病理学形态分析的细胞阵列质量控制装置 |
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| 申请号 | CN201080034906.5 | 申请日 | 2010-12-07 | 公开(公告)号 | CN103347574A | 公开(公告)日 | 2013-10-09 |
| 申请人 | 朱伟星; | 发明人 | 朱伟星; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公布一个以细胞阵列为 基础 的病理学分析 质量 控制装置及其制作和使用方法。本装置将多种癌症类型和起源的体外培养细胞放置在固体 基板 上，形成低 密度 的细胞阵列。本装置可为免疫和分子化验程序(例如免疫组织化学、免疫细胞化学和原位杂交)提供显示阳性和阴性反应的多功能质控标示。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种病理学检测的质量控制装置，其特征在于，包含细胞阵列，所述细胞阵列特征在于包含多种不同细胞；其中所述细胞附着在一个固体基板的表面；同时，其中所述各种细胞被安排成诸多分离的细胞点。 |
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| 说明书全文 | 病理学形态分析的细胞阵列质量控制装置技术领域[0001] 本发明是关于制造和使用载有低密度细胞阵列的质量控制玻片的方法。因为载玻片上的培养细胞的特性是已知的或可以通过研究知道，这些细胞可以被用作组织病理学检测的阳性或阴性对照。这些病理学检测包括免疫组织化学(IHC)，免疫细胞化学(ICC)，原位杂交(ISH)，和细胞遗传学分析。细胞阵列质量控制载玻片可以代替常常难以得到的组织制成的量控制玻片。 背景技术[0002] 病理学检测，诸如IHC，ICC，和ISH，被用在病人标本上做例行的癌症诊断和预测。一般IHC，ICC和ISH检测需要进过许多步骤，包括获得生物标本，在福尔马林中固定标本，处理标本以达到脱水和透明目的，在石蜡中包埋标本，系列切片并载于显微玻片上。接下来还要进行脱蜡(在二甲苯，酒精和水中处理)，最终进行各种反应。反应包括将一系列的溶液，如酶，第一抗体，第二抗体，检测试剂，显色剂，滴于组织切片上，保温并洗脱。反应完成后，组织切片被置于显微镜下观察。 [0003] 传统的活检样本的显微观察显示的是总体的细胞和组织架构。例如，在常用的苏木和伊红染色(H&E)下，细胞核被染成紫色(苏木染色)，细胞质被染成红色(伊红染色)。然而，从H&E染色得出的信息常常不足于做准确的诊断。IHC和ISH检测的结果可以把对组织样本的细胞大小和形状分析扩展到分子水平。用抗体和核酸探针可以检测组织样本中特定的蛋白和基因的表达。某些检测靶标或生物标志物的存在与否可以表明肿瘤的谱系，有助于诊断或对特定抗肿瘤疗法的预后。另外，这些方法也可用于检测微生物，如细菌，真菌，和病毒。 [0004] 大多数病理实验室用事先确定含有特定抗原的组织标本作IHC的阳性对照。这需要对一组用作IHC阳性对照的组织标本进行登记，切片和存档。当阳性组织样本用完时需要准备新的。在日常IHC检测过程中每一个抗体需要一个阳性组织对照。如此每一种抗体都在一特定浓度进行验证。 [0005] 作为一种改进，Battifora(美国专利4,820,504and 5,610,022)阐述了把多个阳性组织样本(多为肿瘤组织样本)一起包埋在一个石蜡块里，同时作为对照的方法。这种“多组织肿瘤蜡块”简化了阳性对照组织的切片过程。Furmanski等人阐述了一种略微不同的方法制备“多组织肿瘤蜡块”(U.S.Pat.No.4,914,022)。