DGKA抑制剂在制备用于促进抗肿瘤免疫治疗功效的药物中的应用
阅读：626发布：2020-05-08
专利汇可以提供DGKA抑制剂在制备用于促进抗肿瘤免疫治疗功效的药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了DGKA 抑制剂 在制备用于促进抗 肿瘤 免疫 治疗 功效的药物中的应用。本发明还提供了DGKA抑制剂在制备用于增强抗肿瘤免疫反应同时抑制肿瘤生长的药物中的应用。本发明还提供了DGKA抑制剂在制备用于过继性T细胞治疗的药物中的应用。本发明还提供了DGKA抑制剂在制备用于逆转抗肿瘤免疫治疗抵抗的药物中的应用。本发明还提供了DGKA抑制剂在制备用于减缓T细胞耗竭同时抑制肿瘤生长的药物中的应用。本发明能够有效促进抗肿瘤免疫治疗功效，特别是增强抗肿瘤免疫反应同时抑制肿瘤生长，尤其适用于提高PD-1 抗体 治疗肿瘤功效。，下面是DGKA抑制剂在制备用于促进抗肿瘤免疫治疗功效的药物中的应用专利的具体信息内容。
1.DGKA抑制剂在制备用于促进抗肿瘤免疫治疗功效的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述DGKA抑制剂为利坦色林、R59022、R59949中的任意一种。
3.DGKA抑制剂在制备用于增强抗肿瘤免疫反应同时抑制肿瘤生长的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述DGKA抑制剂为利坦色林、R59022、R59949中的任意一种。
5.DGKA抑制剂在制备用于提高PD-1抗体治疗肿瘤功效的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述DGKA抑制剂为利坦色林、R59022、R59949中的任意一种。
7.DGKA抑制剂在制备用于减缓T细胞耗竭同时抑制肿瘤生长的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，所述DGKA抑制剂为利坦色林、R59022、R59949中的任意一种。
9.DGKA抑制剂在制备用于促进过继性T细胞治疗的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述DGKA抑制剂为利坦色林、R59022、R59949中的任意一种。
DGKA抑制剂在制备用于促进抗肿瘤免疫治疗功效的药物中的
应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及DGKA抑制剂在制备用于促进抗肿瘤免疫治疗功效的药物中的应用。
背景技术
[0002] 肿瘤的传统治疗方法包括外科手术治疗、放疗、化疗以及靶向治疗。近年来，免疫治疗作为一种全新、高效的治疗手段，在临床上取得了巨大的成功。肿瘤免疫治疗的设计思想就是通过增强人体本身的免疫系统，清除体内的肿瘤细胞。目前主要分为四大类：免疫检查点抑制剂、过继细胞疗法、非特异性免疫激活剂与肿瘤疫苗。其中以免疫检查点抑制剂为代表的临床试验正在不同的肿瘤类型中不断取得可喜进展，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌、膀胱癌和霍奇金淋巴瘤等。免疫检查点蛋白与其受体或配体结合后，通过复杂的信号传导网络，抑制T细胞的活化与功能，介导负性抗肿瘤免疫。针对免疫检查点蛋白的阻断剂(如PD-1/PD-L1抗体、CTLA-4抗体、Tim3抗体等)可重建免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤，增加抗肿瘤效应。由于免疫治疗的作用对象是免疫系统，而不是直接靶向肿瘤细胞，因此，此类治疗方法具有较高的广谱性，适用于多种不同类型的肿瘤，为患者带来了更多的希望。PD-1/PD-L1抗体作为免疫检查点抑制剂的杰出代表，因在多种恶性肿瘤治疗中疗效显著，已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准应用于多种肿瘤的临床治疗。2018年6月，中国国家药品监督管理局正式批准抗PD-1纳武单抗(Opdivo,Nivolumab)在国内上市，治疗特定的局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者，为今后我国开展肿瘤免疫治疗提供了良好的契机。
