga atccaaaaat 3300
tacggatatg aatataggca tatccgtatc cgaattatcc gtttgacagc tagcaacgat 3360
tgtacaattg cttctttaaa aaaggaagaa agaaagaaag aaaagaatca acatcagcgt 3420
taacaaacgg ccccgttacg gcccaaacgg tcatatagag taacggcgtt aagcgttgaa 3480
agactcctat cgaaatacgt aaccgcaaac gtgtcatagt cagatcccct cttccttcac 3540
cgcctcaaac acaaaaataa tcttctacag cctatatata caaccccccc ttctatctct 3600
cctttctcac aattcatcat ctttctttct ctacccccaa ttttaagaaa tcctctcttc 3660
tcctcttcat tttcaaggta aatctctctc tctctctctc tctctgttat tccttgtttt 3720
aattaggtat gtattattgc tagtttgtta atctgcttat cttatgtatg ccttatgtga 3780
atatctttat cttgttcatc tcatccgttt agaagctata aatttgttga tttgactgtg 3840
tatctacacg tggttatgtt tatatctaat cagatatgaa tttcttcata ttgttgcgtt 3900
tgtgtgtacc aatccgaaat cgttgatttt tttcatttaa tcgtgtagct aattgtacgt 3960
atacatatgg atctacgtat caattgttca tctgtttgtg tttgtatgta tacagatctg 4020
aaaacatcac ttctctcatc tgattgtgtt gttacataca tagatataga tctgttatat 4080
catttttttt attaattgtg tatatatata tgtgcataga tctggattac atgattgtga 4140
ttatttacat gattttgtta tttacgtatg tatatatgta gatctggact ttttggagtt 4200
gttgacttga ttgtatttgt gtgtgtatat gtgtgttctg atcttgatat gttatgtatg 4260
tgcagcccgg atctccgggt aggtcagtcc cttatgttac gtcctgtaga aaccccaacc 4320
cgtgaaatca aaaaactcga cggcctgtgg gcattcagtc tggatcgcga aaactgtgga 4380
attggtcagc gttggtggga aagcgcgtta caagaaagcc gggcaattgc tgtgccaggc 4440
agttttaacg atcagttcgc cgatgcagat attcgtaatt atgcgggcaa cgtctggtat 4500
cagcgcgaag tctttatacc gaaaggttgg gcaggccagc gtatcgtgct gcgtttcgat 4560
gcggtcactc attacggcaa agtgtgggtc aataatcagg aagtgatgga gcatcagggc 4620
ggctatacgc catttgaagc cgatgtcacg ccgtatgtta ttgccgggaa aagtgtacgt 4680
aagtttctgc ttctaccttt gatatatata taataattat cattaattag tagtaatata 4740
atatttcaaa tatttttttc aaaataaaag aatgtagtat atagcaattg cttttctgta 4800
gtttataagt gtgtatattt taatttataa cttttctaat atatgaccaa aatttgttga 4860
tgtgcaggta tcaccgtttg tgtgaacaac gaactgaact ggcagactat cccgccggga 4920
atggtgatta ccgacgaaaa cggcaagaaa aagcagtctt acttccatga tttctttaac 4980
tatgccggaa tccatcgcag cgtaatgctc tacaccacgc cgaacacctg ggtggacgat 5040
atcaccgtgg tgacgcatgt cgcgcaagac tgtaaccacg cgtctgttga ctggcaggtg 5100
gtggccaatg gtgatgtcag cgttgaactg cgtgatgcgg atcaacaggt ggttgcaact 5160
ggacaaggca ctagcgggac tttgcaagtg gtgaatccgc acctctggca accgggtgaa 5220
ggttatctct atgaactgtg cgtcacagcc aaaagccaga cagagtgtga tatctacccg 5280
cttcgcgtcg gcatccggtc agtggcagtg aagggcgaac agttcctgat taaccacaaa 5340
ccgttctact ttactggctt tggtcgtcat gaagatgcgg acttgcgtgg caaaggattc 5400
gataacgtgc tgatggtgca cgaccacgca ttaatggact ggattggggc caactcctac 5460
cgtacctcgc attaccctta cgctgaagag atgctcgact gggcagatga acatggcatc 5520
gtggtgattg atgaaactgc tgctgtcggc tttaacctct ctttaggcat tggtttcgaa 5580
gcgggcaaca agccgaaaga actgtacagc gaagaggcag tcaacgggga aactcagcaa 5640
gcgcacttac aggcgattaa agagctgata gcgcgtgaca aaaaccaccc aagcgtggtg 5700
atgtggagta ttgccaacga accggatacc cgtccgcaag gtgcacggga atatttcgcg 5760
ccactggcgg aagcaacgcg taaactcgac ccgacgcgtc cgatcacctg cgtcaatgta 5820
atgttctgcg acgctcacac cgataccatc agcgatctct ttgatgtgct gtgcctgaac 5880
cgttattacg gatggtatgt ccaaagcggc gatttggaaa cggcagagaa ggtactggaa 5940
aaagaacttc tggcctggca ggagaaactg catcagccga ttatcatcac cgaatacggc 6000
gtggatacgt tagccgggct gcactcaatg tacaccgaca tgtggagtga agagtatcag 6060
tgtgcatggc tggatatgta tcaccgcgtc tttgatcgcg tcagcgccgt cgtcggtgaa 6120
caggtatgga atttcgccga ttttgcgacc tcgcaaggca tattgcgcgt tggcggtaac 6180
aagaaaggga tcttcactcg cgaccgcaaa ccgaagtcgg cggcttttct gctgcaaaaa 6240
cgctggactg gcatgaactt cggtgaaaaa ccgcagcagg gaggcaaaca atgaatcaac 6300
aactctcctg gcgcaccatc gtcggctaca gcctcgggaa ttgctaccga gctcgaattt 6360
ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 6420
tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 6480
atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 6540
atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 6600
atctatgtta ctagatcggg aattggcgat cgcagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 6660
tttcctacta gatctgattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag 6720
gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataatc ggatatttaa 6780
aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt 6820
<210>12
<211>5246
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>REW8的T-DNA，RLM407-型Bar-GUS二元载体：LB＞
＜p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(527)..(1078)
<223>BAR基因/CDS的互补序列；与膦丝菌素乙酰转移酶的#SHBARPA吸水链霉菌bar基因100％同源.
<220>
<221>启动子
<222>(1092)..(1379)
<223>来自胭脂碱合酶基因的启动子的互补序列(Depicker等人1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)
EMBL no：V00087.
<220>
<221>启动子
<222>(1698)..(2693)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(2719)..(4719)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(4790)..(5042)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(5101)..(5246)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(5183)..(5206)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>12
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggtcaa atctcggtga 540
cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt 600
catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga 660
gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct 720
tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg 780
tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc 840
gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga 900
gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg 960
gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg 1020
ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggctcatgg 1080
cgcgccagat ctggattgag agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta 1140
tggaacgtca gtggagcatt tttgacaaga aatatttgct agctgatagt gaccttaggc 1200
gacttttgaa cgcgcaataa tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa 1260
acccgcggct gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc 1320
ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatct 1380
tgatcccctg cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg 1440
cttcccaacc ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa 1500
aaccgcccag tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc 1560
gcttgcgttt tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg 1620
tttctgcgga ctggctttct acgtgttccg cttcctttag cagcccttgc gccctgagtg 1680
cttgcggcag cgtgaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg atatgaatat 1740
aggcatatcc gtatccgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac aattgcttct 1800
ttaaaaaagg aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca aacggccccg 1860
ttacggccca aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact cctatcgaaa 1920
tacgtaaccg caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcaccgcct caaacacaaa 1980
aataatcttc tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt ctcacaattc 2040
atcatctttc tttctctacc cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc ttcattttca 2100
aggtaaatct ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta ggtatgtatt 2160
attgctagtt tgttaatctg cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc tttatcttgt 2220
tcatctcatc cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct acacgtggtt 2280
atgtttatat ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt gtaccaatcc 2340
gaaatcgttg atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca tatggatcta 2400
cgtatcaatt gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac atcacttctc 2460
tcatctgatt gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt tttttattaa 2520
ttgtgtatat atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt tacatgattt 2580
tgttatttac gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga cttgattgta 2640
tttgtgtgtg tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag cccggatctc 2700
cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa 2760
ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg tcagcgttgg 2820
tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt taacgatcag 2880
ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt 2940
ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt cactcattac 3000
ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta tacgccattt 3060
gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt tctgcttcta 3120
cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta atataatatt tcaaatattt 3180
ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagttta taagtgtgta 3240
tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc aggtatcacc 3300
gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt gattaccgac 3360
gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc cggaatccat 3420
cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac cgtggtgacg 3480
catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc caatggtgat 3540
gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca aggcactagc 3600
gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta tctctatgaa 3660
ctgtgcgtca cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg cgtcggcatc 3720
cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt ctactttact 3780
ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa cgtgctgatg 3840
gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac ctcgcattac 3900
ccttacgctg aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt gattgatgaa 3960
actgctgctg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg caacaagccg 4020
aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca cttacaggcg 4080
attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg gagtattgcc 4140
aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact ggcggaagca 4200
acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt ctgcgacgct 4260
cacaccgata ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta ttacggatgg 4320
tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga acttctggcc 4380
tggcaggaga aactgcatca gccgattatc atcaccgaat acggcgtgga tacgttagcc 4440
gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc atggctggat 4500
atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg gtgaacaggt atggaatttc 4560
gccgattttg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gtaacaagaa agggatcttc 4620
actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaacgctg gactggcatg 4680
aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa tcaacaactc tcctggcgca 4740
ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg atcgttcaaa 4800
catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 4860
ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 4920
tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 4980
caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 5040
tcgggaattg gcgatcgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tactagatct 5100
gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt 5160
aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg cgtgaaaagg 5220
tttatccgtt cgtccatttg tatgtc 5246
<210>13
<211>6887
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RET63的T-DNA，RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞
＜p-AtAct2i::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316 pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(561)..(1889)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶CDS的互补序列；GenBank
Acc.-No.：J01603.
<220>
<221>启动子
<222>(1919)..(3326)
<223>具有内部内含子的来自拟南芥肌动蛋白-2启动子的启动子互补序列；与#ATU41998拟南芥肌动蛋
白2(ACT2)基因98％同源。
<220>
<221>启动子
<222>(3339)..(4334)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4360)..(6360)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(6431)..(6683)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(6742)..(6887)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(6824)..(6847)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>13
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggagct cggtacgatc 540
catgctgcgt tgaaacgtta ttaacggcct tttgccagat attgattcat ctcttcttcc 600
ggcaccattc cacctcccgt cgcccacacc agatgagtgg tattacgcag ttgttctgcg 660
ctgaaaccgt gcatctgttg gtaacttact gatgcacaca cgcgctgagg tccggccata 720
cccgccagtg ccgaaggttc aagacgaata ccttcttcct gcgccagcca gccaagcatg 780
tcatacatgg tttgatcgct aagggtatag aagccatcca gcagacgctc cattgcccgc 840
ccgacaaagc ctgatgcgcg accaactgca aggccatccg ctgcggtaag gttgtcgata 900
ccaatatcct gaacagaaat ctgatcgtgt aatcctgtat ggacgcctaa caacatacaa 960
ggggagtgcg ttggttcggc aaaaaagcag tgaacatgat cgccaaacgc cagtttaagc 1020
ccgaatgcga cgccaccagg accaccgcca acaccacacg gcagatagac aaacagaggg 1080
ttatcagcat cgacgatacg gccttgctgg gcaaattgcg ctttaagacg ctggccagcg 1140
acggaatacc caaggaacaa cgtgcgggaa ttttcgtcat caataaagaa acagttcggg 1200
tcagactgcg ctgctttacg tccttcctcg acggcaacac cataatcttg ctcatattcc 1260
acgaccgtaa cgccatggct gcgcagtttc gcttttttcc atgcccgggc atcagcagac 1320
atatgaactg tcaccttaaa gccaatgcgg gcgctcataa tgccgattga taaccccaga 1380
tttccggttg agcccacagc aatgctgtat tggctaaaga actgtttaaa ctccggagaa 1440
agcagtttgc tgtagtcatc atcaagcgtc agcaaccccg cttccagagc cagtttttct 1500
gcgtgtgcca ggacttcata aatcccgccg cgtgctttta tggagccgga aatgggcaaa 1560
tggctatctt ttttcagtaa cagttgcccg ctgatcggtt gctgatattc tttttccagc 1620
cgtttttgca tagctggaat ggcaaccagt tctgattcaa taatcccccc agtggcagca 1680
gtttcaggaa atgcttttgc cagatagggt gcaaaacggg ataagcgcgc atgggcgtcc 1740
tgaacatcct gttcggtcag gccaacataa ggtaaacctt cagccaatga ggtcgtgcca 1800
ggattaaacc aggtggtttc tttaagagca accagatcct ttaccaacgg atactgggcg 1860
atgagcgagt tcattttagc gttttccata gtacgtctct ttggatccgg cgcgcctttt 1920
ttttatgagc tgcaaacaca caaaaagagt tcaatacagt caaataaacc ctgattgaat 1980
cagaaatagc tttctgttca acgtacgaca ctacaaatcc taaagtttcg aagaatctat 2040
acacaaactt catctaacct taaacagtgt tcagattcaa tctaacattg acagtgttca 2100
gattcaatct aacttcaaca gttcagattt caattcacat atacaaatca tttcccaggt 2160
aacatgaaca tggatctctc catcaaggtc aagccaaatt ctggtagcta taatcgagct 2220
aactgatcgg tcaacttaga tcgattctag taaaaccaaa agatttagtg gaggttcaca 2280
gatccaaatt aaacgaattc cagatctcaa ggaaattgag aaaacaagat cgagatccag 2340
caaataaagt agatccagaa agttcctatt accttggaaa gaaagagcgg aagaagatga 2400
gattgaggaa gattcaaaac ggagaatgaa tctcctggat tatctcttac tttctctctt 2460
agtcttcttc cttgttcttc tctgtcaagt cgccggagat tcaaaacggc tgatgaaagt 2520
gaggaggaca acgagacaat tcaaagcgga gaggaaaata tatgaattta tataggcggg 2580
tttatctctt acaactttat tttcggcctt tcaaaaaaat aattaaaatc gacagacacg 2640
aatcatttcg accacaggta aagataacgt gacctggctg tcagacagcc ttttccctcg 2700
tgttaactaa tttttaaact aattaatcat ctcagccctt ggattagttc ttttgctttg 2760
atggcttcat gactgtgacc tgctcgatcc gcgtgttaca tgacagctcc gtttttttag 2820
tggttaactt aaaccgagtc aatccaggca acgttagtcg tcgtcgtggt tggcttgttc 2880
aattagattt catacaattc aacgtaattt aattcgtttt ctattagaat tgtatcataa 2940
ttaattcaga ccgtgaaaga aagtgtcttt catgatgtgt ttatggatat ttatacaata 3000
agatacaatg tttcatcata ttcactattc acgattagta tgtacattaa ataatggcta 3060
ctactacatc cgaactcgtc aaaacgattc tgaatcaatt atacatatgc tgactcttgc 3120
atacataaaa aatagttgtt taaattttgt ctaactaatg tttggtataa gtataatgtt 3180
gagttgagat accaattaca tcgagtctag ccattttgtc gtgccatatt cgtcaaaact 3240
ttcttacata atgataacct agatctagat gagatatgta tcaatgtatt tgagatcata 3300
attaagttcg ttctaaattt tgtcgaaacc aacgcaagct tgactagaga attcgaatcc 3360
aaaaattacg gatatgaata taggcatatc cgtatccgaa ttatccgttt gacagctagc 3420
aacgattgta caattgcttc tttaaaaaag gaagaaagaa agaaagaaaa gaatcaacat 3480
cagcgttaac aaacggcccc gttacggccc aaacggtcat atagagtaac ggcgttaagc 3540
gttgaaagac tcctatcgaa atacgtaacc gcaaacgtgt catagtcaga tcccctcttc 3600
cttcaccgcc tcaaacacaa aaataatctt ctacagccta tatatacaac ccccccttct 3660
atctctcctt tctcacaatt catcatcttt ctttctctac ccccaatttt aagaaatcct 3720
ctcttctcct cttcattttc aaggtaaatc tctctctctc tctctctctc tgttattcct 3780
tgttttaatt aggtatgtat tattgctagt ttgttaatct gcttatctta tgtatgcctt 3840
atgtgaatat ctttatcttg ttcatctcat ccgtttagaa gctataaatt tgttgatttg 3900
actgtgtatc tacacgtggt tatgtttata tctaatcaga tatgaatttc ttcatattgt 3960
tgcgtttgtg tgtaccaatc cgaaatcgtt gatttttttc atttaatcgt gtagctaatt 4020
gtacgtatac atatggatct acgtatcaat tgttcatctg tttgtgtttg tatgtataca 4080
gatctgaaaa catcacttct ctcatctgat tgtgttgtta catacataga tatagatctg 4140
ttatatcatt ttttttatta attgtgtata tatatatgtg catagatctg gattacatga 4200
ttgtgattat ttacatgatt ttgttattta cgtatgtata tatgtagatc tggacttttt 4260
ggagttgttg acttgattgt atttgtgtgt gtatatgtgt gttctgatct tgatatgtta 4320
tgtatgtgca gcccggatct ccgggtaggt cagtccctta tgttacgtcc tgtagaaacc 4380
ccaacccgtg aaatcaaaaa actcgacggc ctgtgggcat tcagtctgga tcgcgaaaac 4440
tgtggaattg gtcagcgttg gtgggaaagc gcgttacaag aaagccgggc aattgctgtg 4500
ccaggcagtt ttaacgatca gttcgccgat gcagatattc gtaattatgc gggcaacgtc 4560
tggtatcagc gcgaagtctt tataccgaaa ggttgggcag gccagcgtat cgtgctgcgt 4620
ttcgatgcgg tcactcatta cggcaaagtg tgggtcaata atcaggaagt gatggagcat 4680
cagggcggct atacgccatt tgaagccgat gtcacgccgt atgttattgc cgggaaaagt 4740
gtacgtaagt ttctgcttct acctttgata tatatataat aattatcatt aattagtagt 4800
aatataatat ttcaaatatt tttttcaaaa taaaagaatg tagtatatag caattgcttt 4860
tctgtagttt ataagtgtgt atattttaat ttataacttt tctaatatat gaccaaaatt 4920
tgttgatgtg caggtatcac cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg 4980
ccgggaatgg tgattaccga cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt ccatgatttc 5040
tttaactatg ccggaatcca tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa cacctgggtg 5100
gacgatatca ccgtggtgac gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg 5160
caggtggtgg ccaatggtga tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca acaggtggtt 5220
gcaactggac aaggcactag cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg 5280
ggtgaaggtt atctctatga actgtgcgtc acagccaaaa gccagacaga gtgtgatatc 5340
tacccgcttc gcgtcggcat ccggtcagtg gcagtgaagg gcgaacagtt cctgattaac 5400
cacaaaccgt tctactttac tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt gcgtggcaaa 5460
ggattcgata acgtgctgat ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac 5520
tcctaccgta cctcgcatta cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat 5580
ggcatcgtgg tgattgatga aactgctgct gtcggcttta acctctcttt aggcattggt 5640
ttcgaagcgg gcaacaagcc gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact 5700
cagcaagcgc acttacaggc gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc 5760
gtggtgatgt ggagtattgc caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat 5820
ttcgcgccac tggcggaagc aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc 5880
aatgtaatgt tctgcgacgc tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc 5940
ctgaaccgtt attacggatg gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta 6000
ctggaaaaag aacttctggc ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa 6060
tacggcgtgg atacgttagc cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag 6120
tatcagtgtg catggctgga tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc 6180
ggtgaacagg tatggaattt cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc 6240
ggtaacaaga aagggatctt cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc ttttctgctg 6300
caaaaacgct ggactggcat gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg caaacaatga 6360
atcaacaact ctcctggcgc accatcgtcg gctacagcct cgggaattgc taccgagctc 6420
gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 6480
cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 6540
catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 6600
catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 6660
ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt ggcgatcgca gcttggcgta atcatggtca 6720
tagctgtttc ctactagatc tgattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt 6780
tgacaggata tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataatcggat 6840
atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgtc 6887
<210>14
<211>6600
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RET19的T-DNA，RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞
＜p-AtAct2i::c-dao1/pa::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316 pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(536)..(1642)
<223>红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶CDS的互补序列；GenBank U60066 & US专利5948660；来自
QC142-1/LM202。
<220>
<221>启动子
<222>(1668)..(3075)
<223>具有内部内含子的来自拟南芥肌动蛋白-2启动子的启动子互补序列；与#ATU41998拟南芥肌动蛋
白2(ACT2)基因98％同源。
<220>
<221>启动子
<222>(3088)..(4083)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4109)..(6109)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(6180)..(6432)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(6491)..(6635)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(6573)..(6596)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>14
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggaatc ccgccctaca 540
acttcgactc ccgcgccgcg ccgtggtacc gctggaacgc ctcgtcgacg agctgcgcga 600
catcctccgc cgcgccccaa ctctgctggt atcccgcact cgagaagcca tacgcatgca 660
caagcgtgac ctccttctcc ttcgccgctc gtgcgctgcc cctgccgagc gagaggggcg 720
actttgtccg gtcgagaggc aggacgatcc gttctgcctc aacgcggggt ccgcctcgtc 780
gtgcaggtcg caagccgacg ttgtggcgga ggacctcgat gccttcgatc gttccgtcgc 840
tcgagatggt cgggtcgagg cgcaagcagt gcttgaggat ccgctggacc gtctctgggt 900
tgacagacaa gtcccagtct cccacgccgt acgtcccgcc gcagatgact tcgccacctg 960
gtcggggaat gatgtaggcg ggagaagcgg ggtcggacga gtccatcgtg catcgcttgc 1020
atggggactt gacgaggacg gtttgcccgc ggattggctc ggcggcttgg tcgtcgatgc 1080
ccgcaatcga cttggcgcca agtcccgtag cgttgaccac caaatccgca ccgtcgaacg 1140
cctgctcaag cgacgtaacg gtccgtctct caaacgtcgc gccgagcttc tgcagctctc 1200
ttgcaaggta ctggcagtac tttggtgcgt ggacggagag ggtgtcgtag gttacgccga 1260
tagcgccagg tggacattcg gaagatggga gggggcggta atttggcgtg atgtccttgt 1320
accagtgccc gagcaagccg tcttcgttct gcgcgaaccg cctcgtcccc ttgagccaca 1380
tggcatggcc cgtcgggacc aactcgaccc acttcttgaa agtcgattct tcccattttg 1440
cttgtcgagg accgtctgta agcgtcatga aaggcgtcca attcgcgcca gcccatggtg 1500
aagcgaaagt ctggctcgag acgtcctccg gcaagtcgcg cgcgagaata tgcacgctgt 1560
agcccttccg agcgaggatg agggcgctgc tcagaccgat aacgcctgat ccgaggacaa 1620
cgacgcgctt ctgcgagtgc atggtggccc gggatccggc gcgccttttt tttatgagct 1680
gcaaacacac aaaaagagtt caatacagtc aaataaaccc tgattgaatc agaaatagct 1740
ttctgttcaa cgtacgacac tacaaatcct aaagtttcga agaatctata cacaaacttc 1800
atctaacctt aaacagtgtt cagattcaat ctaacattga cagtgttcag attcaatcta 1860
acttcaacag ttcagatttc aattcacata tacaaatcat ttcccaggta acatgaacat 1920
ggatctctcc atcaaggtca agccaaattc tggtagctat aatcgagcta actgatcggt 1980
caacttagat cgattctagt aaaaccaaaa gatttagtgg aggttcacag atccaaatta 2040
aacgaattcc agatctcaag gaaattgaga aaacaagatc gagatccagc aaataaagta 2100
gatccagaaa gttcctatta ccttggaaag aaagagcgga agaagatgag attgaggaag 2160
attcaaaacg gagaatgaat ctcctggatt atctcttact ttctctctta gtcttcttcc 2220
ttgttcttct ctgtcaagtc gccggagatt caaaacggct gatgaaagtg aggaggacaa 2280
cgagacaatt caaagcggag aggaaaatat atgaatttat ataggcgggt ttatctctta 2340
caactttatt ttcggccttt caaaaaaata attaaaatcg acagacacga atcatttcga 2400
ccacaggtaa agataacgtg acctggctgt cagacagcct tttccctcgt gttaactaat 2460
ttttaaacta attaatcatc tcagcccttg gattagttct tttgctttga tggcttcatg 2520
actgtgacct gctcgatccg cgtgttacat gacagctccg tttttttagt ggttaactta 2580
aaccgagtca atccaggcaa cgttagtcgt cgtcgtggtt ggcttgttca attagatttc 2640
atacaattca acgtaattta attcgttttc tattagaatt gtatcataat taattcagac 2700
cgtgaaagaa agtgtctttc atgatgtgtt tatggatatt tatacaataa gatacaatgt 2760
ttcatcatat tcactattca cgattagtat gtacattaaa taatggctac tactacatcc 2820
gaactcgtca aaacgattct gaatcaatta tacatatgct gactcttgca tacataaaaa 2880
atagttgttt aaattttgtc taactaatgt ttggtataag tataatgttg agttgagata 2940
ccaattacat cgagtctagc cattttgtcg tgccatattc gtcaaaactt tcttacataa 3000
tgataaccta gatctagatg agatatgtat caatgtattt gagatcataa ttaagttcgt 3060
tctaaatttt gtcgaaacca acgcaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg 3120
atatgaatat aggcatatcc gtatccgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac 3180
aattgcttct ttaaaaaagg aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca 3240
aacggccccg ttacggccca aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact 3300
cctatcgaaa tacgtaaccg caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcaccgcct 3360
caaacacaaa aataatcttc tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt 3420
ctcacaattc atcatctttc tttctctacc cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc 3480
ttcattttca aggtaaatct ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta 3540
ggtatgtatt attgctagtt tgttaatctg cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc 3600
tttatcttgt tcatctcatc cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct 3660
acacgtggtt atgtttatat ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt 3720
gtaccaatcc gaaatcgttg atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca 3780
tatggatcta cgtatcaatt gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac 3840
atcacttctc tcatctgatt gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt 3900
tttttattaa ttgtgtatat atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt 3960
tacatgattt tgttatttac gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga 4020
cttgattgta tttgtgtgtg tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag 4080
cccggatctc cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga 4140
aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg 4200
tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt 4260
taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg 4320
cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt 4380
cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta 4440
tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt 4500
tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta atataatatt 4560
tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagttta 4620
taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc 4680
aggtatcacc gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt 4740
gattaccgac gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc 4800
cggaatccat cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac 4860
cgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc 4920
caatggtgat gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca 4980
aggcactagc gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta 5040
tctctatgaa ctgtgcgtca cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg 5100
cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt 5160
ctactttact ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa 5220
cgtgctgatg gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac 5280
ctcgcattac ccttacgctg aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt 5340
gattgatgaa actgctgctg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg 5400
caacaagccg aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca 5460
cttacaggcg attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg 5520
gagtattgcc aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact 5580
ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt 5640
ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta 5700
ttacggatgg tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga 5760
acttctggcc tggcaggaga aactgcatca gccgattatc atcaccgaat acggcgtgga 5820
tacgttagcc gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc 5880
atggctggat atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg gtgaacaggt 5940
atggaatttc gccgattttg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gtaacaagaa 6000
agggatcttc actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaacgctg 6060
gactggcatg aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa tcaacaactc 6120
tcctggcgca ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg 6180
atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 6240
tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca 6300
tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 6360
cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta 6420
tgttactaga tcgggaattg gcgatcgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 6480
tactagatct gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat 6540
attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg 6600
<210>15
<211>6076
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RET17的T-DNA，RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞
＜p-NOS:c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(561)..(1889)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶CDS的互补序列；GenBank Acc.-No.：J01603.
<220>
<221>启动子
<222>(1922)..(2209)
<223>来自胭脂碱合酶基因的启动子的互补序列(Depicker等人1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)
EMBL no：V00087.
<220>
<221>启动子
<222>(2528)..(3523)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(3549)..(5549)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(5620)..(5872)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(5931)..(6076)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(5971)..(5994)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>15
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggagct cggtacgatc 540
catgctgcgt tgaaacgtta ttaacggcct tttgccagat attgattcat ctcttcttcc 600
ggcaccattc cacctcccgt cgcccacacc agatgagtgg tattacgcag ttgttctgcg 660
ctgaaaccgt gcatctgttg gtaacttact gatgcacaca cgcgctgagg tccggccata 720
cccgccagtg ccgaaggttc aagacgaata ccttcttcct gcgccagcca gccaagcatg 780
tcatacatgg tttgatcgct aagggtatag aagccatcca gcagacgctc cattgcccgc 840
ccgacaaagc ctgatgcgcg accaactgca aggccatccg ctgcggtaag gttgtcgata 900
ccaatatcct gaacagaaat ctgatcgtgt aatcctgtat ggacgcctaa caacatacaa 960
ggggagtgcg ttggttcggc aaaaaagcag tgaacatgat cgccaaacgc cagtttaagc 1020
ccgaatgcga cgccaccagg accaccgcca acaccacacg gcagatagac aaacagaggg 1080
ttatcagcat cgacgatacg gccttgctgg gcaaattgcg ctttaagacg ctggccagcg 1140
acggaatacc caaggaacaa cgtgcgggaa ttttcgtcat caataaagaa acagttcggg 1200
tcagactgcg ctgctttacg tccttcctcg acggcaacac cataatcttg ctcatattcc 1260
acgaccgtaa cgccatggct gcgcagtttc gcttttttcc atgcccgggc atcagcagac 1320
atatgaactg tcaccttaaa gccaatgcgg gcgctcataa tgccgattga taaccccaga 1380
tttccggttg agcccacagc aatgctgtat tggctaaaga actgtttaaa ctccggagaa 1440
agcagtttgc tgtagtcatc atcaagcgtc agcaaccccg cttccagagc cagtttttct 1500
gcgtgtgcca ggacttcata aatcccgccg cgtgctttta tggagccgga aatgggcaaa 1560
tggctatctt ttttcagtaa cagttgcccg ctgatcggtt gctgatattc tttttccagc 1620
cgtttttgca tagctggaat ggcaaccagt tctgattcaa taatcccccc agtggcagca 1680
gtttcaggaa atgcttttgc cagatagggt gcaaaacggg ataagcgcgc atgggcgtcc 1740
tgaacatcct gttcggtcag gccaacataa ggtaaacctt cagccaatga ggtcgtgcca 1800
ggattaaacc aggtggtttc tttaagagca accagatcct ttaccaacgg atactgggcg 1860
atgagcgagt tcattttagc gttttccata gtacgtctct ttggatccgg cgcgccagat 1920
ctggattgag agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta tggaacgtca 1980
gtggagcatt tttgacaaga aatatttgct agctgatagt gaccttaggc gacttttgaa 2040
cgcgcaataa tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa acccgcggct 2100
gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc ttgtcccgcg 2160
tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatct tgatcccctg 2220
cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg cttcccaacc 2280
ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa aaccgcccag 2340
tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc gcttgcgttt 2400
tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg tttctgcgga 2460
ctggctttct acgtgttccg cttcctttag cagcccttgc gccctgagtg cttgcggcag 2520
cgtgaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg atatgaatat aggcatatcc 2580
gtatccgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac aattgcttct ttaaaaaagg 2640
aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca aacggccccg ttacggccca 2700
aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact cctatcgaaa tacgtaaccg 2760
caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcaccgcct caaacacaaa aataatcttc 2820
tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt ctcacaattc atcatctttc 2880
tttctctacc cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc ttcattttca aggtaaatct 2940
ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta ggtatgtatt attgctagtt 3000
tgttaatctg cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc tttatcttgt tcatctcatc 3060
cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct acacgtggtt atgtttatat 3120
ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt gtaccaatcc gaaatcgttg 3180
atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca tatggatcta cgtatcaatt 3240
gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac atcacttctc tcatctgatt 3300
gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt tttttattaa ttgtgtatat 3360
atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt tacatgattt tgttatttac 3420
gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga cttgattgta tttgtgtgtg 3480
tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag cccggatctc cgggtaggtc 3540
agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc 3600
tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg tcagcgttgg tgggaaagcg 3660
cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt taacgatcag ttcgccgatg 3720
cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt ataccgaaag 3780
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gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta tacgccattt gaagccgatg 3900
tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt tctgcttcta cctttgatat 3960
atatataata attatcatta attagtagta atataatatt tcaaatattt ttttcaaaat 4020
aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt 4080
tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc aggtatcacc gtttgtgtga 4140
acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt gattaccgac gaaaacggca 4200
agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc cggaatccat cgcagcgtaa 4260
tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac cgtggtgacg catgtcgcgc 4320
aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc caatggtgat gtcagcgttg 4380
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cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg cgtcggcatc cggtcagtgg 4560
cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt ctactttact ggctttggtc 4620
gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa cgtgctgatg gtgcacgacc 4680
acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac ctcgcattac ccttacgctg 4740
aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt gattgatgaa actgctgctg 4800
tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg caacaagccg aaagaactgt 4860
acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca cttacaggcg attaaagagc 4920
tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg gagtattgcc aacgaaccgg 4980
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ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta ttacggatgg tatgtccaaa 5160
gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga acttctggcc tggcaggaga 5220
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caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc atggctggat atgtatcacc 5340
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ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa 5640
taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 5700
ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 5760
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cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcgggaattg 5880
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<210>16
<211>5819
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RET15的T-DNA，RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞
＜p-NOS:c-dao1/ko::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316 pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(533)..(1636)
<223>dao1/ko的CDS的互补序列。
<220>
<221>启动子
<222>(1665)..(1952)
<223>来自胭脂碱合酶基因的启动子的互补序列(Depicker等人1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)
EMBL no：V00087.
