多疣壁虎抗氧化肽及其应用
阅读：1040发布：2020-05-25
专利汇可以提供多疣壁虎抗氧化肽及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及多疣壁虎抗 氧 化肽及其应用，属于 生物 医学技术领域。天然来源的抗氧化肽Gj-CATH3是通过分离纯化和基因克隆的方法得到，含有42个 氨 基酸残基，分子量为5249.28Da，等电点为9.99。Gj-CATH3的改造体包括两种，G3CY-5和G3CY-10，均为直链多肽，分别由5个和10个氨基酸残基组成，分子量分别为655.77Da和1267.49Da，等电点分别为8.2和8.86。这三种抗氧化肽均表现出极强的抗氧化活性，且结构简单，分子量小，溶血性极低，制备方法简单，在制备抗氧化药物、 食品添加剂 和 化妆品 领域具有良好的应用前景。，下面是多疣壁虎抗氧化肽及其应用专利的具体信息内容。
1.一种多疣壁虎抗氧化肽，其特征在于，所述多疣壁虎抗氧化肽为直链多肽，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
2.一种核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码如权利要求1所述的多疣壁虎抗氧化肽。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含如权利要求2所述的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的多疣壁虎抗氧化肽、权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3所述的重组表达载体用于制备抗氧化药物的用途。
5.如权利要求1所述的多疣壁虎抗氧化肽、权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3所述的重组表达载体用于制备抗氧化化妆品、保健品、食品、饲料的添加剂的用途。
多疣壁虎抗氧化肽及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 现代医学有关衰老的自由基学说认为，人之所以会衰老，是由于人体受到疾病以及“自由基”的破坏。所谓“自由基”，是带一个多余电子的极不稳定的分子，是新陈代谢的副产物。这些分子的绝大多数是破坏细胞膜和DNA的氧化物，导致脂质、蛋白质和DNA氧化性退变等氧化损害，从而引发糖尿病、动脉硬化、癌症等一系列慢性疾病。尽管机体存在抗氧化防御系统，但其并不能完全有效地抵御或修复氧化作用带来的损伤。因此，如何适当的清除自由基，使其在体内维持在一个较低的水平，从而延缓机体衰老，是当前一个重要的研究课题。
[0003] 此外，食品中营养成分的氧化反应也会产生过氧化物，从而会影响食品的营养价值，甚至可导致疾病发生，寻找安全的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。目前广泛使用的抗氧化剂多为化学合成物，如BHA(丁基羟基茴香醚)、BHT(二丁基羟基甲苯)、PG(没食子酸丙酯)等，虽抗氧化效果良好，但对人体肝、脾、肺有蓄积性致癌作用。因此人们逐渐把目光转向天然抗氧化剂。
[0004] 目前，国内外开发研究的天然抗氧化剂主要有香辛料提取物、茶多酚类、天然黄酮类、维生素类、以及蛋白质和酶类等。其中，一些天然抗氧化肽因其具有清除自由基、淬灭单线态氧、分解过氧化物及抑制脂质过氧化等功效，且相对于其他的抗氧化剂而言，具有低毒、高效、安全、分子量小、易吸收等特点，已成为新型功能食品和保健品开发的极具潜力的基料。多疣壁虎(Gekkojaponicus)，在我国有悠久的药用历史，近年来壁虎由于在治疗各种疑难杂症方面的广泛应用而日益受到重视。然而目前还未有关于壁虎抗氧化肽的研究报道。
[0005] 本发明提供一条天然来源的多疣壁虎抗氧化肽Gj-CATH3及其两条改造体G3CY-5、G3CY-10，其中两条改造体分子量小，结构简单，为线性分子，方便化学合成及基因工程制备。且相比于其他已报道的抗氧化肽，G3CY-5和G3CY-10的抗氧化活性更强，可开发作为抗氧化药物、食品添加剂以及化妆品有效成分的优良模板。
发明内容
[0006] 本发明提供了三条多疣壁虎来源的具有极强抗氧化能力的抗氧化肽，Gj-CATH3及其改造体G3CY-5和G3CY-10的氨基酸序列。本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供这三条抗氧化肽的制备方法和应用，着重在抗氧化药物制备、食品添加剂以及化妆品有效成分中的应用。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
[0008] 本发明采用的技术方案为：
[0009] 一种多疣壁虎抗氧化肽，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
[0010] 具体地，所述的多疣壁虎抗氧化肽选自多疣壁虎天然抗氧化肽Gj-CATH3及其改造体G3CY-5和G3CY-10，其中：多疣壁虎天然抗氧化肽Gj-CATH3，所述Gj-CATH3为直链多肽，分子量为5249.28Da，等电点是9.99，含有42个氨基酸残基，其序列为：精氨酸-精氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-脯氨酸-酪氨酸-甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-酪氨酸-酪氨酸-组氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-组氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸。全序列的一级结构为：Arg-Arg-Gly-Phe-Phe-Lys-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys-Pro-Lys-Lys-Val-Ala-Lys-Lys-Pro-Tyr-Tyr-His-Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr-Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr-Cys-Gly-Trp-Lys-His-Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr(SEQ ID NO:1)。