[0003] 虽然在多种恶性肿瘤中取得了前所未有的持久应答率，但大多数患者并未能够从免疫治疗中受益。部分患者表现为对于初次接受的肿瘤免疫治疗无反应，即原发性耐药；而一些应答者在一段应答期后又出现肿瘤复发，即获得性耐药。例如，疗效最为突出的PD-1抗体也只有20-40％的反应率。在某些肿瘤类型中，甚至超过60％的患者发生耐药现象。即使是对免疫治疗反应比较好的肿瘤类型，如恶性黑色素瘤，其耐药率也高达50％。
[0004] 联合治疗能够在相对较短的时间内提高治疗效果，是目前快速提高免疫治疗效果的主要策略，在被广泛地探索之中。主要的联合方法有免疫检查点抑制剂分别和免疫激动剂、巨细胞抑制剂、溶瘤病毒、肿瘤疫苗等联用。如何找到合适的靶标和方法，通过联合治疗来提高免疫治疗效果并控制副作用，是目前急需解决的问题。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效促进抗肿瘤免疫治疗功效、逆转免疫治疗抵抗的技术方案。
[0006] 为了实现以上发明目的，本发明提供了DGKA抑制剂在制备用于促进抗肿瘤免疫治疗功效的药物中的应用。
[0007] 在本发明的另一方面，还提供了DGKA抑制剂在制备用于增强抗肿瘤免疫反应同时抑制肿瘤生长的药物中的应用。
[0008] 在本发明的另一方面，还提供了DGKA抑制剂在制备用于提高PD-1抗体治疗肿瘤功效的药物中的应用。
[0009] 在本发明的另一方面，还提供了DGKA抑制剂在制备用于逆转抗肿瘤免疫治疗抵抗的药物中的应用。
[0010] 在本发明的另一方面，还提供了DGKA抑制剂在制备用于减缓T细胞耗竭同时抑制肿瘤生长的药物中的应用。
[0011] 在本发明的另一方面，还提供了DGKA抑制剂在制备用于促进过继性T细胞治疗的药物中的应用。
[0012] 在本发明的另一方面，还提供了DGKA抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0013] 本发明所述的肿瘤包括良性肿瘤和恶性肿瘤，包括但不限于肠癌、肺癌、黑色素瘤、胃癌、鳞状细胞癌、纤维瘤、胰腺癌、脂肪瘤、血管内皮瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤、血管球瘤、骨瘤、巨细胞瘤、脑膜瘤、淋巴瘤、甲状腺癌，特别是肠癌、肺癌、黑色素瘤。
[0014] 优选地，上述DGKA抑制剂为靶向DGKA的小分子抑制剂，包括但不限于利坦色林、R59022、R59949中的任意一种。
[0015] 以下分别是3种小分子DGKA(二酰甘油激酶α)抑制剂利坦色林(Ritanserin)、R59022、R59949的结构式及分子式。
[0016]
[0017] 利坦色林(C27H25N3OF2S)
[0018]
[0019] R59022(C27H26FN3OS)
[0020]
[0022] 图1示出了野生型C57/B6小鼠皮下接种B16-OVA肿瘤细胞后用PD-1抗体治疗的肿瘤体积的变化。
[0023] 图2示出了从PD-1抗体治疗后的肿瘤中分离出的OT-1细胞的qPCR(A)及Western Blot(B)检测结果。
[0025] 图4示出了在不同肿瘤模型中用DMSO或利坦色林(RS)治疗后的肿瘤生长情况和小鼠的生存曲线。
[0026] 图5示出了在不同肿瘤模型中用PD-1抗体单药或与利坦色林(RS)联合治疗后的肿瘤生长情况和小鼠的生存曲线。
[0027] 图6示出了DMSO或利坦色林(RS)联合OT-1过继性免疫细胞治疗后的肿瘤生长曲线和小鼠生存曲线。
[0028] 图7示出了用DMSO或利坦色林(RS)联合OT-1过继性免疫细胞治疗后的T细胞表面耗竭分子的表达情况。
[0029] 图8示出了将利坦色林(RS)与PD-1抗体(PD1 Ab)联用并联合OT-1过继性免疫细胞后的肿瘤生长曲线和小鼠生存曲线。
[0030] 图9示出了利用shRNA敲低肿瘤细胞中的DGKA后的肿瘤生长曲线。
[0032] 图11示出了阻断DGKA对细胞周期的抑制情况。
[0033] 图12示出了DGKA在淋巴细胞中的表达情况与患者存活率的关系。