<220>
<221>启动子
<222>(2271)..(3266)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(3292)..(5292)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(5365)..(5615)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(5674)..(5819)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(5756)..(5779)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>16
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggtcac taaagttttg 540
actctctcgc tgcaccgtgg tatctttgga atgcctcgtc caccaactga gcaacatctt 600
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tatgtatgcc ttatgtgaat atctttatct tgttcatctc atccgtttag aagctataaa 2820
tttgttgatt tgactgtgta tctacacgtg gttatgttta tatctaatca gatatgaatt 2880
tcttcatatt gttgcgtttg tgtgtaccaa tccgaaatcg ttgatttttt tcatttaatc 2940
gtgtagctaa ttgtacgtat acatatggat ctacgtatca attgttcatc tgtttgtgtt 3000
tgtatgtata cagatctgaa aacatcactt ctctcatctg attgtgttgt tacatacata 3060
gatatagatc tgttatatca ttttttttat taattgtgta tatatatatg tgcatagatc 3120
tggattacat gattgtgatt atttacatga ttttgttatt tacgtatgta tatatgtaga 3180
tctggacttt ttggagttgt tgacttgatt gtatttgtgt gtgtatatgt gtgttctgat 3240
cttgatatgt tatgtatgtg cagcccggat ctccgggtag gtcagtccct tatgttacgt 3300
cctgtagaaa ccccaacccg tgaaatcaaa aaactcgacg gcctgtgggc attcagtctg 3360
gatcgcgaaa actgtggaat tggtcagcgt tggtgggaaa gcgcgttaca agaaagccgg 3420
gcaattgctg tgccaggcag ttttaacgat cagttcgccg atgcagatat tcgtaattat 3480
gcgggcaacg tctggtatca gcgcgaagtc tttataccga aaggttgggc aggccagcgt 3540
atcgtgctgc gtttcgatgc ggtcactcat tacggcaaag tgtgggtcaa taatcaggaa 3600
gtgatggagc atcagggcgg ctatacgcca tttgaagccg atgtcacgcc gtatgttatt 3660
gccgggaaaa gtgtacgtaa gtttctgctt ctacctttga tatatatata ataattatca 3720
ttaattagta gtaatataat atttcaaata tttttttcaa aataaaagaa tgtagtatat 3780
agcaattgct tttctgtagt ttataagtgt gtatatttta atttataact tttctaatat 3840
atgaccaaaa tttgttgatg tgcaggtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 3900
cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 3960
ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 4020
aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 4080
tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 4140
caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac 4200
ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca 4260
gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag 4320
ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac 4380
ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg 4440
attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg 4500
gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct 4560
ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc 4620
aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 4680
aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt 4740
gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg 4800
atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 4860
gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 4920
gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt 4980
atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 5040
tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 5100
agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 5160
ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg 5220
gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 5280
ggcaaacaat gaatcaacaa ctctcctggc gcaccatcgt cggctacagc ctcgggaatt 5340
gctaccgagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt 5400
gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 5460
tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 5520
cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 5580
attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttggcgatcg cagcttggcg 5640
taatcatggt catagctgtt tcctactaga tctgattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa 5700
actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta 5760
gaataatcgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtc 5819
<210>17
<211>1408
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1408)
<223>具有第一内含子的拟南芥肌动蛋白2启动子区域。
<220>
<221>内含子
<222>(955)..(1397)
<223>拟南芥肌动蛋白2第一内含子
<400>17
tcgacaaaat ttagaacgaa cttaattatg atctcaaata cattgataca tatctcatct 60
agatctaggt tatcattatg taagaaagtt ttgacgaata tggcacgaca aaatggctag 120
actcgatgta attggtatct caactcaaca ttatacttat accaaacatt agttagacaa 180
aatttaaaca actatttttt atgtatgcaa gagtcagcat atgtataatt gattcagaat 240
cgttttgacg agttcggatg tagtagtagc cattatttaa tgtacatact aatcgtgaat 300
agtgaatatg atgaaacatt gtatcttatt gtataaatat ccataaacac atcatgaaag 360
acactttctt tcacggtctg aattaattat gatacaattc taatagaaaa cgaattaaat 420
tacgttgaat tgtatgaaat ctaattgaac aagccaacca cgacgacgac taacgttgcc 480
tggattgact cggtttaagt taaccactaa aaaaacggag ctgtcatgta acacgcggat 540
cgagcaggtc acagtcatga agccatcaaa gcaaaagaac taatccaagg gctgagatga 600
ttaattagtt taaaaattag ttaacacgag ggaaaaggct gtctgacagc caggtcacgt 660
tatctttacc tgtggtcgaa atgattcgtg tctgtcgatt ttaattattt ttttgaaagg 720
ccgaaaataa agttgtaaga gataaacccg cctatataaa ttcatatatt ttcctctccg 780
ctttgaattg tctcgttgtc ctcctcactt tcatcagccg ttttgaatct ccggcgactt 840
gacagagaag aacaaggaag aagactaaga gagaaagtaa gagataatcc aggagattca 900
ttctccgttt tgaatcttcc tcaatctcat cttcttccgc tctttctttc caaggtaata 960
ggaactttct ggatctactt tatttgctgg atctcgatct tgttttctca atttccttga 1020
gatctggaat tcgtttaatt tggatctgtg aacctccact aaatcttttg gttttactag 1080
aatcgatcta agttgaccga tcagttagct cgattatagc taccagaatt tggcttgacc 1140
ttgatggaga gatccatgtt catgttacct gggaaatgat ttgtatatgt gaattgaaat 1200
ctgaactgtt gaagttagat tgaatctgaa cactgtcaat gttagattga atctgaacac 1260
tgtttaaggt tagatgaagt ttgtgtatag attcttcgaa actttaggat ttgtagtgtc 1320
gtacgttgaa cagaaagcta tttctgattc aatcagggtt tatttgactg tattgaactc 1380
tttttgtgtg tttgcagctc ataaaaaa 1408
a.向大豆细胞或组织引入DNA构建体，所述构建体包含至少一个第 一表达构建体，所述第一表达构建体包含在所述大豆植物中具有活性的启 动子以及与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的 酶的核酸序列，以及
b.在选择培养基上对步骤a)的所述大豆细胞或组织进行至少5天时 间的孵育，所述培养基包含总浓度为大约0.5mM至大约100mM的D-丙 氨酸和/或D-丝氨酸和/或其衍生物，以及
c.将步骤b)的所述大豆细胞或组织转入再生培养基，对包含所述 DNA构建体的大豆植物进行再生和选择。
虽然已知有多种启动子在大豆中具有功能并且适合开展本发明的方 法，但已发现，泛素启动子尤其能导致令人吃惊的高选择效率。因此，在 一种优选的实施方式中，在大豆中具有活性的启动子是来自双子叶植物的 泛素启动子。更优选地，植物泛素启动子是欧芹(欧芹(Petroselinum crispum)或Lomatium foeniculaceum)泛素启动子或大豆(Glycine max) 泛素启动子，最优选地，泛素启动子(或下文所述的其衍生物或片段)。 欧芹泛素和大豆泛素启动子的序列在下文中提供。本领域技术人员已知， 可对启动子序列进行大程度的修饰(例如截短、融合、突变)，而不会显 著改变它们的转录性质。因此，在本发明的一种优选实施方式中，在大豆 中具有活性的启动子选自：
a)序列，其包含SEQ ID NO：7或8所示的序列，以及
b)序列，其包含至少一个片段并且在大豆中具有启动子活性，所述片 段为SEQ ID NO：7或8所示的序列的至少50(优选100或150，更优选 200或250，甚至更优选300或500)个连续碱基对，
c)序列，其包含与SEQ ID NO：7或8所示的序列具有至少60％(优 选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或95％，最优选 98％)同一性的序列，并且在大豆中具有启动子活性，
d)序列，其包含能与SEQ ID NO：7或8所示的序列杂交(优选在 与下述条件相当或均等的条件下，所述条件是用30至(优选)35％的甲酰 胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液于37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优 选1×SSC)中于50至(优选)55℃下洗涤；更优选地，在40至(优选) 45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC (优选0.5×SSC)中于55至(优选)60℃下洗涤，以及最优选地，在50％ 的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60 至(优选)65℃下洗涤)的序列，并且在大豆中具有启动子活性。
优选地，本发明的方法包括下述步骤：
(a)提供大豆幼苗初生叶节或更高叶节的腋生分生组织，以及
(b)将所述腋生分生组织与包含转基因T-DNA的根瘤菌科 (Rhizobiaceae)细菌一起共培养，所述转基因T-DNA包含下述DNA构 建体，所述构建体包含至少一个第一表达构建体，所述第一表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码 能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
(c)将所述经共培养的腋生分生组织转移到枝条诱导和选择培养基 上，所述培养基包含：
(i)浓度适于从所述腋生分生组织从头诱导枝条诱导的至少一种植物 生长因子，以及
(ii)总浓度为大约3mM至大约100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸 和/或其衍生物，以及
(iii)任选地，一种或多种适于抑制根瘤菌科细菌生长的抗生素，
以及，在所述培养基上对所述经共培养的腋生分生组织进行至少5天 的培养，直到从其诱导和发育出枝条，并且分离所述枝条，以及
(d)将所述经分离的枝条转移至生根培养基，在所述生根培养基上培 养所述枝条，直到所述枝条形成根，并且进一步将由此得到的小植物再生 为成熟植物，其包含插入进它们基因组中的所述转基因T-DNA。
在本发明的一种优选的实施方式中，DNA构建体或T-DNA(包含用 于所述能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的所述第一表达盒)还包含至 少一个第二表达构建体，其向所述大豆植物赋予有农业经济价值的性状。
基于腋生分生组织的方法可利用来自多种来源的外植体组织和/或细 胞。优选地，提供选自以下的形式的初生节或更高的节的腋生分生组织：
i)由基本上整株幼苗提供的幼苗腋生分生组织，以及
ii)通过以使得腋生分生组织保持与叶柄相连的方式对初生或更高的叶 加以切割，提供的叶腋生分生组织，
iii)繁殖的腋生分生组织。
在本发明的一种优选的实施方式中(尤其是针对基于腋生分生组织的 方法)，步骤(b)(共培养)和/或(c)(枝条诱导和选择)中至少之一 的培养基包含浓度相当于大约1μM至大约10μM的6-苄氨基嘌呤的浓度 的细胞分裂素。另外，步骤(b)和/或(c)的至少之一的所述培养基还包 含大约0.1μM和大约2μM之间的赤霉酸(GA3)。此外，步骤(b)和/ 或(c)中至少之一的所述培养基还包含至少一种硫醇化合物(例如DTT 或半胱氨酸)。
本领域技术人员已知有多种酶可用作为D-丝氨酸和/或D-丙氨酸代谢 酶。优选地，能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸解氨酶(EC 4.3.1.18)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)和D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。 更优选地，能代谢D-丝氨酸的酶选自：
i)SEQ ID NO：2编码的大肠杆菌(E.coli)D-丝氨酸解氨酶；和
ii)酶，其具有相同的酶活性以及与SEQ ID NO：2编码的序列至少 60％(优选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或95％， 最优选98％)的同一性；以及
iii)下述核酸序列编码的酶，所述核酸序列能与SEQ ID NO：1所示 的序列的互补序列杂交(优选在与下述条件相当或均等的条件下，所述条 件是用30至(优选)35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液于 37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优选1×SSC)中于50至(优选)55℃ 下洗涤；更优选地，在40至(优选)45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS 中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC(优选0.5×SSC)中于55至(优选) 60℃下洗涤，以及最优选地，在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中 于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60至(优选)65℃下洗涤)。
对这些酶而言，选择优选在包含浓度为大约1mM至大约100mM的 D-丝氨酸的培养基上进行。
还更优选地，能代谢D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的酶选自：
i)SEQ ID NO：4或6编码的瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)D- 氨基酸氧化酶；和
ii)酶，其具有相同的酶活性以及与SEQ ID NO：4或6编码的序列 至少60％(优选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或 95％，最优选98％)的同一性；以及
iii)下述核酸序列编码的酶，所述核酸序列能与SEQ ID NO：3或5 所示的序列的互补序列杂交(优选在与下述条件相当或均等的条件下，所 述条件是用30至(优选)35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液 于37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优选1×SSC)中于50至(优选)55℃ 下洗涤；更优选地，在40至(优选)45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS 中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC(优选0.5×SSC)中于55至(优 选)60℃下洗涤，以及最优选地，在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS 中于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60至(优选)65℃下洗涤)。
对这些酶而言，选择优选在包含总浓度为大约1mM至大约100mM 的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行。
有多种途径来进行基于D-氨基酸或下文相关化合物的选择计划 (scheme)。优选地，选择(例如，一般性方法中的步骤b)或基于腋生 分生组织中的方法中的步骤c))这样进行，其中：
i)使用大约3至大约20mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸，和/或
ii)在去分化条件下进行大约3至4周。
优选地，D-丙氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使用)以大约 0.5mM至大约100mM的浓度使用，优选地，大约1mM至大约70mM， 更优选地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3mM至大约20mM。 优选地，D-丝氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使用)以大约0.5mM 至大约100mM的浓度使用，优选地，大约1mM至大约70mM，更优选 地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3mM至大约15mM。
在一种优选的实施方式中，DNA构建体的引入是通过根瘤菌科细菌介 导的转化来介导的。优选地，根瘤菌科细菌是卸甲的(disarmed)根瘤农 杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)细菌。更优选地，农杆菌菌株是卸甲的发根农杆菌K599菌株。
如上文所述，尤其地，使用泛素启动子已经显示出是有好处的。下文 提供的构建体是新颖的，并且尤其有用于开展本发明。此外，它们还可提 供用于其它植物物种中的用途。由此，本发明的另一实施方式涉及异源核 苷酸序列，其包含：
a)选自来自双子叶植物物种的泛素启动子的启动子，以及与其有效连 接的
b)编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
其中，所述启动子相对所述核酸序列而言是异源的。
优选地，泛素启动子是欧芹泛素启动子或大豆泛素启动子。如上文所 述，这些启动子的序列可被修饰，而不会改变它们的转录能力。由此，本 发明的另一实施方式涉及异源核苷酸序列，其包含：
a)选自以下的启动子：
i)序列，其包含SEQ ID NO：7或8所示的序列，以及
ii)序列，其包含至少一个片段并且在大豆中具有启动子活性，所述片 段为SEQ ID NO：7或8所示的序列的至少50(优选100或150，更优选 200或250，甚至更优选300或500)个连续碱基对，
iii)序列，其包含与SEQ ID NO：7或8所示的序列具有至少60％(优 选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或95％，最优选 98％)同一性的序列，并且在大豆中具有启动子活性，
iv)序列，其包含能与SEQ ID NO：7或8所示的序列杂交(优选在 与下述条件相当或均等的条件下，所述条件是用30至(优选)35％的甲酰 胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液于37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优 选1×SSC)中于50至(优选)55℃下洗涤；更优选地，在40至(优选) 45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC (优选0.5×SSC)中于55至(优选)60℃下洗涤，以及最优选地，在50％ 的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60 至(优选)65℃下洗涤)的序列，并且在大豆中具有启动子活性，
以及
b)编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
其中，所述启动子相对所述核酸序列而言是异源的。
本发明的另一实施方式涉及通过下文提供的方法制造的大豆细胞和植 物。因此，另一实施方式涉及包含下述DNA构建体的大豆植物或细胞， 所述DNA构建体包含在所述大豆植物或细胞中具有活性的启动子，以及 与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序 列，其中，所述启动子相对于所述酶编码序列而言是异源的。优选地，启 动子和/或能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶如上文所定义。更优选地，所 述大豆植物或细胞还包含至少一个第二表达构建体，其向所述大豆植物赋 予有农业经济价值的性状。本发明的其它实施方式涉及所述大豆植物的部 分(其包括但不限于大豆种子(大豆))及其用于食物、饲料和工业目的 的用途。
当基于D-氨基酸氧化酶时，本发明的方法可用作为组合的选择/标记缺 失计划。基于所用的D-氨基酸，D-氨基酸氧化酶可作为阴性或反向选择标 记发挥作用。因此，本发明还提供了提供大豆细胞和植物(优选不含标记 的)的方法，所述方法包括下述步骤：
i)用第一DNA构建体转化大豆植物细胞，所述DNA构建体包含：
a)至少一个第一表达构建体，其包含在所述大豆植物中具有活性的启 动子以及与所述启动子有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其 中，所述第一表达盒侧翼有允许特异性缺失所述第一表达盒的序列，以及
b)至少一个第二表达盒，其适合向所述植物赋予有农业经济价值的性 状，其中，所述第二表达盒不处于允许特异性缺失所述第一表达盒的所述 序列之间，以及
ii)用以植物毒性浓度的选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的第一 化合物处理步骤i)的所述经转化的大豆植物细胞，并且选出在其基因组中 包含所述第一DNA构建体的植物细胞，所述构建体向所述经转化的植物 细胞赋予通过表达所述D-氨基酸氧化酶而针对所述第一化合物的抗性，以 及
iii)诱导所述第一表达盒从所述经转化的植物细胞的基因组缺失，以 及用对仍包含所述第一表达盒的植物细胞有毒的浓度的选自D-异亮氨酸、 D-缬氨酸及其衍生物的第二化合物来处理所述植物细胞，由此选出包含所 述第二表达盒但是缺少所述第一表达盒的植物细胞。
优选地，启动子序列和D-氨基酸氧化酶是上文针对一般性方法所定义 的。
针对大豆的有效转化系统以及尤其是选择标记具有缺点。该缺点尤其 涉及依赖多次相继转化的手段。克服该问题的一种方法是上文提供的组合 的选择和标记缺失方法。另一方法是基于对不同选择系统的组合。由此， 本发明的另一实施方式涉及将至少两种DNA构建体相继转化进大豆植物 的方法，所述方法包括如下步骤：
a)用第一构建体转化，所述第一构建体包含至少一个表达构建体，其 包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编 码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，以及
b)用第二构建体转化，所述第二构建体包含第二选择标记基因，其不 赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
优选地，所述第二标记基因赋予针对选自膦丝菌素(phosphinotricin)、 麦草畏、草甘膦、磺酰脲型和咪唑啉酮型除草剂或抗生素的至少一种化合 物的抗性。此外，所述方法的产品相对本领域而言同样是有新颖性和创造 性的。因此，本发明的另一实施方式涉及大豆植物，其包含：
a)第一表达构建体，其包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及 与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序 列，以及
b)第二表达构建体，其用于选择标记基因，所述基因不赋予针对D- 丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
不仅不同的选择标记系统可与下文提供的标记组合。本文提供的不同 的标记还可组合(无先缺失)，以实现随后的多次转化。因此，本发明的 另一实施方式涉及将至少两种DNA构建体相继转化进大豆植物的方法， 所述方法包括如下步骤：
a)用第一构建体转化，所述第一构建体包含下述表达构建体，所述表 达构建体包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效 连接的编码dsdA酶的核酸序列，并且用D-丝氨酸进行选择，以及
b)用第二构建体转化，所述第二构建体包含下述表达构建体，所述表 达构建体包含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效 连接的编码dao酶的核酸序列，并且用D-丙氨酸进行选择。
此外，所述方法的产品也被认为是相对本领域有新颖性和创造性的。 因此，本发明的另一实施方式涉及大豆植物，其包含：
a)第一构建体，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码 dsdA酶的核酸序列，以及
b)第二构建体，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码 dao酶的核酸序列。
本发明的其它目的、优点和特征将从下述说明书中显而易见。
附图说明
图1：未经接种的幼苗腋生分生组织外植体上的杀伤曲线(栽培种 98822)。
图2：D-丝氨酸对经农杆菌接种的幼苗腋生分生组织外植体的杀伤曲 线。
图3：在D-丝氨酸上3周的枝条诱导。
A.SHA07/pSB1/ET017；顶部：15mM，中部：30mM；底部：45mM D-Ser
B.SHA07/pSB1/EW008；顶部：15mM，中部：30mM；底部：45mM D-Ser。
一般性定义
国际专利申请WO 03/004659(RECOMBINATION SYSTEMS AND A METHOD FOR REMOVING NUCLEIC ACID SEQUENCES FROM THE GENOME OF EUKARYOTIC ORGANISMS)，WO 03/060133 (SELECTIVE PLANT GROWTH USING D-AMINO ACIDS)、国际专利 申请PCT/EP 2005/002735、国际专利申请PCT/EP 2005/002734(WO 2005/090581)、提交于2004年9月2日的申请No.60/606,789和国际专利 申请PCT/EP2005/009366中使用的和描述的教导、方法、序列等通过引用 并入本文。
缩写：BAP——6-苄氨基嘌呤；2，4-D——2，4-二氯苯氧乙酸； MS——Murashige和Skoog培养基(Murashige T和Skoog F(1962) Physiol.Plant.15，472-497)；NAA——1-萘乙酸；MES，2-(N-吗啉代)乙磺 酸；LAA-吲哚乙酸；IBA：吲哚丁酸；Kan：硫酸卡那霉素；GA3——赤 霉酸；TimentinTM：替卡西林二钠/克拉维酸钾。
应当理解，本发明并不限于本文描述的特定的方法、方案、细胞系、 植物物种或属、构建体和试剂。还应当理解，本文所用的术语仅是为了描 述特定实施方式的目的而用的，而非意欲限制本发明的范围，本发明的范 围将仅由所附权利要求来限制。必须要注意，在本文和所附权利要求中使 用时，单数形式“一种/个”、“这种/个”(“a”、“an”和“the”)也包括复数， 除非上下文清楚地另有指明。因此，例如，提到“一种载体”是指一种或多 种载体，并且包括本领域技术人员已知的其等同形式等。
术语“大约”在本文中用来表示大致、约略、左右或在区域中。当术语“大 约”与数值范围联合使用时，其通过扩展所示数值上下的边界来修饰该范 围。通常，术语“大约”在本文中用于修饰在指出的值之上或之下有上下百 分之20，优选百分之10，更优选百分之5(更高或更低)的变化的数值。
在本文中使用时，“或”这个词表示特定列表中的任何一个成员，并且 包括该列表的成员的任何组合。
“农业经济价值性状”包括植物生物中对食物生产或食品(包括植物的 部分和植物产品)有用或有好处的任何表型。非食物的农业产品，例如， 纸等也包括在内。农业经济价值性状的部分列表包括：有害生物抗性，茁 壮性(vigor)，发育时间(收获的时间)，增强的营养含量，新的生长模 式、味道或颜色，盐、热、旱和冷耐受性等。优选地，农业经济价值性状 不包括可选择标记基因(例如，编码除草剂或抗生素抗性的、仅用于协助 对经转化细胞的检测或选择的基因)、导致植物激素(例如，仅用于选择 的生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯)产生的激素生物合成基 因或者报道基因(例如，荧光素酶、葡糖醛酸糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶 (CAT)等)。此类农业经济价值重要性状可包括对有害生物抗性(例如 Melchers 2000)，茁壮性，发育时间(收获的时间)，增强的营养含量， 新的生长模式、味道或颜色，盐、热、旱和冷耐受性(例如Sakamoto 2000； Saijo 2000；Yeo 2000；Cushman 2000)等的改进。技术人员将认识到，有 大量的多核苷酸可供选择来赋予这些或其它农业经济价值性状。
在本文中使用时，术语“氨基酸序列”指代表氨基酸残基的缩写、字母、 字符或词的列表。氨基酸在本文中可用它们公知的三字母标识或单字母标 识(IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的)来代指。类似地，核苷酸可用它们公认的单字母编 码来代指。本文针对氨基酸使用的缩写是传统的单字母编码：A，丙氨酸； B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸盐、 谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨 酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰 胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y， 酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸(见L.Stryer，Biochemistry，1988，W.H. Freeman and Company，New York)。在本文中，字母“x”在氨基酸序列中 可代表任何氨基酸残基。
术语“核酸”指单链或双链的、正义或反义形式的、脱氧核糖核苷酸或 核糖核苷酸及其聚合物或杂化物。除非另有指明，特定的核酸序列还暗示 性包括经保守修饰的其变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确 指出的序列。术语“核酸”在本文中可与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡 核苷酸”和“多核苷酸”互换。
术语“核酸序列”在本文中指代表核苷酸的缩写、字母、字符或词的连 续列表。在一种实施方式中，核酸可以是“探针”，这是相对较短的核酸， 通常长度小于100个核苷酸。通常，核酸探针大约50个核苷酸长至大约 10个核苷酸长。核酸的“靶区域”是核酸中被认为感兴趣的部分。核酸的“编 码区域”是当置于合适的调控序列控制下时以序列特异性方式转录和翻译 以产生特定多肽或蛋白质的核酸的部分。编码区域被描述为编码此类多肽 或蛋白质。除非另有指明，特定的核酸序列还暗示性包括经保守修饰的其 变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。术语“核酸” 在本文中可与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互 换使用。
术语“感兴趣的核苷酸序列”指下述任何核苷酸序列，对其进行的操作 可被本领域普通技术人员认为是就任何原因而言想要的(例如，赋予改进 的品质)。此类核苷酸序列包括但不限于，结构基因(例如，报道基因、 选择标记基因、癌基因、药物抗性基因、生长因子等)的编码序列和不编 码mRNA或蛋白质产物的非编码调控序列(例如，启动子序列、多聚腺苷 酸化序列、终止序列、增强子序列等)。感兴趣的核酸序列可优选编码农 业经济价值性状。
术语“反义”应当被理解为表示具有与靶序列互补的序列的核酸，例如 信使RNA(mRNA)序列，其表达的阻断被是通过与靶序列杂交来起始的。
术语“正义”应当被理解为表示具有与靶序列同源或相同的序列，例如， 与蛋白质转录因子结合并且涉及给定基因表达的序列。根据优选的实施方 式，核酸包含感兴趣的基因和允许所述感兴趣的基因表达的元件。
在本文中使用时，术语“互补”或“互补性”用来描述通过碱基配对规则 相关的核苷酸序列。例如，序列5’-AGT-3’就与序列5’-ACT-3’互补。互补 性可以是“部分的”或“全部的”。“部分的”互补性是这样的，其中，一个或 多个核酸碱基并不按照碱基配对规则匹配。核酸之间“全部的”或“完全的” 互补性是这样的，其中，各个和每一核酸碱基都按照碱基配对规则与另一 碱基匹配。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度有着 显著的影响。本文所用的核酸序列的“互补序列”指这样的核苷酸序列，其 核酸展示出与所述核酸序列的核酸的全部的互补性。
术语“基因组”或“基因组DNA”表示宿主生物的可遗传的遗传信息。所 述基因组DNA既包含细胞核的DNA(也称作染色体DNA)，也包含质体 (例如叶绿体)和其它细胞器(例如线粒体)的DNA。优选地，术语基因 组或基因组DNA指细胞核的染色体DNA。
术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”应当被理解为独立于细胞周 期状态的细胞核基因组DNA。染色体DNA因此可能是在染色体或染色单 体中组织，它们可以是凝聚的(condensed)或非螺旋的(uncoiled)。染 色体DNA中的插入可以是通过本领域已知的多种方法来展现和分析的， 例如，聚合酶链式反应(PCR)分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交 (FISH)和原位PCR。
术语“经分离的”在本文中使用时表示，材料已经从其最初环境移出。 例如，活的动物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的，但是 与自然系统中共存物质中的一些或全部分开的同样的多核苷酸或多肽是经 分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以 是组合物的一部分，并且因为此类载体或组合物并非其最初环境的一部分， 故而将是经分离的。优选地，当用于与核酸相关时，术语“经分离的”表示 与通常和其在天然来源中相关联的至少一种污染性核酸分离并鉴定的核酸 序列。
在本文中使用时，术语“经纯化的”表示下述分子，其是从其天然环境 移出的核酸或氨基酸序列，是经分离的或分开的。因此，“经分离的核酸序 列”是经纯化的核酸序列。“高度纯化的”分子至少60％不含，优选至少75％ 不含，更优选至少90％不含它们天然相关联的其它组分。
“多核苷酸构建体”指至少部分通过重组方法产生的核酸。术语“DNA 构建体”指脱氧核糖核苷酸构成的多核苷酸构建体。构建体可以是单链或者 优选是双链的。构建体可以是环状或线性的。技术人员熟悉用于获得DNA 构建体之一的多种方法。可通过惯用的重组和克隆技术来制备构建体，例 如Maniatis 1989，Silhavy 1984和Ausubel 1987中描述的。
术语“野生型”、“天然”或“天然来源”的在提到生物、多肽或核酸序列 时表示所述生物是天然存在的或者在至少一种天然存在的未经改变、突变 或人工操作的生物中可获得的。
术语“外来基因”表示通过实验操作引入细胞基因组的任何核酸(例如 基因序列)，其可包括在该细胞中发现的基因序列，只要引入的基因相对 天然存在的基因含有一些修饰(例如，点突变、可选择标记基因的存在等) 即可。
术语“异源核酸序列”或“异源DNA”互换使用，表示这样的核苷酸序 列，其与或被操作为与天然其并不相连的核酸序列或与其于天然状态下在 不同的位置相连的核酸序列相连。异源DNA对其所引入的细胞来说并不 是内源的，其是从另一细胞获得的。通常(但并非一定)，此类异源DNA 编码其表达进的细胞正常情况下并不产生的RNA和蛋白质。如果启动子、 转录调控序列或其它遗传元件和另一序列(例如，编码标记序列或农业经 济相关性状)在它们的天然环境中并非组合的或在它们的天然环境中是以 不同方式有效连接的话，那么所述启动子、转录调控序列或其它遗传元件 就被认为相对所述另一序列而言是“异源的”。优选地，所述序列在它们的 天然环境中并非有效连接的(即来自不同基因)。最优选地，所述调控序 列与其天然环境中并不相邻的核酸共价连结并且相邻。
术语“转基因”在本文中用于表示引入细胞基因组或者经由人工实验操 作操作过的任何核酸序列。优选地，所述序列导致产生与天然存在的生物 不同的基因组(例如，如果所述序列对于所述生物是内源的，其被引入与 其天然位置不同的位置或者其拷贝数增加或减少)。转基因可以是“内源 DNA序列”、“外源DNA序列”(例如外来基因)或“异源DNA序列”。术 语“内源DNA序列”指在引入的细胞中天然发现的核苷酸序列，只要其相 对天然存在的序列而言不含一些修饰(例如，点突变、可选择标记基因的 存在等)即可。
当提到细胞或生物时(例如，关于大豆植物或细胞时)，术语“转基因” 或“重组”表示含有转基因的细胞或生物，或者其基因组已通过引入转基因 而改造过的细胞或生物。转基因生物或组织可包含一个或多个转基因细胞。 优选地，所述生物或组织基本由转基因细胞构成(即，所述生物或组织中 的细胞超过80％，优选90％，更优选95％，最优选99％都是转基因的)。 术语“重组”在关于核酸时表示核酸与其天然环境中不相邻的核酸共价连结 并且相邻。“重组”多肽或蛋白质表示通过重组DNA技术生产的多肽或蛋 白质，即，通过被编码想要的多肽或蛋白质的重组DNA构建体转化的细 胞生产的。重组核酸和多肽还可包含天然状态下并不原样存在而是经过修 饰、改变、突变或人工操作过的分子。
“重组多肽”是序列上与天然存在的多肽至少一个氨基酸残基有所不同 的非天然存在的多肽。用于生产此类多肽和/或核酸的优选方法可包含定点 或非定点诱变、DNA混编或回归重组(recursive reconbination)的其它方 法。
当用于核酸或氨基酸序列相关时，术语“同源性”或“同一性”表示序列 相关性或互补性的程度。下述术语被用于描述两条或多条核酸或氨基酸序 列间的序列相关性：(a)“参照序列”、(b)“比较窗”；(c)“序列同一 性”、(d)“序列同一性百分比”和“高度同一性”。
(a)在本文中使用时，“参照序列”是用作为序列比较基础的给定序列。 参照序列可以是指定序列的亚组或整体，例如，作为全长cDNA或基因序 列的片断，或者完整的cDNA或基因序列。
(b)在本文中使用时，“比较窗”表示多核苷酸序列的连续的指定片断， 其中，为了对两条序列进行最优比对，比较窗中的多核苷酸序列较之参照 序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即，空位)。通常，比 较窗长度为至少20个连续核苷酸，任选地，可以是30、40、50、100或更 长。本领域技术人员理解，为避免由于多核苷酸序列中空位的并入导致的 与参照序列的高相似性，一般要引入空位罚分，其要从匹配数中减去。
为比较而对序列加以比对的方法是本领域中公知的。因此，对任何两 条序列间百分比同一性的测定可以使用数学算法来完成。此类数学算法的 优选的非限制性实例是Myers和Miller，1988的算法；Smith等人1981的 局部同源性算法；Needleman和Wunsch 1970的同源性比对算法；Pearson 和Lipman 1988的搜索相似性方法；Karlin和Altschul，1990的算法，在 Karlin和Altschul，1993中改良过。为比较下文的序列，优选地，针对核 苷酸序列使用算法BLASTN，针对蛋白质使用BLASTX，使用它们各自的 默认参数。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用的字长(W)为11， 期望(E)为10，截止(cutoff)为100，M＝5，N＝-4，对两条链加以比较。 对于氨基酸序列而言，BLASTP程序默认使用的字长(W)为3，期望(E) 为10，以及使用BLOSUM62计分矩阵(见Henikoff&Henikoff，1989)。 见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。比对还可通过观察手动进行。多重比对 (即，超过2条序列)优选使用Clustal W算法(Thompson 1994；例如 在软件VectorNTITM，版本9中；英杰生命科学公司(Invitrogen Inc.)) 来进行，其中使用计分矩阵BLOSUM62MT2，使用默认设置(空位开放 罚分15/19，空位延伸罚分6.66/0.05；空位分开罚分范围(gap separation penalty range)8；针对比对延迟的％同一性(％identity for alignment delay)40；使用残基特异性空位和亲水残基空位)。优选用其默认参数使 用BlastN程序(版本1.4.7或更后出的版本)或任何等同程序来进行比较。 “等同程序”意在表示下述任何序列比较程序，其中针对任何两条待讨论的 序列，较之通过优选程序产生的相应比对而言，所述程序能产生具有相同 的核苷酸或氨基酸残基匹配的比对以及相同的百分比序列同一性。用于进 行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)为公众所获 得。除了计算百分比序列同一性之外，BLAST算法还能进行对两条序列间 相似性的统计学分析(见，例如，Karlin&Altschul(1993))。BLAST算 法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了对两条核苷 酸或氨基酸序列将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸序列 与参照核酸序列比较中的最小总和概率小于大约0.1，更优选小于大约 0.01，最优选小于大约0.001的话，测试核酸序列就被认为是与参照序列相 似的。
术语“杂交”在本文中使用时包括“通过其使得核酸的链经由碱基配对 与互补链相连结的任何过程”(Coombs 1994)。杂交和杂交强度(即，核 酸之间结合的强度)受下述因素影响，例如，核酸间互补性的程度、涉及 的条件的严格性、形成的杂化物的Tm以及核酸内的G∶C比。在本文中使 用时，术语“Tm”用来表示“解链温度”。解链温度是双链核酸分子的群体一 半解离为单链的温度。用于计算核酸Tm的公式是本领域公知的。如标准 参考文献所指出的，当核酸处于1M NaCl的水溶液中时，对Tm值的简 单估计可通过公式Tm＝81.5+0.41(％G+C)来计算(见，例如，Anderson 和Young，(1985))。其它参考文献包括更复杂的计算，其中为了计算Tm 考虑了结构特点和序列特点。
高严格洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl，在72℃进行大约15分 钟。严格洗涤条件的一个实例是0.2×SSC，在65℃洗涤15分钟(关于对 SSC缓冲液的描述见下文Maniatis)。通常，低严格性洗涤优于高严格性 洗涤，以除去背景探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体而言， 示例性中等严格性洗涤是1×SSC于45℃进行15分钟。对于例如超过100 个核苷酸的双链体而言，示例性低严格性洗涤是4至6×SSC于40℃进行 15分钟。对于短探针(例如大约10至50个核苷酸)而言，通常，严格条 件包括小于大约1.5M(更优选地，大约0.01至1.0M)Na离子浓度(或 其它盐)的盐浓度，于pH 7.0至8.3进行，温度通常为至少大约30℃，对 于长探针(例如＞50个核苷酸)而言，至少大约60℃。严格条件还可通过 加入去稳定剂(例如甲酰胺)来获得。通常，在特定杂交测定中信噪比是 用不相关探针观察到的2×(或更高)就表示检测到了特异性杂交。在严格 条件下互相不杂交的核酸如果编码高度相同的话，它们仍是高度相同的。 这例如发生在使用遗传密码允许的最大密码子简并性来制造核酸拷贝时。
非常严格的条件被选为与针对特定探针的Tm相等。在Southern或 Northern印迹的膜上用于有超过100个互补残基的互补核酸杂交的高严格 条件的实例是50％甲酰胺，例如，在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中 于37℃杂交，以及在60至65℃于0.1×SSC中洗涤。示例性的低严格性 条件包括：用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠) 的缓冲溶液在37℃进行杂交以及在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3 M柠檬酸三钠)中于50至55℃洗涤。示例性的适度严格性条件包括：在 40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交以及在0.5×至 1×SSC中于55至60℃洗涤。
当关于感兴趣的杂交条件时提到杂交条件时，术语“相当”表示杂交条 件和感兴趣的杂交条件导致具有相同范围百分比(％)同源性的核酸序列 杂交。例如，如果感兴趣的杂交条件导致第一核酸序列与和第一核酸序列 具有80％至90％同源性的其它核酸序列杂交，那么如果另外的杂交条件也 导致第一核酸序列与和第一核酸序列具有80％至90％同源性的其它核酸 序列杂交的话，这种另外的杂交条件就被认为是与感兴趣的杂交条件相当 的。
当提到核酸杂交使用时，本领域技术人员公知，大量相当条件是可使 用的，以包括低或高严格性条件；因素例如探针的长度和性质(DNA、RNA、 碱基组合物)以及靶的性质(DNA、RNA、碱基组合物，以溶液或被固定 化存在的，等)和盐及其它组分的浓度(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙 二醇的存在与否)被考虑，杂交溶液可变化，以产生与上述条件不同但与 其相当的低或高严格性杂交条件。本领域技术人员知道，虽然较高的严格 性可能是优选的，以降低或消除非特异性结合，但是较低的严格性也可能 是优选的，以检测到更大量的具有不同同源性的核酸序列。
术语“基因”表示与能以一定方式调控多肽表达的合适调控序列有效连 接的编码区域。基因包括编码区域(可读框，ORF)前(上游)和后(下 游)的DNA非翻译调控区域(例如，启动子、增强子、阻遏子等)，以 及在适用的情况下，在各编码区域(即，外显子)之间的间插序列(即， 内含子)。术语“结构基因”在本文中使用时意指转录为mRNA其再翻译为 特定多肽所特有的氨基酸序列的DNA序列。
在本文中使用时，提到结构基因时使用的术语“编码区域”指这样的核 苷酸序列，其编码在新生多肽中发现的氨基酸，所述多肽是mRNA分子翻 译的结果。在真核细胞中，编码区域在5’侧的边界是编码起始子甲硫氨酸 的核苷酸三联体“ATG”，在3’侧的边界是代表终止密码子的三种三联体 (即TAA、TAG、TGA)之一。除了含有内含子之外，基因的基因组形 式还包括位于RNA转录本上呈现的序列5’和3’末端的序列。这些序列被 称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录本上的非翻 译序列的5’或3’)。5’侧翼区域可含有调控序列，例如启动子和增强子， 其控制或影响基因的转录。3’侧翼区域可含有指导转录终止、转录后切割 和多聚腺苷酸化的序列。