[0011] 所述Gj-CATH3的包括两种改造体：G3CY-5和G3CY-10：
[0012] (1)改造体G3CY-5：直链多肽，分子量为655.77Da，等电点8.20，含有5个氨基酸残基，其序列为：半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸；全序列的一级结构为：Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr(SEQ ID NO:2)。
[0013] (2)改造体G3CY-10：直链多肽，分子量为1267.49Da，等电点8.86，含有10个氨基酸残基，其序列为：半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-组氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸；全序列的一级结构为：Cys-Gly-Trp-Lys-His-Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr(SEQ ID NO:3)。
[0014] 另一方面，本发明提供了一种核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码上述的多疣壁虎抗氧化肽中的一种或多种。
[0015] 具体地，所述Gj-CATH3的编码基因：由126个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:cggagaggct tctttaaacc atatggcaag aaacccaaga aggttgccaa aaagccgtactatcactgtggctggaagtactgtggctggaagtactgtggctggaagcactgtggctggaagtac(SEQ ID NO:4)。
[0016] 另一方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含上述的核苷酸序列中的一种或多种。
[0017] 本发明还提供了上述多疣壁虎抗氧化肽、上述核苷酸序列或上述重组表达载体用于制备抗氧化药物的用途；以及上述多疣壁虎抗氧化肽、上述核苷酸序列或上述重组表达载体用于制备抗氧化化妆品、保健品、食品、饲料的添加剂的用途。
[0018] 在其他实施方案中，本发明还提供了上述多疣壁虎抗氧化肽、上述核苷酸序列或上述重组表达载体用于药理活性检测的用途。
[0019] 本发明的有益效果：本发明通过基因克隆和分离纯化的方法得到一条多疣壁虎天然抗氧化肽Gj-CATH3的氨基酸序列和编码基因。并根据Gj-CATH3的氨基酸序列，通过分子改造的方法设计了其改造体G3CY-5和G3CY-10，这两条改造体均表现出极强的抗氧化活性，在20ug/ml的浓度下对的DPPH自由基的清除率就可以分别达到42.96％和43.32％，对ABTS·+正离子自由基清除率均在99％以上，此外，这两条改造体还具有分子量小、结构简单、无溶血性、制备方法简单等有益特点。
具体实施方式
[0020] 下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
[0021] 实施例1多疣壁虎天然抗氧化肽Gj-CATH3的分离纯化：
[0022] Gj-CATH3是从多疣壁虎皮肤蛋白粗提物先经Sephadex G-50凝胶过滤，然后反相高压液相层析(RP-HPLC)分离得到的。
[0023] 首先，选取健康状况良好的成年多疣壁虎(n＝20)，取新鲜皮肤组织置于方盘中，用生理盐水少许洗涤，匀浆。用少量生理盐水溶解后，按PS液与正丁醇1：50(V/V)比例，把PS与正丁醇在室温下搅拌60min，13000r/min，20min离心两次，然后将沉淀冻干。随后，第一步Sephadex G-50凝胶过滤层析：0.9g冻干粉用10ml 0.1M磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4,pH 6.0)缓冲液溶解，12000rpm离心10min，取上清液上样于已平衡好的Sephadex G-50凝胶排阻色谱柱(1.6cm x 90cm,Amersham Bioscience)，用同样缓冲液洗脱，流速3mL/10min，用自动部分收集器收集3mL/管，220nm检测并收集各峰检测抗菌活性，冻干备用。
[0024] 第二步反相高效液相层析(RP-HPLC)：Sephadex G-50凝胶排阻色谱分离得到的活性成分的峰重新溶解于纯水中，4℃，12000rpm离心15min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，上样于经含1‰三氟乙酸的超纯水充分平衡的C18反相柱(Hypersil BDS C18,30cm x 0.46cm)用乙腈(含1‰三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱,215nm检测多肽浓度。收集得到的各峰，冻干浓缩，用灭菌的去离子水重新溶解并进行抗氧化活性检测。
[0025] 第三步一级结构分析：纯化的Gj-CATH3分子量测定采用电喷雾四级杆飞行时间串联质谱法(ESI-Q-TOF-MS,Biosystems/MDS Sciex多伦多，加拿大)。等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
[0026] 实施例2 Gj-CATH3编码基因的克隆测序：
[0027] 第一步：多疣壁虎皮肤总RNA提取：取300mg多疣壁虎皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，利用RNeasyAxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit(Qiagen,union city,CA,USA)提取多疣壁虎皮肤组织总RNA。
