使用阿吡莫德治疗癌症的方法
阅读：67发布：2024-02-21
专利汇可以提供使用阿吡莫德治疗癌症的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用阿吡莫德 治疗 癌症的方法以及相关组合物和方法。，下面是使用阿吡莫德治疗癌症的方法专利的具体信息内容。
1.一种在需要其的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效抑制所述个体癌细胞中的细胞PIKfyve活性的量的包含阿吡莫德的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症是脑癌、胶质瘤、肉瘤、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、阑尾癌、泌尿生殖系统癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸癌、阴茎癌、宫颈癌、卵巢癌、希-林病、头颈部癌、胃肠癌、肝细胞癌、胆囊癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、神经内分泌肿瘤、甲状腺肿瘤、垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、恶性血液肿瘤、淋巴瘤或白血病。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症是B细胞淋巴瘤。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述癌症是非霍奇金B细胞淋巴瘤。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中施用步骤在至少一个周期中进行，所述周期由至少1天施用包含阿吡莫德的组合物，接着至少1个连续日不施用包含阿吡莫德的组合物组成。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述施用步骤在2至10个周期中进行。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述施用步骤在2至5个周期中进行。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述周期由1至10个连续日施用组合物，然后1至5个连续日不施用组合物组成。
10.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述周期由2至5个连续日施用组合物，然后1至2个连续日不施用组合物组成。
11.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述周期由5个连续日施用组合物，然后
2个连续日不施用组合物组成。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述阿吡莫德组合物包含阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述阿吡莫德组合物是口服剂型或适于静脉内施用的剂型。
14.如权利要求4-13中任一项所述的方法，其中所述非霍奇金B细胞淋巴瘤选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、纵隔B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述非霍奇金B细胞淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述非霍奇金B细胞淋巴瘤是顽固或复发的。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中将至少一种附加活性剂与包含阿吡莫德的组合物组合施用。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述至少一种附加活性剂与所述包含阿吡莫德的组合物在同一组合物中施用，或与所述包含阿吡莫德的组合物在分开的组合物中施用。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述至少一种附加活性剂选自烷化剂、嵌入剂、微管蛋白结合剂、皮质类固醇及其组合。
20.如权利要求17或18所述的方法，其中所述至少一种附加活性剂是选自依鲁替尼、利妥昔单抗、多柔比星、泼尼松龙、长春新碱、万珂及其组合的治疗剂。
21.如权利要求17或18所述的方法，其中所述至少一种附加活性剂是选自环磷酰胺、羟基柔红霉素(也称为多柔比星或Adriamycin™)、长春新碱(也称为Oncovin™)、泼尼松、泼尼松龙及其组合的治疗剂。
22.如权利要求17或18所述的方法，其中所述至少一种附加活性剂是非治疗剂。
23.如权利要求22所述的方法，其中选择非治疗剂以改善所述阿吡莫德组合物的一种或多种副作用。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述非治疗剂选自昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼和帕洛诺司琼。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述非治疗剂选自吲哚洛尔和利培酮。
26.如权利要求22所述的方法，其中选择非治疗剂以增加所述阿吡莫德组合物中阿吡莫德的生物利用度。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述非治疗剂是CYP3A抑制剂。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述CYP3A抑制剂是利托那韦或科比司他。
29.一种用于在个体中治疗癌症的阿吡莫德组合物，所述组合物包含阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德和一种或多种选自烷化剂、嵌入剂、微管蛋白结合剂、皮质类固醇、CYP3A抑制剂和涉及检查点信号转导通路的程序性死亡1(PD-1)受体和/或其配体(PD-L1/
2)的抑制剂的附加活性剂。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述组合物包含依鲁替尼、利妥昔单抗、多柔比星、泼尼松龙、长春新碱、万珂和依维莫司中的一种或多种。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述组合物包含泼尼松龙、万珂和依维莫司中的一种或多种。
32.如权利要求30所述的组合物，其中所述组合物包含依鲁替尼。
33.如权利要求30所述的组合物，其中所述组合物包含长春新碱。
34.如权利要求29-33中任一项所述的组合物，其包含CYP3A抑制剂。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述CYP3A抑制剂选自利托那韦和科比司他。
36.如权利要求29-35中任一项所述的组合物，其包含涉及检查点信号转导通路的程序性死亡1(PD-1)受体和/或其配体(PD-L1/2)的抑制剂。
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述抑制剂选自BMS-936559/MDX-1105、
MPDL3280A、MSB0010718C、MEDI473、CT-011/pidilizumab、BMS-936558/MDX-1106/纳武单抗和派姆单抗，以及前述中的任何一个的两个或更多个的组合。
38.如权利要求29-37中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼、帕洛诺司琼、吲哚洛尔和利培酮中的一种或多种。
使用阿吡莫德治疗癌症的方法
[0002] 本发明涉及包含阿吡莫德(apilimod)的组合物及其使用方法。
[0003] 发明背景阿吡莫德，也称为STA-5326，以下称为“阿吡莫德”，被认为是一种强效的IL-12 与IL-
23 的转录抑制剂。参见例如Wada 等人Blood 109 (2007): 1156-1164。IL-12 和IL-23 是通常由免疫细胞如B细胞和巨噬细胞响应抗原刺激而产生的炎性细胞因子。自身免疫性病症和以慢性炎症为特征的其它病症部分由这些细胞因子的不适当产生来表征。在免疫细胞中，通过阿吡莫德选择性抑制IL-12/IL-23 转录近来显示受到阿吡莫德向磷脂酰肌醇-3-磷酸5-激酶(PIKfyve)的直接结合的介导。参见例如Cai 等人Chemistry and Biol. 20 (2013):912-921。PIKfyve 在Toll 样受体信号转导中起作用，这在先天免疫中是重要的。
23 的转录抑制剂。参见例如Wada 等人Blood 109 (2007): 1156-1164。IL-12 和IL-23 是通常由免疫细胞如B细胞和巨噬细胞响应抗原刺激而产生的炎性细胞因子。自身免疫性病症和以慢性炎症为特征的其它病症部分由这些细胞因子的不适当产生来表征。在免疫细胞中，通过阿吡莫德选择性抑制IL-12/IL-23 转录近来显示受到阿吡莫德向磷脂酰肌醇-3-磷酸5-激酶(PIKfyve)的直接结合的介导。参见例如Cai 等人Chemistry and Biol. 20 (2013):912-921。PIKfyve 在Toll 样受体信号转导中起作用，这在先天免疫中是重要的。
[0004] 基于其作为免疫调节剂和IL-12/IL-23 的特异性抑制剂的活性，已经提出阿吡莫德可用于治疗自身免疫性和炎性疾病和病症。参见例如US 6,858,606 和6,660,733(描述了一类嘧啶化合物，包括阿吡莫德，据称可用于治疗以IL-12 或IL-23 过度产生为特征的疾病和病症，如类风湿性关节炎、脓毒症、克罗恩病、多发性硬化症、银屑病或胰岛素依赖型糖尿病)。类似地，基于其抑制c-Rel 或IL-12/23 的活性，阿吡莫德被建议可用于治疗某些癌症，特别是在其中这些细胞因子据信在促进异常的细胞增殖方面起作用的癌症中。参见例如WO2006/128129 和Baird 等人, Frontiers in Oncology 3:1(分别为2013)。
[0005] 三种阿吡莫德临床试验各自专注于其在自身免疫性和炎性疾病中的潜在功效。在患有银屑病、类风湿性关节炎和克罗恩病的患者中进行该试验。在患有银屑病的患者中的开放标签临床研究的结论是，口服施用阿吡莫德显示了免疫调节活性，其支持抑制IL-12/IL-23 合成用于治疗TH1-和TH17-介导的炎性疾病。Wada 等人, PLosOne 7:e35069 (2012 年4 月)。但是在类风湿性关节炎和克罗恩病中的对照试验的结果不支持阿吡莫德对IL-12/IL-23 的抑制转化为这些适应症任一的临床改善的概念。在患有类风湿性关节炎的患者中的随机双盲安慰剂对照的阿吡莫德II 期临床试验中，阿吡莫德未能改变滑液的IL-12 与IL-23 表达。Krauz 等人, Arthritis & Rheumatism 64:1750-1755 (2012)。作者得出结论“结果不支持阿吡莫德对IL-12/IL-23 的抑制能够在RA中诱导强有力的临床改善的概念”。类似地，用于治疗活动性(active)克罗恩病的阿吡莫德的随机双盲安慰剂对照试验得出以下结论：尽管耐受性良好，阿吡莫德未表现出超越安慰剂的功效。Sands 等人Inflamm Bowel Dis. 2010 Jul;16(7):1209-18。
[0006] 雷帕霉素哺乳动物靶蛋白(mTOR)通路是重要的细胞信号转导通路，其参与多种生理功能，包括细胞生长、细胞增殖、代谢、蛋白质合成和自体吞噬(La Plante 等人Cell 2012, (149 (2), 第274-293 页)。mTOR是整合标志着氨基酸、应激、氧、能量和生长因子水平的胞内与胞外刺激并调节对这些环境刺激的细胞响应的激酶。mTOR失调(deregulation)已经牵涉了多种病症和疾病，包括癌症、肥胖、糖尿病和神经变性。已经探索了mTOR 通路的某些组分作为用于治疗这些疾病中的某一些的药物靶标。但是，疗效是有限的，例如在一些癌症的治疗中，并且一些mTOR 抑制剂已经显示对代谢具有不利影响。结节性硬化症肿瘤抑制基因TSC1 与TSC2 是mTOR 的负调节物。
[0007] 发明概述本发明部分基于令人惊讶的发现：阿吡莫德在TSC 裸细胞中是高度细胞毒性剂。在这些细胞中，mTOR 通路是组成性活性的。该mTOR 通路在多种癌症中被激活，并且在超过100 种癌细胞系的进一步筛选中，阿吡莫德在来自不同癌症的细胞系中显示出抗增殖活性。在阿吡莫德敏感性癌细胞系中，B细胞淋巴瘤是最为敏感的。但是，预料不到的是，B细胞淋巴瘤对阿吡莫德的差异敏感性与这些细胞中的c-Rel 表达、IL-12 表达或IL-23 表达不相关。这是令人惊讶的，因为较早期的工作已提出阿吡莫德将可用于对抗其中c-Rel 和/或IL-12/23表达在促进异常细胞增殖方面至关重要的癌症。相反，本发明人证明，阿吡莫德在癌细胞中的细胞毒活性是由于胞内运输的抑制和细胞凋亡方面的相应提高。根据阿吡莫德的免疫调节活性(经由其抑制IL-12/23 产生)无法预测这种活性。此外，超过450 种激酶的筛选将PIKfyve 确定为人类癌细胞系中唯一的阿吡莫德高亲和力结合靶标(Kd=75 pM)。
[0008] 本发明提供了用于阿吡莫德在治疗癌症，且特别是治疗B细胞淋巴瘤，且尤其是对标准化疗方案耐药或顽固的那些中的治疗用途的新方法。
[0009] 在一个实施方案中，本发明提供了用于在需要其的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效抑制所述个体的癌细胞中的细胞PIKfyve活性的量的包含阿吡莫德的组合物。在一个实施方案中，所述个体是人。
[0010] 在一个实施方案中，所述癌症是脑癌、胶质瘤、肉瘤、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、阑尾癌、泌尿生殖系统癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸癌、阴茎癌、宫颈癌、卵巢癌、希-林病(von Hippel Lindau disease)、头颈部癌、胃肠癌、肝细胞癌、胆囊癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、神经内分泌肿瘤、甲状腺肿瘤、垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、恶性血液肿瘤、淋巴瘤或白血病。在一个实施方案中，所述癌症是淋巴瘤并且在进一步的实施方案中，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤。