它们的改进在于把用普通饮料吸管从多个原组织中切出的组织芯包埋在一个石蜡块中。 [0006] 然而，使用组织作为对照给组织学技师造成很大负担，因为必须收集多余组织样本，制备对照玻片，并对它们的抗原特性进行分析。许多研究者使用过非组织材料，比如体外培养的细胞甚至多肽。许多研究者和IHC诊断试剂盒的生产商把已知染色特性的细胞点在载玻片上作为阳性或阴性对照。Moskaluk等人(C.A.Moskaluk and M.H.Stoler，Diagnostic Molecular Pathology，2002，p234-238)阐述了把培养细胞包埋在琼脂糖中制成多细胞系的细胞阵列置于载玻片上。朱(美国专利7,598,036)阐述了将蛋白质，核酸，或体外培养细胞直接点在玻片上，或者先点在特制的膜上再将膜与检测样品一起贴在显微玻片上用作外来对照。阐述了一种用以共价键联在固体支持物上的多肽作为IHC对照的方法。 发明内容[0007] 本发明有关于一种在免疫和分子病理学检测中进行质量控制的以细胞阵列为基础的广谱质量控制装置以及生产和使用此装置的方法。 [0008] 本发明的一个方面是质量控制细胞阵列。细胞阵列由多种细胞构成的多个独立分散的区域(点)构成。细胞阵列包含的细胞可以是正常细胞，也可以是良性或恶性肿瘤细胞。质量控制细胞阵列的一个实施方式是包括由来源于多种肿瘤或癌类型(carcinoma癌，melanoma黑色素瘤，sarcoma肉瘤，leukemia/lymphoma血癌/淋巴瘤，and tumors of the neural system和神经系统肿瘤)的培养细胞组成的分开的细胞点。一种细胞或几种细胞的混合物被点在一个固体支持物的表面上的一个独立的区域内，这个区域被称为细胞点。细胞阵列由多个细胞点组成，可置于显微玻片表面或置于可贴在微玻片表面的胶片或薄膜上。 [0009] 本发明的一个实施方式是质控细胞阵列包括从癌组织中分离出的细胞系。本发明的另一个实施方式是质控细胞阵列包括从淋巴瘤组织中分离出的细胞系。本发明的另一个实施方式是质控细胞阵列包括从黑色素瘤，肉瘤，或神经系统肿瘤中分离出的细胞系。 [0010] 本发明的另一个实施方式是质控细胞阵列包含微生物感染的或表达微生物基因的细胞。 [0011] 本发明的另一个实施方式是质控细胞阵列中的每一个细胞系对某些检测是阳性对照，同时对另一些检测是阴性对照。本发明的另一个实施方式是质控细胞阵列中的细胞是体外培养得到，并经过化学试剂处理过。处理细胞的化学试剂包括甲醛，戊醛，乙醇，丙酮，乙酸，二甲苯，或者二甲苯替代物。本发明的另一个实施方式是质控细胞阵列包含少于50个细胞点。本发明的另一个实施方式是质控细胞阵列每一个细胞点中含102到104个细胞。本发明的另一个实施方式是质控细胞阵列的每一个细胞点包含一种或几种细胞的混合物。 [0012] 本发明的另一个实施方式是质控细胞阵列被点在显微载玻片上。所述显微载玻片有一个标记区域和一个包含质控细胞阵列的检测区域。本发明的另一个实施方式是质控细胞阵列被点在显微载玻片上。所述显微载玻片有一个标记区域，一个样本区域，和另外一个包含质控细胞阵列的区域。另一个实施方式是一个贴在标记区的包含病人或标本信息的标签，一个预先确定的印在标签上的某一检测靶标在质控细胞阵列上的表达格局，以及(可选择的)检测日期。另一个实施方式是质控细胞阵列装置进一步包含确定一组由被质控的检测方法检测的靶标。另一个实施方式是质控细胞阵列装置进一步包含一个预先确定的联系检测靶标和质控细胞阵列的数据组。 [0013] 本发明的另一方面是制造质控细胞阵列装置的方法。首先，确定一组由质控细胞阵列装置进行质控的检测方法检测的靶标。