术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋 白(质)”在本文中可互换使用，用于表示连续氨基酸残基的多聚物或寡聚 物。
术语“经遗传修饰的生物”或“GMO”指包含转基因DNA的任何生物。 示例性生物包括植物、动物和微生物。
术语“植物”在本文中使用时表示多个植物细胞，它们很大程度上分化 为存在于植物发育任何阶段的结构。此类结构包括一种或多种植物器官， 包括但不限于，果、枝条、茎、叶、花瓣等。
术语“细胞”或“植物细胞”的单数形式在本文中使用时表示单个细胞。 术语“细胞”的复数形式表示细胞的群。该群可以是包含一种细胞类型的纯 的群。类似地，所述群可包含超过一种细胞类型。在本发明中，对于细胞 的群可包含的细胞类型的数量没有限制。细胞可以是同步或不同步的。本 发明该涵义中的植物细胞可被分离(例如，在悬浮培养物中)或可被包含 于植物组织、植物器官或任何发育阶段的植物中。
术语“器官”在提到植物时(或“植物器官”)表示植物的部分，其可包 括(但不限于)例如根、果、枝条、茎、叶、花药、萼片、花瓣、花粉、 种子等。
术语“组织”在提到植物时(或“植物组织”)表示多个植物细胞的排列， 其包括分化的和未分化的植物组织。植物组织可构成植物器官的一部分(例 如植物叶的表皮)，其也可以构成肿瘤组织(例如愈伤组织)和培养物中 的多种类型的细胞(例如，单个细胞、原生质体、胚、愈伤组织、原球茎 样体等)。植物组织可以处于植物中，器官培养物、组织培养物或细胞培 养物中。
术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”应当被理解为独立于细胞周 期状态的细胞核基因组DNA。染色体DNA因此可能是在染色体或染色单 体中组织，它们可以是凝聚的(condensed)或非螺旋的(uncoiled)。染 色体DNA中的插入可以是通过本领域已知的多种方法来展现和分析的， 例如，PCR分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。
术语“结构基因”在本文中使用时意指这样的DNA序列，其转录为 mRNA，所述mRNA之后再翻译为特定多肽所特有的氨基酸序列。
术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表 达包括结构基因向mRNA的转录以及任选地mRNA随后向一种或多种多 肽的翻译。
术语“表达盒”或“表达构建体”在本文中使用时意指将表达的任何核酸 序列的组合，所述核酸序列与启动子序列以及任选地协助所述核酸序列表 达的额外的元件(例如终止子和/或多聚腺苷酸化序列)有效连接。
“启动子”、“启动子元件”或“启动子序列”在本文中使用时表示在核苷 酸序列5’端的核苷酸序列，其指导转录的起始(即，能控制核苷酸序列向 mRNA的转录)。通常但非必须地，启动子位于感兴趣的核苷酸序列的5’ (即，上游)，所述启动子控制所述核苷酸序列向mRNA的转录，并且提 供RNA聚合酶和用于起始转录的其它转录因子特异性结合的位点。启动 子序列是必须的，但并非在所有情况下都足以驱动下游基因的表达。通常， 真核启动子在转录起始(帽)位点的5’大约10-30bp处包括与共有的 5′-TATAAT-3′(TATA)框同源的特征性DNA序列，所述转录起始(帽) 位点按照惯例被编号为+1。相对于帽位点3’的碱基被给出正数编号，而帽 位点5’的碱基则获得负数编号，这反映了它们与帽位点的距离。另一启动 子组分—CAAT框通常被发现于TATA框5’的大约30至70bp处，其 与规范形式5′-CCAAT-3′具有同源性(Breathnach 1981)。在植物中，CAAT 框有时候被已知为AGGA框的序列所替换，所述AGGA框是具有腺嘌呤 残基的区域，对称侧接三联体G(或T)NG(Messing 1983)。赋予对转 录的调控影响的其它序列可被发现于启动子区域中，它们延伸到帽位点5’ 的1000bp那么远或者更远。当提到启动子时术语“组成型”表示，所述启 动子能在不存在刺激(例如，热激、化学物、光等)时指导有效连接的核 酸序列的转录。通常，组成型启动子能指导基本上任何细胞和任何组织中 转基因的表达。
调控控制指主要(但非绝对)位于转录起始位点(5’)上游的DNA序 列元件诱导的对基因表达的调节。调控可导致对环境刺激的全有或全无应 答，或者其可能导致产生基因表达水平的变化。在本发明中，热激调控元 件作用于：应答于突然的温度升高，瞬时增强下游基因表达的水平。
多聚腺苷酸化信号表示能影响mRNA加工的任何核酸序列，其通常特 征在于向mRNA前体的3’端加上了聚腺苷酸段(tract)。多聚腺苷酸化 信号DNA片断自身可以是源自数种来源的片断的混合物，可以是天然存 在的或合成的，并且可以来自基因组DNA或源自RNA的cDNA。多聚腺 苷酸化信号通常由存在与规范形式5′-AATAA-3′的同源性来被识别，虽然 距离的变化、部分“连读”和多串联规范序列也并非不常见(Messing 1983)。 应当认识到，规范的“多聚腺苷酸化信号”事实上可能导致转录终止而并非 多聚腺苷酸化本身(Montell 1983)。
热激元件指应答于突然的温度升高胁迫而调控基因表达的DNA序列。 应答被认为下游基因表达水平的立刻的(虽然是瞬时的)增强。虽然对热 激基因的最初工作是用果蝇进行的，但是很多其它物种(包括植物) (Barnett 1980)展示出对胁迫的类似应答。热激元件的关键主要组分于果 蝇中被描述为具有共有序列5′-CTGGAATNTTCTAGA-3′(其中N＝A、T、 C或G)，并且位于转录起始位点上游残基-66至-47bp之间的区域中 (Pelham 1982)。该共有序列的化学合成的寡核苷酸拷贝可代替天然序列 赋予热激可诱导性。
前导序列指包含大约100个核苷酸的、位于转录起始位点和翻译起始 位点之间的DNA序列。前导序列中包含指定核糖体结合位点的区域。
在这方面的研究中，内含子或间插序列指随着编码序列(外显子)一 起转录但是随后在成熟mRNA形成中被除去的那些DNA序列区域。内含 子可存在于转录的序列中的任何地方——在相同或不同基因的编码序列之 间、在基因编码序列中、打断和分开其氨基酸序列以及在启动子区域中(翻 译起始位点的5’)。初级转录本中的内含子被切掉，编码序列同时精确连 接，形成成熟mRNA。内含子和外显子的连接处形成剪接位点。内含子的 碱基序列以GU起始以AG结尾。在很多高等真核生物中发现了同样的剪 接信号。
术语“有效地相连”或“有效连接”应当被理解为表示：例如，调控元件 (例如启动子)与待表达核酸序列以及根据需要还有其它调控元件(例如 终止子)的顺序排列，排列的方式使得每个调控元件都能达到其意欲的功 能以允许、修饰、协助或者另外影响所述核酸序列的表达。对于正义或反 义RNA，表达可根据核酸序列的排列而产生。为达到此目的，以化学正义 的直接连接并非必需。遗传控制序列，例如，增强子序列也可从更远的位 置或者甚至是来自其它DNA分子的位置对靶序列施加其功能。优选的排 列是这样的，其中，待重组表达的核酸序列位于作为启动子发挥作用的序 列之后，使得两条序列互相共价相连。启动子序列和待重组表达的核酸序 列之间的距离优选小于200个碱基对，尤其优选小于100个碱基对，非常 尤其优选小于50个碱基对。有效连接和表达盒可通过惯用的重组和克隆技 术产生，(例如Maniatis 1989；Silhavy 1984；Ausubel 1987；Gelvin 1990 中)所述的。但是，其它序列，例如作为与针对限制性酶的特异性切割位 点的接头发挥作用的序列，或者作为信号肽发挥作用的序列也可位于两条 序列之间。序列的插入还可能导致融合蛋白的表达。优选地，由启动子和 待表达的核酸的连接构成的表达盒可作为载体整合形式存在，并且可被插 入植物基因组，例如通过转化实现。
术语“转化”在本文中用于表示向细胞中引入遗传材料(例如，转基因)。 细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。术语“瞬时转化”或“经瞬时转化的”指 将一种或多种转基因引入细胞，而所述转基因并不整合进宿主细胞的基因 组。瞬时转化可例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测，其检测转 基因中一种或多种所编码的多肽的存在。备选地，可通过检测转基因(例 如uid A基因)编码的蛋白质(例如β-葡糖醛酸糖苷酶)的活性来检测瞬 时转化，如本文所述(例如，通过用在存在GUS酶时提供蓝色沉淀物的 X-gluc进行染色，来对GUS酶活性进行组织化学测定；以及用GUS-Light 试剂盒(Tropix)来对GUS酶活性进行化学发光测定)。术语“瞬时转化 体”指瞬时掺入了一种或多种转基因的细胞。相反，术语“稳定转化”或“经 稳定转化的”指将一种或多种转基因引入并整合进细胞的基因组，优选产生 染色体整合以及通过减数分裂的稳定可遗传性。可通过用能与转基因中一 种或多种相结合的核酸序列对细胞的基因组DNA进行Southern印迹杂交 分析来检测对细胞的稳定转化。备选地，还可通过对细胞的基因组DNA 进行聚合酶链式反应以扩增转基因序列，来检测对细胞的稳定转化。术语 “稳定转化”指已经向其基因组DNA(包括质体和核DNA，优选整合进核 的染色体DNA)中稳定整合了一种或多种转基因的细胞。因此，稳定转化 体与瞬时转化体的区别在于，来自稳定转化体的基因组DNA含有一种或 多种转基因，而来自瞬时转化体的基因组DNA不含转基因。转化还包括 将遗传材料以植物病毒载体的形式引入植物细胞，包括表染色体复制和基 因表达，其可展示出关于减数分裂稳定性的可变性质。转化还包括将遗传 材料以植物病毒载体的形式引入植物细胞，包括表染色体复制和基因表达， 其可展示出关于减数分裂稳定性的可变性质。优选地，术语“转化”包括将 遗传材料引入植物细胞，导致染色体整合和经由减数分裂的稳定可遗传性。
术语用细菌“感染”的各种词性形式表示：在使得细菌中含有的核酸序 列能被引入靶生物样品的一个或多个细胞中的条件下，将靶生物样品(例 如，细胞、组织等)与细菌共孵育。
术语“农杆菌”表示土传(soil-borne)、革兰氏阴性、杆状致植物病性 细菌，其导致冠瘿。术语“农杆菌”包括但不限于：菌株根瘤农杆菌(通常 在受感染的植物中导致冠瘿)和发根农杆菌(在受感染的宿主植物中导致 发根病)。用农杆菌对植物细胞的感染通常导致受感染的细胞产生冠瘿碱 (例如，胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，导致胭脂碱产生的农杆菌 菌株(例如菌株LBA4301、C58、A208)被称为“胭脂碱型”农杆菌；导致 章鱼碱产生的农杆菌菌株(例如菌株LBA4404、Ach5、B6)被称为“章鱼 碱型”农杆菌；导致农杆碱产生的农杆菌菌株(例如菌株EHA105、EHA101、 A281)被称为“农杆碱型”农杆菌。
术语“轰击”的各种词性形式和“生物射弹轰击”指：将颗粒朝向靶生物 样品(例如，细胞、组织等)加速，以导致靶生物样品的细胞的细胞膜受 损伤和/或使颗粒进入靶生物样品中的过程。用于生物射弹轰击的方法是本 领域已知的(例如US 5,584,807，其内容通过引用并入本文)并且是可商 业获得的(例如，氦气驱动的微粒加速器(PDS-1000/He)(BioRad))。
在提到植物组织时，术语“微损伤”表示在该组织中引入显微损伤。微 损伤可例如通过本文所述的粒子轰击来实现。
本文所用的“转化效率”或“转化频率”可通过在标准实验条件下恢复的 经转化细胞(或从各经转化细胞生长的转基因生物)的数量(即，针对与 外来DNA接触的细胞的量、递送的DNA的量、DNA递送的类型和条件、 一般性培养条件等标准化或归一化的)来测量。例如，当腋生分生组织的 经分离外植体被用作为转化的起始材料时，转化的频率可被表示为从每 100个经分离的经转化外植体获得的转基因植物株系的数量。
术语“分生组织”(“meristem”或“meristematic tissue”)或“分生组织 细胞”可互换使用，它们意指未分化的植物组织，其不断分裂，形成新的细 胞，如在茎尖或根尖发现的那样。术语“节”或“叶节”意指茎上与叶相连或 已相连有叶的点。术语“节间”意指茎上两个节之间的段或部分。术语“叶柄 (petiole)”意指叶与茎相连的柄，也称为“叶柄(leaf-stalk)”。术语“腋芽” 意指茎或枝上的小突起(protuberance)，它们有时是被保护性鳞片 (protective scales)所包裹的，并且含有未发育的枝条、叶或花，也被称 为侧芽。术语“下胚轴(hypocotyl)”意指种子的叶(子叶)和根之间的茎 的部分。术语“叶腋”意指叶和其所生出的茎之间的角度。腋芽存在于叶腋 上。术语“子叶”意指种子植物的胚的叶，其在萌发时或者保留于种子中或 者脱出、变大并变绿；其也被称为子叶(seed leaf)。胚轴位于子叶之间， 其在最接近珠孔的末端与它们相连。
术语“去分化”、“去分化处理”或“去分化预处理”表示获得下述细胞簇 (例如愈伤组织)的过程，所述细胞簇展示出无组织(unorganized)的生 长，所述过程通过在去分化培养基上培养分化的植物组织细胞来实现。更 具体地，术语“去分化”在本文中使用时意指快速分裂的、在植物机体的范 围中没有特定功能的细胞形成的过程。这些细胞通常具有增加的潜力，所 述潜力有发育成多种植物组织的能力。优选地，该术语意指分化的或特化 的(specialized)组织向更多能或全能(例如，胚胎)形式的反转。去分 化可导致植物组织的重编程(首先反转为未分化的、未特化的细胞，然后 进入新的不同的途径)。术语“全能性”在本文中使用时表示含有形成整株 植物所需的所有遗传和/或细胞信息的植物细胞。可通过某些植物生长调控 子(例如生长素和/或细胞分裂素化合物)来启动去分化，尤其是通过其某 些组合和/或浓度来启动。
发明详述
本发明是基于D-氨基酸选择系统对大豆(Glycine max)的品种进行 直接种系遗传转化的方法。本发明的第一种实施方式涉及一种方法，用于 产生转基因大豆植物，所述方法包括步骤：
a.向大豆细胞或组织引入DNA构建体，所述构建体包含至少一个第 一表达构建体，所述第一表达构建体包含在所述大豆植物中具有活性的启 动子以及与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的 酶的核酸序列，以及
b.在选择培养基上对步骤a)的所述大豆细胞或组织进行至少5天时 间的培养，所述培养基包含总浓度为大约3mM至大约100mM的D-丙氨 酸和/或D-丝氨酸和/或其衍生物，以及
c.将步骤b)的所述大豆细胞或组织转入再生培养基，对包含所述 DNA构建体的大豆植物进行再生和选择。
在一种实施方式中，在共培养后施加的选择压力包括下述步骤中的一 种或多种：
a.在枝条诱导时首先无选择；
b.在枝条诱导期间选择，
c.在枝条延长期间选择。
优选地，如果加入培养基，例如SIM培养基等培养基，D-ala浓度为 40mM或更低，更优选30mM或更低。此外，在一种实施方式中，所述 浓度为2mM左右、3mM左右或5mM左右或更高，更优选的是10mM 左右。因此，在一种实施方式中，在用于选择的培养基中，所述浓度为7.5 和20mM D-ala之间。与低于10mM D-丝氨酸的浓度组合，D-ala的浓度 优选为30mM或更低，甚至更优选的是20mM或更低。本领域技术人员 从该数据可以知道如何针对每种单独的选择计划的特定条件来调整D-ala 或D-ala和D-ser浓度，例如，如果使用另外的培养基、另外的枝条龄、 另外的孵育时间或另外的构建体等的话，浓度可以变化。例如，更高的表 达速率或酶活性(例如，由于使用了更强的启动子)允许更高浓度的D-ala 和/或D-ser使用。因此，在一种实施方式中，选择应当以枝条诱导中的5 至20mM D-Ala左右，例如，10至15mM左右，与枝条延长中的1至10 mM，优选低于7.5mM，更优选2至5mM D-Ala，例如3mM左右D-Ala 的组合。因此，在一种实施方式中，选择应当以枝条诱导中的5至20mM D-Ser左右，例如，10至15mM左右，与枝条延长中的1至10mM，优 选低于7.5mM，更优选2至5mM D-Ser，例如3mM左右D-Ser的组合。 因此，在一种实施方式中，选择应当以枝条诱导中的大约5至20mM D-Ser 和D-Ala，例如，10至15mM，组合枝条延长中的1至10mM，优选低 于7.5mM，更优选2至5mM D-Ser和D-Ala，例如3mM左右D-Ser和 D-Ala。例如，选择这样进行，其中：
i)使用大约3至大约30mM的D-丙氨酸；
ii)使用大约30至50mM的D-丝氨酸，和/或
iii)使用大约1至10mM的D-丝氨酸组合30mM或更少的D-丙氨酸， 优选大约5至7mM左右的D-丝氨酸，例如7.5mM，和10mM至20mM 的D-丙氨酸，在去分化条件下进行大约3至4周。因此，在一种实施方式 中，用dsda基因转化后的选择包含下述步骤：
a.5至10天，例如7天的枝条诱导，无选择，
b.2至4周，例如3周，在含有5mM至10mM，例如7.5mM D-丝 氨酸的枝条诱导培养基上进行，
c.2mM至7mM，例如5mM的D-丝氨酸，在枝条延长期间进行。
因此，在另一实施方式中，用dao 1基因转化后的选择包含下述步骤：
a.5至10天，例如，6至7天的枝条诱导，无选择，
b.2至4周，例如3周，在含有5mM至10mM，例如7.5mM D-丙 氨酸的枝条诱导培养基上进行，
c.2mM至7mM，例如5mM的D-丙氨酸，在枝条延长期间进行。
此外，用dao 1基因转化后的选择包含例如下述步骤：
a.5至10天，例如，5至7天的枝条诱导，无选择，
b.2至4周，例如3周，在含有5mM至10mM，例如7.5mM D-丙 氨酸和5mM至10mM，例如7.5mM D-丝氨酸的枝条诱导培养基上进行，
c.2mM至7mM，例如5mM的D-丝氨酸和2mM至7mM，例如5 mM的D-丙氨酸，在枝条延长期间进行。
在一种实施方式中，本发明的方法包括下述步骤中的一种或多种，例 如，全部：
a.对幼苗进行灭菌；
b.在光下使幼苗进行3至10天，优选5至8天，例如7天的生长；
c.使具有具一小叶的叶的上胚轴生长至子叶的长度或更长；
d.使上胚轴生长至0.5cm至4cm，例如0.7cm或更长，1.0cm或更 长或2cm或更短
e.除去所有预先形成的叶，包括顶端分生组织
f.切几下，使位于在第一组叶子(the first set of leaves)上的节损伤，
g.将受到损伤的节与农杆菌混合物在液体培养基中共培养0.1h至1 h，例如0.5h。
h.将节与农杆菌在黑暗中于固体共培养培养基上共培养3至5天；
i.在18h光照/6h黑暗的周期下，70至100microE/m2s下，对外植 体加以选择，直到在上胚轴以上第一节处腋生分生组织生长；
j.共培养后至多2周，移出转化前形成的枝条，并且任选地，在此期 间将外植体切为小块；
k.共培养后2至4周后，将外植体转入枝条原基延长培养基，除去死 的组织后，每2至3周将外植体转入新鲜的含有选择剂的培养基，直到枝 条延长；
l.从外植体上移出3cm或更长的枝条，将其放进根诱导培养基一周， 直到根开始形成；
m.将生根的枝条转进土壤，使其在生长室中硬化(harden)2至3周， 之后将生根的枝条转入温室。
因此，使用dsdA基因的本发明的方法在一个优选的步骤中包括使用 来自大豆的枝条腋生分生组织作为外植体用于转化。特别地，可使用发根 农杆菌SHA017或根瘤农杆菌菌株来进行转化，优选的是使用发根农杆菌 SHA017，例如下文所述的菌株K599。在一种实施方式中，感染在室温， 例如18℃至低于25℃之间，优选20℃至23℃之间进行30分钟左右， 例如，25至35分钟之间。在一种实施方式中，OD可在1.5左右。此外， 共培养优选进行5天左右，例如，3至8天，更优选4或5天，优选在黑 暗中进行，并且在例如23℃至27℃，优选24℃至25℃进行。在一种实 施方式中，经转化外植体的恢复进行5天左右至8天左右，例如，6或7 天，优选在光下进行，并且在例如大约25℃或23℃至27℃，优选地，24℃ 至26℃进行。如上文已经描述的以及下文将要描述的，枝条/愈伤组织启 动期间的选择可在例如3mM至10mM D-ser的浓度下进行，优选地，7.5 mM左右的D-ser，或者在本文描述的其它合适的浓度和组合物下进行， 所述选择进行3周左右，例如15至24天，优选20至22天，优选在光下 进行，并且例如在大约25℃或23℃至26℃，优选地，24℃至25℃进行。 此外，枝条延长/愈伤组织再生期间的选择步骤可在例如3mM至10mM D-ser的浓度下进行，优选地，5mM左右的D-ser，或者在本文描述的其 它合适的浓度和组合物下进行，所述选择进行4至5周左右，例如25至 35天，优选30天左右，优选在光下进行，并且例如在大约25℃或23℃ 至26℃，优选地，24℃至25℃进行。生根步骤可在没有或非常小量的选 择下进行，例如，在0mM左右的D-ser下进行1至2周左右，例如，5 至10天，优选在光下进行，并且例如在23℃至27℃，优选24℃至25℃ 进行。
1.本发明的DNA构建体
1.1本发明的第一表达构建体
第一表达构建体包含在大豆中具有活性的启动子以及与所述启动子有 效连接的编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列。优选地， 所述启动子相对所述酶编码序列来说是异源的。在大豆植物中具有活性的 启动子和D-丙氨酸和/或D-丝氨酸代谢酶如下文所详细定义。
1.1.1能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶
本领域技术人员知道多种适于代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的序列。 术语“能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶”优选表示这样的酶，其能以转化 相应L-氨基酸(即，D-丙氨酸和/或D-丝氨酸)以及更优选地任何其它D- 和/或L-或非手性氨基酸的活性的至少两倍(至少高100％)，优选至少三 倍，更优选至少五倍，甚至更优选至少10倍，最优选至少50倍或100倍 的活性来转化和/或代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸。
优选地，能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自：D-丝氨酸解氨酶(D- 丝氨酸脱水酶；EC 4.3.1.18；以前是EC 4.2.1.14)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)和D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。更优选地，能代谢D-丙氨酸 或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸解氨酶(D-丝氨酸脱水酶；EC 4.3.1.18；以 前是EC 4.2.1.14)和D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)。术语“D-丝氨酸解氨 酶”(D-丝氨酸脱水酶；EC 4.3.1.18；以前是EC 4.2.1.14)表示能催化D- 丝氨酸向丙酮酸盐和氨转化的酶。催化的反应可能包括：最初除去水(因 此该酶原来被分类为EC 4.2.1.14)，接着异构化，以及通过C-N键断裂来 水解产物。关于合适的酶的实例，参见 http://www.expasy.org/enzyme/4.3.1.18。术语“D-丙氨酸转氨酶”(EC 2.6.1.21)表示能催化D-丙氨酸与2-酮戊二酸反应形成丙酮酸盐和D-谷氨 酸盐的反应的酶。D-谷氨酸盐对植物的毒性比D-丙氨酸要小得多。 http://www.expasy.org/enzyme/2.6.1.21。
术语D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3；缩写为DAAO、DAMOX或DAO) 指这样的酶，其能优选通过用氧(O2)作为底物来进行，将D-氨基酸转化 为2-氧代酸，并且产生过氧化氢(H2O2)作为副产物(Dixon 1965a，b，c； Massey 1961；Meister 1963)。DAAO的描述可见国际生物化学和分子生 物学命名协会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)(IUBMB)关于EC(酶协会(Enzyme Commission))编号1.4.3.3的描述。通常，EC 1.4.3.3类的DAAO酶是 FAD黄素酶，其催化中性和碱性D-氨基酸氧化为其对应的酮酸。DAAO 已经在真菌和脊椎动物中被表征和测序过，在真菌和脊椎动物中它们已知 位于过氧化物酶体中。在DAAO中，已经显示(Miyano 1991)，保守的 组氨酸对于酶的催化活性来说是重要的。在本发明的一种优选的实施方式 中，DAAO指包含下述共有基序的蛋白质： [LIVM]-[LIVM]-H＊-[NHA]-Y-G-x-[GSA]-[GSA]-x-G-x5-G-x-A，其中，括 号中给出的氨基酸残基代表对各位置的备选残基，x代表任何氨基酸残基， 指数数字表示各连续氨基酸残基的数量。对于各氨基酸残基而言，缩写具 有其标准IUPAC含义，如上文所定义。D-氨基酸氧化酶(EC编号1.4.3.3) 可分离自多种生物，包括但不限于：猪、人、大鼠、酵母、细菌或真菌。 示例性生物是热带假丝酵母(Candida tropicalis)、三角酵母(Trigonopsis variabilis)、粗糙麦孢菌(Neurospora crassa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和瘦弱红酵母。合适的D-氨基酸代谢多肽可以是真核生物酶， 例如，来自酵母(例如，瘦弱红酵母)、真菌或动物，或者其可以是原核 生物酶，例如，来自细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)。关于合适 的酶的实例，见http://www.expasy.org/enzyme/1.4.3.3。
能代谢D-氨基酸的合适的多肽的实例如表1所示。编码所述酶的核酸 序列可从数据库(例如，在Genbank登录号No.U60066、A56901、 AF003339、Z71657、AF003340、U63139、D00809、Z50019、NC_003421、 AL939129、AB042032下)获得。如上文所述，来自数种不同物种的DAAO 已被表征过，它们显示了略有不同的底物亲和性(Gabler 2000)，但是一 般而言，它们都展示广谱底物特异性，对所有D-氨基酸都能氧化性脱氨。
表1：适于代谢D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的酶。尤其优选的酶以黑体 表示。
酶 EC 编 号 示例性来源生物 底物 D-丝氨酸脱水酶(D- 丝氨酸解氨酶，D- 丝氨酸脱氨酶) EC 4.3.1.18 (最初 是EC 4.2.1.14) P54555枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) P00926大肠杆菌.DSDA Q9KL72霍乱弧菌(Vibrio cholera.)VCA0875 Q9KC12 Bacillus halodurans. D-Ser D-Thr D-别苏氨酸 (D-allothreonine) D-氨基酸氧化酶 EC 1.4.3.3 JX0152腐皮镰孢(Fusarium solani) O01739漂亮新小杆线虫 (Caenorhabditis elegans.) O33145麻疯分枝杆菌 (Mycobacterium leprae.)AAO. O35078大鼠(Rattus norvegicus)(大鼠) O45307漂亮新小杆线虫 P00371猪(Sus scrofa)(猪) P14920人(Homo sapiens)(人) P14920人(人) P18894小鼠(Mus musculus) (小鼠) P22942穴兔(Oryctolagus cuniculus)(兔) P24552腐皮镰孢(pisi亚种) (Fusarium solani(subsp.pisi))(Nectria haematococca) P80324红冬孢酵母 (Rhodosporidium toruloides)(酵母) (瘦弱红酵母) Q19564漂亮新小杆线虫 大多数D-氨基 酸
酶 EC编 号 示例性来源生物 底物 Q28382猪(猪) Q7SFW4粗糙麦孢菌 Q7Z312人(人) Q82MI8阿佛曼菌(Streptomyces avermitilis) Q8P4M9野油菜黄单胞菌 (Xanthomonas campestris) Q8PG95地毯草黄单胞菌 (Xanthomonas axonopodis) Q8R2R2小鼠(小鼠) Q8SZN5黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) Q8VCW7小鼠(小鼠) Q921M5 Cavia parcellus(豚鼠) Q95XG9漂亮新小杆线虫 Q99042三角酵母 Q9C1L2粗糙麦孢菌 Q9JXF8脑膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseria meningitidis)(血清群B) NMB2068 Q9V5P1黑腹果蝇 Q9VM80黑腹果蝇 Q9X7P6天蓝色链霉菌 (Streptomyces coelicolor) Q9Y7N4粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)(裂殖 酵母)SPCC1450 Q9Z1M5 Cavia porcellus(豚鼠) Q9Z302田鼠(Cricetulus griseus) U60066红冬孢酵母，(瘦弱红酵 母)菌株TCC 26217 D-丙氨酸转氨酶 2.6.1.21 P54692地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) P54693球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus) P19938芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)(菌株YM-1) 007597枯草芽孢杆菌 085046单核细胞增生利斯特氏菌 (Listeria monocytogenes) P54694溶血性葡萄球菌 D-Ala D-Arg D-Asp D-Glu D-Leu D-Lys D-Met D-Phe D-正缬氨酸
酶 EC编 号 示例性来源生物 底物 (Staphylococcus haemolyticus)
本文上下文中，尤其优选的是来自酵母瘦弱红酵母(红冬孢酵母)的 dao1基因(EC：1.4.3.3；GenBank登录号：U60066)和大肠杆菌基因dsdA (D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)[EC：4.3.1.18；GenBank登录号： J01603])。dao1基因特别有好处，因为其可用作为双功能标记(见国际 专利申请PCT/EP 2005/002734；WO 2005/090581)。
合适的D-氨基酸催化酶还包括上文例示的多肽的片段、突变体、衍生 物、变体和等位体。合适的片段、突变体、衍生物、变体和等位体是保留 有上文定义的D-氨基酸代谢酶的功能特点的那些。对序列的改变以产生突 变体、变体或衍生物可能是通过核酸中一个或多个核苷酸的添加、插入、 缺失或取代的一种或多种造成的，这导致编码的多肽中一个或多个氨基酸 的添加、插入、缺失或取代。当然，不造成编码氨基酸序列差异的核酸改 变也包括在内。
对本发明的方法而言更优选地，能代谢D-丝氨酸的酶选自：
i)SEQ ID NO：2编码的大肠杆菌D-丝氨酸解氨酶；和
ii)酶，其与SEQ ID NO：2编码的序列具有相同酶活性并且具有至 少60％(优选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或95％， 最优选98％)的同一性；以及
iii)下述核酸序列编码的酶，所述核酸序列能与SEQ ID NO：1所示 的序列的互补序列杂交(优选在与下述条件相当或均等的条件下，所述条 件是用30至(优选)35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液于 37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优选1×SSC)中于50至(优选)55℃ 下洗涤；更优选地，在40至(优选)45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS 中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC(优选0.5×SSC)中于55至(优选) 60℃下洗涤，以及最优选地，在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中 于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60至(优选)65℃下洗涤)，
并且，其中，选择在包含浓度为大约0.5mM至大约100mM的D-丝 氨酸的培养基上进行，所述浓度优选地，大约1mM至大约70mM，更优 选地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3mM至大约15mM。 在去分化条件下进行的总的选择时间优选为大约1至10周，优选2至8 周，更优选3至4周。
因此，在一种实施方式中，在本发明的方法中，能代谢D-丝氨酸的酶 选自：
i)表1所示的D-丝氨酸解氨酶，
ii)酶，其具有相同的酶活性，并且与表1所示的D-丝氨酸解氨酶的 氨基酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优 选至少95％，最优选至少98％)的同一性；以及
iii)酶，其具有相同的酶活性，并且与表1所示的D-丝氨酸解氨酶的 核酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选 至少95％，最优选至少98％)的编码核酸序列的同一性；以及
iv)能与编码表1所示的D-丝氨酸解氨酶的序列的互补序列杂交的核 酸序列编码的酶，
并且，其中，选择在包含浓度为3mM至100mM的D-丝氨酸的培养 基上进行，优选地，4至10mM；
或者，其中，能代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸的酶选自：
i)表1所示的D-氨基酸氧化酶，
ii)酶，其具有相同的酶活性，并且与表1所示的D-氨基酸氧化酶的 氨基酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优 选至少95％，最优选至少98％)的同一性；以及
iii)酶，其具有相同酶活性，并且与表1所示的D-氨基酸氧化酶的核 酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至 少95％，最优选至少98％)的编码核酸序列的同一性；以及
iv)能与编码表1所示的D-氨基酸氧化酶的序列的互补序列杂交的核 酸序列编码的酶，
并且，其中，选择在包含总浓度为3mM至100mM的D-丙氨酸和/ 或D-丝氨酸的培养基上进行，优选地，4至10mM。
在关于D-丝氨酸解氨酶的上下文中，“相同活性”表示能代谢D-丝氨 酸的能力，优选地，D-丝氨酸作为最优选的底物。代谢表示上文所指出的 裂合酶反应。
此外，对本发明的方法而言更优选地，能代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸 的酶选自：
i)SEQ ID NO：4或6编码的瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶；和
ii)酶，其具有相同的酶活性并且与SEQ ID NO：4或6编码的序列 具有至少60％(优选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％ 或95％，最优选98％)的同一性；以及
iii)下述核酸序列编码的酶，所述核酸序列能与SEQ ID NO：3或5 所示的序列的互补序列杂交(优选在与下述条件相当或均等的条件下，所 述条件是用30至(优选)35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液 于37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优选1×SSC)中于50至(优选)55℃ 下洗涤；更优选地，在40至(优选)45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS 中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC(优选0.5×SSC)中于55至(优选) 60℃下洗涤，以及最优选地，在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中 于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60至(优选)65℃下洗涤)，
并且，其中，选择在包含总浓度为大约0.5mM至大约100mM的D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行，所述浓度优选地，大约1mM至 大约70mM，更优选地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3mM 至大约15mM。优选地，D-丙氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使 用)以大约0.5mM至大约100mM的浓度使用，优选地，大约1mM至 大约70mM，更优选地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3mM 至大约20mM。优选地，D-丝氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使 用的话)以大约0.5mM至大约100mM的浓度使用，优选地，大约1mM 至大约70mM，更优选地，大约2mM至大约50mM，最优选地，大约3 mM至大约15mM。去分化条件下进行的总的选择时间优选为大约1至10 周，优选2至8周，更优选3至4周。
在关于D-氨基酸氧化酶的上下文中，“相同活性”表示能代谢广谱D- 氨基酸的能力(优选地，至少D-丝氨酸和/或D-丙氨酸)。代谢表示上文 所指出的氧化酶反应。
指出的序列的突变体和衍生物还可包含一种或多种特点(Ki、底物特 异性等)有所改进但仍包含关于D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的代谢活性的酶。 此类序列和蛋白质还包括源自诱变和重组流程(例如DNA混编)的序列 和蛋白质。使用此类流程，可对一种或多种不同的编码序列加以操作，以 产生新的具有想要的性质的多肽。以这种方式，从相关序列多核苷酸的群 中产生重组多核苷酸文库，所述相关序列多核苷酸的群包含具有高度序列 同一性并且可被体外或体内同源重组的序列区域。可例如用DNA混编方 案来调节编码候选酶的多核苷酸。DNA混编是在DNA分子中迅速、容易 且高效引入突变或重排(优选随机地)或在两个或多个DNA分子间产生 DNA序列的交换(优选随机地)的方法。DNA混编产生的DNA分子是经 改组的DNA分子，其是源自至少一种模板DNA分子的非天然存在的DNA 分子。经改组的DNA编码相对于模板DNA编码的酶而言经修饰的酶，其 优选具有相对于模板DNA编码的酶而言改变的生物学活性。DNA混编可 基于回归重组和突变的过程，这通过对相关基因的库进行随机片段化接着 通过聚合酶链式反应类似的过程对片段加以重新装配来实现。见，例如， Stemmer 1994 a，b；Crameri 1997；Moore 1997；Zhang 1997；Crameri 1998；US 5,605,793、US 5,837,458、US 5,830,721和US 5,811,238。通过经 改组的DNA得到的dsdA样或dao样的酶具有与酶的原始版本不同的氨基 酸序列。序列同一性的示例性范围如上文所述。
本发明的D-氨基酸代谢酶可在植物细胞的细胞溶胶、过氧化物酶体或 其它细胞内区室中表达。对D-氨基酸代谢酶的区室化可通过将编码DAAO 多肽的核酸序列与编码转运肽的序列融合产生融合蛋白来实现。没有此类 转运肽时表达的基因产物通常积累于细胞溶胶中。
1.1.2用于大豆植物的启动子
1.1.2.1一般性启动子
术语“启动子”在本文中使用时意指指导DNA序列(例如，结构基因) 转录的DNA序列。通常，启动子位于基因的5’区域，接近于结构基因的 转录起始位点。如果启动子是可诱导启动子，那么转录速率应答于诱导剂 而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，那么转录的速率不受诱导试 剂的调控。此外，可以以组织特异性或组织优选型方式对启动子加以调控， 使得其仅对在特定组织类型(例如叶、根或分生组织)中转录相关编码区 域有活性。
术语“在大豆植物中具有活性的启动子”表示下述任何启动子，无论是 否源自植物，所述启动子能在发育中或在去分化条件下于至少一个时间点 诱导有效连接的核苷酸序列在至少一种大豆细胞、组织、器官或植物中发 生转录。此类启动子可以是非植物启动子(例如，源自植物病毒或农杆菌) 或植物启动子，优选地，双子叶植物启动子。本领域技术人员知道可能适 用于大豆植物的数种启动子。在本文上下文中，表达可以是，例如，组成 型的、可诱导的或发育依赖性的。下述启动子是优选的：
a)组成型启动子
“组成型”启动子指：在植物发育的大量时期，优选在植物发育期间的 所有时间，在大量组织，优选所有组织中都确保表达实现的那些启动子。 实例包括：CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子(Franck 1980；Shewmaker 1985；Gardner 1986；Odell 1985)、19S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey 1989)、Rubisco小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、 豆球蛋白B启动子(GenBank登录号No.X03677)、来自农杆菌的胭脂 碱合酶的启动子、TR双启动子、来自农杆菌的OCS(章鱼碱合酶)启动 子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、液泡ATPase亚基的启动子、 pEMU启动子(Last 1991)、MAS启动子(Velten 1984)、拟南芥 (Arabidopsis thaliana)腈水解酶-1基因的启动子(GenBank登录号No.： U38846，核苷酸3862至5325或5342)以及在植物中组成型表达的基因的 其它启动子。
其它合适的组成型启动子是肌动蛋白启动子。来自双子叶植物的数种 肌动蛋白启动子的序列可从Genbank公开的基因组序列(例如：AY063089 (拟南芥肌动蛋白8基因)；AY096381(拟南芥肌动蛋白2基因)； AY305730：(陆地棉(Gossypium hirsutum)肌动蛋白8基因)；AY305724 (陆地棉肌动蛋白2基因)；AF111812(欧洲油菜(Brassica napus)肌 动蛋白基因))获得。它们的启动子在异源表达中的使用被针对香蕉肌动 蛋白启动子描述过(US20050102711)。An等人[Plant J 199610(1)：107-121] 报道过：Act2和Act8mRNA在叶、根、茎、花、花粉和长角果中强烈表 达。嵌合GUS构建体在植物组织的大多数中表达，但是在种皮、下胚轴、 雌蕊或花粉囊中几乎没有检测到表达。
b)组织特异性或组织优选型启动子
还优选对于种子具有特异性的启动子，例如，菜豆蛋白启动子(US 5,504,200；Bustos 1989；Murai 1983；Sengupta-Gopalan 1985)、2S清蛋白 基因的启动子(Joseffson 1987)、legumine启动子(Shirsat 1989)、USP (未知的种子蛋白)启动子(1991a)、油菜籽蛋白基因启动子 (US 5,608,152；Stalberg 1996)、蔗糖结合蛋白的启动子(WO 00/26388) 和豆球蛋白B4启动子(LeB4；1991b；Becker 1992)、拟南芥属 (Arabidopsis)油质蛋白启动子(WO 98/45461)和芸苔属(Brassica) Bce4启动子(WO 91/13980)。还优选的是叶特异性和光诱导启动子，例 如，来自cab或Rubisco的(Simpson 1985；Timko 1985)；花药特异性启 动子，例如来自LAT52的(Twell 1989b)和小孢子优选型启动子，例如 来自apg的(Twell 1983)。
c)化学可诱导型启动子
表达盒还可含有化学可诱导型启动子(综述文章：Gatz 1997)；外源 基因在植物中的表达可于特定时间点受其控制。同样可使用此类启动子， 例如，PRP1启动子(Ward 1993)、水杨酸可诱导启动子(WO 95/19443)、 苯磺酰胺可诱导启动子(EP 0388186)、四环素可诱导启动子(Gatz 1991； Gatz 1992)、脱落酸可诱导启动子(EP 0335528)或乙醇-环已酮可诱导 启动子(WO 93/21334)。谷胱甘肽-S转移酶同种型II基因(GST-II-27) 的启动子也是合适的，其可被外源应用的安全剂(例如，二烯丙基-2，2-二 氯乙酰胺)活化(W093/01294)，并且其在单子叶植物和双子叶植物的大 量组织中都是有效的。可用于本发明的其它示例性可诱导启动子包括来自 ACE1系统的应答于铜的启动子(Mett 1993)，或来自玉米的应答于苯磺 酰胺除草剂安全剂的In2启动子(Hershey 1991；Gatz 1994)。应答于植 物正常情况下不应答的诱导剂的启动子也可使用。示例性的可诱导启动子 是来自类固醇激素基因的可诱导启动子，其转录活性受糖皮质类固醇激素 的诱导(Schena 1991)。
特别优选的是组成型启动子。此外，启动子可与待表达的核酸序列有 效连接，启动子使得所述序列在其它植物组织或其它生物(例如，大肠杆 菌细菌)中的表达成为可能。合适的植物启动子原则上包括上文描述的所 有启动子。
1.1.2.2优选的启动子序列
虽然已知有多种启动子在大豆中具有功能并且适合开展本发明的方 法，但已发现，泛素启动子(尤其是欧芹泛素启动子)尤其能导致令人吃 惊的高选择效率。因此，在一种优选的实施方式中，在大豆中具有活性的 启动子是植物泛素启动子。更优选地，植物泛素启动子是欧芹(欧芹 (Petroselinum crispum)或Lomatium foeniculaceum)泛素启动子或大豆 泛素启动子，更优选地，欧芹泛素启动子。如上文所述，尤其是欧芹泛素 启动子已经显示为获得的，并且产生持续高的转化效率。这些启动子优秀 表现的原因尚不可知。但是已知，最优选择需要选择标记在靶组织的相关 细胞(其随后去分化并再生为转基因植物)、在正确时间、至正确浓度(足 够高以确保高效选择但不能过高以防止对细胞造成的可能的负面影响)的 表达。泛素启动子(特别是欧芹泛素启动子)的优秀功能和有效性还可表 明对大豆细胞具有足够数量的、对大豆来说外源的(非天然的)D-丙氨酸 和/或D-丝氨酸代谢酶(例如DSDA或DAO蛋白)的需要，以能够在施加 于其上的选择压力下存活。这些效果可以是启动子和/或标记依赖性的，从 而启动子和标记的某些组合胜过其它一些。泛素启动子因此可用作为驱动 D-氨基酸代谢酶在大豆中表达的标准启动子。
下文提供的构建体是新颖的，并且尤其有用于进行本发明。此外，它 们还可用于其它植物物种。由此，本发明的另一实施方式涉及异源核苷酸 序列，其包含：
a)来自双子叶植物物种的泛素启动子，以及与其有效连接的
b)编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
其中，所述启动子相对所述核酸序列而言是异源的。
数种来自双子叶植物的泛素启动子已被描述过(Callis 1989，1990)。 描述了来自双子叶植物的启动子，例如，马铃薯(Garbarino 1992)、烟 草(Genschick 1994)、番茄(Hoffman 1991))、欧芹(Kawalleck 1993； WO03/102198，其通过引用并入本文)、拟南芥(Callis 1990；Holtorf 1995；UBQ8，GenBank登录号No：NM_111814；UBQ1，GenBank登录号No： NM_115119；UBQ5，GenBank登录号No：NM_116090)。
通常，术语“泛素启动子”在本文中使用时表示泛素或泛素样基因起始 密码子或图谱上的转录起始位点上游多至5000个碱基对(bp)的基因组 DNA区域。泛素是所有真核细胞中发现的丰富的76个氨基酸的多肽。有 数种不同的基因编码泛素，它们氨基酸水平上的同源性相当高。例如，人 和小鼠具有很多不同的编码泛素的基因，每个都位于不同的染色体基因座 上。功能上，所有泛素基因都是细胞泛素依赖性蛋白水解机制的关键作用 者。每个泛素基因与驱动其表达的启动子相关联。泛素启动子是泛素或泛 素样基因起始密码子或图谱上的转录起始位点上游多至5000个bp的基因 组DNA区域。术语“植物泛素调控系统”指植物(优选地，欧芹)泛素基 因翻译起始位点5’的大约2kb的核苷酸序列，并且包含指导转录启动、调 控转录、控制表达水平、诱导胁迫基因和增强应答于胁迫的表达的序列。 包含启动子和调控功能的调控系统是提供对基因表达的调控控制或调节的 DNA序列。因此，来自本发明的双子叶植物的泛素启动子是DNA片段(优 选地，大约0.5至2kb长)，所述DNA片段包含植物泛素调控系统，其 中，所述调控系统含有启动子(所述启动子包含转录起始位点)，以及， 优选地，位于所述转录起始位点5’的一个或多个热激元件，以及，优选地， 位于所述转录起始位点3’的内含子，其中，所述调控系统能调控在大豆中 的表达。
优选地，泛素启动子是欧芹泛素启动子或大豆(Glycine max)泛素启 动子。欧芹和大豆泛素的序列在下文中提供(分别是SEQ ID NO：5和6)。 公开的序列包含
本领域技术人员已知，启动子序列可被很大程度地修饰(例如，截短、 融合、突变)，而不会显著改变它们的转录性质。由此，本发明的另一实 施方式涉及包含欧芹泛素或大豆泛素启动子片段或衍生物的异源核苷酸序 列。它们可以是合成序列(即，不存在于自然界中)或来自其它植物物种 的直向同源序列。因此，本发明的另一实施方式涉及异源核苷酸序列，其 包含：
a)选自下述的启动子：
i)序列，其包含SEQ ID NO：7或8所示的序列，以及
ii)序列，其包含至少一个片段并且在大豆中具有启动子活性，所述片 段为SEQ ID NO：7或8所示的序列的至少50(优选100或150，更优选 200或250，甚至更优选300或500)个连续碱基对，
iii)序列，其包含与SEQ ID NO：7或8所示的序列具有至少60％(优 选70％或75％，更优选80％或85％，甚至更优选90％或95％，最优选 98％)同一性的序列，并且在大豆中具有启动子活性，
iv)序列，其包含能与SEQ ID NO：7或8所示的序列杂交(优选在 与下述条件相当或均等的条件下，所述条件是用30至(优选)35％的甲酰 胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液于37℃杂交，以及在1×至2×SSC(优 选1×SSC)中于50至(优选)55℃下洗涤；更优选地，在40至(优选) 45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.5×至1×SSC (优选0.5×SSC)中于55至(优选)60℃下洗涤，以及最优选地，在50％ 的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.1×SSC中于60 至(优选)65℃下洗涤)的序列，并且在大豆中具有启动子活性，以及
b)编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
其中，所述启动子相对所述核酸序列而言是异源的。
在大豆植物中的“启动子活性”表示在大豆植物或源自大豆植物的至少 一个细胞或组织中实现有效连接的核酸序列的转录的能力。优选地，其表 示组成型转录活性，允许在大多数组织和大多数发育阶段表达。
因此，本发明利用的泛素启动子还可以是SEQ ID NO：7或8所示的 启动子的片段或其衍生物。片段可包括SEQ ID NO：7或8所示的启动子 的截短版本，其中，非必要序列已被除去。缩短的启动子序列是高度有好 处的，因为它们更易于操作，并且有时在其基因表达方面是经过优化的。 制备缩短或截短的启动子的一种高效的靶向方法依赖于对启动子序列中假 定调控元件的鉴定。这可通过与已知以相似组织特异性方式或以发育独特 方式待表达的启动子序列进行比较来启动。具有相似表达模式的启动子共 享的序列是用于转录因子结合的可能候选者，因此可能是赋予表述模式的 元件。对这些假定调控元件的验证可这样进行：对每种假定调控区域进行 缺失分析，接着通过报道基因(其与每种构建体功能性相连)测定对每种 缺失构建体进行功能分析。同样，一旦提供了起始启动子序列，那么就可 以容易地制备起始启动子的多种不同缺失突变体中的任何一种。泛素启动 子(例如，SEQ ID NO：7或8所示)的功能等价片段还可通过除去或缺 失非必要序列而不缺失必要序列来获得。将转录调控核苷酸序列缩小到其 必要转录介导元件可通过尝试法(trial-and-arrow)缺失突变来体外实现， 或者使用启动子元件搜索途径以计算机方式实现。对于启动子活性来说必 要的区域通常展示出某些已知启动子元件的簇。此类分析可使用可获得的 计算机算法，例如PLACE(“Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements”； Higo 1999)、BIOBASE数据库“Transfac”(Biologische Datenbanken GmbH，Braunschweig；Wingender 2001)或数据库PlantCARE(Lescot 2002)来进行。优选地，本发明的转录调控核苷酸序列之一的功能等价片段 包含SEQ ID NO：7或8所示的转录调控核苷酸序列的至少100个碱基对， 优选至少200个碱基对，更优选至少500个碱基对。更优选地，该片段从 指出的序列的3’端开始。