[0011] 在一个实施方案中，所述癌症选自DLBCL、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤(MZL)、CLL/SLL (慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤)和套细胞淋巴瘤。
[0012] 在一个实施方案中，施用步骤在至少一个周期中进行，所述周期由至少1天施用包含阿吡莫德的组合物，接着至少1个连续日不施用包含阿吡莫德的组合物组成。在某些实施方案中，施用步骤在2至10个周期或2至5个周期中进行。在一个实施方案中，周期由1至10个连续日施用组合物，然后1至5个连续日不施用组合物组成。在另一个实施方案中，周期由2至5个连续日施用组合物，然后1至2个连续日不施用组合物组成。在进一步的实施方案中，周期由5个连续日施用组合物，然后2个连续日不施用组合物组成。
[0013] 在具体的实施方案中，本发明提供了使用阿吡莫德以下述方案治疗癌症的方法，所述方案由在28天的周期中用阿吡莫德治疗5天，然后停止治疗2天达1至2个月、1至3个月、1至4个月、1至5个月、1至6个月或6至12个月的时间段组成。其他实施方案在下面以及在下文中更详细地描述。
[0014] 在一方面，本发明提供了在需要其的个体中治疗癌症的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的本发明的阿吡莫德组合物，所述组合物包含阿吡莫德，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物、多晶型物、前药、类似物或衍生物。在一个实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效抑制所述个体的癌细胞中的细胞PIKfyve活性的量的包含阿吡莫德的组合物。在一个实施方案中，所述阿吡莫德组合物包含阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德。
[0015] 在一个实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用至少一种附加活性剂。所述至少一种附加活性剂可以是治疗剂或非治疗剂。所述至少一种附加活性剂可以与该阿吡莫德组合物一起在单一剂型中施用，或与该阿吡莫德组合物在分开的剂型中施用。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂选自烷化剂、嵌入剂、微管蛋白结合剂、皮质类固醇及其组合。
[0016] 在一个实施方案中，所述至少一种附加剂是涉及检查点信号转导通路的程序性死亡1(PD-1)受体及其配体(PD-L1/2)的抑制剂。在一个实施方案中，所述方法包括抗-PD-L1剂和抗-PD-1剂的组合。在一个实施方案中，所述抑制剂是抗-PD-L1剂，其选自BMS-936559/MDX-1105 (PD-L1的全人源高亲和性免疫球蛋白(Ig) G4单克隆抗体)、MPDL3280A (靶向PD-L1的工程化人单克隆抗体)、MSB0010718C和MEDI473。在一个实施方案中，所述抑制剂是抗-PD-1剂，其选自CT-011/pidilizumab、BMS-936558/MDX-1106/纳武单抗和派姆单抗。在一个实施方案中，所述抑制剂选自BMS-936559/MDX-1105、MPDL3280A、MSB0010718C、MEDI473、CT-011/pidilizumab、BMS-936558/MDX-1106/纳武单抗和派姆单抗，以及前述中的任何一个的两个或更多个的组合。
[0017] 在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选自依鲁替尼(ibrutinib)、利妥昔单抗、多柔比星、泼尼松龙、长春新碱、万珂和依维莫司及其组合的治疗剂。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选自环磷酰胺、羟基柔红霉素(也称为多柔比星或Adriamycin™ )、长春新碱(也称为Oncovin™ )、泼尼松、泼尼松龙及其组合的治疗剂。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是治疗剂，其选自BMS-936559/MDX-1105、MPDL3280A、MSB0010718C、MEDI473、CT-011/pidilizumab、BMS-936558/MDX-1106/纳武单抗和派姆单抗，以及前述中的任何一个的两个或更多个的组合。
[0018] 在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是非治疗剂。在一个实施方案中，选择所述非治疗剂以改善阿吡莫德组合物的一种或多种副作用。在一个实施方案中，所述非治疗剂选自昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼和帕洛诺司琼。在一个实施方案中，所述非治疗剂选自吲哚洛尔和利培酮。在一个实施方案中，选择所述非治疗剂以增加阿吡莫德组合物中阿吡莫德的生物利用度。在该实施方案的一个方面中，所述非治疗剂是CYP3A抑制剂。在特定的实施方案中，所述CYP3A抑制剂是利托那韦或科比司他。
[0019] 在一个实施方案中，该阿吡莫德组合物的剂型是口服剂型。在另一实施方案中，该阿吡莫德组合物的剂型适于静脉内施用。在一个实施方案中，当该剂型适于静脉内施用时，通过单次注射或通过滴灌袋(drip bag)进行施用。
[0020] 在一个实施方案中，所述个体是人类癌症患者。在一个实施方案中，需要用本发明的阿吡莫德组合物治疗的人类癌症患者是其癌症对标准化疗方案顽固的患者。在一个实施方案中，需要用阿吡莫德组合物治疗的人类癌症患者是其癌症在用标准化疗方案治疗后已经复发的患者。在一个实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一个实施方案中，所述癌症是B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述B细胞淋巴瘤是非霍奇金B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述非霍奇金B细胞淋巴瘤选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、纵隔B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤。在一个实施方案中，所述非霍奇金B细胞淋巴瘤是DLBCL。在一个实施方案中，所述DLBCL是GCB 亚型。
[0021] 在一个实施方案中，所述标准化疗方案包含一种或多种选自依鲁替尼、利妥昔单抗、多柔比星、泼尼松龙、长春新碱、万珂、环磷酰胺、地塞米松和依维莫司的治疗剂。在一个实施方案中，所述标准化疗方案选自CHOP(环磷酰胺、羟基柔红霉素、Oncovin™ (长春新碱)和泼尼松或泼尼松龙)、COOP(环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸甲基苄肼、泼尼松)、CVP(环磷酰胺、硫酸长春新碱、泼尼松)、EPOCH(依托泊苷、泼尼松、硫酸长春新碱、环磷酰胺、盐酸多柔比星)、Hyper-CVAD(环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸多柔比星、地塞米松)、ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)、R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸甲基苄肼、泼尼松)和R-CVP(利妥昔单抗、环磷酰胺、硫酸长春新碱、泼尼松)。
[0022] 在一个实施方案中，所述方法是使用包含阿吡莫德组合物与用于治疗淋巴瘤的化疗方案的联合疗法治疗淋巴瘤的方法。在一个实施方案中，所述化疗方案是CHOP 方案。在另一实施方案中，该化疗方案选自COOP、CVP、EPOCH、Hyper-CVAD、ICE、R-CHOP 和R-CVP。所述方案还可包括一种或多种如上所述的附加的非治疗剂，例如选自一种或多种CYP3A抑制剂的非治疗剂，例如利托那韦或科比司他、昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼、帕洛诺司琼、吲哚洛尔和利培酮。
[0024] 图1B: 阿吡莫德对癌细胞细胞活力的作用，与非癌(正常)细胞相比。
[0025] 图2A: 在用化合物孵育3、5和7天时，HCT116结直肠癌细胞对阿吡莫德的十点剂量响应。
[0026] 图2B: 在7天测定中不同NHL亚型对阿吡莫德的敏感度(IC50 < 125 nM)。
[0027] 图3: 在含有和不含阿吡莫德(10nM)的情况下用93种药物的手动组织库(manually curated library)筛选SU-DHL-4细胞，确定依鲁替尼为一种与阿吡莫德联用时发挥协同活性的药物。
[0028] 图4: 阿吡莫德抑制SU-DHL-6 DLBCL异种移植肿瘤的生长；顶部的线显示了媒介物盐水(菱形，浅灰色实线)QD×5，2 天停药，QD×5 i.v.；0.5%甲基纤维素(三角形，深灰色实线)QD×5，2 天停药，QD×5 p.o.；二甲磺酸阿吡莫德(正方形，虚线)67.5 mg/kg (47 mg/kg游离碱)QD×5 i.v.，2 天停药，QD×5；阿吡莫德游离碱(正方形，浅灰色实线)150 mg/kg QD×5，2 天停药，QD×5 p.o；阿吡莫德游离碱(叉，实线)75 mg/kg BID×5，2 天停药，BID×5 p.o.。
[0029] 图5: 阿吡莫德与依鲁替尼的组合对DLBCL肿瘤在体内的抗肿瘤活性；顶部的线显示媒介物(菱形，浅灰色实线)QD×5，2 天停药，QD×5 p.o. + i.v.；依鲁替尼(三角形，深灰色实线) 10 mg/kg QD x12 i.v.；阿吡莫德游离碱(正方形，虚线) 75 mg/kg QD×5，2 天停药，QD×5 p.o.；依鲁替尼(叉，深色实线) 20 mg/kg QD×12 i.v.；阿吡莫德游离碱75 mg/kg QD×5，2 天停药，QD×5 p.o. + 依鲁替尼10 mg/kg QD×12 i.v.(正方形，浅灰色实线)；阿吡莫德游离碱75 mg/kg QD×5，2 天停药，QD×5 p.o. + 依鲁替尼10 mg/kg QD×12 i.v.(圆形，中灰色实线)。
[0030] 图6: 阿吡莫德以高亲和力与PIKfyve结合 (Kd = 75 pM)。
[0031] 图7: 在非霍奇金B细胞淋巴瘤中，IL-23A表达不是敏感度的统计学显著的预测因子。显示了阿吡莫德敏感的NHB细胞系(底部，深色)和阿吡莫德不敏感的NHB细胞系(顶部，浅色)。
[0032] 图8A: 在用指示浓度的阿吡莫德处理24小时的H4神经胶质瘤细胞中磷酸肌醇PI(3,5)P2的免疫染色。
[0033] 图8B: 用媒介物(左侧)或100 nM 阿吡莫德(右侧)处理24小时的H4神经胶质瘤细胞的微分干涉对比(DIC)镜像。
[0034] 图9A: 左侧: 用非靶向shRNA (对照)或靶向PIKFYVE 的发夹(shPIKFYVE)转导的H4的DIC镜像。右侧: 对照或在多西环素下的PIKFYVE shRNA诱导后H4细胞的活力。
[0035] 图9B: H4神经胶质瘤中的PIKFYVE敲低。
[0036] 发明详述本发明提供涉及在需要此类治疗的个体，优选人类个体中使用阿吡莫德治疗癌症的组合物和方法。本发明通常涉及阿吡莫德的新用途，其基于令人惊讶的发现：阿吡莫德针对淋巴和非淋巴来源的一系列癌细胞的细胞毒活性，所述活性是并非明确涉及阿吡莫德的已知免疫调节和IL-12/23 抑制活性或可由阿吡莫德的已知免疫调节和IL-12/23 抑制活性预测的活性。此外，基于使用单独的阿吡莫德、作为单一疗法的阿吡莫德，或与至少一种附加治疗剂诸如附加的抗癌(化疗)剂组合的阿吡莫德的治疗方案，本发明向癌症治疗提供了新的治疗方法。此处描述的治疗方案利用与非癌(正常)细胞相比阿吡莫德对癌细胞的选择性细胞毒活性以及癌细胞对在一段时间内施用的阿吡莫德的敏感度增加。
[0037] 本文中所用的术语“阿吡莫德组合物”可以指包含阿吡莫德本身(游离碱)的组合物，或可以如下所述涵盖阿吡莫德的药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物、多晶型物、前药、类似物或衍生物。阿吡莫德的结构显示在式I 中：。
[0038] 阿吡莫德的化学名称是2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶(IUPAC 名称：(E)-4-(6-(2-(3-甲基亚苄基)肼基)-2-(2-(吡啶-2-基)乙氧基)嘧啶-4-基)吗啉)，并且CAS 编号为541550-19-0。
[0039] 阿吡莫德可以例如根据美国专利号7,923,557 和7,863,270 以及WO 2006/128129 中描述的方法来制备。
[0040] 本文中所用的术语“药学上可接受的盐”是由例如酸和阿吡莫德组合物的碱性基团形成的盐。示例性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、苯磺酸盐(besylate)、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucaronate)、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(例如1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。在优选实施方案中，阿吡莫德的盐包含甲磺酸盐。
[0041] 术语“药学上可接受的盐”还指的是由具有酸性官能团，如羧酸官能团的阿吡莫德组合物与药学上可接受的无机或有机碱制备的盐。
[0042] 术语“药学上可接受的盐”还指的是由具有碱性官能团，如氨基官能团的阿吡莫德组合物与药学上可接受的无机或有机酸制备的盐。