[0034] 图13示出了DGKA在肿瘤细胞中的表达情况与患者存活率的关系。
[0035] 图14示出了DGKA在淋巴细胞和肿瘤细胞中的表达情况与患者存活率的关系。
具体实施方式
[0036] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
[0037] 在本发明中，首先研究DGKA对T细胞功能的影响。利用B16-OVA/OT-1动物模型，研究DGKA在PD-1抗体耐药过程中的表达情况，以及它是否介导了免疫治疗抵抗。其次，在体外及体内通过抑制剂阻断DGKA，观察是否能够提高或者维持T细胞功能。随后，在小鼠肿瘤动物模型中评估DGKA小分子抑制剂利坦色林的治疗效果和可能的副作用，并观察其与免疫治疗联合应用的治疗效果。然后，进一步深化研究DGKA对肿瘤本身的增殖、免疫逃逸等方面的影响和作用机制，同时结合肠癌临床标本，明确DGKA在肿瘤中的功能。通过一系列的实验，明确DGKA在免疫细胞及肿瘤细胞中的作用，检测DGKA抑制剂的治疗效果，建立高效的免疫治疗新方法。
[0038] 最理想的联合方案应该是能够同时激活抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤本身的增长，获得双重治疗效果。而对免疫系统的调节则需要是特异性地增强抗肿瘤的免疫反应，从而实现对肿瘤的特异攻击，消除免疫抵抗和耐受，减少副作用。这种联合方式将能够有效克服现有肿瘤免疫治疗联合方案的缺点。
[0039] DGKA(diacylglycerol kinase alpha,甘油二酯激酶α)的主要功能是催化甘油二酯磷酸化为磷脂酸，其底物及产物均是体内非常重要的第二信使，参与许多信号通路及细胞功能的调控。在T细胞中，甘油二酯能够促进Ras-MEK-ERK和NF-kB通路的信号传导，从而促进细胞的增殖和功能的增强。DGKA通过消耗其底物甘油二酯，对T细胞的激活进行负向调控。因此，在T细胞中靶向抑制DGKA，能够恢复T细胞的功能，增强抗肿瘤免疫反应。而在肿瘤细胞中，DGKA催化形成的产物磷脂酸可激活AKT-mTOR信号通路，促进肿瘤的增殖及迁移。因此，在肿瘤细胞中靶向抑制DGKA，也可抑制肿瘤的生长。
[0040] 目前靶向抑制基因的策略通常为抑制剂、shRNA或CRISPR/Cas9。后两种均为基因编辑方法，在临床中和免疫治疗联用有一定难度。因此，小分子抑制剂是最佳的选择。目前已有靶向DGKA的小分子抑制剂R59022、R59949和利坦色林，其中利坦色林已经完成了二期临床试验，在人体内的安全性及生物利用度等已得到验证，非常有利于后续快速转化到临床应用。以下将以利坦色林为例，说明靶向DGKA的小分子抑制剂对同时激活抗肿瘤免疫反应并和抑制肿瘤本身增长的功能，该靶向DGKA的小分子抑制剂包括但不限于利坦色林、R59022、R59949。
[0041] 本发明围绕DGKA作为增强抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤生长的双重靶标作用所展开。本发明的成功实施，将有望建立一个以DGKA为靶点的免疫治疗新方法，并通过联合治疗，提高现有免疫治疗方法的治疗效果和反应率，降低肿瘤免疫治疗的抵抗与耐药。
[0042] 实施例1：DGKA参与免疫治疗耐药
[0043] 1)免疫治疗耐药模型的建立。
[0044] 如图1所示，在野生型C57/B6小鼠的皮下接种B16-OVA肿瘤细胞。接种后第12天，通过尾静脉注射3×106肿瘤特异性OT-1细胞，第15天，选择肿瘤大小一致的小鼠分成两组，通过腹腔注射分别注入200μg PD-1抗体或对照抗体，每三天注射一次，直到肿瘤生长失控，直径达到15mm。
[0045] 2)OT-1细胞分选及测序分析。
[0046] 如图2所示，在PD-1抗体敏感或耐药时期，通过流式细胞仪从肿瘤中分离出OT-1细胞，进行qPCR及Western Blot检测。通过与对照组相比，发现DGKA在耐药时期的表达明显升高。证明DGKA参与了免疫治疗的耐药。
[0047] 实施例2：阻断DGKA在不同肿瘤类型中均有较好的治疗效果
[0048] 1)阻断DGKA增强TCR信号转导。