尤其优选的是转录调控核苷酸序列的下述等价片段，它们是通过缺失 掉编码mRNA 5’-非翻译区域的区域由此仅提供(不转录的)启动子区域 来获得的。可通过本领域已知的方法(例如5’-RACE分析)容易地确定5’- 非翻译区域。
除了泛素启动子之外，还有其它启动子也已显示为适于获得大豆中的 D-氨基酸抗性，它们包括拟南芥肌动蛋白2启动子和nos启动子。但是， 转化效率显著低于泛素启动子。
1.1.3其它元件
本发明的表达盒(或包含它们的载体)除了包含在大豆植物中具有活 性的启动子(例如泛素启动子)之外，还可包含其它功能性元件和遗传控 制序列。术语“功能性元件”或“遗传控制序列”应当被理解为广义的，是指 对根据本发明的表达盒的功能或实体化(materialization)具有影响的所有 序列。例如，遗传控制序列能修饰转录和翻译。遗传控制序列已被描述过 (例如，Goeddel 1990；Gruber 1993及其中提到的参考文献)。
优选地，根据本发明的表达盒包括位于核酸序列(例如编码D-氨基酸 代谢酶的)5’-上游的、在大豆植物中具有活性的启动子(例如泛素启动子) 以及3’-下游的终止子序列和多聚腺苷酸化信号，以及如果合适的话，还有 其它惯用的调控元件，在每种情况下它们可与待表达的核酸序列有效连接。
此外，遗传控制序列和功能性元件还包括基因的5’-非翻译区域、内含 子或非编码3’-区域，例如，肌动蛋白-1内含子或Adh1-S内含子1、2和6 (一般性文献：The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot，编著， Springer，New York(1994))。已经阐述过：它们可在对基因表达的调控中 发挥显著作用。因此，已经描述过：5’-非翻译序列可增强异源基因的瞬时 表达。可被论及的翻译增强子的实例是烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie 1987)等。此外，它们可促进组织特异性(Rouster 1998)。
适合作为遗传控制序列的多聚腺苷酸化信号是植物多聚腺苷酸化信 号，优选地，基本上对应于来自根瘤农杆菌的T-DNA多聚腺苷酸化信号 的那些。特别合适的终止子序列的实例是OCS(章鱼碱合酶)终止子和 NOS(胭脂碱合酶)终止子。
本发明的遗传组分和/或表达盒可包含其它功能性元件。功能性元件可 包括，例如(但不限于)可选择或可筛选标记基因(除了D-丙氨酸或D- 丝氨酸代谢酶之外)。可选择和可筛选标记可包括：
a)阴性选择标记，即，赋予对杀生物化合物的抗性的标记，所述杀生 物化合物例如，代谢抑制剂(例如，2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐，WO 98/45456)、 抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(例如，膦 丝菌素或草甘膦)。尤其优选的阴性选择标记是赋予对除草剂的抗性的那 些(细节见下文的共转化章节)。
b)阳性选择标记，即，向经转化的植物赋予较之未经转化的植物而言 生长优势的标记，例如，Ebinuma等人2000a，b和EP-A 0601092中描述 的基因和方法。
c)反向选择标记，即，适于选择具有给定的、缺失的、包含所述标记 的生物的标记(Koprek 1999)。实例包含胞嘧啶脱氨酶codA(Schlaman 1997)。
d)报道基因，即，编码易于被定量(通过颜色或酶活性；Schenborn 1999)的蛋白质的标记。优选的是绿色荧光蛋白(GFP)(Sheen 1995； Haseloff 1997；Reichel 1996；Tian 1997；WO 97/41228；Chui 1996；Leffel 1997)和尤其优选的葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Jefferson 1987a，b)。
可包含在本发明的载体中的功能性元件包括：
i)复制起点，其确保根据本发明的载体或表达盒在例如大肠杆菌中能 够复制。可被论及的实例是ORI(DNA复制起点)、pBR322ori或P15A ori(Maniatis，1989)，
ii)多克隆位点(MCS)，其使得一种或多种核酸序列的插入可行， 并且协助这种插入，
iii)使得同源重组、标记缺失以及向宿主生物基因组中的插入成为可 能的序列。基于cre/lox(Sauer 1998；Odell 1990；Dale 1991)、FLP/FRT (Lysnik 1993)或Ac/Ds系统(Wader 1987；US 5,225,341；Baker 1987； Lawson 1994)的方法允许——(根据需要)组织特异性和/或可诱导的—— 从宿主生物的基因组除去特定的DNA序列。控制序列在这方面表示特定 的侧翼序列(例如，lox序列)，其之后允许被除去(例如通过cre重组酶) (还见，国际专利申请PCT/EP 2005/002734；WO 2005/090581)，
iv)元件，例如边界序列，其使得农杆菌介导的在植物细胞中的转移 (用于转移和整合进植物基因组)成为可能，例如，T-DNA或vir区域的 左或右边界。
1.2第二表达盒
优选地，插入靶植物基因组的DNA构建体包含至少一个第二表达盒， 其向大豆植物赋予农业经济相关性状。这可通过表达选择标记、性状基因、 反义RNA或双链RNA来实现。本领域技术人员知道可用于这方面的大量 序列，例如，以增加食物和饲料的品质，以生产化学品、精细化学品或药 物(例如，维生素、油、碳水化合物；Dunwell 2000)，赋予对除草剂的 抗性，或赋予雄性不育。此外，可增强生长、产量和针对非生物和生物胁 迫因素(例如，真菌、病毒或昆虫)的抗性。可通过过量表达蛋白质或通 过减少内源蛋白的表达(通过，例如表达相应的反义(Sheehy 1988；US 4,801,340；Mol 1990)或双链RNA(Matzke 2000；Fire 1998；Waterhouse 1998；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914； WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)来实现)来赋予有好处的性质。
对这些序列的表达而言，可以使用适合在大豆中的基因表达的所有启 动子。优选地，所述第二表达构建体并不包含与用于表达D-氨基酸代谢酶 的启动子相同的启动子。表达可例如是组成型、可诱导或发育依赖性的。 本领域已知有多种启动子用于在双子叶植物(例如大豆中)表达(细节见 上文)。
2.本发明的转化和选择方法
2.1植物材料的来源和制备
多种植物材料可用于本文公开的转化流程。此类植物材料可包括但不 限于，例如，叶、根、未成熟和成熟的胚、花粉、分生组织、花序、愈伤 组织、原生质体或植物细胞的悬浮液。
用于转化的植物材料可从基本上任何大豆品种或大豆植物中获得或分 离。尤其优选的是选自Jack、Resnik、Williams 82、Corsoy、Crawford、 Hutcheson、Kunitz和Champ的大豆植物。其它合适的大豆品种可从研究 和商业机构获得，例如，University of Guelph(Ontario Agricultural College；例如大豆品种RCAT Staples、Westag 97、RCAT Bobcat、OAC Prudence、OAC Woodstock、OAC 9908)；或来自Daryland或Soygenetics 的大豆品种。其它合适的品种是PI548402(Peking)、PI437654(Er-hejjan)、 PI438489(Chiquita)、PI507354(Tokei 421)、PI548655(Forrest)、 PI548988(Pickett)、PI88788、PI404198(Sun Huan Do)、PI404166 (Krasnoaarmejkaja)、Hartwig、Manokin、Doles、Dyer和Custer。
虽然本领域描述了基于不同大豆外植体的数种转化和再生方法(例如， 基于子叶节的)(它们都是本领域技术人员已知的)，但是本发明的方法 优选基于腋生分生组织，其更优选是源自大豆植物第一或更高的叶节的。 初生或更高的节的腋生分生组织可由幼苗腋生分生组织提供，并被用于随 后的转化(例如，农杆菌共转化)步骤。
优选地，本发明的方法包括下述步骤：
(a)提供大豆幼苗初生叶节或更高的叶节的腋生分生组织，以及
(b)将所述腋生分生组织与包含转基因T-DNA的根瘤菌科细菌一起 共培养，所述转基因T-DNA包含下述DNA构建体，所述构建体包含至少 一个第一表达构建体，所述第一表达构建体包含在所述大豆植物中具有活 性以及与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶 的核酸序列，
(c)将所述经共培养的腋生分生组织转移到枝条诱导和选择培养基 上，所述培养基包含：
(i)浓度适于从所述腋生分生组织从头诱导枝条诱导的至少一种植物 生长因子，以及
(ii)总浓度为大约3mM至大约100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸 和/或其衍生物，以及
(iii)任选地，一种或多种适于抑制根瘤菌科细菌生长的抗生素，
以及，在所述培养基上对所述经共培养的腋生分生组织进行至少5天 的培养，直到从其诱导和发育出枝条，并且分离所述枝条，以及
(d)将所述经分离的枝条转移至生根培养基，在所述生根培养基上培 养所述枝条，直到所述枝条形成根，进一步将由此得到的小植物再生为成 熟植物，其包含插入进它们基因组中的所述转基因T-DNA。
基于腋生分生组织的方法可利用来自多种来源的外植体组织和/或细 胞，优选地，来自初生或更高的叶节。初生叶节是当从根到叶的方法移动 时直接紧随子叶节(即，茎上与子叶相连或已连有子叶的点)的节(即， 茎上与叶相连或已连有叶的点)。更高的叶节是在初生叶节之后的所有叶 节，例如，第二、第三、第四等叶节。优选的是初生叶结的腋生分生组织。
优选地，初生或更高的节的腋生分生组织以选自下述的形式提供：
i)由基本上整株幼苗提供的幼苗腋生分生组织，以及
ii)通过以使得腋生分生组织保持与叶的叶柄相连的方式对初生或更高 的叶加以切割，而提供的叶腋生分生组织，
iii)繁殖的腋生分生组织。
初生或更高的节的腋生分生组织可以于随后的农杆菌共培养步骤中以 多种形式提供并利用：
a)方法A：幼苗腋生分生组织：整株幼苗或其相当大的部分(例如幼 苗去掉根或者没有一片或两片子叶的幼苗)可被使用，将其用农杆菌接种， 并被放到枝条诱导培养基(SIM)上。优选地，基本上整株幼苗选自下述 材料：
i)整株幼苗，和
ii)根被去除的幼苗，以及
iii)一片或两片子叶被去除的幼苗，以及
iv)根和一片或两片子叶被去除的幼苗，以及
v)根、两片子叶和上胚轴的一部分被去除，但留有与上胚轴的部分相 连的腋生分生组织的幼苗。
b)方法B：叶腋生分生组织：以使得腋生分生组织保持与叶柄相连的 方式对初生或更高的叶加以切割，将其浸于农杆菌溶液中(用该溶液接种)， 在共培养培养基上进行共培养，并放到枝条诱导培养基(SIM)上。外植 体的小尺寸以及枝条的茁壮生长对于选择经转化细胞来说是有利的，所述 对经转化细胞的选择是目前的转化方法的难题。
c)方法C：繁殖的腋生分生组织：从萌发的(优选大约)7天龄幼苗 的每株幼苗去除下胚轴和两片子叶的一片半或一片和一部分。然后将幼苗 放到繁殖培养基上2至4周。幼苗产生数条分支的枝条，由此获得外植体。 可以切下从第一至第四叶节的腋生节。从每株幼苗平均获得三至四个外植 体。
除了上文指出的来源之外，其它来源也可能适合腋生分生组织。这些 来源可以例如是源自大豆幼苗的更受限的(restricted)外植体，例如，仅 上胚轴和初生叶节。明显地，此类受限(即，小)的外植体既可从初生节 获得，也可从更高的节(例如，第二或更高的节)获得。
较之农杆菌介导的其它转化方案，该方法需要的时间大大降低。从流 程启动后4至6周，可收集可变的表型阳性大豆枝条。此外，本发明的方 法是高度独立于基因型和栽培种的。
用于转化工艺的起始材料通常是大豆种子。种子首先被灭菌，任选地， 浸泡以软化。然后将种子放到萌发培养基上，进行大约4至10天的萌发， 优选进行大约5至8天，最优选进行大约7天。对于繁殖的腋生分生组织 和叶腋生分生组织方法而言，在该时间点上胚轴优选大约0.5cm，对于幼 苗腋生分生组织方法而言，所述上胚轴在该时间点上通常是0.5至2cm。 优选地，萌发在高光照条件下(＞100μMm-2s-1)于25℃进行。
2.2转化流程
2.2.1一般性技术
可使用DNA构建体被插入的载体，将根据本发明的DNA构建体有利 地引入细胞。载体的实例可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒、逆转录病毒 或农杆菌。在一种有利的实施方式中，通过质粒载体来引入表达盒。优选 的载体是能使得表达盒稳定整合进宿主基因组的那些。
可通过本领域技术人员已知的数种手段中的任何手段来将DNA构建 体引入靶植物细胞和/或生物，这种流程被称为转化。适于大豆的数种转化 流程已经被描述过。
例如，可使用射弹方法，例如DNA粒子轰击来将DNA构建体直接引 入植物细胞，或者可使用例如对细胞进行的电穿孔和显微注射的技术，来 引入DNA构建体。颗粒介导的转化技术(还被称为“射弹”)被描述于， 例如EP-A1270,356、US 5,100,792、EP-A-444882、EP-A-434616、Klein 1987、Vasil 1993和Becker 1994中。这些方法包括：通过用在小珠粒或颗 粒的基质中或表面上具有核酸的小颗粒来穿透细胞。射弹PDS-1000Gene Gun(百奥雷得公司(Biorad)，Hercules，CA)使用了氦压力，以加速DNA 包覆的金或钨微载剂冲向靶细胞。该工艺可应用于来自生物(包括植物) 的宽范围的组织和细胞。其它转化方法也是本领域技术人员已知的。
其它技术包括显微注射(WO 92/09696，WO 94/00583，EP-A 331083， EP-A 175966，Green 1987)、聚乙二醇(PEG)介导的转化(Paszkowski 1984；Lazzeri 1995)、基于脂质体的基因递送(WO 93/24640；Freeman 1984)、电穿孔(EP-A 290395，WO 87/06614；Fromm 1985；Shimamoto 1992)。
在将DNA注射或电穿孔进植物细胞的情况下，待转化的DNA构建体 无需达到任何特定要求(事实上，“裸”表达盒就可使用)。可以使用简单 的质粒，例如，pUC系列的那些。
2.2.2土传细菌介导的转化(共培养)
除了这些“直接”转化技术之外并且对其优选的，还可通过土传细菌， 例如，根瘤农杆菌或发根农杆菌进行细菌感染，来开展转化。
2.2.2.1对菌株、载体和共培养条件的选择
用于将DNA(例如T-DNA)转入大豆基因组的土传细菌可以是根瘤 菌科的任何物种。根瘤菌科包含农杆菌属，根瘤菌属(Rhizobium)、大 豆根瘤菌属(Sinorhizobium)和茎瘤菌属(Allorhizobium)，是该细菌科 中的属，它们已基于核糖体特点被包括进了蛋白菌(Proteobacteria)的α-2 亚组。该家族的成员是需氧的革兰氏阴性的。细胞通常是杆状的(0.6-1.0μm ×1.5-3.0μm)，单独或成对存在，没有内生孢子，通过一至六条周鞭毛来 运动。在含碳水化合物的培养基上生长期间，通常产生相当多的细胞外多 糖黏质。尤其优选的是根瘤菌科，例如草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)、快生型大豆根瘤 菌(Sinorhizobium fredii)、根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)NGR234、 根瘤菌属物种BR816、根瘤菌属物种N33、根瘤菌属物种GRH2、萨赫尔 中华根瘤菌(Sinorhizobium saheli)、热带树中华根瘤菌(Sinorhizobium terangae)、豌豆根瘤菌(三叶草生物型)(Rhizobium leguminosarum biovar trifolii)、豌豆根瘤菌(蚕豆生物型)(Rhizobium leguminosarum biovar viciae)、豌豆根瘤菌(菜豆生物型)(Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、 Rhizobium galegae、Rhizobium gallicum、Rhizobium giardinii、海南根瘤 菌(Rhizobium hainanense)、Rhizobium mongolense、羽扇豆根瘤菌 (Rhizobium lupini)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华 癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌 (Mesorhizobium ciceri)、Mesorhizobium mediterraneium、 Mesorhizobium tianshanense、Bradyrhizobium elkanni、大豆慢生根瘤菌 (Bradyrhizobium japonicum)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、 Allobacterium undicola、Phyllobacterium myrsinacearum、根瘤农杆菌、 放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)、发根农杆菌、Agrobacterium vitis和悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)。优选的还有Broothaerts(2005) 中描述的菌株和方法。
农杆菌、茎瘤菌属和根瘤菌属的单源性质以及它们共有的表型分类界 限支持它们被合并进单独的属——根瘤菌属。对农杆菌菌株的归类和表征， 包括区分开根瘤农杆菌和发根农杆菌以及它们的若干种冠瘿碱型的类是本 领域公知的实践(见，例如，Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria，第3版.(2001)Schaad，Jones和Chun(编著)ISBN 0890542635，例如其中公开的Moore等人的文章)。近来的研究表明，通 过其植物-致病性质进行的归类可能并不恰当。因此，基于基因组分析和比 较的更为先进的方法(例如16S rRNA测序、RFLP、Rep-PCR等)被用 来阐释多种菌株之间的关系(见，例如，Young 2003，Farrand 2003，de Bruijn 1996，Vinuesa 1998)。通过展示了农杆菌菌株K599的关系的两种 方法，获得的农杆菌属的成员的系统发生关系展示于Llob 2003中。
本领域已知，不仅农杆菌能介导T-DNA转移，还有其它土传细菌也 可以，只要它们具有用于对Ti或Ri质粒进行T-DNA转移的相关功能元 件即可(Klein&Klein 1953；Hooykaas 1977；van Veen 1988)。
优选地，土传细菌是农杆菌属的。术语“农杆菌”在本文中使用时表示 土传的、革兰氏阴性的、杆状的植物致病性细菌。基于比较性16S rDNA 分析，农杆菌的物种，根瘤农杆菌(同义：放射性农杆菌)、发根农杆菌、 悬钩子农杆菌和Agrobacterium vitis，和Allorhizobium undicola一起，与 根瘤菌属所有的种形成了单源组(Sawada 1993，Young 2003)。农杆菌是 包含植物致病性物种的人造属。
术语Ti质粒在本文中使用时指可在农杆菌中复制的质粒，其在天然状 况下是“带甲”(armed)形式，其能在受农杆菌感染的植物中介导冠瘿。 用农杆菌的Ti质粒的天然“带甲”形式对植物细胞的感染通常导致受感染 的细胞产生冠瘿碱(例如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，导致胭脂 碱产生的农杆菌菌株(例如菌株LBA4301、C58、A208)被称为“胭脂碱 型”农杆菌(Agrobacteria)；导致章鱼碱产生的农杆菌菌株(例如菌株 LBA4404、Ach5、B6)被称为“章鱼碱型”农杆菌；导致农杆碱产生的农杆 菌菌株(例如菌株EHA105、EHA101、A281)被称为“农杆碱型”农杆菌。 卸甲Ti质粒应当被理解为，丢失了其冠瘿介导性质但是仍能提供植物感染 功能的Ti质粒。优选地，以下述方式来修饰所述“卸甲”质粒的T-DNA区 域，所述方式使得除了边界序列外，没有功能性的内部Ti序列被转入植物 基因组。在一种优选的实施方式中(当使用二元载体系统时)，整个T-DNA 区域(包括T-DNA边界)缺失。
术语Ri质粒在本文中使用时指可在农杆菌中复制的质粒，在其天然状 况下是“带甲”形式，其能在受农杆菌感染的植物中介导发根病。用农杆菌 的Ri质粒的天然“带甲”形式对植物细胞的感染通常导致受感染的细胞产 生冠瘿碱(在经转基因的植物细胞中产生的特定氨基糖衍生物，例如农杆 碱、黄瓜碱、章鱼碱、米奇矛碱(mikimopine)等)。传统上，按照与根 瘤农杆菌菌株相同的方式，将发根农杆菌菌株分为亚类。最常见的菌株是 农杆碱型菌株(例如，特征在于Ri质粒pRi-A4)、甘露碱型菌株(例如， 特征在于Ri质粒pRi8196)和黄瓜碱型菌株(例如，特征在于Ri质粒 pRi2659)。一些其它菌株是米奇矛碱型(例如，特征在于Ri质粒pRi1723)。 米奇矛碱和黄瓜碱是立体异构体，但是在核苷酸水平上没有在pRi质粒之 间发现同源性(Suzuki 2001)。卸甲Ri质粒应当被理解为，丢失了其发 根病介导性质但是仍能提供植物感染功能的Ri质粒。优选地，以下述方式 来修饰所述“卸甲”Ri质粒的T-DNA区域，所述方式使得除了边界序列外， 没有功能性的内部Ri序列被转入植物基因组。在一种优选的实施方式中 (当使用二元载体系统时)，整个T-DNA区域(包括T-DNA边界)缺失。
根瘤农杆菌和发根农杆菌各自的Ti和Ri携带有负责对植物遗传转化 的基因(Kado 1991)。载体基于农杆菌的Ti或Ri质粒，并且利用将DNA 转移进植物基因组的天然系统。作为这种被高度开发的寄生情况的一部分， 农杆菌将其基因组信息的给定部分(T-DNA；侧翼有大约25bp的重复， 被称为左边界和右边界)转入植物细胞的染色体DNA(Zupan 2000)。所 述DNA转移是所谓的vir基因(原来的Ti质粒的一部分)的组合作用介 导的。为利用该天然系统，开发了缺少原本的肿瘤诱导基因的Ti质粒(“卸 甲”载体)。在另一实施方式中，所谓的“二元载体系统”中，T-DNA与Ti 质粒的其它功能性元件(例如vir基因)通过并入进穿梭载体而被物理分 离，这允许更容易的操作(EP-A 120516；US 4,940,838)。这些二元载体 包含(除了具有其边界序列的卸甲T-DNA之外)用于在农杆菌和大肠杆 菌中都能复制的原核序列。农杆菌介导的转化的优点是，通常仅边界侧翼 的DNA被转入基因组，优先仅插入一个拷贝。对农杆菌载体系统和用于 农杆菌介导的基因转移的方法的描述是本领域已知的(Miki 1993；Gruber 1993；Moloney 1989)。
因此，为进行农杆菌介导的转化，遗传组合物(例如，包含表达盒) 被整合进特定的质粒，进入穿梭或中间载体，或者进入二元载体。如果将 要用Ti或Ri质粒进行转化，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右边界(但 是在大多数情况下是右边界和左边界)以侧翼区域的形式与待引入的表达 盒相连。二元载体是优选使用的。二元载体在大肠杆菌和农杆菌中都能复 制。它们可包含选择标记基因和在右和左T-DNA边界序列侧翼的接头或 多聚接头(为了插入，例如，待被转移的表达盒的接头或多聚接头)。它 们可被直接转入农杆菌(Holsters 1978)。选择标记基因允许对经转化的 农杆菌加以选择，是例如，nptII基因，其赋予了对卡那霉素的抗性。在这 种情况下，作为宿主生物发挥作用的农杆菌应当已经含有了具有vir区域 的质粒。后者是将T-DNA转移进植物细胞所需要的。以这种方式转化的 农杆菌可用于转化植物细胞。T-DNA用于转化植物细胞的用途已被研究并 深入描述过(EP 120516；Hoekema 1985)。
常见的二元载体基于“宽宿主范围”质粒，例如，源自P型质粒RK2 的pRK252(Bevan 1984)或pTJS75(Watson 1985)。这些载体中的大 多数是pBIN19(Bevan 1984)的衍生物。多种二元载体是已知的，其中一 些是商业可获得的，例如，pBI101.2或pBIN19(克隆技术实验室(Clontech Laboratories)，Inc.USA)。在尺寸和操作性的方面对其它载体进行了改 进(例如，pPZP；Hajdukiewicz 1994)。改进的载体系统还被描述于WO 02/00900中。
优选地，土传细菌是属于农杆菌科的细菌，更优选地，卸甲根瘤农杆 菌或发根农杆菌菌株。在一种优选的实施方式中，用于实践本发明的农杆 菌菌株包括章鱼碱菌株，例如，LBA4404或农杆碱菌株，例如EHA101或 EHA105。用于DNA转移的合适的根瘤农杆菌的菌株是，例如， EHA101[pEHA101](Hood 1986)、EHA105[pEHA105](Li 1992)、 LBA4404[pAL4404](Hoekema 1983)、C58C1[pMP90](Koncz&Schell 1986)和C58C1[pGV2260](Deblaere 1985)。其它合适的菌株是根瘤农 杆菌C58，这是胭脂碱菌株。其它合适的菌株是根瘤农杆菌C58C1(Van Larebeke 1974)、A136(Watson 1975)或LBA4011(Klapwijk 1980)。 在另一优选的实施方式中，土传细菌是发根农杆菌菌株K599的卸甲菌株 变体(NCPPB 2659)。此类菌株被描述于2004年9月2日提交的美国临 时申请No.60/606,789和国际申请PCT/EP2005/009366中，它们通过引用 整体并入本文。
可通过常用的DNA重组技术来修饰二元载体或任何其它载体，在大 肠杆菌中倍增，通过例如电穿孔或其它转化技术(Mozo 1991)引入农杆 菌。
按照本领域已知的方式来培养和使用农杆菌。包含农杆菌菌株的载体 可例如在补充有合适的抗生素(例如，50mg/l壮观霉素)的YEP培养基 (5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl、15g/l琼脂，pH 6.8；见实 施例2)上生长3天。用环从固体培养基收集细菌，并对其进行重新悬浮。 在本发明的一种优选的实施方式中，通过使用冷冻于-80℃的等分试样来 开始农杆菌培养。为进行对多种大豆腋生分生组织外植体组织的农杆菌处 理，优选将细菌重新悬浮于共培养培养基(CCM)中。用于感染的农杆菌 的浓度、直接接触时间和共培养可能需要改变。因此，通常农杆菌浓度的 范围是OD6000.1至3.0。优选地，对于多种腋生分生组织外植体而言，使 用下述浓度的农杆菌悬浮液：
a)方法A(幼苗腋生分生组织)：大约的OD600＝0.5至大约3，优选 地大约OD600＝1至2。
b)方法B(叶腋生分生组织)：大约OD600＝0.1至大约1，优选地大 约OD600＝0.125至0.5。
c)方法C(繁殖的腋生分生组织)：大约OD600＝0.2至大约1.5，优 选地大约OD600＝0.5至0.8。
然后用农杆菌培养物对外植体进行数分钟至数小时的接种，通常，大 约10分钟至3小时，优选地，大约0.5小时至1小时。过量的培养基被排 出，农杆菌被允许与分生组织共培养大约1至大约6天，优选大约3至大 约5天(对根瘤农杆菌菌株而言)，以及大约2至大约3天(对发根农杆 菌菌株而言)，优选在黑暗中进行。在该步骤期间，农杆菌将外来遗传构 建体转移进大豆腋生分生组织的一些细胞中。通常在该步骤期间不存在选 择化合物。
2.2.2.2用于增强转化效率的修饰
将能减少由于植物防御应答(例如，酚氧化)导致的组织坏死的乙烯 抑制剂(例如，硝酸银)、酚吸收化合物(例如聚乙烯吡咯烷酮，Perl 1996) 或抗氧化剂(例如硫醇化合物，例如，二硫代苏糖醇、L-半胱氨酸，Olhoft 2001)补充给共培养培养基可进一步提高农杆菌介导的转化的效率。
将能减少由于植物防御应答(例如，酚氧化)导致的组织坏死的抗氧 化剂(例如，二硫苏糖醇)或硫醇化合物(例如，L-半胱氨酸，Olhoft 2001； US2001034888)补充给共培养培养基可进一步提高农杆菌介导的转化的效 率。在另一优选的实施方式中，共培养培养基包含至少一种硫醇化合物， 优选选自硫代硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)和半胱氨酸。优选地，浓度在 大约1mM至10mM的L-半胱氨酸、0.1mM至5mM DTT和/或0.1mM 至5mM的硫代硫酸钠之间。
可在农杆菌共培养之前或期间，用酚化合物对靶组织和/或农杆菌进行 处理。适于本发明的范围的“植物酚化合物”或“植物酚”是经分离的被取代 的酚分子(它们能诱导阳性趋化性应答)，特别是能在含Ti质粒的农杆菌 属物种(Agrobacterium sp.)中，特别是含Ti质粒的根瘤农杆菌中诱导增 加的vir基因表达的那些。优选的植物酚化合物是乙酰丁香酮(3，5-二甲氧-4- 羟基苯乙酮)。某些化合物，例如渗透保护剂(例如，L-脯氨酸，优选地， 大约200-1000mg/L的浓度或甜菜碱)、植物激素(NAA等)、冠瘿碱或 糖，与植物酚化合物组合加入时能协同作用。
对于根瘤农杆菌来说特别合适的诱导条件已被描述过(Vernade 1988)。可通过本领域已知的多种其它方法来增强用农杆菌进行的转化的 效率，例如，真空渗入(WO 00/58484)、热激和/或离心、加入硝酸银、 超声波处理等。
优选地，本发明的方法包括选自以下的一个或多个额外的步骤：
(a1)在共培养前、期间或之后立即损伤外植体，以及
(b1)步骤(b)后，将所述经共培养的腋生分生组织转进下述培养 基，该培养基包含至少一种适合抑制农杆菌生长的抗生素以及任选地，至 少一种植物生长因子，其中，所述培养基优选缺乏以植物毒性浓度的D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物，以及，
(b2)在步骤(b)以及任选地(b1)后，在枝条诱导培养基(SIM) 上进一步孵育所述腋生分生组织，所述培养基包含至少一种植物生长因子， 其中，所述枝条诱导培养基优选缺乏以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D- 丝氨酸或其衍生物，以及，
(c1)在步骤(c或b2)后，将所述枝条转进枝条延长培养基，其包 含：
(i)浓度适于允许枝条延长的至少一种植物生长因子，以及
(ii)任选地，总浓度为大约3至大约100mM的的D-丙氨酸和/或 D-丝氨酸或其衍生物，
以及，在所述枝条延长培养基上培养所述经转移的枝条，直到所述枝 条延长至至少大约2cm的长度。
在本发明的一种优选的实施方式中，腋生分生组织是受到损伤的(步 骤(a1))。损伤看起来对本发明的方法具有至少两种增强效果：
(i)损伤协助了农杆菌感染和基因转移效率，
(ii)损伤增强了从头枝条诱导的效率，这假设是通过破坏了分生组织 连接从而显著增加了从外植体组织发育的枝条数量来实现的。
损伤可以在用农杆菌接种(共培养)之前、接种期间或接种之后发生。 为获得两种有益效果，优选在共培养之前或期间进行损伤，更优选在共培 养之前。可以使用很多损伤方法，包括，例如，切割、研磨(abrading)、 刺穿(piercing)、戳捅(piking)、用精细颗粒或加压液体穿透、等离子 体损伤(plasma wounding)、应用高压(hyperbaric pressure)或超声波 处理。损伤可用器件来进行，例如但不限于，解剖刀、剪刀、针、研磨器 件、喷枪、颗粒、电基因枪或声波。增强共转化步骤效率的另一备选方法 是真空渗入(Bechtold 1998；Trieu 2000)。
2.3共培养后处理
在共培养之后，优选通过洗涤和/或用合适的抗生素处理来除去土传细 菌。由此，在共培养步骤之后使用的培养基，例如，在步骤(b1)、(b2) 和/或(c1)中使用的培养基优选含有杀菌剂(抗生素)。该步骤意欲用于 终止或者至少延迟未经转化的细胞的生长以及杀死剩余的农杆菌细胞。因 此，本发明的方法优选包括如下步骤：
(b1)步骤(b)后，将所述经共培养的腋生分生组织转进下述培养 基，该培养基包含至少一种适合抑制农杆菌生长的抗生素以及任选地，至 少一种植物生长因子，其中，所述培养基优选缺乏以植物毒性浓度的D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物，以及，
优选的待使用抗生素是，例如，羧苄青霉素(500mg/L或者优选地， 100mg/L)或者TimentinTM(GlaxoSmithKline；优选以大约250-500mg/L 的浓度使用；TimentinTM是替卡西林二钠和克拉维酸钾的混合物；0.8g的 TimentinTM含有50mg克拉维酸和750mg的替卡西林。化学上，替卡西 林二钠是N-(2-羧基-3，3-二甲基-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]已-6-基)-3- 硫-苯丙酰胺酸(phenemalonamic acid)二钠盐。化学上，克拉维酸钾是 (Z)-(2R，5R)-3-(2-羟基亚乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚烷-2- 羧酸钾)。
2.4选择
农杆菌介导的技术通常导致基因递送进靶组织的非常有限的细胞中。 尤其是对于大豆而言，转化效率(没有选择)通常非常低。该问题通过本 文提供的基于D-丙氨酸和/或D-丝氨酸代谢酶的选择方案来解决。因此， 在共培养以及任选地恢复步骤(见下文)后，靶组织(例如腋生分生组织) 被转入选择培养基，并在其上孵育。
优选地，在共培养(步骤(b)或(b1))之后，在缺乏选择化合物 (以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物)的培养基上， 对新鲜经转化(共培养)的外植体进行大约1小时至大约10天的时间，优 选1天至8天，更优选大约4至大约7天的孵育。针对所述选择化合物的 可靠抗性水平的建立需要一定时间，以防止选择化合物甚至对经转化细胞 和组织造成不想要的损伤。因此，本发明的方法可包含共培养和选择之间 的步骤，其在没有选择化合物的情况下进行。在该恢复期间，枝条诱导(见 下文)可能已经启动。
选择培养基包含以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生 物(即，能终止或至少延迟未经转化细胞的生长的浓度)。术语“毒害植物”、 “植物毒性”或“植物毒性效果”在本文中使用时意指对植物或植物细胞生理 学的任何可测量到的负面影响，它们导致下述症状，包括(但不限于)例 如：降低的或受损的生长、降低的或受损的光合作用、降低的或受损的细 胞分裂、降低的或受损的再生(例如，从细胞培养物、愈伤组织或枝条等 的成熟植物再生)、降低的或受损的能育性等。植物毒性还可包括下述影 响，例如，坏死或凋亡。在一种优选的实施方式中，较之未用所述植物毒 性化合物处理的植物而言，导致生长或再生能力降低至少50％，优选至少 80％，更优选至少90％。
用于选择的特定化合物是根据表达何种标记蛋白质来选择的。例如， 当使用大肠杆菌D-丝氨酸解氨酶时，选择在包含D-丝氨酸的培养基上进 行。当使用瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶时，选择在包含D-丙氨酸和/或D- 丝氨酸的培养基上进行。
使用D-氨基酸的事实并不排除L-氨基酸结构或L-氨基酸的存在。对 于一些应用而言，应用D-氨基酸和L-氨基酸的外消旋混合物(或具有丰富 的D-氨基酸含量的混合物)可能是优选的(例如，就成本原因考虑)。优 选地，D-氨基酸与相应的L-对映异构体的比例为至少1∶1，优选2∶1，更优 选5∶1，最优选10∶1或100∶1。使用D-丙氨酸具有如下优点：D-丙氨酸和 L-丙氨酸的外消旋混合物可使用，而没有L-对映异构体的干扰或有害影 响。因此，在一种改进的实施方式中，使用D/L-丙氨酸的外消旋混合物作 为化合物。
术语“衍生物”在关于D-丙氨酸或D-丝氨酸的方面表示这样的化学化 合物，其包含D-丙氨酸或D-丝氨酸的各D-氨基酸结构，但是是经过化学 修饰的。在本文中使用时，术语“D-氨基酸结构”(例如，“D-丝氨酸结构”) 意欲包括D-氨基酸以及D-氨基酸的保持了化合物功能活性的类似物、衍 生物和模拟物。在本文中使用时，“衍生物”还表示D-丝氨酸或D-丙氨酸 的下述形式，其中，化合物上一个或多个反应基团被取代基衍生化。使用 的D-氨基酸可被氨基末端或羧基末端修饰基团修饰，或者通过对侧链的修 饰来修饰。氨基末端修饰基团可以，例如，选自苯乙酰基、二苯乙酰基、 三苯乙酰基、丁酰基、异丁酰基、已酰基、丙酰基、3-羟基丁酰基、4-羟 基丁酰基、3-羟基丙酰基(propionoyl)、2，4-二羟基丁酰基(butyroyl)、1-金 刚烷羰基、4-甲基戊酰基、2-羟基苯乙酰基、3-羟基苯乙酰基、4-羟基苯乙 酰基、3，5-二羟基-2-萘甲酰基、3，7-二羟基-2-萘甲酰基(napthoyl)、2-羟基 肉桂酰基、3-羟基肉桂酰基、4-羟基肉桂酰基、氢化肉桂酰基、4-甲酰基肉 桂酰基、3-羟基-4-甲氧基肉桂酰基、4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基、2-羧基肉 桂酰基、3，4，-二羟基氢化肉桂酰基、3，4-二羟基肉桂酰基、反式-肉桂酰基、 (±)-杏仁酰基(mandelyl)、(±)-杏仁酰基-(±)-杏仁酰基、乙醇酰基、3-甲酰基 苯甲酰基、4-甲酰基苯甲酰基、2-甲酰基苯氧基乙酰基、8-甲酰基-1-萘甲 酰基(napthoyl)、4-(羟甲基)苯甲酰基、3-羟基苯甲酰基、4-羟基苯甲酰 基、5-乙内酰脲基乙酰基、L-氢化乳清酰基(orotyl)、2，4-二羟基苯甲酰基、 3-苯甲酰基丙酰基(propanoyl)、(±)-2，4-二羟基-3，3-二甲基丁酰基、DL-3-(4- 羟基苯基)乳酰基、3-(2-羟基苯基)丙酰基、4-(2-羟基苯基)丙酰基、D-3-苯 基乳酰基、3-(4-羟基苯基)丙酰基、L-3-苯基乳酰基、3-吡啶基乙酰基、4- 吡啶基乙酰基、异烟酰基、4-喹啉羧基、1-异喹啉羧基和3-异喹啉羧基。 羧基末端修饰基团可以，例如，选自酰胺基团、烷基酰胺基团、芳基酰胺 基团和羟基基团。“衍生物”在本文中使用时意欲包括模拟各D-氨基酸的结 构并且保留了D-氨基酸结构的功能性质的分子。用于设计氨基酸或肽类似 物、衍生物和模拟物的手段是本领域已知的(例如，见，Farmer 1980；Ball 1990；Morgan 1989；Freidinger 1989；Sawyer 1995；Smith 1995；Smith 1994；Hirschman 1993)。其它可能的修饰包括N-烷基(或芳基)取代或 主链交联以构建内酰胺和其它环状结构。其它衍生物包括C-末端羟甲基衍 生物、O-修饰的衍生物(例如C-末端羟甲基二苄醚)、N-末端修饰的衍生 物，包括经取代的酰胺，例如，烷基酰胺和酰肼。此外，可以使用包含除 草剂化合物的D-氨基酸结构。此类化合物例如US 5,059,239中所述的，其 包括(但不限于)N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-DL-丙氨酸、N-苯甲酰基 -N-(3-氯-4-氟苯基)-DL-丙氨酸甲基酯、N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-DL- 丙氨酸乙基酯、N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-D-丙氨酸、N-苯甲酰基-N-(3- 氯-4-氟苯基)-D-丙氨酸甲基酯或N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-D-丙氨酸 异丙基酯。
选择化合物(以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物) 可与其它物质组合使用。就本申请的目的而言，选择化合物还可与传统上 用于配制领域的佐剂一起使用，因此，它们被以已知的方式配制为可乳化 的浓缩物、可包覆的糊剂、可直接喷雾或稀释的溶液、稀释乳剂、可润湿 的粉末、可溶的粉末、粉尘(dust)、颗粒以及在例如，聚合物物质中胶 囊化。根据待使用的组合物的性质，根据想要的目的和主要的环境，来选 择应用的方法(例如喷雾、雾化(atomising)、撒粉(dusting)、分散、包 覆或灌注)。但是，更优选地，将选择化合物直接应用到培养基。选择化 合物的贮液可在室温下制造和贮藏延长的时间而没有选择效率的损失是优 点所在。
选择化合物(即，D-丙氨酸、D-丝氨酸、其衍生物或其任何组合)的 最优浓度可根据用于转化的靶组织来变化，但是通常(以及，优选地，对 腋生分生组织的转化而言)，D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的总浓度(即， 当是混合物时，总和)在大约0.5mM至大约100mM的范围内。例如， 当使用大肠杆菌D-丝氨酸解氨酶时，选择在包含D-丝氨酸(例如，并入 经琼脂固化的MS培养基平板中)的培养基上进行，优选地，D-丝氨酸浓 度为大约0.5mM至大约100mM，优选大约1mM至大约70mM，更优 选大约2mM至大约50mM，最优选大约3mM至大约15mM。当使用 瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶时，选择在包含D-丙氨酸和/或D-丝氨酸(例 如，并入经琼脂固化的MS培养基平板中)的培养基上进行，优选地，D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸总浓度为大约0.5mM至大约100mM，优选大约1 mM至大约70mM，更优选大约2mM至大约50mM，最优选大约3mM 至大约15mM。优选地，D-丙氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使 用的话)以大约0.5mM至大约100mM的浓度使用，优选大约1mM至 大约70mM，更优选大约2mM至大约50mM，最优选大约3mM至大 约20mM。优选地，D-丝氨酸(例如，如果作为仅有的选择化合物使用的 话)以大约0.5mM至大约100mM的浓度使用，优选大约1mM至大约 70mM，更优选大约2mM至大约50mM，最优选大约3mM至大约15 mM。
此外，选择时间也可以根据所用的靶组织和所采用的再生方案而变化。 选择压力(选择化合物的存在造成的)可被保持于整个再生过程(包括枝 条诱导、枝条延长和生根)中。
通常，选择时间为至少大约5天，优选至少大约14天。更特别地，在 去分化条件(即，愈伤组织或枝条诱导)下的总选择时间为大约1至大约 10周，优选大约3至7周，更优选大约3至4周。但是，优选地，在去分 化条件下的选择不超过70天。优选地，选择使用大约3至大约20mM D- 丙氨酸和/或D-丝氨酸在去分化条件下进行大约3至4周。选择期之间，外 植体可被转移到新鲜的选择培养基中，这可发生一次或多次。对于本文提 供的特定方案而言，优选地，使用两次选择培养基步骤(例如，向新的选 择培养基中转移一次)。优选地，选择步骤以两步进行，第一选择步骤进 行大约14至20天，然后将存活的细胞或组织转移至与第一选择培养基具 有基本相同组成的第二选择培养基中，再培养额外的14至20天。但是， 也可以只应用单步骤的选择。D-氨基酸代谢酶的存在并不排除使用其它标 记。
2.5可育大豆植物的再生
共培养步骤(以及任选的恢复步骤)之后，在包含至少一种植物生长 因子的枝条诱导培养基上孵育经共培养的外植体。在枝条诱导培养基上进 行的所述孵育可在共培养步骤后立即开始(即，平行于用于抑制农杆菌生 长的步骤(b1))或在其它中间步骤，例如，(b1)(抑制农杆菌的生长) 和/或(b2)(没有选择化合物时的再生；见下文)之后开始。
用于枝条诱导(和/或枝条延长)的培养基优选补充有一种或多种植物 生长调控子，例如，细胞分裂素化合物(例如，6-苄氨基嘌呤)和/或生长 素化合物(例如，2，4-D)。术语“植物生长调控子”(PGR)在本文中使用 时表示：能调控植物生长和发育的天然存在的或合成的(非天然存在的) 化合物。PGR可单独作用，或与另一种一起作用，或与其它化合物(例如 糖、氨基酸)一起作用。术语“生长素”或“生长素化合物”包含刺激细胞延 长和分裂、维管组织分化、果实发育、不定根形成、乙烯产生和以高浓度 诱导去分化(愈伤组织形成)的化合物。最常用的天然存在的生长素是吲 哚乙酸(IAA)，其被指导转运进根和茎中。合成的生长素在现代农业中 广泛使用。合成的生长素化合物包含吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA) 和2，4-二氯苯氧乙酸(例如，2，4-D)。诱导枝条形成的化合物包括但不限 于IAA、NAA、IBA、细胞分裂素、生长素、激动素(kinetins)、草甘膦 和噻苯隆(thiadiazuron)。术语“细胞分裂素”或“细胞分裂素化合物”包含 刺激细胞分裂、子叶扩展和侧芽生长的化合物。它们延缓分离的叶的衰老， 并且与生长素(例如IAA)组合，可能影响根和枝条的形成。细胞分裂素 化合物包含，例如，6-异戊烯腺嘌呤(IPA)和6-苄基腺嘌呤/6-苄氨基嘌 呤(BAP)。
在本发明的一个实施方式中(尤其是对基于腋生分生组织的方法而 言)，步骤(b)(共培养)和/或(c)(枝条诱导和选择)中的至少一个 的培养基包含细胞分裂素(例如，6-苄氨基嘌呤(BAP))，优选浓度相 当于大约1μM至大约10μM 6-苄氨基嘌呤的浓度。对于枝条诱导培养基 而言，大约1至大约3μM的BAP浓度是优选的。优选地，BAP浓度不超 过5μM。
因此，在一种实施方式中，在共培养期间向培养基中加入一种或多种 植物激素或细胞分裂素。优选地，植物激素或细胞分裂素的浓度在0.1至 20微摩尔(microMolar)之间，更优选地，在1至10微摩尔之间。但是， 本领域技术人员知道，如何根据提供的数据来改变浓度以适应进行实验的 特定条件，例如，所用的培养基，孵育时间、温度、外植体的性质等。在 一种实施方式中，BAP具有例如在1左右至10左右的微摩尔范围内的浓 度，例如，7.5微摩尔左右。在一种实施方式中，使用激动素，优选地，1 微摩尔左右至10微摩尔左右的范围，例如1、3、5或7.5微摩尔左右。优 选的是1至8微摩尔的激动素，例如7.5微摩尔。
在另一优选的实施方式中，步骤(b)、(b1)、(b2)和/或(c)中 的至少一个的培养基包含细胞分裂素。
此外还尤其优选地，步骤(b)、(b1)、(b2)、(c)和/或(c1) 中至少一个，优选地，至少(b)和(c1)的培养基包含大约0.1μM至大 约2μM的赤霉酸(GA3)。
在另一优选的实施方式中，步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)中的 至少一个的培养基包含至少一种硫醇化合物，优选选自硫代硫酸钠、二硫 苏糖醇(DTT)和半胱氨酸。优选地，浓度为大约1mM至10mM L-半 胱氨酸、0.1mM至5mM DTT和/或0.1mM至5mM硫代硫酸钠之间。
在所述枝条诱导培养基上孵育外植体，直到枝条发育出来。形成的枝 条原基通常不超过0.3cm的尺寸。枝条原基的形成开始于在枝条诱导培养 基上1周左右，平均来说，此类枝条启动持续大约3至4周达到最大尺寸。 因此，经共培养的外植体在所述枝条诱导培养基上孵育大约2至6周，优 选大约3至4周。
如上文所讨论地，枝条诱导和随后的再生步骤优选在选择性条件(例 如，用大约3至100mM浓度的D-丝氨酸或D-丙氨酸补充枝条诱导培养 基、枝条延长培养基、生根培养基)下进行。
组织在该培养基中生长大约1至大约4周的时间，优选地，大约7天， 直到枝条发育出来。枝条形成开始于大约1至大约2周，这取决于处理和 共培养条件。
在一种优选的实施方式中，在转化前形成的所有枝条原基都将在共培 养后至多大约1周被除去，以刺激从分生组织进行新的生长。这有助于降 低初级转化体中的嵌合状态，以及增加转基因分生组织细胞的扩增 (amplification)。在该时期内，外植体可或可不被切为较小的块(即， 通过切上胚轴使得节与外植体分开)。
在SIM培养基(优选地，有选择)上2至4周后(或直到形成大量枝 条)，将外植体转移至枝条延长(SEM)培养基，其将刺激(枝条原基的) 枝条延长。该培养基可或可不含选择化合物，但是优选含选择化合物(例 如，大约3至大约20mM浓度的D-丝氨酸)。该组织在该培养基上生长 大约1至大约8周的时期。延长的枝条的频率和长度受SEM中激素水平， 特别是GA的影响。
在本发明的另一优选的实施方式中，步骤(c1)和/或(d)中至少一 个的培养基包含大约0.01mg/l(0.057M)至大约1mg/l(5.7μM)的吲哚 乙酸(IAA)和/或大约0.1μM至大约4μM的赤霉酸(GA3)和/或大约 0.5μM至大约6μM的反式-玉米素核苷酸(trans-zeatin riboside acid)。
优选地，每2至3周后，小心地除去死的组织后，将外植体转移至新 鲜的SEM培养基(优选地，含有选择化合物)。外植体应当保持在一起， 而不片段化为块，并且保持一定的健康。优选地，外植体将被继续转移， 直到外植体死亡或枝条延长。
转移至枝条延长培养基后大约4至8周，延长的枝条可被收获。可针 对表型规则性(regularity)和健康来对枝条进行评估，仅具有延长的茎(大 约1英寸或2cm)并且形成完整的具有三叶的叶的枝条才被收获。
将收集的枝条放到生根培养基上，以诱导根的形成。根的形成发生大 概1至4周，之后植物被转移至土壤，生长至完全成熟。生根培养基还可 (非排他性优选地)含有选择化合物。优选地，延长的枝条(长度大于3cm) 被除去，并被在根开始形成的时间放进生根培养基(RM)中大约1周(方 法B)，或者根据栽培种大约2至4周(方法C)。在具有根的外植体的 情况下，将它们直接转移进土壤。生根的枝条被转移至土壤，并在转入温 室前在生长室中硬化2-3周。使用该方法获得的再生的植物是可育的，每 株植物平均产生500粒种子。
通过该技术制造的T0植物是转基因植物，其通常以相当合理的产量被 回收。对于方法C而言，使用繁殖的腋生分生组织方案，大豆小植物的平 均再生时间为从外植体接种开始14周。因此，该方法具有快速的再生时间， 产生可育的、健康的大豆植物。
经转化的、表达标记基因的植物材料(例如细胞、组织或小植物)能 在存在能遏制未经转化的野生型组织生长的浓度的相应选择化合物时发 育。得到的植物可被用于育种，并以惯用的方式杂交。应当培养两代或更 多代，以确保基因组整合稳定并且是遗传性的。本发明的其它重要方面包 括通过公开的方法制备的转基因植物的后代以及源自此类后代的细胞和从 此类后代获得的种子。
本发明的另一实施方式涉及通过下文提供的方法制造的大豆细胞和植 物。因此，另一实施方式涉及包含下述DNA构建体的大豆植物或细胞， 所述DNA构建体包含在所述大豆植物或细胞中具有活性的启动子以及与 所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列， 其中，所述启动子相对所述酶编码序列来说是异源的。优选地，启动子和/ 或能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶如上文所定义。更优选地，所述大豆 植物或细胞还包含至少一个第二表达构建体，其向所述大豆植物赋予有农 业经济价值的性状。本发明的其它实施方式涉及所述大豆植物的部分，这 包括但不限于大豆种子(大豆)，以及涉及它们用于食物、饲料和工业目 的的用途。
在一种优选的实施方式中，大豆植物选自Jack、Resnik、Williams 82、 Corsoy、Crawford、Hutcheson、Kunitz和Champ。其它合适的大豆品种 可从研究和商业机构获得，例如，University of Guelph(Ontario Agricultural College；例如大豆品种RCAT Staples、Westag 97、RCAT Bobcat、OAC Prudence、OAC Woodstock、OAC 9908)；或来自Daryland 或Soygenetics的大豆品种。其它合适的品种是PI548402(Peking)、 PI437654(Er-hejjan)、PI438489(Chiquita)、PI507354(Tokei 421)、 PI548655(Forrest)、PI548988(Pickett)、PI88788、PI404198(Sun Huan Do)、PI404166(Krasnoaarmejkaja)、Hartwig、Manokin、Doles、Dyer 和Custer。
本发明的其它一些实施方式涉及本发明的大豆植物的部分、器官、细 胞、果实和其它繁殖材料。优选的部分选自组织、细胞、花粉、胚珠、根、 叶、种子、小孢子和营养部分。
得到的转基因植物可自花授粉或可与其它大豆植物杂交。收获T1种 子，干燥并适当贮藏，种子袋上加上适当的标签。应当培养两代或更多代， 以确保基因组整合稳定并且可遗传。例如，T1或T2代中的转基因事件应 当包括预先育种杂交程序，用于组合不同的转基因(基因堆积)。本发明 的其它重要方面包括通过公开的方法制备的转基因植物的后代以及源自此 类后代的细胞和从此类后代获得的种子。
2.6产生子代
转基因植物(包含本发明的DNA构建体)转化、选择和再生之后， 产生子代，因为切割启动子的活性，其经历切割，不包含标记序列和针对 内切核酸酶的表达盒。
子代可通过性繁殖或非性繁殖来产生。非性繁殖可通过本领域公知的 技术引入体细胞胚胎发生来实现。优选地，通过性繁殖/受精来产生子代。 受精可通过自交(自花授粉)或与其它转基因或非转基因植物杂交来实现。 本发明的转基因植物在本文中可作为母本或父本植物发挥作用。受精过程 后，收获种子，萌发，并生长为成熟植物。对子代的分离和鉴定(经历切 割过程)可在植物发育的任何阶段进行。用于此类鉴定的方法是本领域内 公知的，其可包含例如PCR分析、Northern印迹、Southern印迹或表型 筛选(例如，针对阴性选择标记)。
子代可包含农业经济价值性状基因的一个或多个拷贝。优选地，分离 仅包含一个拷贝的所述性状基因的子代。
此外，根据本发明还有源自上述转基因生物的细胞、细胞培养物、部 分(例如，在转基因植物生物的情况下，根、叶等)以及转基因繁殖材料 (例如种子或果实)。
根据本发明的经遗传修饰的、可被人或动物消耗的植物可用作为食物 或饲料，例如直接使用或对其进行本身已知的后续加工。在这方面，为了 消费者接受以及产品安全的理由，缺失例如对抗生素和/或除草剂的抗性 (产生转基因植物中通常引入的)。