[0043] 本文中所述的化合物的盐可以由母体化合物通过常规化学方法来合成，如Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Hemrich Stalil(编者), Camille G. Wermuth(编者), ISBN: 3-90639-026-8, 2002 年8 月中描述的方法。通常，此类盐可以通过使母体化合物与适当的酸在水中或在有机溶剂中或在二者的混合物中反应来制备。
[0044] 本文中所述的化合物的一种盐形式可以通过本领域技术人员熟知的方法转化成游离碱和任选转化成另一种盐形式。例如，可以通过使盐溶液通过含有胺固定相的柱(例如Strata-NH2 柱)来形成该游离碱。或者，该盐的水溶液可以用碳酸氢钠处理以分解该盐并沉淀出该游离碱。该游离碱可以随后使用常规方法与另一种酸混合。
[0045] 本文中所用的术语“多晶型物”指的是本发明的化合物(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)或其络合物的固体结晶形式。相同化合物的不同多晶型物可以展现出不同的物理、化学和/或光谱性质。不同的物理性质包括但不限于稳定性(例如，对热或光)、可压缩性和密度(在制剂和产品制造中是重要的)，以及溶解速率(这可以影响生物利用度)。稳定性方面的差异可能来自于化学反应性(例如不同的氧化，使得剂型在包含一种多晶型物时比包含另一种多晶型物时更快速地变色)或机械特性(例如，由于动力学有利的多晶型物转化成热力学更稳定的多晶型物，片剂在储存时破裂)或二者(例如，一种多晶型物的片剂更容易在高湿度下破碎)的变化。多晶型物的不同物理性质可影响它们的加工。例如，一种多晶型物与另一种多晶型物相比可能更可能形成溶剂化物或可能更难以过滤或洗涤至不含杂质，归因于例如其颗粒的形状或尺寸分布。
[0046] 本文中所用的术语“水合物”指的是本发明的化合物(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)或其盐，其进一步包括化学计算量或非化学计算量的通过非共价分子间力结合的水。
[0047] 本文中所用的术语“包合物”指的是晶格形式的本发明的化合物(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)或其盐，其包含具有捕获在其中的客体分子(例如溶剂或水)的空间(例如，通道)。
[0048] 本文中所用的术语“前药”指的是本文中所述的化合物(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)的衍生物，其可以在生物条件(体外或体内)下水解、氧化或以其它方式反应以提供本发明的化合物。前药可以仅在生物条件下在此类反应时变为活性的，或它们可以以其未反应形式具有活性。在本发明中关注的前药的实例包括但不限于本文中所述的化合物(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)的类似物或衍生物，其包含可生物水解部分，如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸酯类似物。前药的其它实例包括包含-NO、-NO2、-ONO 或-ONO2 基团的本文中公开的任一式的化合物的衍生物。通常可以使用熟知方法，如由Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery(1995), 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff 编著, 第5 版)描述的那些方法制备前药。
[0049] 本文中所用的术语“溶剂化物”或“药学上可接受的溶剂化物”是一个或多个溶剂分子与本文中公开的化合物之一(例如，2-[2-吡啶-2-基)-乙氧基]-4-N'-(3-甲基-亚苄基)-肼基]-6-(吗啉-4-基)-嘧啶)结合所形成的溶剂化物。术语溶剂化物包括水合物(例如，半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物等等)。
[0050] 本文中所用的术语“类似物”指的是结构上类似于另一种但是在组成上略微不同的化合物(如一个原子被不同元素的原子替代，或存在特定官能团，或一个官能团被另一个官能团替代)。由此，类似物是在功能和外观方面而非在结构或来源方面类似于参照化合物或可与之相比的化合物。本文中所用的术语“衍生物”指的是具有共同的核心结构并被本文中所述的各种基团取代的化合物。
[0051] 治疗方法本发明提供了通过向个体施用治疗有效量的本发明的阿吡莫德组合物在需要其的个体中治疗癌症的方法，所述组合物包含阿吡莫德，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物、水合物、多晶型物、前药、类似物或衍生物。在一个实施方案中，所述阿吡莫德组合物包含阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德。本发明进一步提供了阿吡莫德组合物用于制备可用于治疗癌症的药物的用途。
[0052] 在一个实施方案中，所述癌症是脑癌、胶质瘤、肉瘤、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、阑尾癌、泌尿生殖系统癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸癌、阴茎癌、宫颈癌、卵巢癌、希-林病(von Hippel Lindau disease)、头颈部癌、胃肠癌、肝细胞癌、胆囊癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、神经内分泌肿瘤、甲状腺肿瘤、垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、恶性血液肿瘤或白血病。
[0053] 在一个实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一个实施方案中，所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述B细胞淋巴瘤选自霍奇金B细胞淋巴瘤和非霍奇金B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述B细胞淋巴瘤是选自DLBCL、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤(MZL)或黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤(与慢性淋巴细胞性白血病重叠)和套细胞淋巴瘤的非霍奇金B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述B细胞淋巴瘤是选自伯基特淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(其可以表现为瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia))、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、富于T 细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫性大B细胞淋巴瘤、腿型(原发性皮肤DLBCL，腿型)、老年人的EBV 阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、与炎症相关的弥漫性大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤和浆母细胞性淋巴瘤的非霍奇金B细胞淋巴瘤。
[0054] 在一个实施方案中，所述癌症是淋巴瘤，其选自DLBCL、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤(MZL)、CLL/SLL(慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤)和套细胞淋巴瘤。
[0055] 在一个实施方案中，该方法是用于在需要其的个体中治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治疗方案。在一个实施方案中，所述方法包括对所述个体施用每日量的阿吡莫德组合物，所述每日量的阿吡莫德组合物有效抑制所述个体的癌细胞中的细胞PIKfyve活性。在一个实施方案中，阿吡莫德组合物以如下方案施用：所述方案由至少1天施用包含阿吡莫德的组合物，然后至少1个连续日不施用包含阿吡莫德的组合物组成。在一个实施方案中，施用步骤在2至10个周期或2至5个周期中进行。在一个实施方案中，周期由1至10个连续日施用组合物，然后1至5个连续日不施用组合物组成。在一个实施方案中，周期由2至5个连续日施用组合物，然后1至2个连续日不施用组合物组成。在一个实施方案中，周期由5个连续日施用组合物，然后2个连续日不施用组合物组成。
[0056] 在一个实施方案中，所述方法包含或由下列组成：在28天的周期中用阿吡莫德治疗5天，然后停止治疗2天达1至2个月、1至3个月、1至4个月、1至5个月、1至6个月或6至12个月的时间段。
[0057] 根据这些实施方案中的任一个，阿吡莫德组合物可以包含阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德。在一个实施方案中，NHL是滤泡性淋巴瘤。在一个实施方案中，NHL是套细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，NHL是伯基特淋巴瘤。在一个实施方案中，NHL是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、纵隔B细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，NHL是DLBCL。在一个实施方案中，DLBCL是顽固的。在一个实施方案中，顽固性DLBCL是DLBCL-ABC或DLBCL-GCB。在一个实施方案中，顽固性DLBCL含有双重myc/bcl2易位(“双重打击DLBCL”)。在一个实施方案中，DLBCL对于标准CHOP治疗是顽固的。
[0058] 联合疗法本发明还提供了包含联合疗法的方法。本文中所用的“联合疗法”或“综合疗法”包括施用治疗有效量的阿吡莫德组合物与至少一种附加活性剂，作为意在由阿吡莫德组合物与附加活性剂的共同作用提供有益效果的特定治疗方案的一部分。“联合疗法”并非意在涵盖施用两种或更多种治疗化合物作为单独的单一疗法方案的一部分，其附带和任意地导致并未设想或预测的有益效果。
[0059] 在一个实施方案中，所述方法是使用包含阿吡莫德组合物和用于治疗癌症的化疗方案的联合疗法来治疗癌症的方法。在一个实施方案中，所述化疗方案是CHOP 方案。CHOP 指的是通常用于治疗非霍奇金淋巴瘤的方案，由以下活性剂组成：环磷酰胺((C)yclophosphamide)，一种通过与DNA 结合并导致形成交联来破坏DNA 的烷化剂；羟基柔红霉素((H)ydroxydaunorubicin，也称为多柔比星或阿霉素)，一种通过在DNA 碱基之间插入其本身来破坏DNA 的嵌入剂；长春新碱((O)ncovin, vincristine)，其通过与蛋白质微管蛋白结合来防止细胞复制；和泼尼松((P)rednisone)或泼尼松龙((P)rednisolone)，其是皮质类固醇。在另一实施方案中，该化疗方案选自COOP(环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸甲基苄肼、泼尼松)、CVP(环磷酰胺、硫酸长春新碱、泼尼松)、EPOCH(依托泊苷、泼尼松、硫酸长春新碱、环磷酰胺、盐酸多柔比星)、Hyper-CVAD(环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸多柔比星、地塞米松)、ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)、R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、硫酸长春新碱、盐酸甲基苄肼、泼尼松)和R-CVP(利妥昔单抗、环磷酰胺、硫酸长春新碱、泼尼松)。
[0060] 所述至少一种附加活性剂可以是治疗剂，例如抗癌剂或癌症化疗剂，或非治疗剂及其组合。对于治疗剂，该组合的有益效果包括但不限于治疗活性化合物的组合所产生的药代动力学或药效学共同作用。对于非治疗剂，该组合的有益效果可以涉及减轻与组合中的治疗活性剂相关的毒性、副作用或不良事件。
[0061] 在一个实施方案中，所述至少一种附加剂是缓解阿吡莫德组合物的一种或多种副作用的非治疗剂，所述一种或多种副作用选自恶心、呕吐、头痛、头晕(dizziness)、眩晕(lightheadedness)、嗜睡和压力中的任一种。在该实施方案的一个方面，该非治疗剂是血清素受体(也称为5-羟色胺受体或5-HT 受体)的拮抗剂。在一方面，所述非治疗剂是5-HT3 或5-HT1a 受体的拮抗剂。在一方面，所述非治疗剂选自昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼和帕洛诺司琼。在另一方面，所述非治疗剂选自吲哚洛尔和利培酮。
[0062] 在一个实施方案中，所述至少一种附加剂是治疗剂。在一个实施方案中，所述治疗剂是抗癌剂。在一个实施方案中，所述抗癌剂是依鲁替尼。在一个实施方案中，阿吡莫德组合物与依鲁替尼一起在单一剂型中或在分开的剂型中施用。在一个实施方案中，所述剂型是口服剂型。在另一实施方案中，所述剂型适于静脉内施用。