[0049] 如图3所示，在体外用DGKA抑制剂利坦色林预先孵育T细胞24小时，再用包被了CD3/CD28抗体的培养板刺激48小时，通过Western Blot检测TCR(T细胞抗原受体)信号通路蛋白ERK(细胞外调节蛋白激酶)的磷酸化情况。发现，阻断DGKA可明显促进ERK磷酸化，从而激活TCR信号转导。
[0050] 2)阻断DGKA在不同肿瘤模型中的治疗效果。
[0051] 如图4所示，对不同肿瘤模型(肠癌MC38、肠癌CT26、肺癌LLC及黑色素瘤B16)用DMSO或利坦色林(RS)治疗，测量皮下肿瘤的大小，观察小鼠的生存情况。利坦色林具有明显的抑制肿瘤生长的作用，且明显延长了小鼠的生存期。
[0052] 3)阻断DGKA与PD1抗体联合应用在不同肿瘤模型中的治疗效果。
[0053] 如图5所示，对不同肿瘤模型(肠癌MC38、肠癌CT26、肺癌LLC及黑色素瘤B16)用PD1抗体单药或与利坦色林(RS)联合治疗，测量皮下肿瘤的大小，观察小鼠的生存情况。PD1抗体单药具有一定的抑制肿瘤生长的作用，与利坦色林联合后，抗肿瘤效应明显提高，且明显延长了小鼠的生存期。
[0054] 实施例3：阻断DGKA逆转免疫治疗抵抗
[0055] 1)阻断DGKA促进过继性T细胞治疗的功效。
[0056] 如图6所示，将B16-OVA荷瘤小鼠随机分为两组，通过尾静脉注射3×106肿瘤特异性OT-1细胞，3天后进行DMSO或利坦色林治疗。发现，OT-1细胞具有一定的抑制肿瘤生长的效果，但后期肿瘤又重新生长起来。利坦色林治疗组的肿瘤生长速度明显慢于对照组，且小鼠生存期明显延长，证明阻断DGKA促进了过继性T细胞治疗的功效。
[0057] 2)阻断DGKA减缓T细胞耗竭。
[0058] 如图7所示，在以上模型中，发现利坦色林治疗组中T细胞表面耗竭分子的表达明显少于对照组，而且T细胞产生细胞因子的能力明显增强。证明阻断DGKA可以减缓T细胞耗竭，促进T细胞的抗肿瘤功效。
[0059] 3)阻断DGKA增加PD-1抗体功效。
[0060] 将B16-OVA荷瘤小鼠随机分为两组，通过尾静脉注射3×106肿瘤特异性OT-1细胞，3天后进行PD-1抗体单药或与利坦色林联合治疗。如图8所示，PD-1抗体对荷瘤小鼠已经有较好的治疗功效，但联合治疗组的肿瘤生长速度明显慢于单药组，且小鼠生存期明显延长，证明阻断DGKA促进了PD-1抗体的抗肿瘤功效。
[0061] 实施例4：阻断DGKA抑制肿瘤细胞生长
[0062] 1)DGKAshRNA抑制肿瘤细胞生长。
[0063] 如图9所示，利用shRNA敲低肿瘤细胞中的DGKA，建立稳定转染的细胞株，并接种于免疫缺陷鼠上，肿瘤生长曲线显示，shDGKA组的小鼠皮下肿瘤生长的速度慢于对照组。
[0064] 2)DGKA抑制剂具有较好的治疗效果。
[0065] 如图10所示，利用免疫缺陷小鼠模型，于皮下接种肿瘤细胞，待肿瘤直径约5mm时，随机分成两组，通过腹腔注射分别注入DMSO或利坦色林进行治疗。利坦色林明显抑制了小鼠皮下肿瘤的生长。
[0066] 3)阻断DGKA抑制细胞周期。
[0067] 如图11所示，在体外用shRNA敲低或用利坦色林阻断DGKA，可导致细胞周期阻滞于G1/S期。
[0068] 实施例5：DGKA高表达提示不良预后
[0069] 1)DGKA在淋巴细胞中高表达与不良预后相关
[0070] 选取了约200例术后病理为pT3N0M0的随访资料完整的的结直肠癌患者，取手术组织标本进行石蜡包埋，并通过免疫组化染色检测DGKA的表达，分析其表达量与患者5年无复发生存的相关性。如图12所示，发现DGKA在肿瘤浸润淋巴细胞中高表达与患者的不良预后显著相关。
[0071] 2)DGKA在肿瘤细胞中高表达与不良预后相关
[0072] 如图13所示，同时也判读了DGKA在肿瘤细胞当中的表达情况。发现DGKA在肿瘤细胞中高表达也与患者的不良预后显著相关。
[0073] 3)DGKA在淋巴细胞与肿瘤细胞中同时高表达预后最差
[0074] 如图14所示，同时评估淋巴细胞与肿瘤细胞，发现DGKA在两种细胞中表达双高的患者预后最差。这表明DGKA在免疫细胞中的表达抑制了抗肿瘤免疫反应，而在肿瘤细胞中的表达又促进了肿瘤本身的生长。
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