[0028] 第二步：多疣壁虎cDNA文库的构建：
[0029] 采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit。
[0030] (1)cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
[0031] ①无RNA酶的离心管中加入1μl多疣壁虎皮肤总RNA、1μl 3’端一链合成引物(3’In-Fusion SMARTer CDS Primer)和2.5μl DEPC处理水，使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。
[0032] ②在上述离心管中加入以下试剂(均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备)，2.0μl 5×第一链缓冲液、0.25μl 100mM DTT、1.0μl 10mMdNTP Mix、1.0μl SMARTer V Oligonucleotide、0.25μl RNase Inhibitor和1.0μl SMARTScribe Reverse Transcriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm，30s)，在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。
[0033] (2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备)
[0034] ①将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲液、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl 50×Advantage 2Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。
[0035] ②在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。
[0036] 第三步、多疣壁虎抗氧化肽Gj-CATH3的基因克隆筛选
[0037] (3)多疣壁虎抗氧化肽Gj-CATH3基因克隆筛选：
[0038] 根据爬行纲cathelicidin信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为5’-ATCCTGCTGATGCTTGGC-3’(SEQ ID NO:5)，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司In-TMFusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit中的3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’(SEQ ID NO:6)。PCR反应在如下条件下进行：94℃
4min，94℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。
4min，94℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。
[0039] 第四步、测序结果：
[0040] Gj-CATH3前体肽的编码基因由510个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:
[0041]
[0043] 编码Gj-CATH3成熟肽为382位到507位的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列为：
[0044] Arg-Arg-Gly-Phe-Phe-Lys-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys-Pro-Lys-Lys-Val-Ala-Lys-Lys-Pro-Tyr-Tyr-His-Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr-Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr-Cys-Gly-Trp-Lys-His-Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr(SEQ ID NO:1)。
[0045] 实施例3Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10的化学合成：
[0046] 1、Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10的化学合成方法：根据其氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。
[0047] 2、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
[0048] 3、纯化的Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
[0049] 测序结果为：多疣壁虎天然抗氧化肽Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10均为直链多肽，分别含有42、5、10个氨基酸残基，分子量分别为5249.28Da、655.77Da、1267.49Da，等电点分别为9.99、8.2、8.86。多疣壁虎天然抗氧化肽Gj-CATH3的全序列为：