[0063] 在一个实施方案中，所述抗癌剂是批准用于治疗淋巴瘤的药物。此类药物的非限制性实例包括abitrexate(甲氨蝶呤) 、adcetris (brentuximab vedotin) 、ambochlorin (苯丁酸氮芥) 、amboclorin (chloramucil) 、arranon (奈拉滨)、becenum (卡莫司汀)、beleodaq (贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、bexxar (托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗)、BiCNU (卡莫司汀)、blenoxane (博来霉素)、博来霉素、硼替佐米、brentuximab vedotin、carmubris (卡莫司汀)、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、clafen (环磷酰胺)、环磷酰胺、cytoxan (环磷酰胺)、地尼白介素-毒素连接物、DepoCyt (阿糖胞苷脂质体)、盐酸多柔比星、folex (甲氨蝶呤)、folotyn (普拉曲沙)、替伊莫单抗、依鲁替尼、艾代拉里斯 (idelalisib)、imbruvica (依鲁替尼)、甘乐能 (重组干扰素α-2b)、istodax (罗米地辛)、来那度胺、瘤可宁(苯丁酸氮芥)、linfolizin (苯丁酸氮芥)、阿糖胞苷脂质体、盐酸氮芥、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、mexate (甲氨蝶呤)、mexate–AQ (甲氨蝶呤)、mozobil (普乐沙福)、mustargen (盐酸氮芥)、奈拉滨、neosar (环磷酰胺)、昂他克(地尼白介素-毒素连接物)、普乐沙福、普拉曲沙、泼尼松、重组干扰素α-2b、revlimid (来那度胺)、美罗华(利妥昔单抗)、利妥昔单抗、罗米地辛、托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗、treanda (盐酸苯达莫司汀)、velban (硫酸长春碱)、万珂 (硼替佐米)、velsar (硫酸长春碱)、硫酸长春碱、vincasar PFS (硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、伏立诺他、zevalin (替伊莫单抗)、zolinza (伏立诺他)和zydelig (艾代拉里斯)。
[0064] 在一个实施方案中，所述抗癌剂选自EZH2的抑制剂，例如EPZ-6438。在一个实施方案中，所述抗癌剂选自紫杉酚、长春新碱、多柔比星、坦罗莫司、卡铂、奥法木单抗、利妥昔单抗及其组合。
[0065] 在一个实施方案中，所述至少一种附加剂是B细胞受体通路抑制剂。在一些实施方案中，所述B细胞受体通路抑制剂是CD79A 抑制剂、CD79B 抑制剂、CD 19 抑制剂、Lyn 抑制剂、Syk 抑制剂、PI3K抑制剂、Blnk 抑制剂、PLCy 抑制剂、PKCP 抑制剂或其组合。在一些实施方案中，所述至少一种附加剂是抗体、B细胞受体信号转导抑制剂、PI3K 抑制剂、IAP 抑制剂、mTOR抑制剂、放射免疫治疗剂、DNA 损伤剂、蛋白酶体抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、hedgehog 抑制剂、Hsp90 抑制剂、端粒酶抑制剂、Jakl/2 抑制剂、蛋白酶抑制剂、PKC 抑制剂、PARP 抑制剂或其组合。
[0066] 在一个实施方案中，所述至少一种附加剂选自苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、多柔比星、美沙拉秦、沙利度胺、来那度胺、坦罗莫司、依维莫司、氟达拉滨、fostamatinib、紫杉醇、多西他赛、奥法木单抗、利妥昔单抗、地塞米松、泼尼松、CAL-101、替伊莫单抗、托西莫单抗、硼替佐米、喷司他丁、内皮抑素或其组合。
[0067] 在一个实施方案中，所述至少一种附加剂是单克隆抗体，诸如，例如阿仑珠单抗、贝伐珠单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、依决可单抗、吉姆单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、阿达木单抗、阿非莫单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、卡那奴单抗、达克珠单抗、美泊利单抗、托珠单抗、优特克单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿仑珠单抗、抗CD30 单克隆抗体Xmab2513、抗MET 单克隆抗体MetMab、阿泊珠单抗、apomab、阿西莫单抗、巴利昔单抗、双特异性抗体2B1、兰妥莫单抗、brentuximab vedotin、卡罗单抗喷地肽、西妥木单抗、claudiximab、可那木单抗、达西珠单抗、地舒单抗、依库珠单抗、依帕珠单抗、厄马索单抗、达珠单抗、芬妥木单抗(figitumumab)、夫苏木单抗(fresolimumab)、加利昔单抗、ganitumab、吉妥珠单抗奥佐米星、glembatumumab、替伊莫单抗、依珠单抗奥佐米星、伊匹木单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、米拉珠单抗、单克隆抗体CC49、奈昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗、奥法木单抗、奥戈伏单抗、帕妥珠单抗、ramacurimab、雷珠单抗、希普利珠单抗、sonepcizumab、他尼珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲美木单抗(tremelimumab)、西莫白介素单抗、维妥珠单抗、维西珠单抗、伏洛昔单抗和扎鲁木单抗。
[0068] 在联合疗法的情况下，阿吡莫德组合物的施用可以与一种或多种附加活性剂的施用同时或相继进行。在另一实施方案中，联合疗法的不同组分的施用可以以不同的频率进行。所述一种或多种附加剂可以在施用本发明的化合物之前(例如，之前5 分钟、15 分钟、30 分钟、45 分钟、1 小时、2 小时、4 小时、6 小时、12 小时、24 小时、48 小时、72 小时、
96 小时、1 周、2 周、3 周、4 周、5 周、6 周、8 周或12 周)、同时或之后(例如，之后5 分钟、15 分钟、30 分钟、45 分钟、1 小时、2 小时、4 小时、6 小时、12 小时、24 小时、48 小时、72 小时、96 小时、1 周、2 周、3 周、4 周、5 周、6 周、8 周或12 周)施用。
96 小时、1 周、2 周、3 周、4 周、5 周、6 周、8 周或12 周)、同时或之后(例如，之后5 分钟、15 分钟、30 分钟、45 分钟、1 小时、2 小时、4 小时、6 小时、12 小时、24 小时、48 小时、72 小时、96 小时、1 周、2 周、3 周、4 周、5 周、6 周、8 周或12 周)施用。
[0069] 所述一种或多种附加活性剂可以配制用于与阿吡莫德组合物一起在单一剂型中共同施用，如本文中更详细地描述的。所述一种或多种附加活性剂可以与包含本发明的化合物的剂型分开施用。当该附加活性剂与阿吡莫德组合物分开施用时，其可以通过与阿吡莫德组合物相同或不同的途径施用。
[0070] 优选地，与一种或多种附加剂组合施用阿吡莫德组合物在受治疗的个体中提供协同响应。在这方面，术语“协同”指的是该组合的功效比任一单独的单一疗法的累加效应更有效。与该组合中至少一种药剂在该组合之外的其剂量和/或频率相比，根据本发明的联合疗法的协同效应可以允许使用更低的剂量和/或更低频率地施用所述药剂。该组合的附加有益效果可能表现为避免或减少与使用该组合中单独的任一疗法(也称为单一疗法)相关的不良或不想要的副作用。
[0071] “联合疗法”还包括与非药物疗法(例如手术或放射治疗)进一步组合施用本发明的化合物。当该联合疗法进一步包括非药物治疗时，所述非药物治疗可以在任何合适的时间进行，只要实现来自该治疗性化合物与非药物治疗的组合的共同作用的有益效果。例如，在适当的情况下，当从施用治疗性化合物中暂时(可能数天或甚至数周)移除非药物治疗时，仍实现该有益效果。
[0072] 该非药物治疗可以选自化疗、放射疗法、激素疗法、抗雌激素疗法、基因疗法和手术。例如，非药物疗法是除去卵巢(例如，为了降低身体中雌激素的水平)、胸腔穿刺术(例如，从胸部移除流体)、穿刺术(例如，从腹腔移除流体)、手术切除或收缩血管肌脂瘤、肺移植(并任选采用抗生素以防止移植造成的感染)、或氧疗法(例如，通过包含两个放置在两个鼻孔中的小塑料管或叉管的鼻插管，通过贴合在鼻子与嘴上的面罩，或通过经颈部前部插入气管的小管，也称为经气管氧疗法)。
[0073] 在本文中所述的方法的情况下，施用于个体的阿吡莫德组合物的量是治疗有效量。术语“治疗有效量”指的是足以治疗所治疾病或病症、改善其症状、减轻其严重程度或减少其持续时间，或增强或改善另一疗法的治疗效果，或足以在个体中表现出可检测的治疗效果的量。在一个实施方案中，阿吡莫德组合物的治疗有效量是有效抑制PIKfyve 激酶活性的量。
[0074] 阿吡莫德组合物的有效量可以为大约0.001 mg/kg至大约1000 mg/kg、大约0.01 mg/kg至大约100 mg/kg、大约10 mg/kg至大约250 mg/kg、大约0.1 mg/kg至大约15 mg/kg的范围；或其中该范围的下限为0.001 mg/kg至900 mg/kg之间的任意量且该范围的上限为0.1 mg/kg至1000 mg/kg之间的任意量的任何范围(例如，0.005 mg/kg至200 mg/kg、
0.5mg/kg至20 mg/kg)。如本领域技术人员所公认的，有效剂量还将根据治疗的疾病、施用途径、赋形剂使用、以及与其它治疗性治疗(如使用其它药剂)共同使用的可能性而变化。参见例如美国专利号7,863,270，其通过引用并入本文。
0.5mg/kg至20 mg/kg)。如本领域技术人员所公认的，有效剂量还将根据治疗的疾病、施用途径、赋形剂使用、以及与其它治疗性治疗(如使用其它药剂)共同使用的可能性而变化。参见例如美国专利号7,863,270，其通过引用并入本文。
[0075] 在更具体的方面，以30-1000 mg/天(例如30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275 或300 mg/天)的剂量方案施用阿吡莫德组合物至少1周(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、36、48 或更多周)。优选地，阿吡莫德组合物以100-1000 mg/天的剂量方案施用4或16 周。替代地或随后地，阿吡莫德组合物以每天两次100 mg-300mg的剂量方案施用8 周，或任选52 周。替代地或随后地，阿吡莫德组合物以每天两次50 mg-1000 mg的剂量方案施用8 周，或任选52 周。
[0076] 有效量的阿吡莫德组合物可以每天一次、或每天两次、或每天两次至五次、每天最多两次或最多三次，或每天最多八次施用。在一个实施方案中，所述阿吡莫德组合物每天三次、每天两次、每天一次施用，在3 周周期中施用十四天(每天四次、每天三次或每天两次、或每天一次)和停药7 天，在3 周周期中最多施用五天或七天(每天四次、每天三次或每天两次、或每天一次)和停药14-16 天，或每两天一次，或一周一次，或每两周一次，或每三周一次。
[0077] 在一个实施方案中，阿吡莫德组合物每天一次或两次以5天施用、2天停药的方案在28天的周期中施用达一定时间段，所述时间段为1-2个月、1-3个月、1-4个月、1-5个月、1-6个月或6-12个月。
[0078] 按照本文中所述的方法，“需要的个体”是患有疾病、病症或疾病状态的个体，或相对于大多数人具有提高的发展疾病、病症或疾病状态的风险的个体。需要其的个体可以是对疾病或病症(例如癌症)的现有可利用的疗法“无响应”或“顽固”的个体。在这方面，术语“无响应”和“顽固”指的是个体对治疗的响应在临床上不足以缓解与该疾病或病症相关的一种或多种症状。在此处描述的方法的一个方面，需要其的个体是患有癌症的个体，其癌症对于标准疗法是顽固的，或者其癌症在标准治疗后复发。
[0079] “个体”包括哺乳动物。哺乳动物可以是例如任何哺乳动物，例如人、灵长类动物、脊椎动物、鸟、小鼠、大鼠、家禽、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。优选地，该哺乳动物是人。术语“患者”指的是人类个体。
[0080] 本发明还提供了用于治疗本文中所述的疾病、病症或疾病状态的单一疗法。本文中所用的“单一疗法”指的是向需要其的个体施用单一的活性或治疗性化合物。
[0081] 本文中所用的“治疗”(“treatment”、“treating”或“treat”)描述了为了抗击疾病、疾病状态或病症的目的对患者进行的管理和护理，并包括施用阿吡莫德组合物以缓解疾病、疾病状态或病症的症状或并发症，或消除该疾病、疾病状态或病症。
[0082] 本文中所用的“预防/防止”(“prevention”、“preventing”或“prevent”)描述了减少或消除疾病、疾病状态或病症的症状或并发症的发作，并包括施用阿吡莫德组合物以减少疾病、疾病状态或病症的症状的发作、发展或复发。
[0083] 在一个实施方案中，施用阿吡莫德组合物导致消除了所治疗的疾病或病症的症状或并发症，但是，消除并不是必须的。在一个实施方案中，降低了所述症状的严重程度。在癌症的情况下，此类症状可以包括严重程度或进展的临床指标，包括肿瘤分泌生长因子、降解细胞外基质、变得血管化、丧失对并置组织(juxtaposed tissue)的粘附、或转移的程度，以及转移灶的数量。
[0084] 根据本文中所述的方法治疗癌症可以导致肿瘤尺寸的减小。肿瘤尺寸的减小也可被称为“肿瘤消退”。优选地，在治疗后，肿瘤尺寸相对于其治疗前的尺寸减小5%或更多；更优选地，肿瘤尺寸减小10%或更多；更优选地，减小20%或更多；更优选地，减小30%或更多；更优选地，减小40%或更多；甚至更优选地，减小50%或更多；且最优选地，减小超过75%或更多。肿瘤的尺寸可以通过任何可再现的测量手段来测量。可以以肿瘤直径的形式来测量肿瘤的尺寸。
[0085] 根据本文中所述的方法治疗癌症可以导致肿瘤体积的减小。优选地，在治疗后，肿瘤体积相对于其治疗前的尺寸减小5%或更多；更优选地，肿瘤体积减小10%或更多；更优选地，减小20%或更多；更优选地，减小30%或更多；更优选地，减小40%或更多；甚至更优选地，减小50%或更多；且最优选地，减小超过75%或更多。肿瘤体积可以通过任何可再现的测量手段来测量。
[0086] 根据本文中所述的方法治疗癌症可以导致肿瘤数量的降低。优选地，在治疗后，肿瘤数量相对于治疗前的数量减少5%或更多；更优选地，肿瘤数量减少10%或更多；更优选地，减少20%或更多；更优选地，减少30%或更多；更优选地，减少40%或更多；甚至更优选地，减少50%或更多；且最优选地，减少超过75%。肿瘤数量可以通过任何可再现的测量手段来测量。