本发明的另一主题涉及根据本发明的上述转基因生物和源自它们的细 胞、细胞培养物、部分(例如，在转基因植物生物的情况下，根、叶等) 以及转基因繁殖材料(例如种子或果实)用于生产食物或饲料、药物或精 细化学品的用途。精细化学品应当被理解为表示，酶、维生素、氨基酸、 糖、脂肪酸、天然和合成的香料(flavor)、芳香剂和着色剂。尤其优选的 是对生育酚或生育三烯酚的生产和对类胡萝卜素的生产。通过技术人员已 知的方法来进行对经转化的宿主生物的培养以及从宿主生物或从培养基分 离。药物(例如抗体或疫苗)的生产被描述过(例如，Hood 1999；Ma 1999)。
3.其它修饰
3.1反向选择和随后的标记缺失
优选地，可以以允许随后标记缺失的方式来构建D-氨基酸代谢酶的第 一表达构建体，尤其是当所述酶是D-氨基酸氧化酶时，其可被用于阴性选 择和反向选择(即，作为双功能标记)。当基于D-氨基酸氧化酶时，本发 明的方法可用作为组合的选择/标记缺失计划。基于所用的D-氨基酸，D- 氨基酸氧化酶可作为阴性或反向选择标记发挥作用。此类方法在PCT/EP 2005/002734(WO 2005/090581)中有详细描述，该文献通过引用整体并入本 文。
就此目的而言，第一表达盒优选侧翼有允许对所述第一表达盒加以特 异性缺失的序列。本发明的该实施方式利用D-氨基酸氧化酶(DAAO)作 为双功能标记发挥作用的性质，即，作为既允许(取决于所用的底物)作 为阴性选择标记又允许作为反向选择标记的标记。与D-氨基酸，例如D- 丝氨酸和D-丙氨酸(它们对植物具有高度的植物毒性，被D-氨基酸氧化 酶“去毒性”)相反，D-缬氨酸和D-异亮氨酸对野生型植物无毒，但是可被 表达D-氨基酸氧化酶DAAO的植物转化为毒性化合物。DAAO表达减轻 D-丝氨酸和D-丙氨酸的毒性但诱导使得D-异亮氨酸和D-缬氨酸具有毒性 的代谢变化这一发现表明在植物中该酶提供底物依赖性的、双功能可选择 标记。
因此，本发明的另一实施方式涉及一种方法，用于提供大豆细胞和植 物(优选不含标记)，所述方法包含下述步骤：
i)用第一DNA构建体转化大豆植物，所述DNA构建体包含：
a)至少一个第一表达构建体，其包含在所述大豆植物中具有活性的启 动子以及与所述启动子有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其 中，所述第一表达盒侧翼有允许特异性缺失所述第一表达盒的序列，以及
b)至少一个第二表达盒，其适合向所述植物赋予农业经济价值性状， 其中，所述第二表达盒不处于允许特异性缺失所述第一表达盒的所述序列 之间，以及
ii)用以植物毒性浓度的选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的第一 化合物处理步骤i)的所述经转化的大豆植物细胞，选出在其基因组中包含 所述第一DNA构建体的植物细胞，所述构建体向所述经转化的植物细胞 赋予通过表达所述D-氨基酸氧化酶的针对所述第一化合物的抗性，以及
iii)诱导所述第一表达盒从所述经转化的植物细胞的基因组缺失，以 及用对仍包含所述第一表达盒的植物细胞有毒的浓度的选自D-异亮氨酸、 D-缬氨酸及其衍生物的第二化合物来处理所述植物细胞，由此选出包含所 述第二表达盒但是缺少所述第一表达盒的植物细胞。
优选的启动子和D-氨基酸氧化酶序列如上文所述。
优选地，对第一表达盒的缺失可通过本领域已知的多种方法来实现， 这包括但不限于下述方法中的一种或多种：
a)序列特异性重组酶诱导的重组，其中，所述第一表达盒侧翼有相应 的重组位点，所述侧翼方式使得所述侧翼重组位点之间的重组导致其中间 的序列从基因组缺失；
b)所述第一表达盒侧翼的同源序列A和A’之间的同源重组，优选地， 通过序列特异性内切核酸酶导致的所述同源序列间的序列特异性双链断裂 (break)来诱导，其中，所述同源序列A和A’具有足够的长度和同源性， 以确保A和A’之间的同源重组，并且具有这样的定向，所述定向使得当A 和A’之间重组时，导致将所述第一表达盒从所述植物的基因组上切下来。
对于本领域技术人员来说，有多种手段可将缺失/切割诱导机制与本发 明的包含D-氨基酸氧化酶双功能选择标记的DNA构建体组合起来。优选 地，可用于本发明方法中的重组酶或内切核酸酶可由选自下述的方法来表 达：
a)将用于表达与植物启动子有效连接的重组酶或序列特异性内切核酸 酶的第二表达盒并入所述DNA构建体，优选地，与侧翼有允许特异性缺 失的所述序列的所述第一表达盒一起并入，
b)将用于表达与植物启动子有效连接的重组酶或序列特异性内切核酸 酶的第二表达盒并入用作为转化靶材料的植物细胞或植物中，由此产生主 细胞系(master cell line)或细胞，
c)将用于表达与植物启动子有效连接的重组酶或序列特异性内切核酸 酶的第二表达盒并入单独的DNA构建体，通过与所述第一DNA构建体共 转化进所述植物细胞的方式来对其进行转化，
d)将用于表达与植物启动子有效连接的重组酶或序列特异性内切核酸 酶的第二表达盒并入随后与包含本发明DNA构建体的植物杂交的植物或 植物细胞中。
在另一优选的实施方式中，可以以防止双功能标记被成熟前缺失/切割 的方式来诱导或活化缺失/切割诱导机制。优选地，因此，优选使用的序列 特异性重组酶或内切核酸酶的表达和/或活性可被诱导和/或活化，优选通过 选自下述的方法进行：
a)可诱导的表达，通过将编码所述重组酶或内切核酸酶的序列与可诱 导启动子有效连接来进行，
b)可诱导的活化，通过用包含配体结合结构域的经修饰重组酶或内切 核酸酶来进行，其中，可通过用与所述配体结合结构域有结合活性的化合 物进行处理来修饰所述经修饰的重组酶或内切核酸酶的活性。
优选地，本发明的方法因此产生不含选择标记的植物细胞或植物。
本发明的另一主题涉及适合用于本发明方法的DNA构建体。适合用 于本发明的DNA构建体优选包含：
a)第一表达盒，其包含与在大豆植物中具有活性的启动子(如上文所 定义；优选地，泛素启动子)有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列， 其中，所述第一表达盒侧翼有允许对所述第一表达盒进行特异性缺失的序 列，以及
b)至少一个第二表达盒，其适合用于向所述植物赋予有农业经济价值 的性状，其中，所述第二表达盒不位于允许对所述第一表达盒进行特异性 缺失的所述序列之间。
优选的启动子和D-氨基酸氧化酶序列如上文所描述。
为确保标记缺失/切割，本发明的DNA构建体中包含的针对D-氨基酸 氧化酶的表达盒(第一表达构建体)侧翼有针对序列特异性重组酶的重组 位点，所述侧翼方式使得所述侧翼重组位点之间诱导的重组导致所述第一 表达盒从基因组中缺失。优选地，允许对所述第一表达盒进行特异性缺失 的所述序列选自下述序列：
a)以一定方式排列的针对序列特异性重组酶的重组位点，所述排列方 式使得所述侧翼重组位点之间的重组导致其间的序列从基因组缺失，以及
b)同源序列A和A’，其具有足够的长度和同源性，以确保A和A’ 之间的同源重组，并且具有这样的定向：当在A和A’之间重组时，导致其 间的序列从基因组缺失。
优选地，构建体包含位于所述序列之间的针对序列特异性核酸酶的至 少一个识别位点，其允许对所述第一表达盒的特异性缺失(尤其对于上文 中的变体b而言)。
本领域已知多种重组位点和相应的序列特异性重组酶，它们可用于本 发明的目的。本领域技术人员已知用于定点去除重组引入的核酸序列的数 种系统。它们主要基于使用序列特异性重组酶来实现。多种序列特异性重 组系统已经被描述过，例如，噬菌体P1的Cre/lox系统(Dale1991；Russell 1992；Osborne 1995)、酵母FLP/FRT系统(Kilby 1995；Lyznik 1996)、 Mu噬菌体Gin重组酶、大肠杆菌Pin重组酶或质粒pSR1的R/RS系统 (Onouchi 1995；Sugita 2000)。基于attP位点和噬菌体λ重组酶的系统也 可使用(Zubko 2000)。此外，适于与本文公开的方法组合的方法被描述 于WO 97/037012和WO 02/10415中。
在一种优选的实施方式中，通过序列特异性双链断裂诱导的同源重组， 来进行双标记序列的缺失/切割。基本原理公开于WO 03/004659中，其通 过引用并入本文。就此目的而言，第一表达构建体(编码双功能标记)侧 翼有同源序列A和A’，其中，所述同源序列具有足够的长度和同源性，以 确保A和A’之间的同源重组，并且具有这样的定向：当在A和A’之间重 组时，导致第一表达盒从基因组切下。此外，所述同源序列侧翼的序列还 包含至少10个碱基对的至少一种识别序列，用于通过序列特异性的DNA 双链断裂诱导酶(优选地，序列特异性DNA内切核酸酶，更优选地，回 归内切核酸酶，最优选地，选自I-SceI、I-CeuI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI 和I-ChuI或其与配体结合结构域的嵌合体的内切核酸酶)定点引入DNA 双链断裂。
针对内切核酸酶或重组酶的表达盒(包含与植物启动子有效连接的序 列特异性重组酶或内切核酸酶)可被包括进本发明的DNA构建体。优选 地，所述第二表达盒与侧翼有允许特异性缺失的所述序列的所述第一表达 盒在一起。
在另一优选的实施方式中，所述序列特异性重组酶或内切核酸酶的表 达和/或活性可被诱导和/或活化，以避免在仍需要其作为阴性选择标记发挥 作用期间对双功能标记的成熟前缺失/切割。优选地，诱导/活化可通过选自 下述的方法来进行：
a)可诱导的表达，通过将编码所述重组酶或内切核酸酶的序列与可诱 导启动子有效连接来进行，
b)可诱导的活化，通过用包含配体结合结构域的经修饰重组酶或内切 核酸酶来进行，其中，可通过用与所述配体结合结构域具有结合活性的化 合物进行处理来修饰所述经修饰的重组酶或内切核酸酶的活性。
本发明的其它一些实施方式涉及包含本发明DNA构建体的转基因载 体。转基因细胞或非人生物包含本发明的DNA构建体或载体。优选地， 所述细胞或非人生物是具有农业用途的植物细胞或植物，优选地，植物。
本发明能够以可精确预测的方式、以高效率产生不含标记的转基因细 胞和生物，优选地，植物。
在上文关于一般性选择计划的上下文中，关于对化合物，浓度，应用 D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的模式的选择对反向选择步骤(ii)的优 先选择进行了描述。
为进行反向选择步骤(iii)，化合物选自包含D-异亮氨酸或D-缬氨酸 结构的化合物。更优选地，化合物选自D-异亮氨酸和D-缬氨酸。最优选 地，用于反向选择的化合物或组合物包含D-异亮氨酸。当通过细胞培养基 来应用时(例如，并入经琼脂固化的培养基平板中)，D-异亮氨酸可以以 大约0.5mM至大约100mM的浓度被使用，优选大约1mM至大约50 mM，更优选大约10mM至大约30mM。当通过细胞培养基来应用时(例 如，并入经琼脂固化的培养基平板中)，D-缬氨酸可以以大约1mM至大 约100mM的浓度被使用，优选大约5mM至大约50mM，更优选大约15 mM至大约30mM。
因此，使用上文所述的方法，可制造不含标记的大豆植物。术语“不含 标记”或“不含选择标记”在本文中关于细胞或生物的方面使用时意指不能 表达功能性选择标记蛋白(表达盒b编码的；如上文所定义的)的细胞或 生物，所述功能性选择标记蛋白与编码农业经济价值性状的基因组合插入 所述细胞或生物中。编码所述选择标记蛋白的序列可部分不存在，或者优 选整体不存在。此外，与其有效连接的启动子可通过部分或整体不存在来 失去功能。但是得到的植物可能包含可用作为选择比标记发挥功能的其它 序列。例如，植物可包含作为农业经济价值性状的除草剂抗性赋予基因。 但是，最优选地，得到的植物不包含任何选择标记。
本领域技术人员将从本文公开的内容显而易见本发明的多个其它方面 和实施方式。本申请文件中提到的所有文献都通过引用整体并入本文。下 面将举例并参照附图来阐述本发明的某些方面和实施方式。
3.2基因堆积
针对大豆的高效转化系统以及尤其是选择标记具有缺点。该缺点尤其 涉及依赖多次相继转化的手段。克服该问题的一种方法是上文提供的组合 的选择和标记缺失方法。另一方法基于对不同选择系统的组合。本发明的 方法和组合物允许相继转化。D-丝氨酸和/或D-丙氨酸代谢酶是相容的， 并且不干扰其它选择标记和选择系统。因此，可用本发明的构建体转化包 含另一选择标记的已有的转基因植物，或者随后用另一标记来转化通过本 发明的方法获得的植物(其包含D-丝氨酸和/或D-丙氨酸代谢酶的表达构 建体)。由此，本发明的另一实施方式涉及将至少两种DNA构建体相继 转化进大豆植物的方法，所述方法包括如下步骤：
a)用第一构建体转化，所述构建体包含至少一个表达构建体，其包含 在所述大豆植物中具有活性的启动子(优选地，上文定义的泛素启动子) 以及与所述启动子有效连接的编码能代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核 酸序列，以及
b)用第二构建体转化，所述构建体包含第二选择标记基因，其不赋予 针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
优选地，所述第二标记基因是阴性选择标记，其赋予对杀生物化合物 的抗性，所述杀生物化合物例如，(非D-氨基酸)代谢抑制物(例如，2- 脱氧葡萄糖-6-磷酸盐，WO 98/45456)、抗生素(例如卡那霉素、G418、 博来霉素或潮霉素)或除草剂(例如，膦丝菌素、磺酰脲型和咪唑啉酮型 除草剂或草甘膦)。实例是：
-膦丝菌素乙酰转移酶(PAT；也称为抗性；bar；de Block 1987；Vasil 1992，1993；Weeks 1993；Becker 1994；Nehra 1994；Wan& Lemaux 1994；EP 0333033；US 4,975,374)
-5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS) (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)，其赋予对 (N-(膦酰甲基)甘氨酸)的抗性(Shah 1986；Della-Cioppa 1987a，b)
降解酶(氧化还原酶；gox)
失活脱卤素酶(deh)
-磺酰脲型和/或咪唑啉酮型失活乙酰乳酸合酶(ahas或ALS；例如， 具有例如S4、XI12、XA17和/或Hra突变的突变的ahas/ALS变体)
降解腈水解酶(bxn)
-卡那霉素或遗传霉素(G418)抗性基因(NPTII；NPTI)，其编码 例如新霉素磷酸转移酶(Fraley 1983；Nehra 1994)
-潮霉素磷酸转移酶(HPT)，其介导对潮霉素的抗性(Vanden Elzen 1985)
-二氢叶酸还原酶(Eichholtz 1987)
多种时间计划可被用于多种阴性选择标记基因。当使用抗体基因(例 如，针对除草剂的)的情况下，优选地，在愈伤组织诱导期期间应用选择 大约4周，并且超过至少4周进入再生。此类选择计划可用于所有选择方 案。此外，还可(虽然并非排他性地优选地)在整个再生计划(包括生根) 期间保持选择。例如，用膦丝菌素抗性基因(bar，PAT)作为选择性标记 时，可在培养基中包括浓度为大约1至50mg/l的膦丝菌素或双丙氨膦。
优选地，所述第二标记赋予针对选自膦丝菌素、麦草畏、草甘膦、磺 酰脲型和咪唑啉酮型除草剂的至少一种化合物的抗性。
此外，所述方法的产物相对本领域本身就有新颖性和创造性。因此， 本发明的另一实施方式涉及大豆植物，其包含：
a)第一表达构建体，其包含在所述大豆植物中具有活性的启动子(优 选地，上文定义的泛素启动子)以及与所述启动子有效连接的编码能代谢 D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，以及
b)针对选择标记基因的第二表达构建体，所述选择标记基因不赋予针 对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
优选地，所述第二标记基因如上文所定义，其最优选赋予针对选自膦 丝菌素、麦草畏、草甘膦、磺酰脲型和咪唑啉酮型除草剂的至少一种化合 物的抗性。
下述组合是尤其优选的：
-用赋予针对膦丝菌素的抗性的选择标记进行第一次转化，接着用 dsdA选择标记基因进行第二次转化；
-用赋予针对膦丝菌素的抗性的选择标记进行第一次转化，接着用 dao1选择标记基因进行第二次转化；
-用dsdA选择标记基因进行第一次转化，接着用赋予针对膦丝菌素的 抗性的选择标记进行第二次转化；
-用dao1进行第一次转化，接着用赋予针对膦丝菌素的抗性的选择标 记进行第二次转化。
除了与用于不赋予针对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性的选择标记基因 的第二表达构建体堆积之外，此外还可堆积dsdA和dao1基因。例如，可 使用dsdA基因以及D-丝氨酸作为选择剂来进行第一次选择，随后可使用 dao1基因以及D-丙氨酸作为选择剂来进行第二次选择。因此，本发明的 另一实施方式涉及一种方法，所述方法用于将至少两种DNA构建体相继 转化进大豆植物，所述方法包括如下步骤：
a)用第一构建体转化，所述构建体包含表达构建体，其包含在所述大 豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码dsdA酶的 核酸序列，并且用D-丝氨酸进行选择，以及
b)用第二构建体转化，所述构建体包含表达构建体，其包含在所述大 豆植物中具有活性的启动子以及与所述启动子有效连接的编码dao酶的核 酸序列，并且用D-丙氨酸进行选择。
此外，所述方法的产品被认为相对于本领域而言是具有新颖性和创造 性的。因此，本发明的另一实施方式涉及大豆植物，其包含：
a)第一构建体，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子(优选地，上文定义的泛素启动子) 以及与所述启动子有效连接的编码dsdA酶的核酸序列，以及
b)第二构建体，所述构建体包含下述表达构建体，所述表达构建体包 含在所述大豆植物中具有活性的启动子(优选地，上文定义的泛素启动子) 以及与所述启动子有效连接的编码dao酶的核酸序列。
更优选地，用于所述第一和所述第二表达构建体的启动子不相同或相 同。在包含两种表达盒的上述构建体中，优选地，在大豆植物中具有活性 的两种启动子不相同。优选地，一种启动子(例如，用于表达D-丙氨酸和 /或D-丝氨酸代谢酶的启动子)是上文定义的泛素启动子，而另一种启动子 是肌动蛋白启动子。
在本文公开的内容教导下，本文公开和要求保护的所有组合物和方法 都可以在不进行过度实验的情况下产生和执行。虽然本发明的组合物和方 法是以优选实施方式的形式被描述的，但是本领域技术人员显而易见：可 对本文所述的组合物、方法以及方法的步骤或步骤顺序加以变化，而并不 偏离本发明的概念、宗旨和范围。更具体地，显而易见：本文所述的物质 可被化学和生理学上相关的某些物质取代，但仍获得相同或相似的结果。 对于本领域技术人员而言显而易见的所有此类相似取代和修饰都落在由所 附权利要求界定的本发明的宗旨、范围和概念中。本申请文件中提到的所 有出版物和专利申请都代表了本发明所属领域技术人员的技术水平。所有 出版物和专利申请都通过引用并入本文，这与每篇单独的出版物或专利申 请被特别地、单独地指示为通过引用并入的程度是一样的。
此外，本发明涉及用于选择、再生、生长、培养或保持转基因大豆植 物细胞、转基因大豆植物组织、转基因大豆植物器官或转基因大豆植物或 其部分的组合物，其包含有效量的D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物，允许 对转基因大豆植物细胞、大豆植物组织、大豆植物器官或大豆植物或其部 分和转基因大豆生物、转基因大豆细胞、转基因细胞培养物、转基因大豆 植物和/或其部分加以选择，本发明还涉及包含源自位于第一组叶上的节的 一种或多种胚胎发生愈伤组织的细胞培养物，其包含总浓度为大约5mM 至10mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸。
本发明还涉及包含大豆靶组织和以植物毒性浓度的D-丙氨酸和/或D- 丝氨酸或其衍生物的选择培养基。
本文中展示的启动子数据表明，欧芹泛素工作良好(2％TE)，ScBV 和具有内含子的ScBV(即，p-ScBV-iSuc UDP)以相似的效率(1.4％) 工作。大豆泛素也显示出好的效率(构建体RLM434；5％的转化效率；仅 60个外植体)。因此，例如，强组成型启动子与dsda或dao1组合使用。 强组成型启动子例如肌动蛋白2启动子、35S或19S启动子以及上文描述 的泛素启动子(例如，PcUbi或GmUbi启动子)或p-ScBV或p-ScBv-iSuc UDP启动子。nos或“超级启动子”也可能是合适的，特别是对于一些组织 特异性表达而言。因此，在一种实施方式中，本发明涉及下述构建体，其 包含与dsda或dao1基因有效连接的PcUbi启动子和/或包含与dsda或 dao1基因有效连接的p-ScBV或p-ScBv-iSuc UDP启动子。
序列
1.SEQ ID NO：1编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]的核苷酸 序列
2.SEQ ID NO：2编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]的氨基酸 序列
3.SEQ ID NO：3编码瘦弱红酵母(红冬孢酵母)D-氨基酸氧化酶的 核苷酸序列
4.SEQ ID NO：4编码瘦弱红酵母(红冬孢酵母)D-氨基酸氧化酶的 氨基酸序列
5.SEQ ID NO.5经密码子优化的、编码瘦弱红酵母(红冬孢酵母) D-氨基酸氧化酶的核苷酸序列
6.SEQ ID NO.6编码瘦弱红酵母(红冬孢酵母)D-氨基酸氧化酶的 氨基酸序列
7.SEQ ID NO：7欧芹(Petroselinum crispum)UBI4-2启动子，其 包含具有内部内含子(406-993)的5′非翻译区域的部分，总共996bp长。
8.SEQ ID NO：8大豆(Glycine max)泛素启动子，其包含具有内部 内含子(1519-2031)的5′非翻译区域的部分，总共2031bp长。
9.SEQ ID NO：9人工构建体：Bar-Selda二元载体RLM407：LB＞ ＜p-NOS::c-BAR::t-NOS p-PcUBI4-2::c-dsdA/na::t-NOS＞RB＞。
10.SEQ ID NO：10人工构建体：RLM274的T-DNA插入片段， RLM407-型Bar-GUS二元载体：LB＞＜p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
11.SEQ ID NO：11人工构建体：RLM254T-DNA插入片段， RLM407-型Selda-GUS二元载体的：LB＞＜p-sTPT::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
12.SEQ ID NO：12人工构建体：REW008的T-DNA插入片段， Bar-GUS二元载体：LB＞＜p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
13.SEQ ID NO：13人工构建体：RET063的T-DNA插入片段， RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞＜p-AtAct2i::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
14.SEQ ID NO：14人工构建体：RET019的T-DNA插入片段， RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞＜p-AtAct2i::c-dao1/pa::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
15.SEQ ID NO：15人工构建体：RET017的T-DNA插入片段， RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞＜p-NOS:c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
16.SEQ ID NO：16人工构建体：RET015的T-DNA插入片段， RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞＜p-NOS:c-dao1/ko::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞。
17.SEQ ID NO：17拟南芥肌动蛋白2启动子区域，其具有第一内含 子(955-1397)；总长度：1408个核苷酸。
实施例
除非另有指明，所有化学物都来自贝克梅林克罗克公司(Mallinckrodt Baker，Inc.)(Phillipsburg，NJ，USA)、植物技术实验室(Phytotechnology Laboratories)(Shawnee Mission，KS，USA)、EMD化学公司(EMD Chemicals，Inc.)(Gibbstown，NJ，USA)、阿尔法伊萨和西格玛公司(Alfa Aesar and Sigma)(St.Louis，MO，USA)。
A.用于培养基的贮液：
1.B5主要盐(10×贮液)
a.0.25M KNO3(硝酸钾)
b.0.01M CaCl2＊2H2O(氯化钙)
c.0.01M MgSO4＊7H2O(硫酸镁)
d.0.01M(NH4)2SO4(硫酸铵)
e.0.01M NaH2PO4＊H2O(磷酸钠)
2.B5次要盐(100×贮液)
a.5mM H3BO3(硼酸)
b.10mM MnSO4＊H2O(硫酸镁)
c.0.7mM ZnSO4＊7H2O(硫酸锌)
d.0.45mM KI(碘化钾)
e.0.1mM Na2MoO4＊2H2O(钼酸)
f.0.01mM CuSO4＊5H2O(硫酸铜)
g.0.01mM CoCl2＊6H2O(氯化钴)
3.B5维生素(100×贮液)
a.0.055M肌醇
b.0.8mM烟酸
c.0.5mM吡哆醇-HCl
d.3mM硫胺素-HCl
4.MS主要盐(10×贮液)
a.0.2M NH4NO3(硝酸铵)
b.0.2M KNO3(硝酸钾)
c.30mM CaCl2＊2H2O(氯化钙)
d.15mM MgSO4＊7H2O(硫酸镁)
e.12.5mM KH2PO4(磷酸钾)
5.MS次要盐(100×贮液)
a.10mM H3BO3(硼酸)
b.13mM MnSO4＊H2O(硫酸镁)
c.3mM ZnSO4＊7H2O(硫酸锌)
d.0.5mM KI(碘化钾)
e.0.1mM Na2MoO4＊2H2O(钼酸)
f.0.01mM CuSO4＊5H2O(硫酸铜)
g.0.01mM CoCl2＊6H2O(氯化钴)
6.MSIII铁(100×贮液)
a.10mM FeSO4＊7H2O(硫酸亚铁)
b.10mM C10H14O8Na2N2＊2H2O(NaEDTA)
B.培养基组成
除非下文另有指明，培养基可用于本发明方法的所有三种优选外植体 组织。
1.萌发培养基GM(固体)，在25×100mm培养皿或PlantconTM(西 格玛公司(Sigma))培养箱中：
a.1×B5主要盐，
b.1×B5次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.2％蔗糖，
e.1×B5维生素，
f.5uM BAP(任选的)，
g.0.8％经纯化的琼脂(西格玛公司(Sigma))；
h.pH 5.8。
2.YEP培养基(固体和液体)，在锥形瓶中，或15×100mm培养皿中：
a.10g/L细菌用蛋白胨(蒂夫科公司(Difco)；贝克特迪克森公司 (Becton Dickinson & Co.)，Cockeysville，MD，USA)，
b.5g/L酵母提取物(蒂夫科公司(Difco))，
c.5g/L NaCl，
d.用于选择的合适抗生素，
e.1.2％颗粒化琼脂(蒂夫科公司(Difco))仅固体；
f.pH 7.0。
3.繁殖培养基MODPROP(固体)，在25×100mm培养皿中(方法 C)
a.1×MS主要盐，
b.1×MS次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.1×B5维生素，
e.3％蔗糖
f.0.22至1.12mg/L(1μM至5μM)BAP(优选大约1μM)
g.0.8％经纯化的琼脂(西格玛公司(Sigma))
h.pH 5.8。
4.共培养培养基CCM(液体)：
a.1/10×B5主要盐，
b.1/10×B5次要盐，
c.1/10×MSIII铁，
d.1×B5维生素
e.3％蔗糖，
f.20mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES；MW＝213.26g/Mol)，
g.200μM乙酰丁香酮(AS)，
h.0.72μM至1.44μM GA3(赤霉酸；Mw＝346.38g/Mol)
i.BAP(6-苄氨基嘌呤；MW＝225.25g/mol)：7.5μM，
j.仅方法C：400mg/L L-半胱氨酸(3.3mM)(西格玛公司(Sigma))
k.pH 5.4。
5.共培养培养基CCM(固体)，在15×100mm的培养皿中：
a.1/10×B5主要盐，
b.1/10×B5次要盐，
c.1/10×MSIII铁，
d.1×B5维生素，
e.3％蔗糖，
f.20mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)
g.200μM乙酰丁香酮AS，
h.0.72μM至1.44μM GA3(赤霉酸；Mw＝346.38g/Mol)
i.BAP(6-苄氨基嘌呤；MW＝225.25g/mol)：7.5μM，
j.硫醇化合物，
(i).100至1000g/L L-半胱氨酸(MW＝121.16g/Mol；西格玛公司 (Sigma))；优选地：方法B和C：400mg/L L-半胱氨酸(3.3mM)； 方法A：1g/l(8.25mM)L-半胱氨酸
(ii).0至1mM或154.2mg/L DTT(费舍科学公司(Fisher Scientific)， Fair Lawn，NJ，USA)，
(iii).0至1mM无水硫代硫酸钠(158.1mg/L)或五水合硫代硫酸钠 245mg/L(梅林可多公司(Mallinckrodt)，Paris，KY，USA)，方法A：1 mM二硫苏糖醇，1mM硫代硫酸钠
k.0.5％经纯化的琼脂；
l.pH 5.4。
6.洗涤培养基Modwash(液体)：
a.1×B5主要盐，
b.1×B5次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.3％蔗糖，
e.1×B5维生素
f.30mM MES，
g.350mg/L TimentinTM
h.pH 5.6。
6.枝条诱导培养基SIM(液体)：
a.1×B5主要盐，
b.1×B5次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.1×B5维生素，
e.3％蔗糖，
f.3mM MES，
g.1μM至7.5μM(优选地1μM)BAP
h.250mg/L TimentinTM
i.0.8％经纯化的琼脂)
j.pH 5.6。
5.枝条诱导培养基SIM(固体)，在20×100mm培养皿中：
a.1×B5主要盐，
b.1×B5次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.1×B5维生素，
e.3％蔗糖，
f.3mM MES，
g.1μM至7.5μM(优选大约1μM)BAP
h.5μM激动素
i.250mg/L TimentinTM
j.合适的话，选择化合物，
k.0.8％经纯化的琼脂；
l.pH 5.6。
7.枝条延长培养基SEM(固体)，在20×100mm培养皿中，
a.1×MS主要盐，
b.1×MS次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.1×B5维生素，
e.3％蔗糖，
f.3mM MES，
g.50mg/L L-天冬酰胺(0.378mM)，
h.100mg/L L-焦谷氨酸(0.775mM)，
i.0.1mg/L IAA(0.57μM)，
j.0.5mg/L GA3(1.44μM)，
k.1mg/L反式玉米素核苷(2.85μM)，
l.250mg/L TimentinTM
m.合适的话，选择化合物，
n.0.8％经纯化的琼脂；
o.pH 5.6。
7.生根培养基RM(固体)，在25×100mm培养皿中或PlantconTM (西格玛公司(Sigma))培养箱中：
a.1/2×B5主要盐，
b.1/2×B5次要盐，
c.1×MSIII铁，
d.2％蔗糖，
e.3mM MES，
f.1mg/L(5μM)吲哚丁酸(IBA，Mw＝203.24g/Mol)
g.0.8％经纯化的琼脂；仅方法C：250mg/L Timentin
h.pH 5.6。
实施例1：大豆种子的灭菌和萌发
几乎任何大豆品种的任何种子都可用于本发明的方法。数种大豆栽培 种(包括Jack、Williams 82和Resnik)对于大豆转化来说都是合适的。 在具有氯气的室中对大豆种子加以灭菌，所述氯气是通过向具有紧密盖紧 的瓶盖的干燥器中100ml漂白剂(5.25％次氯酸钠)滴加3.5ml 12N HCl 来产生的。在室中24至48小时后，移出种子，将大约18至20粒种子放 到固体GM培养基上，该培养基处于25×100mm培养皿中，其中有或没 有5μM 6-苄氨基嘌呤(BAP)。没有BAP的幼苗更加延长，根发育，尤 其是次生根和侧根形成。BAP通过形成更短矮粗的幼苗使得幼苗增强。
将在25℃光照(＞100μM/m2s)下生长的7天龄的幼苗用于三种外植 体类型的外植体材料。在该时间，种皮已裂开，具有具一小叶的叶的上胚 轴最小也生长到了子叶的长度。上胚轴应当至少0.5cm，以避免子叶节组 织(因为大豆栽培种和种子批次发育时间有变化，对萌发阶段的描述比对 特定萌发时间的描述更为精确)。
实施例2：农杆菌培养物的生长和制备
通过以下所述来制备农杆菌培养物：将携带想要的二元载体的农杆菌 (例如，根瘤农杆菌或发根农杆菌)划线到固体YEP生长培养基上，并在 25℃进行孵育，直到菌落出现(大约2天)。根据在Ti或Ri质粒、二元 载体和细菌染色体上存在的可选择标记基因，将使用不同的选择化合物来 用于YEP固体和液体培养基中进行根瘤农杆菌和发根农杆菌的选择。多种 农杆菌菌株可用于转化方法。
大致2天后，挑取单个菌落(用灭菌牙签进行)，接种50ml含抗生 素的液体YEP，在175rpm(25℃)下振荡，直到达到0.8-1.0的OD600 (大致2天)。制备用于转化的工作甘油贮液(15％)，将1ml的农杆菌 贮液装入1.5ml Eppendorf管作为等分试样，然后贮藏于-80℃。
外植体接种前一天，用5μl至3ml工作农杆菌贮液在500ml锥形瓶 中接种200ml YEP。在25℃振荡该瓶过夜，直到OD600在0.8至1.0之间。 在制备大豆外植体之前，通过在5500×g于20℃离心10分钟来沉淀农杆 菌。将沉淀重新悬浮于液体CCM中，至想要的密度(OD6000.5-2.0)，在 使用前放在室温下至少30分钟。
实施例3：外植体制备和共培养(接种)
幼苗在该时间已将上胚轴延长了至少0.5cm，但是通常在0.5至2cm 之间。已经成功使用了长至4cm的延长的上胚轴。然后制备外植体，其：
i)有或没有一些根，
ii)有部分、一片或两片子叶，所有预先形成的叶都被除去，包括顶端 分生组织，使用锋利的解剖刀切数下来损伤位于第一组叶(the first set of leaves)的节。
在所述节处进行的切割不仅诱导农杆菌感染，还使得腋生分生组织细 胞分散，以及破坏了预先形成的枝条。在损伤和制备之后，将外植体从培 养皿取出，随后与液体CCM/农杆菌混合物共培养30分钟。然后从液体 培养基中移出外植体，放到具有固体共培养培养基的15×100mm培养板上 的灭菌滤纸顶部。受到损伤的靶组织以使得它们与培养基直接接触的方式 被放置。
实施例4：枝条诱导
在黑暗下于25℃共培养3至5天后，将外植体用液体SIM培养基漂 洗(以除去过量的农杆菌)，之后放到固体SIM培养基上。放置大约5个 外植体，使得靶组织与培养基直接接触。在开始两个星期期间，可用或不 用选择性培养基来培养外植体。优选地，将外植体转移到无选择的SIM上 一周。
用3M微孔胶带(3M公司(3M)，St.Paul，Minnesota，USA)封住平 板，将其放进生长室中2周，温度平均为25℃，在70-100μE/m2s下以18 小时光照/6小时黑暗周期进行。针对该外植体已经测试了数种光强度和波 长、选择方案和SIM。外植体将在有或无选择的SIM培养基上保持，直到 在靶区域(例如，在上胚轴以上第一个节处的腋生分生组织)发生了从头 枝条生长。可在该时期内转移到新鲜的培养基上。大约一周之后，将外植 体从有或无选择的SIM转移到有选择的SIM上。在该时间，在幼苗外植 体的初生节上有相当的从头枝条发育。
优选地，在转化前形成的所有枝条都在共培养后至多2周被移出，以 刺激从分生组织的新的生长。这有助于降低初级转化体中的嵌合状态，以 及增加转基因分生组织细胞的扩增。在该时间期间，外植体可或可不被切 为更小的块(即，通过切上胚轴将节与外植体分开)。
实施例5：枝条延长
在SIM培养基(优选具有选择)上2至4周后(或者直到形成了大量 的枝条后)，将外植体转移进SEM培养基，这将刺激枝条原基的枝条延 长。该培养基可以含有或者可以不含选择化合物。
每2至3周后，在小心地除去死的组织之后，将外植体转移至新鲜的 SEM培养基(优选含有选择)。外植体应当保持到一起，不被片段化为小 块，并且保留一定的健康。外植体将被继续转移，直到外植体死亡或枝条 延长。＞3cm的延长的枝条被移出，并且放进RM培养基大约1周，此时 根开始形成。在具有根的外植体的情况下，将它们直接转移进土壤。生根 的枝条被转移至土壤，并在转入温室前在生长室中硬化2-3周。使用该方 法获得的再生的植物是可育的，每株植物平均产生500粒种子。
与根瘤农杆菌一起共培养5天后，在幼苗腋生分生组织外植体上广泛 分布有瞬时GUS表达，尤其是在外植体制备期间损伤的区域中。将外植体 放进没有选择的枝条诱导培养基中，以观察初生节是怎样应答枝条诱导和 再生的。目前为止，超过70％的外植体在该区域形成了新的枝条。在SIM 上14天之后，GUS基因的表达是稳定的，这暗示了T-DNA整合进了大豆 基因组。此外，初步实验在SIM上3周之后导致了GUS阳性枝条形成。
实施例6：在未经接种的幼苗腋生分生组织外植体上的杀伤曲线
在腋生分生组织外植体上进行D-丝氨酸对未经农杆菌感染的大豆组 织的毒性的杀伤曲线。按照实施例1所述制备三十个外植体，在含有0mM、 3μM、30μM、300μM、3mM、30mM或60mM D-丝氨酸的SIM上培 养总共4周。该时间后，对具有新的枝条原基(即，多条根的出现)的外 植体的百分比加以计算。在该实验中，观察到了3至30mM之间出现的再 生的降低，以及暴露给60mM D-丝氨酸时外植体的仅30％再生(图1)。
实施例7：D-丝氨酸对经农杆菌接种的幼苗腋生分生组织外植体的杀 伤曲线
在枝条诱导水平上，有或没有农杆菌感染的情况下，针对三种大豆栽 培种来进行D-丝氨酸选择幼苗腋生分生组织(SAM)的杀伤曲线。对于每 种栽培种而言，切下10个外植体并且用根瘤农杆菌菌株AGL1/pREW008 (没有dsdA基因对照)接种，用AGL1/pRET017(nosP-dsda-nosT)接 种10个外植体，5个外植体不予接种。共培养之后，将SAM外植体转移 到具有0、10、30、50或70mM D-丝氨酸的枝条诱导培养基上。枝条诱导 4周后，观察外植体的存活，发现D-丝氨酸的合适的选择水平为30至50 mM(图2)。
实施例8a：用D-丝氨酸对经接种的腋生分生组织外植体建立杀伤曲线
为建立枝条诱导和延长期间的有效选择水平，最初使用宽范围的D- 丝氨酸浓度。按照实施例1和3所述，从来自Dairyland栽培种98043的7 天龄的幼苗制备大豆腋生分生组织外植体。
按照实施例2所述，制备具有Super Vir pSB1质粒和含有二元质粒 pRET017或pREW008的发根农杆菌菌株SHA017。pRET017含有 nosP-c-dsdA/na-nosT和pPcUBI-gusINT-nosT(实施例9)。pREW008 含有nosP-bar-nosT和pPcUBI-gusINT-nosT，其被用作为对照载体(实施 例9)。
按照上文的实施例4所述来操作外植体。在没有选择的枝条诱导培养 基(SIM)上一周之后，将外植体转移至含有范围从0至15至30至45mM 的多种浓度的D-丝氨酸的SIM培养基中。孵育3和6周后，所有再生外 植体(枝条垫(shoot pad))被转移至含有3mM D-丝氨酸的枝条延长培 养基(SEM)。延长中的枝条被转移至生根培养基(RM)，通过GUS表 达和Taqman分析进行筛选。
表1：在枝条诱导(SIM)培养基中3周之后，在多种D-丝氨酸浓度 上再生的每个构建体的外植体百分比
SIM 中的 0mM 15mM 30mM 45mM
D-Ser REW008 79.0 76.9 55.3 21.9 RET017 74.4 78.1 61.2 25.5
表2：在枝条延长(SEM)+3mM D-丝氨酸中3周之后，存活的每个 构建体的外植体的百分比
SIM 中的 D-Ser 0mM 15mM 30mM 45mM REW008 94.7 72.1 34.5 2.6 RET017 82.8 74.1 33.6 4.9
枝条诱导培养基中D-丝氨酸的增加水平减少了再生和形成枝条垫的 外植体的百分比(图3)。形成的枝条垫的大小随着D-丝氨酸水平的增加 而减少。此外，棕色易碎愈伤组织的形成随着增加D-丝氨酸浓度而增加。 在枝条诱导期间，枝条垫形态在含dsdA(RET017)和对照(REW008) 构建体之间几乎观察不到区别(图3)。在枝条诱导期间，来自30或45mM D-Ser的这些外植体上在3mM D-Ser时没有枝条延长。枝条诱导期间，少 数枝条从暴露给15mM D-Ser的外植体延长(数据未示出)。在实验期间 进行的GUS测定显示了在枝条诱导培养基中3周后，从pRET017和 pREW008产生的枝条垫中的GUS阳性片区(sector)。在枝条诱导期间 于15mM D-丝氨酸上形成的并在枝条延长时被转至3mM D-丝氨酸的少 数延长的枝条上，GUS测定和Taqman(uidA和dsdA)分析都是阴性的。 在枝条诱导期间以比15mM D-丝氨酸更高的浓度孵育后没有观察到延长 的枝条。
实施例8b：使用初生节外植体的D-丙氨酸和D-丙氨酸/D-丝氨酸杀伤 曲线
使用dao1作为可选择标记基因，进行更多的实验来研究具有和不具有 7.5mM D-丝氨酸时D-丙氨酸选择的杀伤曲线。还针对代谢D-丙氨酸和 D-丝氨酸的dao1基因，用D-丙氨酸和D-丝氨酸的组合来进行研究。用二 元质粒RET019(Pactin-dao1，Pubi-gus)和REW008(Pnos-bar，Pubi-gus) 分别作为阳性和阴性对照，使用发根农杆菌菌株SHA017pSB1，将T-DNA 移到大豆中。
用农杆菌接种外植体，共培养5天，然后移到有或没有选择的枝条诱 导培养基上一周。在该时间后，将外植体转移到新的具有选择的SIM上。
在实验1中，向SIM培养基中加入下述浓度的D-丙氨酸：0、3、7.5、 10、20、30和50mM。
在实验2中，加入相同浓度的D-丙氨酸和7.5mM的D-丝氨酸。
实验设计如下所示：T(处理)1：用REW008接种且1周恢复的7 个外植体；T2：用REW008接种且无恢复的7个外植体；
实验结果示于表2b中。再生频率不会下降70％以下，直到外植体在 共培养之后立即暴露给30mM D-丙氨酸。这种降低在具有恢复的外植体上 看不到，直到使用了20mM的D-丙氨酸。当与D-丝氨酸组合时，外植体 在更低的浓度——7.5至10mM之间再生确实降低。
表2b：采用相应处理时，基于在SIM上3周后的再生的D-丙氨酸杀 伤曲线的结果。
实验1：在SIM上3周后，D-丙氨酸杀伤曲线——再生(％)
实施例9：用于评估dsdA和dao1基因的转化载体
制造数种含有dsdA或dao1基因的转化载体。包含bar选择标记的构 建体在转化实验中被用作为对照(表3)。使用pSUN3二元载体作为背景， 开发大多数载体(除了pLM407和pLM274，它们具有Gateway背景)(表 3)。DSDA蛋白质仅用D-丝氨酸作为底物，而DAO1蛋白质能酶促氧化 更宽范围的D-氨基酸，例如D-Ser和D-Ala。
表3：在建立用dsdA和dao1基因作为选择标记的转化中，对用于实 验的转化载体的描述。EcdsdA＝大肠杆菌dsdA；dao 1＝D-氨基酸氧化 酶基因；bar＝膦丝菌素乙酰转移酶；p-PcUbi4-2＝欧芹ubi启动子； STPT＝来自拟南芥的丙糖磷酸易位蛋白；pNos＝胭脂碱合酶启动子； p-AtACT＝拟南芥肌动蛋白启动子；t-OCS3′＝OCS3′终止子；t-NOS＝nos 终止子。
载体 SEQ ID NO： LB-选择标记 报道基因/选择标记-RB pRET017 15 p-Nos::EcdsdA::t-NOS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS pRLM407 9 p-PcU bi4-2::EcdsdA::t- OCS p-Nos::bar::t-NOS pRET063 13 p-AtAct::EcdsdA::t-OCS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS pET019 14 p-AtAct::dao 1/ko::t-OCS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS RET015 16 p-Nos::dao1/ko p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS pLM254 11 p-STPT::EcdsdA::t-OCS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS pLM274 10 p-Nos::bar::t-NOS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS pREW008 12 p-Nos::bar::t-NOS p-PcUbi4-2::gusINT::t-NOS
对于pRLM407(gateway背景)而言，pRLM274是对照，而对于所 有其余构建体(pSUN3背景)而言，pREW008是对照。
实施例10a：当在不同启动子下使用dsdA或dao1基因时D-丝氨酸选 择的影响。
按照实施例1和3所述，从来自Dairyland栽培种93061的7天龄的 幼苗制备大豆腋生分生组织外植体。
按照实施例2所述，制备具有Super Vir pSB1质粒和含有表3所述的 二元质粒的发根农杆菌菌株SHA017。
按照实施例4所述来操作外植体。在没有选择的枝条诱导培养基 (SIM)上一周之后，将外植体转移至含有7.5mM的D-丝氨酸的SIM中。 孵育3和6周后，所有再生外植体(枝条垫)被转移至含有5mM D-丝氨 酸的枝条延长培养基(SEM)。延长中的枝条被转移至生根培养基(RM)， 通过GUS表达和/或Taqman分析进行筛选。
如表4所示，欧芹泛素启动子驱动dsdA基因的表达更为高效。基于 对uidA报道基因的基因表达分析已知，欧芹泛素启动子在大豆腋生幼苗 中是高度组成型的启动子。当使用dsdA基因时，拟南芥肌动蛋白启动子 也能向大豆细胞赋予表达抗性水平，但是效率要比欧芹泛素启动子低得多 (表4)。当使用在NOS或STPT启动子控制下的dsdA基因时，没有获 得转基因枝条。当使用dao1/ko基因时，拟南芥肌动蛋白和NOS启动子能 向大豆细胞赋予抗性水平。在该情况下，NOS启动子和dao1/ko基因的组 合看起来较之At肌动蛋白::dao1/ko有高两倍的效率。
表4对在D-丝氨酸选择下对用不同启动子驱动dsdA和dao1基因的 构建体进行评估的转化实验的概括
载体 SEQ ID NO： 标记描述 #外植体 #延长的 枝条 阳性 枝条的#* RET017 15 p-Nos::EcdsdA 455 17 0 RLM407 9 p-PcU bi4-2::EcdsdA 672 38 24 RET063 13 p-AtAct::EcdsdA 268 29 1 RET019 14 p-AtAct::dao 1/ko 597 58 4 RLM254 11 p-STPT::EcdsdA 306 44 0 RET015 16 p-Nos::dao 1/ko 284 N/A 4 REW008 12 p-Nos::bar 426 5 0 RLM274 10 p-Nos::bar 228 0 0
＊基于GUS或dsdA Taqman分析的阳性枝条
对于RLM407(gateway背景)而言，RLM274是对照，而对于所有 其余构建体(pSUN3背景)而言，pREW008是对照。
看起来大豆需要高度组成型启动子，以用dsdA选择系统来选择转基 因植物。欧芹泛素启动子的使用导致产生了比通常用于双子叶植物的其它 启动子(例如拟南芥肌动蛋白或STP启动子)一致更高的转化效率。较之 这些启动子，欧芹泛素启动子的转化效率显著更高。已知，最优选择需要 选择标记在靶组织(其之后去分化，再生为转基因植物)的相关细胞中在 正确的时间以正确的浓度表达。
实施例10b：SELDA选择和启动子-dsda组合
在转化方案中测试了驱动dsda基因的启动子对转化效率的影响。用4 种启动子-dsda组合(处理)，RLM407，RLM431，RLM432，RLM433 来完成具6次重复随时间进行的实验(2位研究者来进行切割实验)，每 种处理最少50个外植体(表4a)。在2份重复中，包括RLM254，在一 份重复中，包括RLM434。制备外植体，将其随机分进6种处理之一(发 根农杆菌菌株SHA017/pSB1中携带的质粒)，进行30分钟。接种之后， 将外植体在固体共培养培养基(含有5μM激动素)上于黑暗中共培养5 天。按照上文所述，采用D-丝氨酸选择方案进行流程：无选择的枝条诱导 一周，在具有7.5mM D-丝氨酸的枝条诱导培养基上3周，然后在枝条延 长期间5mM D-丝氨酸。每个外植体仅一个枝条被移出，以消除克隆的再 生。使用定量PCR(TaqMan)针对dsda基因的存在对假定转化体加以验 证，使用下式计算转化效率(TE)：[(dsda阳性的、TaqMan验证的独立 事件的数量/接种的外植体的总数(n))＊100]。
从测试的所有启动子-dsda组合恢复转基因事件(表4b)。含有泛素 -dsda组合，RLM407和RLM434的构建体在该研究中给出了最高的转化 效率。
表4a.用于在6个构建体中驱动dsda基因的启动子
表4b.用不同启动子-dsda组合和D-丝氨酸选择接种的外植体的转化 效率。
实施例11：比较两种可选择标记：dsdA和bar
进行转化实验，以比较采用两种转化系统的转化效率，所述系统即 dsdA/D-丝氨酸、bar/膦丝菌素(表5)。二元载体LM407携带两种可选 择标记dsdA和bar，它们分别受到pPcUbi和pNos启动子下。载体LM274 具有受到pNos启动子控制下的bar基因，并且其已经成功地与膦丝菌素 选择组合与大豆腋生转化方法一起使用。
按照实施例1和3所述，从来自Dairyland栽培种93061的7天龄的 幼苗制备大豆腋生分生组织外植体。
按照实施例2所述，制备具有Super Vir pSB1质粒和含有表3所述的 二元质粒的发根农杆菌菌株SHA017。
按照实施例4所述来操作外植体。在没有选择的枝条诱导培养基 (SIM)上一周之后，将外植体转移至含有从7.5mM的D-丝氨酸或3mg/l 膦丝菌素的SIM中。在SIM中孵育3周后，所有再生外植体(枝条垫) 被转移至含有5mM D-丝氨酸或5mg/l膦丝菌素的枝条延长培养基(SEM) 中。延长中的枝条被转移至生根培养基(RM)，通过Taqman分析进行 筛选。
表5：比较评估两种构建体和两种选择系统
载体 标记描述 感染 的外 植体 选择 独立+ 延长的枝 条 GH中 的独立 事件 TE (％) pRLM407 (SEQ ID NO：9) p-PcUbi4-2::EcdsdA /pNos::bar 220 D-丝 氨酸 10 8 3.6 pRLM407 p-PcUbi4-2::EcdsdA /pNos::bar 170 PPT 5 2 1.2
当使用D-丝氨酸选择，使用相同的构建体pRLM407时，获得转化效 率两倍的增加。但是，值得注意，这代表小量的用于转化的外植体。
实施例11：SELDA选择和共培养激素
在第一项实验中，实验设计包括随着时间的10份重复(3位研究者来 进行切割实验)，其中每份重复采用4种不同的共培养培养基(处理)， 每种处理最少50个外植体。按照前文所述来制备固体共培养，除了用下述 四种激素之一来代替激素BAP：7.5μM BAP、1.0μM激动素、5.0μM激 动素或7.5μM激动素。
在第二项实验中，实验设计包括随着时间的3份重复(1位研究者来 进行切割实验)，其中每份重复采用5种不同的共培养培养基(处理)， 每种处理最少50个外植体。通过用下述五种激素之一来代替BAP：7.5μM BAP、1.0μM激动素、3μM激动素、5μM激动素或7μM激动素，来制 备固体共培养。
对于两项实验，制备外植体，用50ml液体共培养培养基(含有携带 载体RLM407的SHA017/pSB1)接种30分钟，然后将其分别随机放到4 或5种固体共培养培养基处理之一上。按照上文所述，采用D-丝氨酸选择 方案进行流程：无的枝条诱导一周，在具有7.5mM D-丝氨酸的枝条诱导 培养基上3周，然后在枝条延长期间5mM D-丝氨酸。每个外植体仅一个 枝条被移出，以消除克隆的再生。使用定量PCR(TaqMan)针对dsda 基因的存在对假定转化体加以验证，使用下式计算转化效率(TE)：[(dsda 阳性的、TaqMan验证的独立事件的数量/接种的外植体的总数(n))＊100]。
在两项实验中，从测试的所有处理恢复转基因事件(表6和7)。此 外，激动素在共培养培养基中的存在导致产生比在存在BAP时共培养外植 体的情况更高的平均转化效率。
表6：在含有4种不同激素方案的共培养培养基上共培养的外植体的 转化效率。
表7：在含有5种不同激素方案的共培养培养基上共培养的外植体的 转化效率。
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170.US 5,100,792
171.US 5,225,341
172.US 5,352,605
173.US 5,510,474
174.US 5,605,793
175.US 5,608,152；
176.US 5,683,439
177.US 5,811,238
178.US 5,830,721
179.US 5,837,458
180.US2001034888
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221.WO 00/49035