[0050] Arg-Arg-Gly-Phe-Phe-Lys-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys-Pro-Lys-Lys-Val-Ala-Lys-Lys-Pro-Tyr-Tyr-His-Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr-Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr-Cys-Gly-Trp-Lys-His-Cys-Gly-Trp-Lys-Tyr(SEQ ID NO:1)。
[0051] 精氨酸-精氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-脯氨酸-酪氨酸-甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-酪氨酸-酪氨酸-组氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-组氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸
[0052] 改造体G3CY-5的全序列为：半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸(SEQ ID NO:2)。改造体G3CY-10的全序列为：半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-组氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸(SEQ ID NO:3)。
[0053] 实施例4 Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10的药理实验：
[0054] 1、Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10的抗氧化活性测定：
[0055] 1.1DPPH自由基清除活性(DPPH radical scavenging assay)
[0056] 称取一定量的DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate，Sigma，美国)，用甲醇溶解，配成6×10-5M的溶液，现配现用。将DPPH溶液和样品(2mg/ml)混合，室温下避光静置30min，于517nm处测定吸光值。空白对照组以样品溶解介质代替待测样品。实验做三个平行，紫外分光光度计调零时使用甲醇。
[0057] DPPH·清除率(％)＝(AB－AA)/A B×100(AB:空白对照组吸光值；AA:样品组吸光值)。
[0058] 表1三种抗氧化肽对DPPH自由基清除活性(％)
[0059]
[0060] 结果如表1所示，这两种改造体G3CY-5和G3CY-10表现出很强的抗氧化活性，在40μg/ml的时候，对DPPH自由基的清除率I％分别为61.59％和70.87％，在80μg/ml的作用浓度下，清除率均达到90％以上。而相比来说，Gj-CATH3对DPPH自由基的清除效果不是很好，80μg/ml的作用浓度下清除率仅为28.57％。
[0061] 1.2 ABTS·+自由基正离子清除活性
[0062] ABTS(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonic acid)(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)用PBS缓冲液(pH7.4)配成2mM的ABTS储存液。将ABTS储存液和70mM过硫酸钾(K2S2O8)水溶液·+按体积比250:1混合，于室温避光放置15-16h。试验开始前，将ABTS 释至734nm波长处的吸光值为0.80±0.03。将不同浓度的上述三种抗氧化肽Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10样品和96μl上述校正过的ABTS·+溶液混合，室温放置10min后，于734nm波长处检测反应液的吸光值。
空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行。
空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行。
[0063] ABTS·+清除率I(％)＝(AB－AA)/AB×100(AB:空白对照组吸光值；AA:样品组吸光值)。
[0064] 表2抗氧化肽Gj-CATH3对ABTS·+自由基正离子清除活性I(％)
[0065]
[0066] 表3抗氧化肽G3CY-5和G3CY-10对ABTS·+自由基正离子清除活性I(％)[0067]
[0068] 结果如表2和表3所示，这三种抗氧化肽均表现出很强的抗氧化活性，且其活性随着样品浓度的升高而逐步增强，具有一定的浓度依赖性。在样品浓度为20μg/ml时，Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10对ABTS·+正离子自由基清除率I％分别可以达到32.08％、100％、99.36％。
[0069] 2、Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10的溶血活性测定：
[0070] 将采集的健康人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液分别与溶解于生理盐水的Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10的样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用TritonX-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝(A样品-A阴性对照)/A阳性对照×100％。
[0071] 实验结果表明，三种抗氧化肽Gj-CATH3、G3CY-5和G3CY-10在浓度高达200μg/ml时，其溶血率分别为2.18％、1.07％、2.35％。说明这三种抗氧化肽均对人血红细胞不具有溶血性，这一特点更有利于其在抗氧化药物、食品或者化妆品领域的开发应用。
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