肿瘤的数量可以通过计数肉眼可见或在规定放大倍数下可见的肿瘤来测量。所述规定放大倍数优选为2x、3x、4x、5x、10x或50x。
肿瘤的数量可以通过计数肉眼可见或在规定放大倍数下可见的肿瘤来测量。所述规定放大倍数优选为2x、3x、4x、5x、10x或50x。
[0087] 根据本文中所述的方法治疗癌症可以导致在远离肿瘤原发部位的其它组织或器官中转移病灶数量的降低。优选地，在治疗后，转移病灶的数量相对于治疗前的数量减少5%或更多；更优选地，转移病灶的数量减少10%或更多；更优选地，减少20%或更多；更优选地，减少30%或更多；更优选地，减少40%或更多；甚至更优选地，减少50%或更多；且最优选地，减少超过75%。转移病灶的数量可以通过任何可再现的测量手段来测量。转移病灶的数量可以通过计数肉眼可见或在规定放大倍数下可见的转移病灶来测量。所述规定放大倍数优选为2x、3x、4x、5x、10x或50x。
[0088] 本文中所用的术语“选择性”指的是倾向于在一个群体中比在另一群体中更频繁发生。对比群体可以是细胞群体。优选地，本文中所述的阿吡莫德组合物与正常细胞相比选择性作用于过度增殖细胞或不正常增殖细胞。本文中所用的“正常细胞”是不能被归类为“细胞增殖性病症”的部分的细胞。正常细胞缺乏失调或不正常的生长或两者，这可导致不希望的疾病状态或疾病的发展。优选地，正常细胞具有功能正常的细胞周期检查点控制机制。优选地，阿吡莫德组合物选择性作用以调节一种分子靶(例如，靶激酶)，但是不显著调节另一分子靶(例如，非靶激酶)。本发明还提供了选择性抑制酶(如激酶)的活性的方法。优选地，如果一事件在群体A中与群体B相比以大于两倍的更高频率发生，该事件在群体A中相对于群体B选择性发生。如果一事件在群体A中以大于五倍的更高频率发生，该事件选择性发生。如果与群体B相比，一事件在群体A中以大于十倍的更高频率发生；更优选地，大于五十倍；甚至更优选地，大于100 倍；且最优选地，大于1000 倍的更高频率在群体A中发生，该事件选择性发生。例如，如果细胞死亡在病变或过度增殖细胞中与正常细胞相比以大于两倍的频率发生，细胞死亡将被称作在病变或过度增殖细胞中选择性发生。
[0089] 药物组合物和制剂本发明提供为优选适合用于哺乳动物，优选人类的药学上可接受的组合物的阿吡莫德组合物。在这方面，该组合物可以进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，其中其量对于治疗疾病或病症有效。在一个实施方案中，所述疾病或病症是癌症，优选淋巴瘤，且最优选B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述疾病或病症是mTOR疾病或病症。
[0090] 在一个实施方案中，所述阿吡莫德组合物包含阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德。
[0091] 在一个实施方案中，所述阿吡莫德组合物与至少一种附加活性剂在单一剂型中组合。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含抗氧化剂。
[0092] 在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂选自烷化剂、嵌入剂、微管蛋白结合剂、皮质类固醇及其组合。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选自依鲁替尼、利妥昔单抗、多柔比星、泼尼松龙、长春新碱、万珂和依维莫司及其组合的治疗剂。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选自环磷酰胺、羟基柔红霉素(也称为多柔比星或Adriamycin™ )、长春新碱(也称为Oncovin™ )、泼尼松、泼尼松龙及其组合的治疗剂。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂是选择以改善该阿吡莫德组合物的一种或多种副作用的非治疗剂。在一个实施方案中，所述非治疗剂选自昂丹司琼、格拉司琼、多拉司琼和帕洛诺司琼。在一个实施方案中，所述非治疗剂选自吲哚洛尔和利培酮。
[0093] 在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂选自mTOR通路的抑制剂、PI3K抑制剂、双重PI3K/mTOR抑制剂、SRC抑制剂、VEGF抑制剂、Janus激酶(JAK)抑制剂、Raf抑制剂、Erk抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、抗有丝分裂剂、多重耐药外排抑制剂、抗生素和治疗性抗体。在一个实施方案中，所述至少一种附加活性剂选自法尼基转移酶抑制剂(例如替吡法尼)、抗有丝分裂剂(例如多西他赛)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(例如伏立诺他)和多重耐药外排抑制剂。
[0094] 在一个实施方案中，所述抗有丝分裂剂选自灰黄霉素、酒石酸长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛、长春新碱、长春碱、埃博霉素A、埃博霉素B 、ABT-751、CYT997 (Lexibulin) 、酒石酸长春氟宁、Fosbretabulin、GSK461364、ON-01910 (Rigosertib)、Ro3280、BI2536、NMS-P937、BI 6727 (Volasertib)、HMN-214 和MLN0905。
[0095] 在一个实施方案中，聚醚抗生素选自莫能菌素、尼日利亚菌素、缬氨霉素、盐霉素的钠盐。
[0096] “药物组合物”是适于施用于个体的含有药学上可接受形式的本文中所述的化合物的制剂。本文中所用的短语“药学上可接受的”指的是在合理的医学判断范围内适于与人类和动物的组织接触使用而不具有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、载体和/或剂型。
[0097] “药学上可接受的赋形剂”指的是可用于制备药物组合物的赋形剂，其通常是安全、无毒且既非生物学上也非在其它方面不合意的，并包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例包括但不限于无菌液体、水、缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等等)、油、洗涤剂、悬浮剂、碳水化合物(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白或其合适的混合物。
[0098] 药物组合物可以以散装或以剂量单位形式提供。为了便于施用和剂量的均匀性，尤其有利的是以剂量单位形式配制药物组合物。本文中所用的术语“剂量单位形式”指的是适于作为用于待治疗的个体的单一剂量的物理上分离的单位；各单位含有计算以与所需药物载体结合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果决定并直接取决于此。剂量单位形式可以是安瓿、小瓶、栓剂、糖衣丸、片剂、胶囊、IV 袋、或在气溶胶吸入器上的单一泵。
[0099] 在治疗应用中，在影响所选剂量的其它因素中，该剂量根据药剂、受体患者的年龄、重量和临床状况、以及施用该疗法的临床医生或医师的经验与判断而不同。通常，该剂量应当为治疗有效量。剂量可以以mg/kg/天的测量单位来提供(该剂量可以针对患者的重量(以kg计)、体表面积(以m2计)和年龄(以岁计)来进行调节)。药物组合物的有效量是提供由临床医生或其他合格的观察者所注意到的客观上可鉴定的改善的量。例如，缓解病症、疾病或疾病状态的症状。本文中所用的术语“剂量有效方式”指的是在个体或细胞中产生所需生物效应的药物组合物的量。
[0100] 例如，该剂量单位形式可以包含1 ng至2 mg、或0.1 mg至2 g；或10 mg至1 g，或50 mg至500 mg，或1 μg至20 mg；或1 μg至10 mg；或0.1 mg至2 mg。
[0101] 在一个实施方案中，单位剂型包含25、50、75、100、200或300 mg活性药物成分，例如阿吡莫德游离碱或二甲磺酸阿吡莫德。在一个实施方案中，单位剂型是用于口服递送的片剂或胶囊的形式。
[0102] 该药物组合物可以采取任何合适的形式(例如液体、气溶胶、溶液、吸入剂、雾、喷雾；或固体、粉末、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、贴剂等等)用于通过任何所需途径(例如经肺、吸入、鼻内、口服、含服、舌下、胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、胸膜内、鞘内、透皮、透粘膜、直肠等等)施用。例如，本发明的药物组合物可以是用于通过吸入或吹入(经口或鼻)的气溶胶施用的水溶液或粉末形式、用于口服施用的片剂或胶囊形式、适于通过直接注射或通过添加到用于静脉内输注的无菌输注液中来施用的无菌水溶液或分散体形式；或用于透皮或透粘膜施用的洗剂、乳膏、泡沫、贴剂、混悬剂、溶液或栓剂的形式。
[0103] 药物组合物可以是口服可接受的剂型的形式，包括但不限于胶囊、片剂、含服形式、糖锭(troche)、锭剂(lozenge)和乳液、水性混悬剂、分散体或溶液形式的口服液。胶囊可以含有本发明的化合物与惰性填料和/或稀释剂如药学上可接受的淀粉(例如，玉米、马铃薯或木薯淀粉)、糖、人造甜味剂、粉末状纤维素如结晶纤维素和微晶纤维素、面粉、明胶、树胶等等的混合物。在用于口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。也可以加入润滑剂如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服施用，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服施用水性混悬剂和/或乳液时，本发明的化合物可以悬浮或溶解在油相中，其与乳化剂和/或悬浮剂组合。如果需要的话，可以加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。
[0104] 药物组合物可以为片剂形式。该片剂可以包含单位剂量的本发明的化合物以及惰性稀释剂或载体如糖或糖醇，例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇或甘露糖醇。该片剂可以进一步包含非糖衍生的稀释剂如碳酸钠、磷酸钙、碳酸钙或纤维素或其衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素，以及淀粉如玉米淀粉。该片剂可以进一步包含粘合剂和造粒剂如聚乙烯吡咯烷酮、崩解剂(例如可溶胀的交联聚合物，如交联的羧甲基纤维素)、润滑剂(例如硬脂酸盐)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)、抗氧化剂(例如BHT)、缓冲剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)和泡腾剂如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物。
[0105] 该片剂可以是包衣片剂。该包衣可以是保护膜包衣(例如蜡或清漆)或设计为控制活性剂释放的包衣，例如延迟释放(在摄取后预定滞后时间后释放活性物)或在胃肠道中的特定位置处释放。后者可以例如使用肠溶膜包衣(如以商品名Eudragit®出售的那些)来实现。
[0106] 片剂制剂可以通过常规压缩、湿法造粒或干法造粒方法，并使用药学上可接受的稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、表面改性剂(包括表面活性剂)、悬浮剂或稳定剂来制造，所述试剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、月桂基硫酸钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钙、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、藻酸、阿拉伯树胶、黄原胶、柠檬酸钠、复合硅酸盐、碳酸钙、甘氨酸、糊精、蔗糖、山梨糖醇、磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、高岭土、甘露糖醇、氯化钠、滑石、干淀粉和糖粉。优选的表面改性剂包括非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性实例包括但不限于泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、鲸蜡硬脂醇、聚西托醇乳化蜡、脱水山梨糖醇酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸镁铝和三乙醇胺。
[0107] 药物组合物可以为硬或软明胶胶囊形式。按照该制剂，本发明的化合物可以为固体、半固体或液体形式。
[0108] 药物组合物可以为适于胃肠外施用的无菌水溶液或分散体形式。本文中所用的术语胃肠外包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
[0109] 药物组合物可以为适于通过直接注射或通过添加到用于静脉内输注的无菌输注液来施用的无菌水溶液或分散体的形式，并包含溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)，其合适的混合物，或一种或多种植物油。游离碱或药理学上可接受的盐形式的本发明的化合物的溶液或混悬剂可以在适当地混有表面活性剂的水中制备。下面给出合适的表面活性剂的实例。还可以例如在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散体。