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序列表
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<120>对大豆的D-氨基酸选择
<130>AE 20051280/PF 57689
<160>17
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>1329
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1329)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]基因/CDS
<400>1
atg gaa aac gct aaa atg aac tcg ctc atc gcc cag tat ccg ttg gta 48
Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val
1 5 10 15
aag gat ctg gtt gct ctt aaa gaa acc acc tgg ttt aat cct ggc acg 96
Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr
20 25 30
acc tca ttg gct gaa ggt tta cct tat gtt ggc ctg acc gaa cag gat 144
Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp
35 40 45
gtt cag gac gcc cat gcg cgc tta tcc cgt ttt gca ccc tat ctg gca 192
Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala
50 55 60
aaa gca ttt cct gaa act gct gcc act ggg ggg att att gaa tca gaa 240
Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu
65 70 75 80
ctg gtt gcc att cca gct atg caa aaa cgg ctg gaa aaa gaa tat cag 288
Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln
85 90 95
caa ccg atc agc ggg caa ctg tta ctg aaa aaa gat agc cat ttg ccc 336
Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro
100 105 110
att tcc ggc tcc ata aaa gca cgc ggc ggg att tat gaa gtc ctg gca 384
Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala
115 120 125
cac gca gaa aaa ctg gct ctg gaa gcg ggg ttg ctg acg ctt gat gat 432
His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp
130 135 140
gac tac agc aaa ctg ctt tct ccg gag ttt aaa cag ttc ttt agc caa 480
Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln
145 150 155 160
tac agc att gct gtg ggc tca acc gga aat ctg ggg tta tca atc ggc 528
Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly
165 170 175
att atg agc gcc cgc att ggc ttt aag gtg aca gtt cat atg tct gct 576
Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala
180 185 190
gat gcc cgg gca tgg aaa aaa gcg aaa ctg cgc agc cat ggc gtt acg 624
Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr
195 200 205
gtc gtg gaa tat gag caa gat tat ggt gtt gcc gtc gag gaa gga cgt 672
Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg
210 215 220
aaa gca gcg cag tct gac ccg aac tgt ttc ttt att gat gac gaa aat 720
Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn
225 230 235 240
tcc cgc acg ttg ttc ctt ggg tat tcc gtc gct ggc cag cgt ctt aaa 768
Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys
245 250 255
gcg caa ttt gcc cag caa ggc cgt atc gtc gat gct gat aac cct ctg 816
Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu
260 265 270
ttt gtc tat ctg ccg tgt ggt gtt ggc ggt ggt cct ggt ggc gtc gca 864
Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala
275 280 285
ttc ggg ctt aaa ctg gcg ttt ggc gat cat gtt cac tgc ttt ttt gcc 912
Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala
290 295 300
gaa cca acg cac tcc cct tgt atg ttg tta ggc gtc cat aca gga tta 960
Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu
305 310 315 320
cac gat cag att tct gtt cag gat att ggt atc gac aac ctt acc gca 1008
His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala
325 330 335
gcg gat ggc ctt gca gtt ggt cgc gca tca ggc ttt gtc ggg cgg gca 1056
Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala
340 345 350
atg gag cgt ctg ctg gat ggc ttc tat acc ctt agc gat caa acc atg 1104
Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met
355 360 365
tat gac atg ctt ggc tgg ctg gcg cag gaa gaa ggt att cgt ctt gaa 1152
Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu
370 375 380
cct tcg gca ctg gcg ggt atg gcc gga cct cag cgc gtg tgt gca tca 1200
Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser
385 390 395 400
gta agt tac caa cag atg cac ggt ttc agc gca gaa caa ctg cgt aat 1248
Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn
405 410 415
acc act cat ctg gtg tgg gcg acg gga ggt gga atg gtg ccg gaa gaa 1296
Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu
420 425 430
gag atg aat caa tat ctg gca aaa ggc cgt taa 1329
Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Arg
435 440
<210>2
<211>442
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val
1 5 10 15
Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr
20 25 30
Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp
35 40 45
Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala
50 55 60
Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu
65 70 75 80
Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln
85 90 95
Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro
100 105 110
Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala
115 120 125
His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp
130 135 140
Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly
165 170 175
Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala
180 185 190
Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr
195 200 205
Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg
210 215 220
Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn
225 230 235 240
Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys
245 250 255
Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu
260 265 270
Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala
275 280 285
Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala
290 295 300
Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu
305 310 315 320
His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala
325 330 335
Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala
340 345 350
Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met
355 360 365
Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu
370 375 380
Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser
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Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn
405 410 415
Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu
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<211>1107
<212>DNA
<213>红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1107)
<223>红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶CDS
<400>3
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Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly
1 5 10 15
ctg agc agc gcc ctc atc ctc gct cgg aag ggc tac agc gtg cat att 96
Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
20 25 30
ctc gcg cgc gac ttg ccg gag gac gtc tcg agc cag act ttc gct tca 144
Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
35 40 45
cca tgg gct ggc gcg aat tgg acg cct ttc atg acg ctt aca gac ggt 192
Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly
50 55 60
cct cga caa gca aaa tgg gaa gaa tcg act ttc aag aag tgg gtc gag 240
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
65 70 75 80
ttg gtc ccg acg ggc cat gcc atg tgg ctc aag ggg acg agg cgg ttc 288
Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
85 90 95
gcg cag aac gaa gac ggc ttg ctc ggg cac tgg tac aag gac atc acg 336
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100 105 110
cca aat tac cgc ccc ctc cca tct tcc gaa tgt cca cct ggc gct atc 384
Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
115 120 125
ggc gta acc tac gac acc ctc tcc gtc cac gca cca aag tac tgc cag 432
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln
130 135 140
tac ctt gca aga gag ctg cag aag ctc ggc gcg acg ttt gag aga cgg 480
Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg
145 150 155 160
acc gtt acg tcg ctt gag cag gcg ttc gac ggt gcg gat ttg gtg gtc 528
Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val
165 170 175
aac gct acg gga ctt ggc gcc aag tcg att gcg ggc atc gac gac caa 576
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln
180 185 190
gcc gcc gag cca atc cgc ggg caa acc gtc ctc gtc aag tcc cca tgc 624
Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys
195 200 205
aag cga tgc acg atg gac tcg tcc gac ccc gct tct ccc gcc tac atc 672
Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile
210 215 220
att ccc cga cca ggt ggc gaa gtc atc tgc ggc ggg acg tac ggc gtg 720
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
225 230 235 240
gga gac tgg gac ttg tct gtc aac cca gag acg gtc cag cgg atc ctc 768
Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
245 250 255
aag cac tgc ttg cgc ctc gac ccg acc atc tcg agc gac gga acg atc 816
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
260 265 270
gaa ggc atc gag gtc ctc cgc cac aac gtc ggc ttg cga cct gca cga 864
Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
275 280 285
cga ggc gga ccc cgc gtt gag gca gaa cgg atc gtc ctg cct ctc gac 912
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp
290 295 300
cgg aca aag tcg ccc ctc tcg ctc ggc agg ggc agc gca cga gcg gcg 960
Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala
305 310 315 320
aag gag aag gag gtc acg ctt gtg cat gcg tat ggc ttc tcg agt gcg 1008
Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala
325 330 335
gga tac cag cag agt tgg ggc gcg gcg gag gat gtc gcg cag ctc gtc 1056
Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val
340 345 350
gac gag gcg ttc cag cgg tac cac ggc gcg gcg cgg gag tcg aag ttg 1104
Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu
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<213>红冬孢酵母
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Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
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Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
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Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly
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Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
65 70 75 80
Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
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Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr
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Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
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Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln
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Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln
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Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
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Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
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Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
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Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
275 280 285
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<212>DNA
<213>红冬孢酵母
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1104)
<223>红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶[dao1]cds，
[Genbank#U60066].最优密码子
<400>5
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ctt tct tct gct ctt ata ctt gca cgc aag ggc tat tct gtt cat att 96
Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
20 25 30
ttg gca cgc gat ctc cca gag gac gta tct agc caa act ttc gct tcc 144
Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
35 40 45
ccc tgg gct ggt gcg aat tgg aca cca ttt atg aca ttg act gac ggc 192
Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly
50 55 60
cct aga cag gca aaa tgg gaa gag agt acc ttt aaa aaa tgg gtt gag 240
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
65 70 75 80
ttg gtc cct acc gga cat gct atg tgg ctg aag gga act cgt cgc ttt 288
Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
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Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr
100 105 110
ccg aat tac cgc ccc ctt ccc tcg tct gaa tgt cca cca ggc gca att 384
Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
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ggc gtg act tat gac aca ctc tct gta cac gct cct aaa tat tgt cag 432
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln
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Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg
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aat gca aca gga ctg gga gca aag agc ata gca ggc ata gat gat caa 576
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln
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Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys
195 200 205
aaa aga tgt acg atg gat agt agt gac cca gcg agt cca gct tat att 672
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ata ccg aga ccg ggt ggc gaa gtt ata tgc gga gga act tac gga gtg 720
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
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Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
245 250 255
aag cat tgc ctc cgc ctt gac cca acc ata tca tct gac gga acc att 816
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
260 265 270
gag gga atc gaa gta ctt agg cat aat gtt ggt ctt agg ccc gct cgt 864
Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
275 280 285
aga gga gga cca cgt gta gaa gct gag aga att gta ttg ccc ctc gat 912
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp
290 295 300
aga acc aaa agc ccc ctt tcg ctt gga aga gga agc gca cgt gca gct 960
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aag gaa aaa gaa gtc aca ctg gta cat gca tat ggt ttt agt agt gcc 1008
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Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val
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gac gag gca ttc caa aga tac cac ggt gca gcg aga gag tca aaa ctt 1104
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<211>368
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<213>红冬孢酵母
<400>6
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Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
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Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
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Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
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Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
85 90 95
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100 105 110
Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
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Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys
195 200 205
Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile
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Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
225 230 235 240
Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
245 250 255
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
260 265 270
Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
275 280 285
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290 295 300
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Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val
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<210>7
<211>996
<212>DNA
<213>欧芹(Petroselinum crispum)
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(996)
<223>具有内部内含子的MTX欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白的#PCCUBI42欧芹(P.crispum)基因
Pcubi4-2有99％同源。
<220>
<221>内含子
<222>(406)..(993)
<223>MTX欧芹UBI4-2启动子的内部内含子；与多聚遍在蛋白的#PCCUBI42欧芹(P.crispum)基因
Pcubi4-2有99％同源。
<400>7
cttgactaga gaattcgaat ccaaaaatta cggatatgaa tataggcata tccgtatccg 60
aattatccgt ttgacagcta gcaacgattg tacaattgct tctttaaaaa aggaagaaag 120
aaagaaagaa aagaatcaac atcagcgtta acaaacggcc ccgttacggc ccaaacggtc 180
atatagagta acggcgttaa gcgttgaaag actcctatcg aaatacgtaa ccgcaaacgt 240
gtcatagtca gatcccctct tccttcaccg cctcaaacac aaaaataatc ttctacagcc 300
tatatataca accccccctt ctatctctcc tttctcacaa ttcatcatct ttctttctct 360
acccccaatt ttaagaaatc ctctcttctc ctcttcattt tcaaggtaaa tctctctctc 420
tctctctctc tctgttattc cttgttttaa ttaggtatgt attattgcta gtttgttaat 480
ctgcttatct tatgtatgcc ttatgtgaat atctttatct tgttcatctc atccgtttag 540
aagctataaa tttgttgatt tgactgtgta tctacacgtg gttatgttta tatctaatca 600
gatatgaatt tcttcatatt gttgcgtttg tgtgtaccaa tccgaaatcg ttgatttttt 660
tcatttaatc gtgtagctaa ttgtacgtat acatatggat ctacgtatca attgttcatc 720
tgtttgtgtt tgtatgtata cagatctgaa aacatcactt ctctcatctg attgtgttgt 780
tacatacata gatatagatc tgttatatca ttttttttat taattgtgta tatatatatg 840
tgcatagatc tggattacat gattgtgatt atttacatga ttttgttatt tacgtatgta 900
tatatgtaga tctggacttt ttggagttgt tgacttgatt gtatttgtgt gtgtatatgt 960
gtgttctgat cttgatatgt tatgtatgtg cagccc 996
<210>8
<211>2031
<212>DNA
<213>大豆(Glycine max)
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(999)
<223>大豆遍在蛋白基因的假定启动子区域TATA框：950-964
<220>
<221>TATA_signal
<222>(950)..(964)
<223>假定TATA框
<220>
<221>内含子
<222>(1519)..(2031)
<223>位于5’UTR内的第一内含子
<400>8
aaatgaaaga aaaaggtatt cacgctctta aaataaatta gtaagcagaa attccaaaat 60
tttcagttag tccttactaa ttattaaatt atagtattaa tccaatgtga ttgcggttac 120
atcatgtacg gaaaaataat tctaatcctt gatttaaatt tgatcttgac tatttattta 180
ttctttattt cattttgtaa atcattttat gtatctcctg gcaagcaatt ttatccacct 240
tgcaccaaca ccttcgggtt ccataatcaa accaccttaa cttcacacca tgctgtaact 300
cacaccgccc agcatctcca atgtgaaaga agctaaaatt taataaacaa tcatacgaag 360
cagtgacaaa ataccagatg gtattaatgc tttgataaaa ttaattggaa agtataaaat 420
ggtagaaaat aataaattat aattaattta aataagataa aaaataatta aaaactaaaa 480
tgttaaaatt ttaaaaaaat tattttaaat aatatttaaa aacattaaaa atcattttaa 540
aaaatttatt tatagaacaa ttaaataaat atttcagcta ataaaaaaca aaagcttacc 600
tagccttaga agacaacttg tccaacaatt agatgatacc cattgccctt acgttttctt 660
taacatcaat tattgttttt gtcaacaagc tatcttttag ttttatttta ttggtaaaaa 720
atatgtcgcc ttcaagttgc atcatttaac acatctcgtc attagaaaaa taaaactctt 780
ccctaaacga ttagtagaaa aaatcattcg ataataaata agaaagaaaa attagaaaaa 840
aataacttca ttttaaaaaa atcattaagg ctatattttt taaatgacta attttatata 900
gactgtaact aaaagtatac aatttattat gctatgtatc ttagagaatt acttataaaa 960
atctacggaa gaatatctta caaagtgaaa aacaaatgag aaagaattta gtgggatgat 1020
tatgatttta tttgaaaatt gaaaaaataa ttattaaaga ctttagtgga gtaagaaagc 1080
tttcctatta gtcttttctt atccataaaa aaaaaaaaaa aaatctagcg tgacagcttt 1140
tccatagatt ttaataatgt aaaatactgg tagcagccga ccgttcaggt aatggacact 1200
gtggtcctaa cttgcaacgg gtgcgggccc aatttaataa cgccgtggta acagataaag 1260
ccaagcgtga agcggtgaag gtacatctct gactccgtca agattacgaa accgtcaact 1320
acgaaggact ccccgaaata tcatctgtgt cataaacacc aagtcacacc atacatgggc 1380
acgcgtcaca atatgattgg agaacggttc caccgcatat gctataaaat gcccccacac 1440
ccctcgaccc taatcgcact tcaattgcaa tcaaattagt tcattctctt tgcgcagttc 1500
cctacctctc ctttcaaggt tcgtagattt cttctgtttt tttttcttct tctttattgt 1560
ttgttctaca tcagcatgat gttgatttga ttgtgttttc tatcgtttca tcgattataa 1620
attttcataa tcagaagatt cagcttttat taatgcaaga acgtccttaa ttgatgattt 1680
tataaccgta aattaggtct aattagagtt tttttcataa agattttcag atccgtttac 1740
agcaagcctt aattgttgat tctgtagtcg tagattaagg tttttttcat gaactacttc 1800
agatccgtta aacaacagcc ttatttgttg atacttcagt cgtttttcaa gaaattgttc 1860
agatccgttg ataaaagcct tattcgttga ttctgtatgg tatttcaaga gatattgctc 1920
aggtccttta gcaactacct tatttgttga ttctgtggcc atagattagg attttttttc 1980
acgaaattgc ttcttgaaat tacgtgatgg attttgattc tgatttatct t 2031
<210>9
<211>10096
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>Bar-Selda二元载体RLM407：LB＞＜p-NOS::c-BAR::t-NOS
p-PcUBI4-2::c-dsdA/na::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1Ti质粒(来自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界
(完全)。
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316pCambia2301bin载体类似
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(527)..(1078)
<223>BAR基因CDS的互补序列；与膦丝菌素乙酰转移酶的#SHBARPA吸水链霉菌(Streptomyces
hygroscopicus)bar基因100％同源。
<220>
<221>启动子
<222>(1092)..(1379)
<223>来自胭脂碱合酶基因的启动子的互补序列(Depicker等人1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)
EMBL no：V00087.
<220>
<221>启动子
<222>(1746)..(2741)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(2826)..(4154)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶[dsdA]基因/CDS；来自QC78-6/SUH405.
[GenBank J01603]
<220>
<221>终止子
<222>(4230)..(4482)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4564)..(4710)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4647)..(4670)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4875)..(5669)
<223>nptII基因/CDS；赋予卡那霉素抗性；与#AY181092合成构建体S1启动子-nptII基因-S3终止子
盒99％同源。
<220>
<221>复制起点
<222>(5967)..(6648)
<223>ColEI复制起点
<220>
<221>复制起点
<222>(7057)..(9651)
<223>pVS1复制起点
<400>9
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggtcaa atctcggtga 540
cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt 600
catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga 660
gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct 720
tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg 780
tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc 840
gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga 900
gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg 960
gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg 1020
ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggctcatgg 1080
cgcgccagat ctggattgag agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta 1140
tggaacgtca gtggagcatt tttgacaaga aatatttgct agctgatagt gaccttaggc 1200
gacttttgaa cgcgcaataa tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa 1260
acccgcggct gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc 1320
ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatct 1380
tgatcccctg cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg 1440
cttcccaacc ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa 1500
aaccgcccag tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc 1560
gcttgcgttt tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg 1620
tttctgcgga ctggctttct acgtgttccg cttcctttag cagcccttgc gccctgagtg 1680
cttgcggcag cgtgaagctt gctatcaact ttgtatcgaa aagttggctc cgaattcgcc 1740
cttagcttga ctagagaatt cgaatccaaa aattacggat atgaatatag gcatatccgt 1800
atccgaatta tccgtttgac agctagcaac gattgtacaa ttgcttcttt aaaaaaggaa 1860
gaaagaaaga aagaaaagaa tcaacatcag cgttaacaaa cggccccgtt acggcccaaa 1920
cggtcatata gagtaacggc gttaagcgtt gaaagactcc tatcgaaata cgtaaccgca 1980
aacgtgtcat agtcagatcc cctcttcctt caccgcctca aacacaaaaa taatcttcta 2040
cagcctatat atacaacccc cccttctatc tctcctttct cacaattcat catctttctt 2100
tctctacccc caattttaag aaatcctctc ttctcctctt cattttcaag gtaaatctct 2160
ctctctctct ctctctctgt tattccttgt tttaattagg tatgtattat tgctagtttg 2220
ttaatctgct tatcttatgt atgccttatg tgaatatctt tatcttgttc atctcatccg 2280
tttagaagct ataaatttgt tgatttgact gtgtatctac acgtggttat gtttatatct 2340
aatcagatat gaatttcttc atattgttgc gtttgtgtgt accaatccga aatcgttgat 2400
ttttttcatt taatcgtgta gctaattgta cgtatacata tggatctacg tatcaattgt 2460
tcatctgttt gtgtttgtat gtatacagat ctgaaaacat cacttctctc atctgattgt 2520
gttgttacat acatagatat agatctgtta tatcattttt tttattaatt gtgtatatat 2580
atatgtgcat agatctggat tacatgattg tgattattta catgattttg ttatttacgt 2640
atgtatatat gtagatctgg actttttgga gttgttgact tgattgtatt tgtgtgtgta 2700
tatgtgtgtt ctgatcttga tatgttatgt atgtgcagcc cggatcaagg gcgaattcga 2760
cccaagtttg tacaaaaaag caggctggcg cgccggatcc tcatctaagc gcaaagagac 2820
gtactatgga aaacgctaaa atgaactcgc tcatcgccca gtatccgttg gtaaaggatc 2880
tggttgctct taaagaaacc acctggttta atcctggcac gacctcattg gctgaaggtt 2940
taccttatgt tggcctgacc gaacaggatg ttcaggacgc ccatgcgcgc ttatcccgtt 3000
ttgcacccta tctggcaaaa gcatttcctg aaactgctgc cactgggggg attattgaat 3060
cagaactggt tgccattcca gctatgcaaa aacggctgga aaaagaatat cagcaaccga 3120
tcagcgggca actgttactg aaaaaagata gccatttgcc catttccggc tccataaaag 3180
cacgcggcgg gatttatgaa gtcctggcac acgcagaaaa actggctctg gaagcggggt 3240
tgctgacgct tgatgatgac tacagcaaac tgctttctcc ggagtttaaa cagttcttta 3300
gccaatacag cattgctgtg ggctcaaccg gaaatctggg gttatcaatc ggcattatga 3360
gcgcccgcat tggctttaag gtgacagttc atatgtctgc tgatgcccgg gcatggaaaa 3420
aagcgaaact gcgcagccat ggcgttacgg tcgtggaata tgagcaagat tatggtgttg 3480