[0110] 除了存在于该制剂中的任何载体或稀释剂(如乳糖或甘露糖醇)之外，用于本发明的方法的药物组合物可以进一步包含一种或多种添加剂。所述一种或多种添加剂可以包含一种或多种表面活性剂或由一种或多种表面活性剂组成。表面活性剂通常具有一个或多个长脂族链如脂肪酸，这使其能够直接插入细胞的脂质结构以增强药物渗透和吸收。通常用于表征表面活性剂的相对亲水性和疏水性的经验参数是亲水亲油平衡值(“HLB”值)。具有较低HLB值的表面活性剂更疏水，且在油中具有更大的溶解度，而具有较高HLB值的表面活性剂更亲水，且在水溶液中具有更大的溶解度。由此，亲水性表面活性剂通常被认为是具有大于大约10 的HLB值的那些化合物，且疏水性表面活性剂通常是具有小于大约10 的HLB值的那些。但是，这些HLB值仅仅是指导，因为对于许多表面活性剂来说，根据选择用于测定HLB值的经验方法，该HLB值可以相差多达大约8个HLB单位。
[0111] 在用于本发明的组合物的表面活性剂中有聚乙二醇(PEG)-脂肪酸和PEG-脂肪酸单酯和二酯、PEG甘油酯、醇-油酯交换产物、聚甘油脂肪酸、丙二醇脂肪酸酯、甾醇和甾醇衍生物、聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚、糖及其衍生物、聚乙二醇烷基酚、聚氧乙烯-聚氧丙烯(POE-POP)嵌段共聚物、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、离子表面活性剂、脂溶性维生素及其盐、水溶性维生素及其两亲性衍生物、氨基酸及其盐、以及有机酸及其酯和酐。
[0112] 本发明还提供包含用于本发明方法的药物组合物的包装和试剂盒。该试剂盒可以包含一种或多种选自瓶、小瓶、安瓿、泡罩包装和注射器的容器。该试剂盒可以进一步包括用于治疗和/或预防本发明的疾病、疾病状态或病症的一个或多个说明、一个或多个注射器、一个或多个涂敷器、或适于重构本发明的药物组合物的无菌溶液。
[0113] 本文中使用的所有百分比和比率除非另行说明均按重量计。本发明的其它特征和优点由不同实施例显而易见。提供的实施例说明了可用于实践本发明的不同组分和方法。所述实施例不限制要求保护的发明。基于本公开，本领域技术人员可以确定和采用可用于实践本发明的其它组分和方法。
实施例
实施例
[0114] 实施例1: 阿吡莫德是癌细胞中的高选择性细胞毒性剂在高通量细胞活力筛选中使用TSC2-/-小鼠胚胎成纤维细胞(TSC2-/- MEF)细胞鉴定阿吡莫德，所述TSC2-/-小鼠胚胎成纤维细胞以组成性升高的mTOR信号转导活性为特征。简而言之，将测试化合物(5 µl储备溶液，6x所需的最终孔浓度)分配到384孔测定板中，将TSC2-/- MEF细胞(1000个细胞每孔，在25μL培养基中)加入到板中，并将板在37℃，5％CO2的气氛下在潮湿的培养箱中孵育72小时(3天)3天。根据制造商的说明用CellTiter-Glo®发光测定(Promega)测定细胞活力。活力表示为未处理的对照细胞的百分比。例如，对于阿吡莫德，MEF-EV细胞活力(平均值+/- StDev, n=3)为 2.16 +/- 0.36% @ 0.5 µM和1.94 +/- 0.07% @ 5 µM。在10点剂量响应曲线中，阿吡莫德抑制细胞活力，对于测试的TSC2-/- MEF细胞IC50为19.5 nM(图1)。我们接下来在其他癌细胞系上测试了阿吡莫德，包括B细胞淋巴瘤(SUDHL-10)、神经胶质瘤(H4)和结直肠癌(HCT116)以及源自脾、肺和结肠的非癌(正常)细胞系。在这些细胞活力测定中，阿吡莫德是癌细胞的高选择性细胞活力抑制剂，与非癌(正常)细胞相比，如其高得多的IC50值所证明的，其范围为癌细胞的IC50值的20-200倍。
这些结果如图1B所示。
这些结果如图1B所示。
[0115] 使用代表24个肿瘤类型的122种人癌细胞系在3天CellTiterGlo™测定中进一步评估阿吡莫德的细胞毒活性。在该3天测定中，如果IC50小于500 nM，则细胞系被称为阿吡莫德敏感的。在该测定中鉴定了35种细胞系对阿吡莫德诱导的细胞毒性敏感。阿吡莫德敏感细胞包括源自几种不同癌症的细胞，包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、结直肠癌和肺癌。测试的那些中最敏感的是非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞系。稍多于50％的测试的NHL细胞系对阿吡莫德敏感，某些NHL亚型对阿吡莫德极其敏感，IC50值小于100 nM (与筛选中的敏感/不敏感的临界值相比，其为500 nM)。这些包括人伯基特淋巴瘤(ST486)、人套细胞淋巴瘤(JeKo-1)和人DLBCL (SUDHL-4, IC50 = 50 nM)。在该测定中不敏感的唯一NHL亚型是滤泡性。DLBCL-GCB和-ABC亚型均是阿吡莫德敏感的，这表明阿吡莫德可对许多NHL癌症有效，包括常常对标准治疗顽固的更具侵袭性的亚型。
[0116] NHL代表一组多种多样的不同严重程度的造血系统恶性肿瘤，其亚型范围从缓慢生长到侵袭性。NHL的亚型包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和滤泡性B细胞淋巴瘤。基于基因表达和细胞来源，DLBCL被分为两个亚型，GCB和ABC。GCB是生发中心B细胞类型，由正常生发中心B细胞产生，ABC是活化的B细胞类型，由分化为浆细胞的过程中的生发中心后B细胞产生。
[0117] 我们接下来在更长的细胞活力测定中测试了阿吡莫德，并比较了在第3、5和7天测试的细胞的敏感度。所有细胞系的敏感度随着暴露于阿吡莫德的时间的增加而增加，暴露7天的IC50小于125 nM。这在图2A中针对HCT116结直肠癌细胞举例说明。不同的NHL亚型在7天测定中也各自显示对阿吡莫德的敏感度增加(IC50 < 125 nM) (图2B)。并且所有NHL亚型在该测定中都敏感，包括套细胞、滤泡性、伯基特、DLBCL-ABC、DLBCL-GCB和双重打击DLBCL。值得注意的是，代表侵袭性淋巴瘤的所有细胞系都是敏感的，包括具有双重myc/bcl2易位的那些(“双重打击DLBCL”)以及套细胞淋巴瘤。总体而言，测试的32种NHL细胞系中有72％对阿吡莫德敏感，平均IC50值为69 nM，与非癌(正常)细胞的15.8微摩尔(uM)相比。
[0118] 实施例2: 阿吡莫德与CHOP 的组分协同作用如上所讨论的，NHL 细胞在我们的癌细胞系筛选中表现出对阿吡莫德特别敏感。DLBCL是NHL 的最常见类型，在西方国家占淋巴瘤的30-40%。DLBCL是成熟B细胞的侵袭性肿瘤。所有DLBCL患者的大约40%在一线治疗后复发。许多顽固性DLBCL-GCB 癌症表现出MYC 与BCL2 的单和双易位。具有这些遗传性变型的患者往往具有较差的预后，至少部分归因于MYC 与BCL2 的过度表达。值得注意的是，甚至在表现这些易位的DLBCL-GCB细胞系中，阿吡莫德也是有效的(表2)，这支持了阿吡莫德(作为单一疗法单独或与标准治疗结合)在治疗NHL 的甚至侵袭性亚型中的作用。
[0119] 表2. B细胞淋巴瘤系的Bcl-2 和c-myc 易位状态以及它们对阿吡莫德的敏感度。ND =无数据
编号 B细胞淋巴瘤模型 细胞系 IC50 (nM) Bcl-2 C-myc
7 人DLBCL-GCB SUDHL-4 25 是 是
8 人DLBCL-GCB SUDHL-6 80 是 否
9 人DLBCL-GCB DB 150 否 否
10 人DLBCL-GCB Toledo 270 ND ND
11 人DLBCL-GCB SUDHL-10 20 是 是
12 人DLBCL-GCB WSU-DLCL2 160 是 否
13 人DLBCL-GCB OCI-Ly19 380 是 否
20 人DLBCL-GCB HT 642 ND ND
21 人DLBCL-GCB Pfeiffer 2,620 ND ND
编号 B细胞淋巴瘤模型 细胞系 IC50 (nM) Bcl-2 C-myc
7 人DLBCL-GCB SUDHL-4 25 是 是
8 人DLBCL-GCB SUDHL-6 80 是 否
9 人DLBCL-GCB DB 150 否 否
10 人DLBCL-GCB Toledo 270 ND ND
11 人DLBCL-GCB SUDHL-10 20 是 是
12 人DLBCL-GCB WSU-DLCL2 160 是 否
13 人DLBCL-GCB OCI-Ly19 380 是 否
20 人DLBCL-GCB HT 642 ND ND
21 人DLBCL-GCB Pfeiffer 2,620 ND ND
[0120] 当针对其他对NHL有活性的临床药剂进行体外测试时，阿吡莫德被证明是测试的最有效的药物之一(表3)。
[0121] 表3: 三天测定中阿吡莫德和各种化疗药物的IC50值的比较。药物 细胞靶标 IC50 (nM) SU-DHL-4 IC50 (nM) WSU-DLCL2
阿吡莫德 PIKfyve 23 54
依鲁替尼 BTK 718 747
艾代拉里斯 PI3Kd 2,034 6,154
EPZ-6438 EZH2 >20,000 >10,000
ABT-199 BCL-2 212 3,371
duvelisib PI3Kγ/δ 13 863
KPT-330 XPO1 93 165
阿吡莫德 PIKfyve 23 54
依鲁替尼 BTK 718 747
艾代拉里斯 PI3Kd 2,034 6,154
EPZ-6438 EZH2 >20,000 >10,000
ABT-199 BCL-2 212 3,371
duvelisib PI3Kγ/δ 13 863
KPT-330 XPO1 93 165
[0122] 为了进一步评价阿吡莫德对侵袭性NHL肿瘤的有效性，测试了阿吡莫德与多种化疗剂(包含用于许多此类癌症的标准一线治疗)的任意一种协同作用的能力。这些包括例如环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(称为“CHOP”化疗方案)，以及化疗剂万珂，其指示用于复发的套细胞淋巴瘤。
[0123] 对于协同作用研究，使用以下DLBCL-GCB细胞系：WSU-DLCL2、SUDHL-4 和SUDHL-6。将细胞以其最佳密度接种在96 孔板中。用单独的各药剂或与阿吡莫德的组合处理细胞。在使用CellTiterGlo®(Promega)评估增殖前，将细胞处理72 小时(3天)。为了计算协同作用，CalcuSyn(2.11 版, Biosoft)用于确定由Chou 等人, Adv. Enzyme. Regul. (1984)
22:27–55 定义的组合指数(CI)。由此，将产生>1 的CI 值的药物组合定义为拮抗性的，CI = 1 定义为累加性的，且CI < 1 定义为协同性的。
22:27–55 定义的组合指数(CI)。由此，将产生>1 的CI 值的药物组合定义为拮抗性的，CI = 1 定义为累加性的，且CI < 1 定义为协同性的。
[0124] 如表4 中所示，阿吡莫德在所有三种细胞系中显示了与所有受试药剂(环磷酰胺、多柔比星、泼尼松龙、长春新碱和万珂)的协同作用活性。这些结果表明，具有阿吡莫德的联合疗法代表了解决治疗未能满足的医疗需求的有希望的新方法，所述治疗有益于在标准化疗方案后复发或对于标准化疗方案顽固的患者。
[0125] 表4
[0126] 在DLBCL-GCB细胞系中阿吡莫德与CHOP 的个体组分、万珂或依维莫司的药物组合效果的总结。显示了为了产生分数效应(Fa)与CHOP(环磷酰胺(马磷酰胺, 20) = Maf;多柔比星= Dox;长春新碱= Vin;泼尼松龙= Pred)组分或万珂(Vel)组合的阿吡莫德(Apili)的浓度。组合指数(CI)用于确定组合效果，其中CI>1 是拮抗性的，CI = 1 是累加性的，且CI < 1 是协同性的，其中Fa > 0.75。
[0127] 实施例3: 阿吡莫德和依鲁替尼之间的协同活性依鲁替尼是靶向B细胞恶性肿瘤的FDA 批准的药物，并且指示用于治疗套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病的单一疗法。其也称为PCI-32765 并以商品名Imbruvica™ 销售。依鲁替尼是酶布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)的选择性和共价抑制剂。BTK 是至少三种平行发生的关键B细胞促生存机理(细胞凋亡、细胞粘附和细胞迁移与归巢的调节)的关键介导物。阿吡莫德与依鲁替尼的协同活性进一步表明阿吡莫德是有望用于与其它化疗剂(尤其是靶向B细胞淋巴瘤的那些)的联合疗法的药剂。与单独使用依鲁替尼或阿吡莫德相比，依鲁替尼在存在阿吡莫德的情况下显著降低了SUDHL-4细胞活力。参见图3。这个结果在另外两个测试的细胞系- WSU-DLCL2和SUDHL-6中得到证实。
[0128] 实施例4: 阿吡莫德在体内对DLBCL肿瘤的抗肿瘤活性接下来测试了单独或与依鲁替尼组合的阿吡莫德在体内抑制肿瘤生长的能力。如下所述，单独的阿吡莫德显著减少了肿瘤生长，并且阿吡莫德与依鲁替尼的组合提供了比任一单独药剂更大的生长抑制。
[0129] 该研究目的是临床前评估单独或与依鲁替尼组合的阿吡莫德在皮下SUDHL-6 人DLBCL癌症异种移植模型的治疗中的体内治疗效果。
[0130] 在第一组(arm)研究中，单独测试了阿吡莫德。在37℃下在5% CO2 的气氛中将SUDHL-6 细胞系保持在补充有10%胎牛血清和L-谷氨酰胺(2 mM)的RPMI-1640 培养基中。肿瘤细胞每周继代培养两次，并在指数生长期间收获用于肿瘤接种。将NOD-SCID 小鼠在接种前ƴ-辐照24 小时。用在0.1 ml的PBS 和Matrigel(1:1)中的SU-DHL-6 肿瘤细胞(5×
106)在右侧腹部皮下接种各小鼠。肿瘤随后生长至大约80-120 mm3 的平均尺寸，并随后将小鼠分成5 组并如表5中详述的那样进行处理。
106)在右侧腹部皮下接种各小鼠。肿瘤随后生长至大约80-120 mm3 的平均尺寸，并随后将小鼠分成5 组并如表5中详述的那样进行处理。
[0131] 表5：DLBCL肿瘤的异种移植模型组 处理 剂量 给药方案 施用途径 小鼠数量
1 媒介物(盐水) - QD×5 -2天停药-QDx5 i.v. 6
2 二甲磺酸阿吡莫德 67.5mg/kg(47mg/kg 游离碱) QD×5 -2天停药-QDx5 i.v. 6
3 0.5% 甲基纤维素 - BID×5 -2天停药-BIDx5 p.o. 6
4 阿吡莫德游离碱 75mg/kg BID×5 -2天停药-BIDx5 p.o. 6
5 阿吡莫德游离碱 150mg/kg QD×5 -2天停药-BIDx5 p.o. 6
1 媒介物(盐水) - QD×5 -2天停药-QDx5 i.v. 6
2 二甲磺酸阿吡莫德 67.5mg/kg(47mg/kg 游离碱) QD×5 -2天停药-QDx5 i.v. 6
3 0.5% 甲基纤维素 - BID×5 -2天停药-BIDx5 p.o. 6
4 阿吡莫德游离碱 75mg/kg BID×5 -2天停药-BIDx5 p.o. 6
5 阿吡莫德游离碱 150mg/kg QD×5 -2天停药-BIDx5 p.o. 6
[0132] 肿瘤尺寸用卡尺在两个维度上一周测量两次，且体积使用以下公式以mm3 表示：V = 0.5 a x b2 ，其中a 和b 分别是肿瘤的长径和短径。监测小鼠29 天，并在所有阿吡莫德处理组中观察到显著的生长抑制。静脉内施用将肿瘤尺寸减少58% (47 mg/kg)，且口服施用使生长减少68% (150 mg/kg分次剂量)或64% (150 mg/kg单剂量)，对体重影响可以忽略不计(参见图4)。由此，阿吡莫德的静脉内和口服施用在体内削弱SU-DHL-6 肿瘤生长方面表现出类似的功效。
[0133] 第二组研究在相同SUDHL-6 人DLBCL癌症异种移植模型中使用与上述相同的方案，评价了与依鲁替尼组合时阿吡莫德的功效。用在0.1 ml的PBS 和Matrigel(1:1)中的SU-DHL-6 肿瘤细胞(5×106)在右侧腹部皮下接种各小鼠。肿瘤随后生长至大约80-120 mm3 的平均尺寸，并随后将小鼠分成6 组并如表6中详述的那样进行处理。
[0134] 表6：SUDHL-6 细胞系异种移植实验组 处理 剂量 给药方案 施用途径 小鼠数量
1 媒介物 NA QDx5-2天停药-QDx5 p.o. + i.v. 6
2 阿吡莫德游离碱 75 mg/kg QDx5-2天停药-QDx5 p.o. 6
3 依鲁替尼 10 mg/kg QD×12 i.v. 6
4 依鲁替尼 20 mg/kg QD×12 i.v. 6
5 阿吡莫德游离碱 + 依鲁替尼 75 mg/kg + 10 mg/kg QDx5-2 天停药-QDx5 + QD×12 p.o. + i.v. 6
6 阿吡莫德游离碱 + 依鲁替尼 75 mg/kg + 20 mg/kg QDx5-2天停药-QDx5 + QD×12 p.o. + i.v. 6[0135] 肿瘤尺寸用卡尺在两个维度上一周测量两次，且体积使用以下公式以mm3 表示：V = 0.5 a x b2，其中a 和b 分别是肿瘤的长径和短径。监测小鼠31 天，并在75 mg/kg阿吡莫德(57%)、10 mg/kg依鲁替尼(54%)和20 mg/kg依鲁替尼(64%)处理组中观察到显著的生长抑制。75 mg/kg阿吡莫德与依鲁替尼的组合以剂量依赖性方式进一步降低了肿瘤生长；
10 mg/kg依鲁替尼(65%)和20 mg/kg依鲁替尼(70%)(参见图5)。
1 媒介物 NA QDx5-2天停药-QDx5 p.o. + i.v. 6
2 阿吡莫德游离碱 75 mg/kg QDx5-2天停药-QDx5 p.o. 6
3 依鲁替尼 10 mg/kg QD×12 i.v. 6
4 依鲁替尼 20 mg/kg QD×12 i.v. 6
5 阿吡莫德游离碱 + 依鲁替尼 75 mg/kg + 10 mg/kg QDx5-2 天停药-QDx5 + QD×12 p.o. + i.v. 6
6 阿吡莫德游离碱 + 依鲁替尼 75 mg/kg + 20 mg/kg QDx5-2天停药-QDx5 + QD×12 p.o. + i.v. 6[0135] 肿瘤尺寸用卡尺在两个维度上一周测量两次，且体积使用以下公式以mm3 表示：V = 0.5 a x b2，其中a 和b 分别是肿瘤的长径和短径。监测小鼠31 天，并在75 mg/kg阿吡莫德(57%)、10 mg/kg依鲁替尼(54%)和20 mg/kg依鲁替尼(64%)处理组中观察到显著的生长抑制。75 mg/kg阿吡莫德与依鲁替尼的组合以剂量依赖性方式进一步降低了肿瘤生长；
10 mg/kg依鲁替尼(65%)和20 mg/kg依鲁替尼(70%)(参见图5)。
[0136] 实施例5:阿吡莫德是PIKfyve 激酶的高选择性结合物为了确定阿吡莫德在癌细胞中的细胞靶，采用化学捕获质谱法(CCMS)使用由人神经胶质瘤细胞制备的全细胞溶解产物来识别其结合配偶体(binding partner)。这项工作在Caprotec Bioanalytics GmbH, Berlin Germany 处进行。参见Michaelis 等人, J. Med. Chem., 553934-44 (2012)和其中引用的参考文献。简而言之，合成两种使用阿吡莫德作为单方向上连接的选择性功能的捕获化合物变体并通过LC-MS和1H-NMR进行分析以确保同一性和纯度。在全细胞溶解产物中优化捕获条件，例如最小化蛋白与捕获化合物的非特异性相互作用，浓缩试剂和蛋白以获得蛋白与捕获化合物的最大结合等等。选择一种捕获化合物以便在使用阿吡莫德作为竞争配体的CCMS实验中确定特异性蛋白结合物。在捕获测定中通过LC-S检测到的并在竞争对照实验中显著减少的蛋白被认为是特异性结合物。使这些特异性结合物进一步经受严格的数据分析标准以便在无偏数据评估后确定特异性。特异性蛋白结合物根据其在捕获实验中的倍数变化(FC)值进行排列。仅有两种蛋白被确定为阿吡莫德的高概率候选靶蛋白：PIKfyve和Vac14。在四种不同捕获化合物浓度实验中这些蛋白的FC和p-值显示在表7中
表7.
表7.
[0137] 在单独的研究中，进行阿吡莫德的蛋白激酶分析以确定激酶靶(DiscoveRx, Fremont, CA)。使用阿吡莫德在渐增的浓度(0.05-3000 nM)下针对PIKfyve(一种已知的阿吡莫德的靶)进行解离常数(Kd)研究。该实验一式两份进行，且Kd确定为0.075 nM(范围0.069-0.081 nM)(图6)。
[0138] 接下来，针对激酶的综合组(comprehensive panel)(不包括PIKfyve)筛选阿吡莫德。总计测定了456 种激酶(包括疾病相关的激酶)与阿吡莫德结合的能力。阿吡莫德的筛选浓度为1 μM，该浓度是阿吡莫德对PIKfyve的Kd 的>10,000 倍。来自该筛选的结果表明，阿吡莫德未结合到受试的456 种激酶的任一种上。
[0139] 总之，这些结果表明，阿吡莫德在癌细胞中以高选择性结合到单一的细胞激酶PIKfyve上。PIKfyve是结合到PI(3)P上并催化脂质第二信使PI(3,5)P2 与PI(5)P的形成的酶，并且其他人已经表明阿吡莫德在正常细胞中也是这种激酶PIKfyve的有效和特异性的抑制剂。Cai X等人, Chem Biol. 2013 Jul 25;20(7):912-21。如下面更详细地讨论的那样，为了理解阿吡莫德针对癌细胞的选择性细胞毒性的机理，我们进行了一系列旨在阐明其在癌细胞中的生物活性的实验。
[0140] 实施例6: 阿吡莫德的抗癌活性的机理阿吡莫德已知是炎性细胞因子IL-12和IL-23的有效抑制剂。阿吡莫德被指示用于治疗疾病或病症的程度是以这种活性为基础的。尽管阿吡莫德的临床试验集中于其在自身免疫性和炎性疾病如银屑病、类风湿性关节炎和克罗恩病方面的潜在功效，但存在一些公开的建议：阿吡莫德可能可用于对抗癌症，且特别是对抗其中c-rel或IL-12/23充当促增殖因子的癌症。分别参见例如WO 2006/128129 和Baird 等人, Frontiers in Oncology 3:1 (2013)。令人惊讶地并与基于阿吡莫德的IL-12/23抑制活性的这些预期相反，我们并未在受试细胞系中发现c-Rel表达(c-Rel 是IL-12/23 基因的转录因子)、IL-12或IL-23表达的任一种和对阿吡莫德的敏感度之间的相关性。简而言之，对22种B细胞淋巴瘤系分析了来自癌细胞系百科全书(CCLE)的基因表达数据，我们获得了22种B细胞淋巴瘤系针对阿吡莫德的剂量响应曲线(参见表8)。
[0141] 表8. 分析22种B细胞淋巴瘤系的基因表达和对阿吡莫德的响应。
[0142] 注意埃巴(Epstein Barr)状态和核cREL状态。ND =无数据编号 B细胞淋巴瘤模型 细胞系 IC50 (nM) EBV 核REL
1 人伯基特淋巴瘤 ST486 25 否 ND
2 人伯基特淋巴瘤 Daudi 200 是 是
3 人伯基特淋巴瘤 EB1 174 是 ND
4 人伯基特淋巴瘤 GA-10 382 否 ND
5 人套细胞淋巴瘤 Rec-1 300 否 ND
6 人套细胞淋巴瘤 JeKo-1 70 否 ND
7 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-4 25 否 是
8 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-6 80 否 ND
9 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB DB 150 否 ND
10 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB Toledo 270 否 ND
11 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-10 20 否 ND
12 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB WSU-DLCL2 160 否 ND
13 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB OCI-Ly19 380 是 ND
14 人伯基特淋巴瘤 Namalwa 600 是 ND
15 人伯基特淋巴瘤 CA46 >10,000 否 ND
16 人伯基特淋巴瘤 Raji >10,000 是 是
17 人套细胞淋巴瘤 GRANTA-519 >10,000 是 ND
18 人滤泡性B细胞淋巴瘤 RL >10,000 ND ND
19 人滤泡性淋巴瘤 - DLBCL-GCB DOHH-2 700 否 ND
20 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB HT 642 否 ND
21 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB Pfeiffer 2,620 ND ND
22 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB KARPAS-422 >10,000 否 ND
1 人伯基特淋巴瘤 ST486 25 否 ND
2 人伯基特淋巴瘤 Daudi 200 是 是
3 人伯基特淋巴瘤 EB1 174 是 ND
4 人伯基特淋巴瘤 GA-10 382 否 ND
5 人套细胞淋巴瘤 Rec-1 300 否 ND
6 人套细胞淋巴瘤 JeKo-1 70 否 ND
7 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-4 25 否 是
8 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-6 80 否 ND
9 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB DB 150 否 ND
10 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB Toledo 270 否 ND
11 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-10 20 否 ND
12 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB WSU-DLCL2 160 否 ND
13 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB OCI-Ly19 380 是 ND
14 人伯基特淋巴瘤 Namalwa 600 是 ND
15 人伯基特淋巴瘤 CA46 >10,000 否 ND
16 人伯基特淋巴瘤 Raji >10,000 是 是
17 人套细胞淋巴瘤 GRANTA-519 >10,000 是 ND
18 人滤泡性B细胞淋巴瘤 RL >10,000 ND ND
19 人滤泡性淋巴瘤 - DLBCL-GCB DOHH-2 700 否 ND
20 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB HT 642 否 ND
21 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB Pfeiffer 2,620 ND ND
22 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB KARPAS-422 >10,000 否 ND
[0143] 通过非配对t-检验在敏感(IC50小于500 nM)和不敏感(IC50大于500 nM)的系中比较了c-REL 的表达。在c-REL表达和敏感度之间没有发现统计学上显著的关系(p=0.97)。此外发现，在已经公开数据的细胞系中没有检测到在对阿吡莫德的敏感度与存在组成性核c-REL或被埃巴病毒感染之间的显著关系。受试的细胞系包括以下阿吡莫德敏感(#1-13)和不敏感(#14-22)的B细胞淋巴瘤系：人伯基特淋巴瘤细胞系1-4 (ST486、Daudi、EB1、GA-10)、人套细胞淋巴瘤5-6 (Rec-1、JeKo-1)、人弥漫性大B细胞淋巴瘤–GCB 7-13 (SUDHL-4 、SUDHL-6、DB、Toledo、SUDHL-10、WSU-DLCL2、OCl-Ly19)、人伯基特淋巴瘤14-16 (Namalwa、CA46、Raji)、人套细胞淋巴瘤17 (GRANTA-519)、人滤泡性B细胞淋巴瘤18 (RL)、人滤泡性淋巴瘤-DLBCL-GCB 19 (DOHH-2) 、人弥漫性大B细胞淋巴瘤-GCB (HT、Pfeiffer、KARPAS-422)。
[0144] 在不同组的75 种癌细胞系(包括前述22 种淋巴瘤系)中对IL-12A、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-12B、IL-23A 和IL-23R 的表达进行了进一步分析(参见表9)。
[0145] 表9.各种癌细胞系编号 癌症模型 细胞系 IC50 (nM)
1 人伯基特淋巴瘤 ST486 25
2 人套细胞淋巴瘤 JeKo-1 70
3 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-4 25