ccgtcgagga aggacgtaaa gcagcgcagt ctgacccgaa ctgtttcttt attgatgacg 3540
aaaattcccg cacgttgttc cttgggtatt ccgtcgctgg ccagcgtctt aaagcgcaat 3600
ttgcccagca aggccgtatc gtcgatgctg ataaccctct gtttgtctat ctgccgtgtg 3660
gtgttggcgg tggtcctggt ggcgtcgcat tcgggcttaa actggcgttt ggcgatcatg 3720
ttcactgctt ttttgccgaa ccaacgcact ccccttgtat gttgttaggc gtccatacag 3780
gattacacga tcagatttct gttcaggata ttggtatcga caaccttacc gcagcggatg 3840
gccttgcagt tggtcgcgca tcaggctttg tcgggcgggc aatggagcgt ctgctggatg 3900
gcttctatac ccttagcgat caaaccatgt atgacatgct tggctggctg gcgcaggaag 3960
aaggtattcg tcttgaacct tcggcactgg cgggtatggc cggacctcag cgcgtgtgtg 4020
catcagtaag ttaccaacag atgcacggtt tcagcgcaga acaactgcgt aataccactc 4080
atctggtgtg ggcgacggga ggtggaatgg tgccggaaga agagatgaat caatatctgg 4140
caaaaggccg ttaataacgt ttcaacgcag catggatcgt accgagctcc tgcagggggg 4200
acccagcttt cttgtacaaa gtggagctcg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct 4260
taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 4320
ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 4380
ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 4440
aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcggccggcc aactttatta 4500
tacatagttg ataagcgatc gcagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctactag 4560
atctgattgt cgtttcccgc cttcagttta aactatcagt gtttgacagg atatattggc 4620
gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt agaataatcg gatatttaaa agggcgtgaa 4680
aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtc catgtgtttt atggacagca agcgaaccgg 4740
aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg 4800
ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag atctgatcaa gagacaggat 4860
gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg 4920
tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg 4980
tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg 5040
ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc 5100
cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 5160
aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatccc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 5220
tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 5280
aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg 5340
atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg 5400
cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 5460
tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 5520
accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 5580
gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 5640
tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttgaaaaagg aagaatgcat gaccaaaatc 5700
ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5760
tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5820
ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5880
ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5940
ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 6000
gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 6060
aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 6120
acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 6180
gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 6240
gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 6300
cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 6360
aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 6420
gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 6480
cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg 6540
atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc 6600
agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg 6660
actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 6720
gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 6780
agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcaggg tgccttgatg tgggcgccgg 6840
cggtcgagtg gcgacggcgc ggcttgtccg cgccctggta gattgcctgg ccgtaggcca 6900
gccatttttg agcggccagc ggccgcgata ggccgacgcg aagcggcggg gcgtagggag 6960
cgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgc agctcttcgg ctgtgcgctg gccagacagt 7020
tatgcacagg ccaggcgggt tttaagagtt ttaataagtt ttaaagagtt ttaggcggaa 7080
aaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtc acttacatgt gtgaccggtt cccaatgtac 7140
ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt acggctttgg gttcccaatg 7200
tacgtgctat ccacaggaaa gagacctttt cgaccttttt cccctgctag ggcaatttgc 7260
cctagcatct gctccgtaca ttaggaaccg gcggatgctt cgccctcgat caggttgcgg 7320
tagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgc cccgcctcct ccttcaaatc gtactccggc 7380
aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga acttcttgaa ctctccggcg 7440
ctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaac aaccatctgg cttctgcctt gcctgcggcg 7500
cggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccg atgccgggat cgatcaaaaa gtaatcgggg 7560
tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct cgcggtacat ccaatcagct 7620
agctcgatct cgatgtactc cggccgcccg gtttcgctct ttacgatctt gtagcggcta 7680
atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt tcttggcctt cttcgtacgc 7740
tgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccga atgcaggttt ctaccaggtc gtctttctgc 7800
tttccgccat cggctcgccg gcagaacttg agtacgtccg caacgtgtgg acggaacacg 7860
cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca tggattcggt tagatgggaa 7920
accgccatca gtaccaggtc gtaatcccac acactggcca tgccggccgg ccctgcggaa 7980
acctctacgt gcccgtctgg aagctcgtag cggatcacct cgccagctcg tcggtcacgc 8040
ttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatg atgctgcgac tatcgcgggt gcccacgtca 8100
tagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgc tcgtcgccct tgggcggctt cctaatcgac 8160
ggcgcaccgg ctgccggcgg ttgccgggat tctttgcgga ttcgatcagc ggccgcttgc 8220
cacgattcac cggggcgtgc ttctgcctcg atgcgttgcc gctgggcggc ctgcgcggcc 8280
ttcaacttct ccaccaggtc atcacccagc gccgcgccga tttgtaccgg gccggatggt 8340
ttgcgaccgc tcacgccgat tcctcgggct tgggggttcc agtgccattg cagggccggc 8400
agacaaccca gccgcttacg cctggccaac cgcccgttcc tccacacatg gggcattcca 8460
cggcgtcggt gcctggttgt tcttgatttt ccatgccgcc tcctttagcc gctaaaattc 8520
atctactcat ttattcattt gctcatttac tctggtagct gcgcgatgta ttcagatagc 8580
agctcggtaa tggtcttgcc ttggcgtacc gcgtacatct tcagcttggt gtgatcctcc 8640
gccggcaact gaaagttgac ccgcttcatg gctggcgtgt ctgccaggct ggccaacgtt 8700
gcagccttgc tgctgcgtgc gctcggacgg ccggcactta gcgtgtttgt gcttttgctc 8760
attttctctt tacctcatta actcaaatga gttttgattt aatttcagcg gccagcgcct 8820
ggacctcgcg ggcagcgtcg ccctcgggtt ctgattcaag aacggttgtg ccggcggcgg 8880
cagtgcctgg gtagctcacg cgctgcgtga tacgggactc aagaatgggc agctcgtacc 8940
cggccagcgc ctcggcaacc tcaccgccga tgcgcgtgcc tttgatcgcc cgcgacacga 9000
caaaggccgc ttgtagcctt ccatccgtga cctcaatgcg ctgcttaacc agctccacca 9060
ggtcggcggt ggcccatatg tcgtaagggc ttggctgcac cggaatcagc acgaagtcgg 9120
ctgccttgat cgcggacaca gccaagtccg ccgcctgggg cgctccgtcg atcactacga 9180
agtcgcgccg gccgatggcc ttcacgtcgc ggtcaatcgt cgggcggtcg atgccgacaa 9240
cggttagcgg ttgatcttcc cgcacggccg cccaatcgcg ggcactgccc tggggatcgg 9300
aatcgactaa cagaacatcg gccccggcga gttgcagggc gcgggctaga tgggttgcga 9360
tggtcgtctt gcctgacccg cctttctggt taagtacagc gataaccttc atgcgttccc 9420
cttgcgtatt tgtttattta ctcatcgcat catatacgca gcgaccgcat gacgcaagct 9480
gttttactca aatacacatc acctttttag acggcggcgc tcggtttctt cagcggccaa 9540
gctggccggc caggccgcca gcttggcatc agacaaaccg gccaggattt catgcagccg 9600
cacggttgag acgtgcgcgg gcggctcgaa cacgtacccg gccgcgatca tctccgcctc 9660
gatctcttcg gtaatgaaaa acggttcgtc ctggccgtcc tggtgcggtt tcatgcttgt 9720
tcctcttggc gttcattctc ggcggccgcc agggcgtcgg cctcggtcaa tgcgtcctca 9780
cggaaggcac cgcgccgcct ggcctcggtg ggcgtcactt cctcgctgcg ctcaagtgcg 9840
cggtacaggg tcgagcgatg cacgccaagc agtgcagccg cctctttcac ggtgcggcct 9900
tcctggtcga tcagctcgcg ggcgtgcgcg atctgtgccg gggtgagggt agggcggggg 9960
ccaaacttca cgcctcgggc cttggcggcc tcgcgcccgc tccgggtgcg gtcgatgatt 10020
agggaacgct cgaactcggc aatgccggcg aacacggtca acaccatgcg gccggccggc 10080
gtggtggtaa cgcgtg 10096
<210>10
<211>6600
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RLM274的T-DNA，RLM407-型Bar-GUS二元载体：LB＞
＜p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316 pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(527)..(1078)
<223>BAR基因/CDS的互补序列；与膦丝菌素乙酰转移酶的#SHBARPA吸水链霉菌bar基因99％同源；来
自QC25-3/EW105。
<220>
<221>启动子
<222>(1092)..(1379)
<223>来自胭脂碱合酶基因的启动子的互补序列(Depicker等人1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)
EMBL no：V00087.
<220>
<221>启动子
<222>(1822)..(2817)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(2843)..(4843)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(4914)..(5166)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(5252)..(5397)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(5292)..(5315)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>10
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggaatc ccgccctaca 540
acttcgactc ccgcgccgcg ccgtggtacc gctggaacgc ctcgtcgacg agctgcgcga 600
catcctccgc cgcgccccaa ctctgctggt atcccgcact cgagaagcca tacgcatgca 660
caagcgtgac ctccttctcc ttcgccgctc gtgcgctgcc cctgccgagc gagaggggcg 720
actttgtccg gtcgagaggc aggacgatcc gttctgcctc aacgcggggt ccgcctcgtc 780
gtgcaggtcg caagccgacg ttgtggcgga ggacctcgat gccttcgatc gttccgtcgc 840
tcgagatggt cgggtcgagg cgcaagcagt gcttgaggat ccgctggacc gtctctgggt 900
tgacagacaa gtcccagtct cccacgccgt acgtcccgcc gcagatgact tcgccacctg 960
gtcggggaat gatgtaggcg ggagaagcgg ggtcggacga gtccatcgtg catcgcttgc 1020
atggggactt gacgaggacg gtttgcccgc ggattggctc ggcggcttgg tcgtcgatgc 1080
ccgcaatcga cttggcgcca agtcccgtag cgttgaccac caaatccgca ccgtcgaacg 1140
cctgctcaag cgacgtaacg gtccgtctct caaacgtcgc gccgagcttc tgcagctctc 1200
ttgcaaggta ctggcagtac tttggtgcgt ggacggagag ggtgtcgtag gttacgccga 1260
tagcgccagg tggacattcg gaagatggga gggggcggta atttggcgtg atgtccttgt 1320
accagtgccc gagcaagccg tcttcgttct gcgcgaaccg cctcgtcccc ttgagccaca 1380
tggcatggcc cgtcgggacc aactcgaccc acttcttgaa agtcgattct tcccattttg 1440
cttgtcgagg accgtctgta agcgtcatga aaggcgtcca attcgcgcca gcccatggtg 1500
aagcgaaagt ctggctcgag acgtcctccg gcaagtcgcg cgcgagaata tgcacgctgt 1560
agcccttccg agcgaggatg agggcgctgc tcagaccgat aacgcctgat ccgaggacaa 1620
cgacgcgctt ctgcgagtgc atggtggccc gggatccggc gcgccttttt tttatgagct 1680
gcaaacacac aaaaagagtt caatacagtc aaataaaccc tgattgaatc agaaatagct 1740
ttctgttcaa cgtacgacac tacaaatcct aaagtttcga agaatctata cacaaacttc 1800
atctaacctt aaacagtgtt cagattcaat ctaacattga cagtgttcag attcaatcta 1860
acttcaacag ttcagatttc aattcacata tacaaatcat ttcccaggta acatgaacat 1920
ggatctctcc atcaaggtca agccaaattc tggtagctat aatcgagcta actgatcggt 1980
caacttagat cgattctagt aaaaccaaaa gatttagtgg aggttcacag atccaaatta 2040
aacgaattcc agatctcaag gaaattgaga aaacaagatc gagatccagc aaataaagta 2100
gatccagaaa gttcctatta ccttggaaag aaagagcgga agaagatgag attgaggaag 2160
attcaaaacg gagaatgaat ctcctggatt atctcttact ttctctctta gtcttcttcc 2220
ttgttcttct ctgtcaagtc gccggagatt caaaacggct gatgaaagtg aggaggacaa 2280
cgagacaatt caaagcggag aggaaaatat atgaatttat ataggcgggt ttatctctta 2340
caactttatt ttcggccttt caaaaaaata attaaaatcg acagacacga atcatttcga 2400
ccacaggtaa agataacgtg acctggctgt cagacagcct tttccctcgt gttaactaat 2460
ttttaaacta attaatcatc tcagcccttg gattagttct tttgctttga tggcttcatg 2520
actgtgacct gctcgatccg cgtgttacat gacagctccg tttttttagt ggttaactta 2580
aaccgagtca atccaggcaa cgttagtcgt cgtcgtggtt ggcttgttca attagatttc 2640
atacaattca acgtaattta attcgttttc tattagaatt gtatcataat taattcagac 2700
cgtgaaagaa agtgtctttc atgatgtgtt tatggatatt tatacaataa gatacaatgt 2760
ttcatcatat tcactattca cgattagtat gtacattaaa taatggctac tactacatcc 2820
gaactcgtca aaacgattct gaatcaatta tacatatgct gactcttgca tacataaaaa 2880
atagttgttt aaattttgtc taactaatgt ttggtataag tataatgttg agttgagata 2940
ccaattacat cgagtctagc cattttgtcg tgccatattc gtcaaaactt tcttacataa 3000
tgataaccta gatctagatg agatatgtat caatgtattt gagatcataa ttaagttcgt 3060
tctaaatttt gtcgaaacca acgcaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg 3120
atatgaatat aggcatatcc gtatccgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac 3180
aattgcttct ttaaaaaagg aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca 3240
aacggccccg ttacggccca aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact 3300
cctatcgaaa tacgtaaccg caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcaccgcct 3360
caaacacaaa aataatcttc tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt 3420
ctcacaattc atcatctttc tttctctacc cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc 3480
ttcattttca aggtaaatct ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta 3540
ggtatgtatt attgctagtt tgttaatctg cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc 3600
tttatcttgt tcatctcatc cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct 3660
acacgtggtt atgtttatat ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt 3720
gtaccaatcc gaaatcgttg atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca 3780
tatggatcta cgtatcaatt gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac 3840
atcacttctc tcatctgatt gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt 3900
tttttattaa ttgtgtatat atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt 3960
tacatgattt tgttatttac gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga 4020
cttgattgta tttgtgtgtg tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag 4080
cccggatctc cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga 4140
aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg 4200
tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt 4260
taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg 4320
cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt 4380
cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta 4440
tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt 4500
tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta atataatatt 4560
tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagttta 4620
taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc 4680
aggtatcacc gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt 4740
gattaccgac gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc 4800
cggaatccat cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac 4860
cgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc 4920
caatggtgat gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca 4980
aggcactagc gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta 5040
tctctatgaa ctgtgcgtca cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg 5100
cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt 5160
ctactttact ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa 5220
cgtgctgatg gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac 5280
ctcgcattac ccttacgctg aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt 5340
gattgatgaa actgctgctg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg 5400
caacaagccg aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca 5460
cttacaggcg attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg 5520
gagtattgcc aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact 5580
ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt 5640
ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta 5700
ttacggatgg tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga 5760
acttctggcc tggcaggaga aactgcatca gccgattatc atcaccgaat acggcgtgga 5820
tacgttagcc gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc 5880
atggctggat atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg gtgaacaggt 5940
atggaatttc gccgattttg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gtaacaagaa 6000
agggatcttc actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaacgctg 6060
gactggcatg aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa tcaacaactc 6120
tcctggcgca ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg 6180
atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 6240
tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca 6300
tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 6360
cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta 6420
tgttactaga tcgggaattg gcgatcgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 6480
tactagatct gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat 6540
attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg 6600
<210>11
<211>6820
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RLM254的T-DNA，RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞
＜p-sTPT::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(561)..(1329)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶CDS的互补序列；GenBank Acc.-No.：J01603.
<220>
<221>启动子
<222>(1913)..(3230)
<223>短丙糖磷酸易位体[sTPT]启动子的互补序列。
<220>
<221>启动子
<222>(3273)..(4268)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4294)..(6294)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(6365)..(6617)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(6676)..(6820)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(6758)..(6781)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>11
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggagct cggtacgatc 540
catgctgcgt tgaaacgtta ttaacggcct tttgccagat attgattcat ctcttcttcc 600
ggcaccattc cacctcccgt cgcccacacc agatgagtgg tattacgcag ttgttctgcg 660
ctgaaaccgt gcatctgttg gtaacttact gatgcacaca cgcgctgagg tccggccata 720
cccgccagtg ccgaaggttc aagacgaata ccttcttcct gcgccagcca gccaagcatg 780
tcatacatgg tttgatcgct aagggtatag aagccatcca gcagacgctc cattgcccgc 840
ccgacaaagc ctgatgcgcg accaactgca aggccatccg ctgcggtaag gttgtcgata 900
ccaatatcct gaacagaaat ctgatcgtgt aatcctgtat ggacgcctaa caacatacaa 960
ggggagtgcg ttggttcggc aaaaaagcag tgaacatgat cgccaaacgc cagtttaagc 1020
ccgaatgcga cgccaccagg accaccgcca acaccacacg gcagatagac aaacagaggg 1080
ttatcagcat cgacgatacg gccttgctgg gcaaattgcg ctttaagacg ctggccagcg 1140
acggaatacc caaggaacaa cgtgcgggaa ttttcgtcat caataaagaa acagttcggg 1200
tcagactgcg ctgctttacg tccttcctcg acggcaacac cataatcttg ctcatattcc 1260
acgaccgtaa cgccatggct gcgcagtttc gcttttttcc atgcccgggc atcagcagac 1320
atatgaactg tcaccttaaa gccaatgcgg gcgctcataa tgccgattga taaccccaga 1380
tttccggttg agcccacagc aatgctgtat tggctaaaga actgtttaaa ctccggagaa 1440
agcagtttgc tgtagtcatc atcaagcgtc agcaaccccg cttccagagc cagtttttct 1500
gcgtgtgcca ggacttcata aatcccgccg cgtgctttta tggagccgga aatgggcaaa 1560
tggctatctt ttttcagtaa cagttgcccg ctgatcggtt gctgatattc tttttccagc 1620
cgtttttgca tagctggaat ggcaaccagt tctgattcaa taatcccccc agtggcagca 1680
gtttcaggaa atgcttttgc cagatagggt gcaaaacggg ataagcgcgc atgggcgtcc 1740
tgaacatcct gttcggtcag gccaacataa ggtaaacctt cagccaatga ggtcgtgcca 1800
ggattaaacc aggtggtttc tttaagagca accagatcct ttaccaacgg atactgggcg 1860
atgagcgagt tcattttagc gttttccatg gtacccagac gtcgactcta gatgaaatcg 1920
aaattcagag ttttgatagt gagagcaaag agggacggac ttatgaggat ttcgagtatt 1980
tcaagagatg gtacttgttg atcggacggc tacgatgatc tcgatttggt taatccagta 2040
tctcgcggtg tatggagtta tggtagggtt aatggtcaat ttcatctaac ggtagagaat 2100
gatgtaatta gataagaatc ttgagatact ggtttagatt ggatgagtgt agggtccatc 2160
ttatcttgat aagtggatgg tttttagaga cacagtgaat attagccaat cgaagttcca 2220
tatcaccatc atcatctgta taattttgtt tttttggaag ataataatga ttgaaatttt 2280
ggtagatttt atttttcatt atttaccttg tatgttgagt ggtcttcaaa ttattgaacg 2340
tgacagattc acaagaaagt agatttttta taaatgaaat tttacttatt ttaaaggtat 2400
ctctatttaa tttcttttgt ttatggttgt ctgtcagcat ttgacttgca gtttcatgct 2460
catagtcata tacgttattc taggcttttt tgaatatctt attacttttt tcgtaataca 2520
attttataat tttatcaaag ttatacaact ataactaaaa ttagggtttt ctacaaaaca 2580
aaaaaatctt ctaatttttt ttgttgtagc cagtttactc gtaagttaca aaaaaataca 2640
aatgaaccca catgtattat gcgtttaact aggattacca tgtactttca tgtactcaat 2700
tcaccctata ctcttttttt ttttttttct agttccaccc aatctataaa attctgtcca 2760
tttgaccaaa ttcaattaat ttctgtaatt gcgatttaaa attaatatta catgttcact 2820
atttctcgat ttgagggaac ccgagtttaa atatgataaa aatgttgacc catcactaca 2880
aatatgttat agtttatact taatagtggt gtttttgggg ataattgatg aattaagtaa 2940
acatgattct tcttatgaag ttgattgagt gattattgta tgtaaaccta tgtgattgat 3000
gttattggtt gattgagtga ttattgtatt agtatgtaag caaagatgat tgttcttatg 3060
aggtaatttg ttactcattc atccttttgc atatgagaaa ttgtgttagc gtacgcaaaa 3120
caatagagaa cataaaagat atgtgtattt atttaaggtg acttttgtta atgatattgt 3180
agtatctata catttatata taacttgttg aatttgagta taagctatca ggatccgggg 3240
gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttgacta gagaattcga atccaaaaat 3300
tacggatatg aatataggca tatccgtatc cgaattatcc gtttgacagc tagcaacgat 3360
tgtacaattg cttctttaaa aaaggaagaa agaaagaaag aaaagaatca acatcagcgt 3420
taacaaacgg ccccgttacg gcccaaacgg tcatatagag taacggcgtt aagcgttgaa 3480
agactcctat cgaaatacgt aaccgcaaac gtgtcatagt cagatcccct cttccttcac 3540
cgcctcaaac acaaaaataa tcttctacag cctatatata caaccccccc ttctatctct 3600
cctttctcac aattcatcat ctttctttct ctacccccaa ttttaagaaa tcctctcttc 3660
tcctcttcat tttcaaggta aatctctctc tctctctctc tctctgttat tccttgtttt 3720
aattaggtat gtattattgc tagtttgtta atctgcttat cttatgtatg ccttatgtga 3780
atatctttat cttgttcatc tcatccgttt agaagctata aatttgttga tttgactgtg 3840
tatctacacg tggttatgtt tatatctaat cagatatgaa tttcttcata ttgttgcgtt 3900
tgtgtgtacc aatccgaaat cgttgatttt tttcatttaa tcgtgtagct aattgtacgt 3960
atacatatgg atctacgtat caattgttca tctgtttgtg tttgtatgta tacagatctg 4020
aaaacatcac ttctctcatc tgattgtgtt gttacataca tagatataga tctgttatat 4080
catttttttt attaattgtg tatatatata tgtgcataga tctggattac atgattgtga 4140
ttatttacat gattttgtta tttacgtatg tatatatgta gatctggact ttttggagtt 4200
gttgacttga ttgtatttgt gtgtgtatat gtgtgttctg atcttgatat gttatgtatg 4260
tgcagcccgg atctccgggt aggtcagtcc cttatgttac gtcctgtaga aaccccaacc 4320
cgtgaaatca aaaaactcga cggcctgtgg gcattcagtc tggatcgcga aaactgtgga 4380
attggtcagc gttggtggga aagcgcgtta caagaaagcc gggcaattgc tgtgccaggc 4440
agttttaacg atcagttcgc cgatgcagat attcgtaatt atgcgggcaa cgtctggtat 4500
cagcgcgaag tctttatacc gaaaggttgg gcaggccagc gtatcgtgct gcgtttcgat 4560
gcggtcactc attacggcaa agtgtgggtc aataatcagg aagtgatgga gcatcagggc 4620
ggctatacgc catttgaagc cgatgtcacg ccgtatgtta ttgccgggaa aagtgtacgt 4680
aagtttctgc ttctaccttt gatatatata taataattat cattaattag tagtaatata 4740
atatttcaaa tatttttttc aaaataaaag aatgtagtat atagcaattg cttttctgta 4800
gtttataagt gtgtatattt taatttataa cttttctaat atatgaccaa aatttgttga 4860
tgtgcaggta tcaccgtttg tgtgaacaac gaactgaact ggcagactat cccgccggga 4920
atggtgatta ccgacgaaaa cggcaagaaa aagcagtctt acttccatga tttctttaac 4980
tatgccggaa tccatcgcag cgtaatgctc tacaccacgc cgaacacctg ggtggacgat 5040
atcaccgtgg tgacgcatgt cgcgcaagac tgtaaccacg cgtctgttga ctggcaggtg 5100
gtggccaatg gtgatgtcag cgttgaactg cgtgatgcgg atcaacaggt ggttgcaact 5160
ggacaaggca ctagcgggac tttgcaagtg gtgaatccgc acctctggca accgggtgaa 5220
ggttatctct atgaactgtg cgtcacagcc aaaagccaga cagagtgtga tatctacccg 5280
cttcgcgtcg gcatccggtc agtggcagtg aagggcgaac agttcctgat taaccacaaa 5340
ccgttctact ttactggctt tggtcgtcat gaagatgcgg acttgcgtgg caaaggattc 5400
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gtggatacgt tagccgggct gcactcaatg tacaccgaca tgtggagtga agagtatcag 6060
tgtgcatggc tggatatgta tcaccgcgtc tttgatcgcg tcagcgccgt cgtcggtgaa 6120
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cgctggactg gcatgaactt cggtgaaaaa ccgcagcagg gaggcaaaca atgaatcaac 6300
aactctcctg gcgcaccatc gtcggctaca gcctcgggaa ttgctaccga gctcgaattt 6360
ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 6420
tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 6480
atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 6540
atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 6600
atctatgtta ctagatcggg aattggcgat cgcagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 6660
tttcctacta gatctgattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag 6720
gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataatc ggatatttaa 6780
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<210>12
<211>5246
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>REW8的T-DNA，RLM407-型Bar-GUS二元载体：LB＞
＜p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(527)..(1078)
<223>BAR基因/CDS的互补序列；与膦丝菌素乙酰转移酶的#SHBARPA吸水链霉菌bar基因100％同源.
<220>
<221>启动子
<222>(1092)..(1379)
<223>来自胭脂碱合酶基因的启动子的互补序列(Depicker等人1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)
EMBL no：V00087.
<220>
<221>启动子
<222>(1698)..(2693)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(2719)..(4719)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(4790)..(5042)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(5101)..(5246)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(5183)..(5206)
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<400>12
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggtcaa atctcggtga 540
cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt 600
catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga 660
gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct 720
tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg 780
tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc 840
gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga 900
gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg 960
gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg 1020
ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggctcatgg 1080
cgcgccagat ctggattgag agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta 1140
tggaacgtca gtggagcatt tttgacaaga aatatttgct agctgatagt gaccttaggc 1200
gacttttgaa cgcgcaataa tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa 1260
acccgcggct gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc 1320
ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatct 1380
tgatcccctg cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg 1440
cttcccaacc ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa 1500
aaccgcccag tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc 1560
gcttgcgttt tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg 1620
tttctgcgga ctggctttct acgtgttccg cttcctttag cagcccttgc gccctgagtg 1680
cttgcggcag cgtgaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg atatgaatat 1740
aggcatatcc gtatccgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac aattgcttct 1800
ttaaaaaagg aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca aacggccccg 1860
ttacggccca aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact cctatcgaaa 1920
tacgtaaccg caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcaccgcct caaacacaaa 1980
aataatcttc tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt ctcacaattc 2040
atcatctttc tttctctacc cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc ttcattttca 2100
aggtaaatct ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta ggtatgtatt 2160
attgctagtt tgttaatctg cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc tttatcttgt 2220
tcatctcatc cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct acacgtggtt 2280
atgtttatat ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt gtaccaatcc 2340
gaaatcgttg atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca tatggatcta 2400
cgtatcaatt gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac atcacttctc 2460
tcatctgatt gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt tttttattaa 2520
ttgtgtatat atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt tacatgattt 2580
tgttatttac gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga cttgattgta 2640
tttgtgtgtg tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag cccggatctc 2700
cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa 2760
ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg tcagcgttgg 2820
tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt taacgatcag 2880
ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt 2940
ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt cactcattac 3000
ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta tacgccattt 3060
gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt tctgcttcta 3120
cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta atataatatt tcaaatattt 3180
ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagttta taagtgtgta 3240
tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc aggtatcacc 3300
gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt gattaccgac 3360
gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc cggaatccat 3420
cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac cgtggtgacg 3480
catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc caatggtgat 3540
gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca aggcactagc 3600
gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta tctctatgaa 3660
ctgtgcgtca cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg cgtcggcatc 3720
cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt ctactttact 3780
ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa cgtgctgatg 3840
gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac ctcgcattac 3900
ccttacgctg aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt gattgatgaa 3960
actgctgctg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg caacaagccg 4020
aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca cttacaggcg 4080
attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg gagtattgcc 4140
aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact ggcggaagca 4200
acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt ctgcgacgct 4260
cacaccgata ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta ttacggatgg 4320
tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga acttctggcc 4380
tggcaggaga aactgcatca gccgattatc atcaccgaat acggcgtgga tacgttagcc 4440
gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc atggctggat 4500
atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg gtgaacaggt atggaatttc 4560
gccgattttg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gtaacaagaa agggatcttc 4620
actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaacgctg gactggcatg 4680
aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa tcaacaactc tcctggcgca 4740
ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg atcgttcaaa 4800
catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 4860
ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 4920
tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 4980
caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 5040
tcgggaattg gcgatcgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tactagatct 5100
gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt 5160
aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg cgtgaaaagg 5220
tttatccgtt cgtccatttg tatgtc 5246
<210>13
<211>6887
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RET63的T-DNA，RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞
＜p-AtAct2i::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316 pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(561)..(1889)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶CDS的互补序列；GenBank
Acc.-No.：J01603.
<220>
<221>启动子
<222>(1919)..(3326)
<223>具有内部内含子的来自拟南芥肌动蛋白-2启动子的启动子互补序列；与#ATU41998拟南芥肌动蛋
白2(ACT2)基因98％同源。
<220>
<221>启动子
<222>(3339)..(4334)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4360)..(6360)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(6431)..(6683)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(6742)..(6887)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(6824)..(6847)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>13
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggagct cggtacgatc 540
catgctgcgt tgaaacgtta ttaacggcct tttgccagat attgattcat ctcttcttcc 600
ggcaccattc cacctcccgt cgcccacacc agatgagtgg tattacgcag ttgttctgcg 660
ctgaaaccgt gcatctgttg gtaacttact gatgcacaca cgcgctgagg tccggccata 720
cccgccagtg ccgaaggttc aagacgaata ccttcttcct gcgccagcca gccaagcatg 780
tcatacatgg tttgatcgct aagggtatag aagccatcca gcagacgctc cattgcccgc 840
ccgacaaagc ctgatgcgcg accaactgca aggccatccg ctgcggtaag gttgtcgata 900
ccaatatcct gaacagaaat ctgatcgtgt aatcctgtat ggacgcctaa caacatacaa 960
ggggagtgcg ttggttcggc aaaaaagcag tgaacatgat cgccaaacgc cagtttaagc 1020
ccgaatgcga cgccaccagg accaccgcca acaccacacg gcagatagac aaacagaggg 1080
ttatcagcat cgacgatacg gccttgctgg gcaaattgcg ctttaagacg ctggccagcg 1140
acggaatacc caaggaacaa cgtgcgggaa ttttcgtcat caataaagaa acagttcggg 1200
tcagactgcg ctgctttacg tccttcctcg acggcaacac cataatcttg ctcatattcc 1260
acgaccgtaa cgccatggct gcgcagtttc gcttttttcc atgcccgggc atcagcagac 1320
atatgaactg tcaccttaaa gccaatgcgg gcgctcataa tgccgattga taaccccaga 1380
tttccggttg agcccacagc aatgctgtat tggctaaaga actgtttaaa ctccggagaa 1440
agcagtttgc tgtagtcatc atcaagcgtc agcaaccccg cttccagagc cagtttttct 1500
gcgtgtgcca ggacttcata aatcccgccg cgtgctttta tggagccgga aatgggcaaa 1560
tggctatctt ttttcagtaa cagttgcccg ctgatcggtt gctgatattc tttttccagc 1620
cgtttttgca tagctggaat ggcaaccagt tctgattcaa taatcccccc agtggcagca 1680
gtttcaggaa atgcttttgc cagatagggt gcaaaacggg ataagcgcgc atgggcgtcc 1740
tgaacatcct gttcggtcag gccaacataa ggtaaacctt cagccaatga ggtcgtgcca 1800
ggattaaacc aggtggtttc tttaagagca accagatcct ttaccaacgg atactgggcg 1860
atgagcgagt tcattttagc gttttccata gtacgtctct ttggatccgg cgcgcctttt 1920
ttttatgagc tgcaaacaca caaaaagagt tcaatacagt caaataaacc ctgattgaat 1980
cagaaatagc tttctgttca acgtacgaca ctacaaatcc taaagtttcg aagaatctat 2040
acacaaactt catctaacct taaacagtgt tcagattcaa tctaacattg acagtgttca 2100
gattcaatct aacttcaaca gttcagattt caattcacat atacaaatca tttcccaggt 2160
aacatgaaca tggatctctc catcaaggtc aagccaaatt ctggtagcta taatcgagct 2220
aactgatcgg tcaacttaga tcgattctag taaaaccaaa agatttagtg gaggttcaca 2280
gatccaaatt aaacgaattc cagatctcaa ggaaattgag aaaacaagat cgagatccag 2340
caaataaagt agatccagaa agttcctatt accttggaaa gaaagagcgg aagaagatga 2400
gattgaggaa gattcaaaac ggagaatgaa tctcctggat tatctcttac tttctctctt 2460
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gagttgagat accaattaca tcgagtctag ccattttgtc gtgccatatt cgtcaaaact 3240
ttcttacata atgataacct agatctagat gagatatgta tcaatgtatt tgagatcata 3300
attaagttcg ttctaaattt tgtcgaaacc aacgcaagct tgactagaga attcgaatcc 3360
aaaaattacg gatatgaata taggcatatc cgtatccgaa ttatccgttt gacagctagc 3420
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cagcgttaac aaacggcccc gttacggccc aaacggtcat atagagtaac ggcgttaagc 3540
gttgaaagac tcctatcgaa atacgtaacc gcaaacgtgt catagtcaga tcccctcttc 3600
cttcaccgcc tcaaacacaa aaataatctt ctacagccta tatatacaac ccccccttct 3660
atctctcctt tctcacaatt catcatcttt ctttctctac ccccaatttt aagaaatcct 3720
ctcttctcct cttcattttc aaggtaaatc tctctctctc tctctctctc tgttattcct 3780
tgttttaatt aggtatgtat tattgctagt ttgttaatct gcttatctta tgtatgcctt 3840
atgtgaatat ctttatcttg ttcatctcat ccgtttagaa gctataaatt tgttgatttg 3900
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tgttgatgtg caggtatcac cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg 4980
ccgggaatgg tgattaccga cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt ccatgatttc 5040
tttaactatg ccggaatcca tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa cacctgggtg 5100
gacgatatca ccgtggtgac gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg 5160
caggtggtgg ccaatggtga tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca acaggtggtt 5220
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RET19的T-DNA，RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞
＜p-AtAct2i::c-dao1/pa::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316 pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(536)..(1642)
<223>红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶CDS的互补序列；GenBank U60066 & US专利5948660；来自
QC142-1/LM202。
<220>
<221>启动子
<222>(1668)..(3075)
<223>具有内部内含子的来自拟南芥肌动蛋白-2启动子的启动子互补序列；与#ATU41998拟南芥肌动蛋
白2(ACT2)基因98％同源。
<220>
<221>启动子
<222>(3088)..(4083)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(4109)..(6109)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(6180)..(6432)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(6491)..(6635)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(6573)..(6596)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>14
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggaatc ccgccctaca 540
acttcgactc ccgcgccgcg ccgtggtacc gctggaacgc ctcgtcgacg agctgcgcga 600
catcctccgc cgcgccccaa ctctgctggt atcccgcact cgagaagcca tacgcatgca 660
caagcgtgac ctccttctcc ttcgccgctc gtgcgctgcc cctgccgagc gagaggggcg 720
actttgtccg gtcgagaggc aggacgatcc gttctgcctc aacgcggggt ccgcctcgtc 780
gtgcaggtcg caagccgacg ttgtggcgga ggacctcgat gccttcgatc gttccgtcgc 840
tcgagatggt cgggtcgagg cgcaagcagt gcttgaggat ccgctggacc gtctctgggt 900
tgacagacaa gtcccagtct cccacgccgt acgtcccgcc gcagatgact tcgccacctg 960
gtcggggaat gatgtaggcg ggagaagcgg ggtcggacga gtccatcgtg catcgcttgc 1020
atggggactt gacgaggacg gtttgcccgc ggattggctc ggcggcttgg tcgtcgatgc 1080
ccgcaatcga cttggcgcca agtcccgtag cgttgaccac caaatccgca ccgtcgaacg 1140
cctgctcaag cgacgtaacg gtccgtctct caaacgtcgc gccgagcttc tgcagctctc 1200
ttgcaaggta ctggcagtac tttggtgcgt ggacggagag ggtgtcgtag gttacgccga 1260
tagcgccagg tggacattcg gaagatggga gggggcggta atttggcgtg atgtccttgt 1320
accagtgccc gagcaagccg tcttcgttct gcgcgaaccg cctcgtcccc ttgagccaca 1380
tggcatggcc cgtcgggacc aactcgaccc acttcttgaa agtcgattct tcccattttg 1440
cttgtcgagg accgtctgta agcgtcatga aaggcgtcca attcgcgcca gcccatggtg 1500
aagcgaaagt ctggctcgag acgtcctccg gcaagtcgcg cgcgagaata tgcacgctgt 1560
agcccttccg agcgaggatg agggcgctgc tcagaccgat aacgcctgat ccgaggacaa 1620
cgacgcgctt ctgcgagtgc atggtggccc gggatccggc gcgccttttt tttatgagct 1680
gcaaacacac aaaaagagtt caatacagtc aaataaaccc tgattgaatc agaaatagct 1740
ttctgttcaa cgtacgacac tacaaatcct aaagtttcga agaatctata cacaaacttc 1800
atctaacctt aaacagtgtt cagattcaat ctaacattga cagtgttcag attcaatcta 1860
acttcaacag ttcagatttc aattcacata tacaaatcat ttcccaggta acatgaacat 1920
ggatctctcc atcaaggtca agccaaattc tggtagctat aatcgagcta actgatcggt 1980
caacttagat cgattctagt aaaaccaaaa gatttagtgg aggttcacag atccaaatta 2040
aacgaattcc agatctcaag gaaattgaga aaacaagatc gagatccagc aaataaagta 2100
gatccagaaa gttcctatta ccttggaaag aaagagcgga agaagatgag attgaggaag 2160
attcaaaacg gagaatgaat ctcctggatt atctcttact ttctctctta gtcttcttcc 2220
ttgttcttct ctgtcaagtc gccggagatt caaaacggct gatgaaagtg aggaggacaa 2280
cgagacaatt caaagcggag aggaaaatat atgaatttat ataggcgggt ttatctctta 2340
caactttatt ttcggccttt caaaaaaata attaaaatcg acagacacga atcatttcga 2400
ccacaggtaa agataacgtg acctggctgt cagacagcct tttccctcgt gttaactaat 2460
ttttaaacta attaatcatc tcagcccttg gattagttct tttgctttga tggcttcatg 2520
actgtgacct gctcgatccg cgtgttacat gacagctccg tttttttagt ggttaactta 2580
aaccgagtca atccaggcaa cgttagtcgt cgtcgtggtt ggcttgttca attagatttc 2640
atacaattca acgtaattta attcgttttc tattagaatt gtatcataat taattcagac 2700
cgtgaaagaa agtgtctttc atgatgtgtt tatggatatt tatacaataa gatacaatgt 2760
ttcatcatat tcactattca cgattagtat gtacattaaa taatggctac tactacatcc 2820
gaactcgtca aaacgattct gaatcaatta tacatatgct gactcttgca tacataaaaa 2880
atagttgttt aaattttgtc taactaatgt ttggtataag tataatgttg agttgagata 2940
ccaattacat cgagtctagc cattttgtcg tgccatattc gtcaaaactt tcttacataa 3000
tgataaccta gatctagatg agatatgtat caatgtattt gagatcataa ttaagttcgt 3060
tctaaatttt gtcgaaacca acgcaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg 3120
atatgaatat aggcatatcc gtatccgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac 3180
aattgcttct ttaaaaaagg aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca 3240
aacggccccg ttacggccca aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact 3300
cctatcgaaa tacgtaaccg caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcaccgcct 3360
caaacacaaa aataatcttc tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt 3420
ctcacaattc atcatctttc tttctctacc cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc 3480
ttcattttca aggtaaatct ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta 3540
ggtatgtatt attgctagtt tgttaatctg cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc 3600
tttatcttgt tcatctcatc cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct 3660
acacgtggtt atgtttatat ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt 3720
gtaccaatcc gaaatcgttg atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca 3780
tatggatcta cgtatcaatt gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac 3840
atcacttctc tcatctgatt gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt 3900
tttttattaa ttgtgtatat atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt 3960
tacatgattt tgttatttac gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga 4020
cttgattgta tttgtgtgtg tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag 4080
cccggatctc cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga 4140
aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg 4200
tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt 4260
taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg 4320
cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt 4380
cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta 4440
tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt 4500
tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta atataatatt 4560
tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagttta 4620
taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc 4680
aggtatcacc gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt 4740
gattaccgac gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc 4800
cggaatccat cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac 4860
cgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc 4920
caatggtgat gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca 4980
aggcactagc gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta 5040
tctctatgaa ctgtgcgtca cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg 5100
cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt 5160
ctactttact ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa 5220
cgtgctgatg gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac 5280
ctcgcattac ccttacgctg aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt 5340
gattgatgaa actgctgctg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg 5400
caacaagccg aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca 5460
cttacaggcg attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg 5520
gagtattgcc aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact 5580
ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt 5640
ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta 5700
ttacggatgg tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga 5760
acttctggcc tggcaggaga aactgcatca gccgattatc atcaccgaat acggcgtgga 5820
tacgttagcc gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc 5880
atggctggat atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg gtgaacaggt 5940
atggaatttc gccgattttg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gtaacaagaa 6000
agggatcttc actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaacgctg 6060
gactggcatg aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa tcaacaactc 6120
tcctggcgca ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg 6180
atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 6240
tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca 6300
tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 6360
cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta 6420
tgttactaga tcgggaattg gcgatcgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 6480
tactagatct gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat 6540
attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg 6600
<210>15
<211>6076
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RET17的T-DNA，RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞
＜p-NOS:c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(561)..(1889)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶CDS的互补序列；GenBank Acc.-No.：J01603.
<220>
<221>启动子
<222>(1922)..(2209)
<223>来自胭脂碱合酶基因的启动子的互补序列(Depicker等人1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)
EMBL no：V00087.
<220>
<221>启动子
<222>(2528)..(3523)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(3549)..(5549)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(5620)..(5872)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(5931)..(6076)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(5971)..(5994)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>15
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggagct cggtacgatc 540
catgctgcgt tgaaacgtta ttaacggcct tttgccagat attgattcat ctcttcttcc 600
ggcaccattc cacctcccgt cgcccacacc agatgagtgg tattacgcag ttgttctgcg 660
ctgaaaccgt gcatctgttg gtaacttact gatgcacaca cgcgctgagg tccggccata 720
cccgccagtg ccgaaggttc aagacgaata ccttcttcct gcgccagcca gccaagcatg 780
tcatacatgg tttgatcgct aagggtatag aagccatcca gcagacgctc cattgcccgc 840
ccgacaaagc ctgatgcgcg accaactgca aggccatccg ctgcggtaag gttgtcgata 900
ccaatatcct gaacagaaat ctgatcgtgt aatcctgtat ggacgcctaa caacatacaa 960
ggggagtgcg ttggttcggc aaaaaagcag tgaacatgat cgccaaacgc cagtttaagc 1020
ccgaatgcga cgccaccagg accaccgcca acaccacacg gcagatagac aaacagaggg 1080
ttatcagcat cgacgatacg gccttgctgg gcaaattgcg ctttaagacg ctggccagcg 1140
acggaatacc caaggaacaa cgtgcgggaa ttttcgtcat caataaagaa acagttcggg 1200
tcagactgcg ctgctttacg tccttcctcg acggcaacac cataatcttg ctcatattcc 1260
acgaccgtaa cgccatggct gcgcagtttc gcttttttcc atgcccgggc atcagcagac 1320
atatgaactg tcaccttaaa gccaatgcgg gcgctcataa tgccgattga taaccccaga 1380
tttccggttg agcccacagc aatgctgtat tggctaaaga actgtttaaa ctccggagaa 1440
agcagtttgc tgtagtcatc atcaagcgtc agcaaccccg cttccagagc cagtttttct 1500
gcgtgtgcca ggacttcata aatcccgccg cgtgctttta tggagccgga aatgggcaaa 1560
tggctatctt ttttcagtaa cagttgcccg ctgatcggtt gctgatattc tttttccagc 1620
cgtttttgca tagctggaat ggcaaccagt tctgattcaa taatcccccc agtggcagca 1680
gtttcaggaa atgcttttgc cagatagggt gcaaaacggg ataagcgcgc atgggcgtcc 1740
tgaacatcct gttcggtcag gccaacataa ggtaaacctt cagccaatga ggtcgtgcca 1800
ggattaaacc aggtggtttc tttaagagca accagatcct ttaccaacgg atactgggcg 1860
atgagcgagt tcattttagc gttttccata gtacgtctct ttggatccgg cgcgccagat 1920
ctggattgag agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta tggaacgtca 1980
gtggagcatt tttgacaaga aatatttgct agctgatagt gaccttaggc gacttttgaa 2040
cgcgcaataa tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa acccgcggct 2100
gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc ttgtcccgcg 2160
tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatct tgatcccctg 2220
cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg cttcccaacc 2280
ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa aaccgcccag 2340
tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc gcttgcgttt 2400
tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg tttctgcgga 2460
ctggctttct acgtgttccg cttcctttag cagcccttgc gccctgagtg cttgcggcag 2520
cgtgaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg atatgaatat aggcatatcc 2580
gtatccgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac aattgcttct ttaaaaaagg 2640
aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca aacggccccg ttacggccca 2700
aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact cctatcgaaa tacgtaaccg 2760
caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcaccgcct caaacacaaa aataatcttc 2820
tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt ctcacaattc atcatctttc 2880
tttctctacc cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc ttcattttca aggtaaatct 2940
ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta ggtatgtatt attgctagtt 3000
tgttaatctg cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc tttatcttgt tcatctcatc 3060
cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct acacgtggtt atgtttatat 3120
ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt gtaccaatcc gaaatcgttg 3180
atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca tatggatcta cgtatcaatt 3240
gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac atcacttctc tcatctgatt 3300
gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt tttttattaa ttgtgtatat 3360
atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt tacatgattt tgttatttac 3420
gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga cttgattgta tttgtgtgtg 3480
tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag cccggatctc cgggtaggtc 3540
agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc 3600
tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg tcagcgttgg tgggaaagcg 3660
cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt taacgatcag ttcgccgatg 3720
cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt ataccgaaag 3780
gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt cactcattac ggcaaagtgt 3840
gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta tacgccattt gaagccgatg 3900
tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt tctgcttcta cctttgatat 3960
atatataata attatcatta attagtagta atataatatt tcaaatattt ttttcaaaat 4020
aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt 4080
tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc aggtatcacc gtttgtgtga 4140
acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt gattaccgac gaaaacggca 4200
agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc cggaatccat cgcagcgtaa 4260
tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac cgtggtgacg catgtcgcgc 4320
aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc caatggtgat gtcagcgttg 4380
aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca aggcactagc gggactttgc 4440
aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta tctctatgaa ctgtgcgtca 4500
cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg cgtcggcatc cggtcagtgg 4560
cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt ctactttact ggctttggtc 4620
gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa cgtgctgatg gtgcacgacc 4680
acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac ctcgcattac ccttacgctg 4740
aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt gattgatgaa actgctgctg 4800
tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg caacaagccg aaagaactgt 4860
acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca cttacaggcg attaaagagc 4920
tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg gagtattgcc aacgaaccgg 4980
atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact ggcggaagca acgcgtaaac 5040
tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt ctgcgacgct cacaccgata 5100
ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta ttacggatgg tatgtccaaa 5160
gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga acttctggcc tggcaggaga 5220
aactgcatca gccgattatc atcaccgaat acggcgtgga tacgttagcc gggctgcact 5280
caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc atggctggat atgtatcacc 5340
gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg gtgaacaggt atggaatttc gccgattttg 5400
cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gtaacaagaa agggatcttc actcgcgacc 5460
gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaacgctg gactggcatg aacttcggtg 5520
aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa tcaacaactc tcctggcgca ccatcgtcgg 5580
ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa 5640
taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 5700
ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 5760
gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 5820
cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcgggaattg 5880
gcgatcgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tactagatct gattgtcgtt 5940
tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga 6000
gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg cgtgaaaagg tttatccgtt 6060
cgtccatttg tatgtc 6076
<210>16
<211>5819
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>RET15的T-DNA，RLM407-型Selda-GUS二元载体：LB＞
＜p-NOS:c-dao1/ko::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS＞RB＞.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(215)
<223>与#TIP37TD1 Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)类似的左T-DNA边界(完全)。)
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>左T-DNA边界重复区域；与#AF234316 pCambia2301bin载体类似。
<220>
<221>终止子
<222>(233)..(485)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子的互补序列。
<220>
<221>misc_feature
<222>(533)..(1636)
<223>dao1/ko的CDS的互补序列。
<220>
<221>启动子
<222>(1665)..(1952)
<223>来自胭脂碱合酶基因的启动子的互补序列(Depicker等人1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561-573)
EMBL no：V00087.
<220>
<221>启动子
<222>(2271)..(3266)
<223>具有内部内含子的欧芹UBI4-2启动子；与多聚遍在蛋白#PCCUBI42欧芹基因Pcubi4-2有99％同源；
来自QC28-6/JB010。
<220>
<221>misc_feature
<222>(3292)..(5292)
<223>包含含大肠杆菌gusA CDS的内含子和内部PIV2内含子的gusINT CDS。
<220>
<221>终止子
<222>(5365)..(5615)
<223>农杆菌胭脂碱合酶聚-A终止子。
<220>
<221>misc_feature
<222>(5674)..(5819)
<223>右T-DNA边界；与genbank#TIP37TD2Ti质粒(来自根瘤农杆菌，胭脂碱菌株T37)T-DNA3’(右)
边界类似
<220>
<221>misc_feature
<222>(5756)..(5779)
<223>右T-DNA边界重复区域；与#TIP37TD2类似；来自pCambia2301。
<400>16
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120
actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180
ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480
cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggtcac taaagttttg 540
actctctcgc tgcaccgtgg tatctttgga atgcctcgtc caccaactga gcaacatctt 600
ctgcagcacc ccatgattgc tgatatccgg cactactaaa accatatgca tgtaccagtg 660
tgacttcttt ttccttagct gcacgtgcgc ttcctcttcc aagcgaaagg gggcttttgg 720
ttctatcgag gggcaataca attctctcag cttctacacg tggtcctcct ctacgagcgg 780
gcctaagacc aacattatgc ctaagtactt cgattccctc aatggttccg tcagatgata 840
tggttgggtc aaggcggagg caatgcttca gaatccgttg gactgtttcg gggttaacgc 900
taagatccca atcacccact ccgtaagttc ctccgcatat aacttcgcca cccggtctcg 960
gtataatata agctggactc gctgggtcac tactatccat cgtacatctt ttgcatggtg 1020
attttaccag cacggtctgg cctctaattg gctccgcagc ttgatcatct atgcctgcta 1080
tgctctttgc tcccagtcct gttgcattca ccacgaggtc tgcaccgtcg aatgcctgtt 1140
ccagtgaggt aaccgtccgt ctttcaaaag ttgcaccgag tttctgaagt tctctggcaa 1200
gatactgaca atatttagga gcgtgtacag agagtgtgtc ataagtcacg ccaattgcgc 1260
ctggtggaca ttcagacgag ggaagggggc ggtaattcgg ggttatatct ttgtaccaat 1320
gtccaagcaa gccgtcttca ttctgtgcaa agcgacgagt tcccttcagc cacatagcat 1380
gtccggtagg gaccaactca acccattttt taaaggtact ctcttcccat tttgcctgtc 1440
tagggccgtc agtcaatgtc ataaatggtg tccaattcgc accagcccag ggggaagcga 1500
aagtttggct agatacgtcc tctgggagat cgcgtgccaa aatatgaaca gaatagccct 1560
tgcgtgcaag tataagagca gaagaaagac ctatgactcc cgaacccaat actacaacgc 1620
gtttttgaga gtgcatggtg gcccgggatc cggcgcgcca gatctggatt gagagtgaat 1680
atgagactct aattggatac cgaggggaat ttatggaacg tcagtggagc atttttgaca 1740
agaaatattt gctagctgat agtgacctta ggcgactttt gaacgcgcaa taatggtttc 1800
tgacgtatgt gcttagctca ttaaactcca gaaacccgcg gctgagtggc tccttcaacg 1860
ttgcggttct gtcagttcca aacgtaaaac ggcttgtccc gcgtcatcgg cgggggtcat 1920
aacgtgactc ccttaattct ccgctcatga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg 1980
cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc 2040
agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct atcgccatgt 2100
aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg tccagatagc 2160
ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc ggactggctt tctacgtgtt 2220
ccgcttcctt tagcagccct tgcgccctga gtgcttgcgg cagcgtgaag cttgactaga 2280
gaattcgaat ccaaaaatta cggatatgaa tataggcata tccgtatccg aattatccgt 2340
ttgacagcta gcaacgattg tacaattgct tctttaaaaa aggaagaaag aaagaaagaa 2400
aagaatcaac atcagcgtta acaaacggcc ccgttacggc ccaaacggtc atatagagta 2460
acggcgttaa gcgttgaaag actcctatcg aaatacgtaa ccgcaaacgt gtcatagtca 2520
gatcccctct tccttcaccg cctcaaacac aaaaataatc ttctacagcc tatatataca 2580
accccccctt ctatctctcc tttctcacaa ttcatcatct ttctttctct acccccaatt 2640
ttaagaaatc ctctcttctc ctcttcattt tcaaggtaaa tctctctctc tctctctctc 2700
tctgttattc cttgttttaa ttaggtatgt attattgcta gtttgttaat ctgcttatct 2760
tatgtatgcc ttatgtgaat atctttatct tgttcatctc atccgtttag aagctataaa 2820
tttgttgatt tgactgtgta tctacacgtg gttatgttta tatctaatca gatatgaatt 2880
tcttcatatt gttgcgtttg tgtgtaccaa tccgaaatcg ttgatttttt tcatttaatc 2940
gtgtagctaa ttgtacgtat acatatggat ctacgtatca attgttcatc tgtttgtgtt 3000
tgtatgtata cagatctgaa aacatcactt ctctcatctg attgtgttgt tacatacata 3060
gatatagatc tgttatatca ttttttttat taattgtgta tatatatatg tgcatagatc 3120
tggattacat gattgtgatt atttacatga ttttgttatt tacgtatgta tatatgtaga 3180
tctggacttt ttggagttgt tgacttgatt gtatttgtgt gtgtatatgt gtgttctgat 3240
cttgatatgt tatgtatgtg cagcccggat ctccgggtag gtcagtccct tatgttacgt 3300
cctgtagaaa ccccaacccg tgaaatcaaa aaactcgacg gcctgtgggc attcagtctg 3360
gatcgcgaaa actgtggaat tggtcagcgt tggtgggaaa gcgcgttaca agaaagccgg 3420
gcaattgctg tgccaggcag ttttaacgat cagttcgccg atgcagatat tcgtaattat 3480
gcgggcaacg tctggtatca gcgcgaagtc tttataccga aaggttgggc aggccagcgt 3540
atcgtgctgc gtttcgatgc ggtcactcat tacggcaaag tgtgggtcaa taatcaggaa 3600
gtgatggagc atcagggcgg ctatacgcca tttgaagccg atgtcacgcc gtatgttatt 3660
gccgggaaaa gtgtacgtaa gtttctgctt ctacctttga tatatatata ataattatca 3720
ttaattagta gtaatataat atttcaaata tttttttcaa aataaaagaa tgtagtatat 3780
agcaattgct tttctgtagt ttataagtgt gtatatttta atttataact tttctaatat 3840
atgaccaaaa tttgttgatg tgcaggtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 3900
cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 3960
ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 4020
aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 4080
tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 4140
caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac 4200
ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca 4260
gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag 4320
ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac 4380
ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg 4440
attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg 4500
gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct 4560
ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc 4620
aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 4680
aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt 4740
gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg 4800
atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 4860
gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 4920
gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt 4980
atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 5040
tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 5100
agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 5160
ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg 5220
gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 5280
ggcaaacaat gaatcaacaa ctctcctggc gcaccatcgt cggctacagc ctcgggaatt 5340
gctaccgagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt 5400
gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 5460
tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 5520
cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 5580
attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttggcgatcg cagcttggcg 5640
taatcatggt catagctgtt tcctactaga tctgattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa 5700
actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta 5760
gaataatcgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtc 5819
<210>17
<211>1408
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1408)
<223>具有第一内含子的拟南芥肌动蛋白2启动子区域。
<220>
<221>内含子
<222>(955)..(1397)
<223>拟南芥肌动蛋白2第一内含子
<400>17
tcgacaaaat ttagaacgaa cttaattatg atctcaaata cattgataca tatctcatct 60
agatctaggt tatcattatg taagaaagtt ttgacgaata tggcacgaca aaatggctag 120
actcgatgta attggtatct caactcaaca ttatacttat accaaacatt agttagacaa 180
aatttaaaca actatttttt atgtatgcaa gagtcagcat atgtataatt gattcagaat 240
cgttttgacg agttcggatg tagtagtagc cattatttaa tgtacatact aatcgtgaat 300
agtgaatatg atgaaacatt gtatcttatt gtataaatat ccataaacac atcatgaaag 360
acactttctt tcacggtctg aattaattat gatacaattc taatagaaaa cgaattaaat 420
tacgttgaat tgtatgaaat ctaattgaac aagccaacca cgacgacgac taacgttgcc 480
tggattgact cggtttaagt taaccactaa aaaaacggag ctgtcatgta acacgcggat 540
cgagcaggtc acagtcatga agccatcaaa gcaaaagaac taatccaagg gctgagatga 600
ttaattagtt taaaaattag ttaacacgag ggaaaaggct gtctgacagc caggtcacgt 660
tatctttacc tgtggtcgaa atgattcgtg tctgtcgatt ttaattattt ttttgaaagg 720
ccgaaaataa agttgtaaga gataaacccg cctatataaa ttcatatatt ttcctctccg 780
ctttgaattg tctcgttgtc ctcctcactt tcatcagccg ttttgaatct ccggcgactt 840
gacagagaag aacaaggaag aagactaaga gagaaagtaa gagataatcc aggagattca 900
ttctccgttt tgaatcttcc tcaatctcat cttcttccgc tctttctttc caaggtaata 960
ggaactttct ggatctactt tatttgctgg atctcgatct tgttttctca atttccttga 1020
gatctggaat tcgtttaatt tggatctgtg aacctccact aaatcttttg gttttactag 1080
aatcgatcta agttgaccga tcagttagct cgattatagc taccagaatt tggcttgacc 1140
ttgatggaga gatccatgtt catgttacct gggaaatgat ttgtatatgt gaattgaaat 1200
ctgaactgtt gaagttagat tgaatctgaa cactgtcaat gttagattga atctgaacac 1260
tgtttaaggt tagatgaagt ttgtgtatag attcttcgaa actttaggat ttgtagtgtc 1320
gtacgttgaa cagaaagcta tttctgattc aatcagggtt tatttgactg tattgaactc 1380
tttttgtgtg tttgcagctc ataaaaaa 1408
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