4 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-6 80
5 人伯基特淋巴瘤 Daudi 200
6 人组织细胞性淋巴瘤 U937 106
7 人肺癌 A549 110
8 人结直肠癌 HCT116 125
9 人B-细胞淋巴瘤 DB 150
10 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB WSU-DLCL2 160
11 人结直肠 HCT-15 200
12 人结直肠 SW480 90
13 人结直肠 COLO-205 380
14 人结直肠 SW620 90
15 人T-细胞白血病 Jurkat 200
16 人神经胶质瘤 H4 250
17 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB Toledo 270
18 人B细胞非霍奇金淋巴瘤 Rec-1 300
19 人霍奇金淋巴瘤 KMH-2 181
20 人伯基特淋巴瘤 EB1 174
21 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-10 20
22 人伯基特淋巴瘤 GA-10 382
23 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB OCI-Ly19 380
24 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB HT 642
25 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB Pfeiffer 2,620
26 人伯基特淋巴瘤 Namalwa 600
27 人滤泡性B细胞淋巴瘤-GCB DOHH-2 700
28 人膀胱癌 (GATOR -/-) SW780 1000
29 人结直肠癌 MDST8 1000
30 人伯基特淋巴瘤 Raji 10,000
31 人霍奇金淋巴瘤 HD-MyZ >1000
32 人霍奇金淋巴瘤 L540 >1000
33 人霍奇金淋巴瘤 HDLM-2 >1000
34 人伯基特淋巴瘤 CA46 >10,000
35 人间变性大细胞淋巴瘤 SUDHL-1 590
36 人肺癌 H1734 1500
37 人结直肠癌 SW1116 1500
38 人结直肠 COLO-320DM 2,060
39 人成神经细胞瘤 A172 2000
40 人肺癌 H1693 2000
41 人肺癌 H460 > 2000
42 人肺癌 H358 >2000
43 人胰腺癌 CAPAN2 >2000
44 人胰腺癌 PANC1 >2000
45 人胰腺癌 MiaPaCa-2 >2000
46 人胰腺癌 AsPC1 >2000
47 人前列腺癌 DU145 >2000
48 人急性髓细胞性白血病 KG-1 >2500
49 人前列腺癌 LnCap 3000
50 人T-细胞淋巴瘤 HH 3,300
51 人T-细胞白血病 MOLT-4 3,300
52 人前列腺癌 22RV1 >5000
53 人结直肠癌 DLD-1 >5000
54 人髓细胞性白血病 K562 >5000
55 人结直肠癌 RKO >5000
56 人卵巢 TOV-21G 7000
57 人前列腺癌 PC-3 10,000
58 人霍奇金淋巴瘤 L428 10,000
59 人浆细胞瘤 RPMI-8226 >10,000
60 人肺癌 NCI-1975 >10,000
61 人乳腺癌 CAMA1 >10,000
62 人成神经细胞瘤 SW1088 >10,000
63 人成神经细胞瘤 M0591K >10,000
64 人成神经细胞瘤 U-118 MG >10,000
65 人成神经细胞瘤 U-87 MG >10,000
66 人急性单核细胞性白血病 THP1 >10,000
67 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB KARPAS-422 >10,000
68 人滤泡性B细胞淋巴瘤 RL >10,000
69 人套细胞淋巴瘤 GRANTA-519 >10,000
70 人细支气管肺泡 NCI-H1650 >20,000
71 人细支气管肺泡 SW1573 >20,000
72 人细支气管肺泡 NCI-H1781 >20,000
73 人细支气管肺泡 NCI-H1666 20,000
74 人结直肠 LOVO >10,000
75 人结直肠 HT-29 >10,000
1 人伯基特淋巴瘤 ST486 25
2 人套细胞淋巴瘤 JeKo-1 70
3 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-4 25
4 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-6 80
5 人伯基特淋巴瘤 Daudi 200
6 人组织细胞性淋巴瘤 U937 106
7 人肺癌 A549 110
8 人结直肠癌 HCT116 125
9 人B-细胞淋巴瘤 DB 150
10 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB WSU-DLCL2 160
11 人结直肠 HCT-15 200
12 人结直肠 SW480 90
13 人结直肠 COLO-205 380
14 人结直肠 SW620 90
15 人T-细胞白血病 Jurkat 200
16 人神经胶质瘤 H4 250
17 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB Toledo 270
18 人B细胞非霍奇金淋巴瘤 Rec-1 300
19 人霍奇金淋巴瘤 KMH-2 181
20 人伯基特淋巴瘤 EB1 174
21 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB SUDHL-10 20
22 人伯基特淋巴瘤 GA-10 382
23 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB OCI-Ly19 380
24 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB HT 642
25 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB Pfeiffer 2,620
26 人伯基特淋巴瘤 Namalwa 600
27 人滤泡性B细胞淋巴瘤-GCB DOHH-2 700
28 人膀胱癌 (GATOR -/-) SW780 1000
29 人结直肠癌 MDST8 1000
30 人伯基特淋巴瘤 Raji 10,000
31 人霍奇金淋巴瘤 HD-MyZ >1000
32 人霍奇金淋巴瘤 L540 >1000
33 人霍奇金淋巴瘤 HDLM-2 >1000
34 人伯基特淋巴瘤 CA46 >10,000
35 人间变性大细胞淋巴瘤 SUDHL-1 590
36 人肺癌 H1734 1500
37 人结直肠癌 SW1116 1500
38 人结直肠 COLO-320DM 2,060
39 人成神经细胞瘤 A172 2000
40 人肺癌 H1693 2000
41 人肺癌 H460 > 2000
42 人肺癌 H358 >2000
43 人胰腺癌 CAPAN2 >2000
44 人胰腺癌 PANC1 >2000
45 人胰腺癌 MiaPaCa-2 >2000
46 人胰腺癌 AsPC1 >2000
47 人前列腺癌 DU145 >2000
48 人急性髓细胞性白血病 KG-1 >2500
49 人前列腺癌 LnCap 3000
50 人T-细胞淋巴瘤 HH 3,300
51 人T-细胞白血病 MOLT-4 3,300
52 人前列腺癌 22RV1 >5000
53 人结直肠癌 DLD-1 >5000
54 人髓细胞性白血病 K562 >5000
55 人结直肠癌 RKO >5000
56 人卵巢 TOV-21G 7000
57 人前列腺癌 PC-3 10,000
58 人霍奇金淋巴瘤 L428 10,000
59 人浆细胞瘤 RPMI-8226 >10,000
60 人肺癌 NCI-1975 >10,000
61 人乳腺癌 CAMA1 >10,000
62 人成神经细胞瘤 SW1088 >10,000
63 人成神经细胞瘤 M0591K >10,000
64 人成神经细胞瘤 U-118 MG >10,000
65 人成神经细胞瘤 U-87 MG >10,000
66 人急性单核细胞性白血病 THP1 >10,000
67 人弥漫性大B细胞淋巴瘤 -GCB KARPAS-422 >10,000
68 人滤泡性B细胞淋巴瘤 RL >10,000
69 人套细胞淋巴瘤 GRANTA-519 >10,000
70 人细支气管肺泡 NCI-H1650 >20,000
71 人细支气管肺泡 SW1573 >20,000
72 人细支气管肺泡 NCI-H1781 >20,000
73 人细支气管肺泡 NCI-H1666 20,000
74 人结直肠 LOVO >10,000
75 人结直肠 HT-29 >10,000
[0146] 简而言之，对75 种癌细胞系分析了来自CCLE的基因表达数据，获得了75 种癌细胞系针对阿吡莫德的剂量响应曲线。通过非配对t-检验在敏感(IC50小于500 nM)和不敏感(IC50大于500 nM)的系中比较各白介素基因的表达。没有发现统计学上显著的关系， 唯一的例外是IL-23A (p=0.022)。此前已经指出IL-23A在阿吡莫德敏感的非小细胞肺癌系中升高，并指出重组体IL-23A提高了非小细胞肺癌系的增殖(参见Baird 等人2013，见上)。重要的是，IL-23A表达在敏感癌症系中的统计学显著性似乎完全仅由两种结肠癌系驱动。此外，IL-23A表达在非霍奇金B细胞淋巴瘤中不是敏感度的统计学显著的预测指标(图7)。
[0147] PIKfyve产生脂质产物PI(3,5)P2和PI5P，其反过来用于建立膜特性和控制内溶酶体动力学。研究表明PIKfyve抑制引起的PI(3,5)P2耗尽产生肿胀的内溶酶体表型。基于这些研究，我们测试了阿吡莫德、PIKfyve抑制和内溶酶体功能障碍之间的关系。如图8所示，我们的实验证明了阿吡莫德在24小时后诱导H4神经胶质瘤细胞中PI(3,5)P2降低大约70％(图8A)，并且这些细胞表现出显著肿胀的内溶酶体(液泡)表型(图8B)。这种表型是可逆的，并且在药物移除后的3-4天内癌细胞系恢复到正常的外观。
[0148] 我们接下来测试PIKfyve基因产物的抑制是否可以概括在所测试的细胞系之一(H4神经胶质瘤细胞)中用阿吡莫德观察到的细胞毒性效应。如图9所示，诱导靶向PIKFYVE转录物的多西环素-诱导性发夹引起了H4细胞中肿胀的内溶酶体表型和细胞活力的显著降低。
[0149] 这里提供的数据一起支持了阿吡莫德的抗癌特性通过其抑制PIKfyve而出现的结论。
[0150] 实施例7: 阿吡莫德在人类中的药代动力学我们的临床前数据表明，如果在临床试验中可以实现合适的血浆浓度，阿吡莫德可以在NHL患者中有活性。阿吡莫德的药代动力学(PK)已经在1期试验中建立，尽管以前没有报道过。简而言之，根据以下给药方案(表10)，在单日口服施用后，将阿吡莫德在正常健康志愿者中的PK参数确定为1个剂量或分成相隔10小时的2个剂量。
[0151] 表10: 1期，在正常健康志愿者中进行剂量递增(QD/BID)研究。个体随机接受活性物或安慰剂。在一天进行给药，其中仅在AM进行QD给药，而在AM和PM进行BID给药。组 每次施用的剂量 频率 总剂量
A 7 mg 一次 7 mg
B 7 mg x2 14 mg
C 14 mg x2 28 mg
D 35 mg x2 70 mg
E 70 mg x2 140 mg
F 105 mg x2 210 mg
A 7 mg 一次 7 mg
B 7 mg x2 14 mg
C 14 mg x2 28 mg
D 35 mg x2 70 mg
E 70 mg x2 140 mg
F 105 mg x2 210 mg
[0152] 阿吡莫德浓度随时间变化的PK曲线如图5所示。在105 mg BID (总每日剂量210mg)中，阿吡莫德在AM和PM的平均血浆浓度分别为192和149 ng/ml (表11)。
[0153] 表11: 阿吡莫德游离碱在人血浆中混合的男性和女性PK参数的总结。aBID施用剂量，在AM和PM剂量之间为10小时，除了接受单剂量的组A外。除E以外，所有组的个体数均为n = 9，其中一个个体由于异常浓度而不包括在分析中。显示的C max值是针对8或9个个体的平均值。a
处理 剂量(mg) AM Cmax (ng/ml) PM Cmax (ng/ml)
A 7 10.8 +/- 2.7 NA
B 14 12.7 +/- 5.9 8.18 +/- 2.73
C 28 18.2 +/- 5.8 10.7 +/- 5.0
D 70 71.8 +/- 17.1 63.0 +/- 22.6
E 140 145 +/- 30 110 +/- 43
F 210 192 +/- 51 149 +/- 38
处理 剂量(mg) AM Cmax (ng/ml) PM Cmax (ng/ml)
A 7 10.8 +/- 2.7 NA
B 14 12.7 +/- 5.9 8.18 +/- 2.73
C 28 18.2 +/- 5.8 10.7 +/- 5.0
D 70 71.8 +/- 17.1 63.0 +/- 22.6
E 140 145 +/- 30 110 +/- 43
F 210 192 +/- 51 149 +/- 38
[0154] 此外，对于24小时时段的 50%，阿吡莫德血浆浓度保持在50 ng/ml(等于125 nM)~以上；图3B中的灵敏度的临界IC50。这些血浆浓度预计也会产生药效学(PD)效应，因为阿吡莫德处理24小时后诱导外周血液单核细胞中的液泡形成。
[0155] 阿吡莫德在105 mg BID时具有可耐受的安全性特性，尽管之前申办方(sponsor)在慢性炎性疾病状况下的2期疗效研究的大部分以100 mg (或更低)的总每日剂量进行。这些数据表明，能够有效抑制体外NHL生长并且可能具有PD效应的阿吡莫德的浓度在人类中是可以实现的，因此支持了我们计划的在NHL中的1期阿吡莫德剂量递增研究。
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