根据选择的检测靶标组，确定包含于细胞阵列中的细胞系。检测靶标组中的每一个靶标都应至少在一个被选择的细胞系中呈阳性表达。可选地，检测靶标组中的所有成员在所选的细胞系中至少有一个细胞系呈阴性表达。检测靶标指检测样品以及质控细胞阵列所包含的细胞中被定性或定量测定出存在或不存在的蛋白质，基因，RNA分子。检测步骤指免疫组化，免疫细胞化学，和原位杂交。对于免疫组化和免疫细胞化学，检测靶标指蛋白抗原。对于原位杂交，检测靶标指DNA或RNA。 [0014] 本发明的一个实施方面是如下检测靶标包括在靶标组中：pencytokeratins，EMA，S-100，HMB45，smooth muscle specific antigen，ER，PR，Her2，P53，PSA，vimentin，chromogranin，desmin，CD3，CD20，CD117/c-kit，CD15，CD30，CD45，CD99，Bcl-1(cyclin D1)，Bcl-2，Ki-67，Ig kappa，Ig lamda，和CEA。根据我们的研究，以上26个细胞蛋白是临床上日常免疫组化或细胞免疫测试中最常用的生物标志物。它们组成质控细胞阵列进行质量控制的中心检测靶标组。 [0015] 本发明的另一方面是使用质控细胞阵列装置的方法。包括建立一个针对细胞阵列预先确定的数据组和相关的检测靶标组；将数据组呈现在纸媒介或电子媒介上；同时在测试样品和质控细胞阵列上用测试检测靶标组中的成员的试剂进行测试步骤；以观察，成像，或数字扫描记录下测试结果；并将测试信号和预先确定的数据库中的数据对比。 [0016] 本发明的一个实施方式是预先确定的数据组是由如下步骤确定的：在质控装置上对检测靶标组中的每一个成员进行测试步骤，以观察，成像，或数字扫描记录下测试结果，并为质控细胞阵列中的每一细胞点对每一个检测靶标。一个实施方式是质控装置预先确定的数据组是储存在数字媒介如CD或DVD中。在这种情况下，数据可以在电脑显示器上显示或打印在纸上。另一个实施方式是预先确定的数据组可呈现为表格，图示，或一组图像。附图说明 [0017] 图1说明一个质量控制细胞阵列装置的样品。质量控制细胞阵列是一个在显微载玻片1上标记记号，其中包含一个样本区域2、一个控制区域3和一个标记区域(图1a)。图1b指出一个打印的标签附属在显微镜载玻片的标签区域。这个打印的标签5包含样本ID6，具体分析样本ID7，在质量控制细胞阵列上具体分析目标的一个预先裁定的显示样本8，和任意一个分析显示的数据库9。图1c说明在质量控制细胞阵列的测试结果的信号指示。 [0018] 图2说明9在显微镜载玻片的质量控制细胞阵列上可能的位置。在a，b，c和d细胞阵列位于接近显微镜载玻片的边缘。这些细胞阵列的定位为以后的在同一个载玻片上测试样本留下了足够的空间。在e和f这些细胞阵列位于显微镜载玻片的中央。在载玻片e和f上没有留有样本区域。 [0019] 图3是一个质量控制细胞阵列的样本。十个细胞点被排列成两排这些细胞阵列包括五个癌症细胞系，两个淋巴瘤细胞系，一个黑素瘤细胞系，一个肉瘤细胞系，和一个CNS肿瘤细胞系。 [0020] 图4是为质量控制细胞阵列建立一个预先确定的数据库的纲要演示。通过抗体或探针针对具体目标在质量控制细胞阵列上进行一个IHC或ISH分析，包括在检测靶标组中来被质量控制细胞阵列控制。这个分析结果通过肉眼或机器读取携带质量控制细胞阵列的显微镜载玻片来记录，并存储在纸上或数字媒介上。定量的或半定量的指示在测试结果中都被指定到测试信号上。这些程序需要被重复，来使每一个分析目标都包括在检测靶标组内，用来建立一个质量控制细胞阵列和与检测靶标组有关的数据库。 [0021] 图5展示了在IHC，ICC或ISH分析中使用质量控制细胞阵列分析的步骤。IHC，ICC或ISH分析在测试样本在测试样本和在质量控制细胞阵列上同时进行，在同一的条件下通过抗体或探针针对感兴趣的目标，包括在检测靶标组内来被质量控制细胞阵列控制。这个分析结果，即，这个信号图像，产生在质量控制细胞阵列上被观察和被与在预先裁定的数据库中的信息做比较。匹配表示这个样本的测试成功。不匹配表示这个样本的测试失败。 [0022] 图6展示了建立和使用与质量控制细胞阵列和检测靶标组有关的电脑软件和数据库的程序。两个平行的信息流被需要。第一个信息流是手工录入分析目标的ID或抗体/探针进入电脑软件。第二个信息流通过机器促成，需要着色的细胞阵列的图像和输入目标或抗体/探针ID，通过可读的数码标记(例如条形码)通过机器。为这两条信息流，电脑软件为每一个测试抗体/探针分配一个ID(例如数字或条形码)，与特定抗体/探针的着色区域有关，在细胞阵列的预先裁定的数据库中，储存在电脑中，并通过分析十进制软件。这个电脑为特定目标或抗体/探针打印着色样式，对于人工程序来说，即被手术人员用来与在现实分析中的着色样式进行对比。在机器流中，需要的着色图像是通过分析测算与预先裁定的数据库中的图像进行对比，然后确认结果将会被生成。这个载玻片读出装置可以被安装在自动染色器上来实现自动质量控制。这个载玻片读出装置也可以被用来作为一个自动质量控制校对器。 具体实施方式[0023] 本发明涉及到为免疫组织化学、细胞学和分子病理学分析提供质量控制的装置，以及使用这个装置对细胞或组织切片中的被检测物进行分析，尤其是免疫组织化学试验时，实现质量控制的方法。需要特别指出的是，本发明涉及到制作质量控制装置，包括制作细胞阵列的方法，以及在相关分析中使用这样的细胞阵列来实现质量控制的方法。具体的说，本发明所涉及的质量控制装置，包括一个由不同类型培养细胞构成的多个独立分散的区域，这些细胞被固定并粘附于经试剂处理的平面固相载体表面。这个平面固相载体可分为前面(也可以此作为上面)和后面(也可以此作为底面)。这个平面固相载体可以是一个平面的检测平台(如，用于显微镜观察的载玻片)，也可以是通过底面的粘合剂粘附于检测平台上的薄膜。 [0024] 1.质量控制细胞阵列装置 [0025] 这个发明的一个方面是质量控制细胞阵列，即由多种细胞构成的多个独立分散的区域(点)。此处所提到的细胞可以是正常细胞，也可以是良性或恶性肿瘤细胞。可以是直接从组织或体液中分离的细胞，也可以是培养细胞。肿瘤分类(类型)包括：癌、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤/白血病和神经系统瘤。单一种类的培养细胞或两到三种不同类型培养细胞的混合物，被加载于固相载体表面相互分离的独立区域，在本文中称为细胞点。 [0026] 专业名词，癌、肉瘤、白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和黑素瘤，通常用来区分不同组织起源的肿瘤。癌，是一种起源于上皮细胞的肿瘤类型，是最常见的恶性肿瘤类型，大约占所有恶性肿瘤病例的80-90％。肉瘤是一种起源于肌肉、骨头、软骨、脂肪或结缔组织的肿瘤类型。白血病起源于白血球及其前体细胞。淋巴瘤是起源于骨髓衍生细胞的恶性肿瘤，并累及淋巴系统。白血病和淋巴瘤都是造血系统的恶性肿瘤。本申请书中，白血病和淋巴瘤被统称为造血系统恶性肿瘤。黑素瘤是起源于黑素细胞的恶性肿瘤，黑素细胞可产生为皮肤、头发、眼睛着色的黑色素。 [0027] 质量控制装置的具体方案之一(图1a)特制的显微镜载玻片1，其具有由多个散在分布、相互独立的细胞点3构成的质量控制区，每个细胞点由单层或接近单层的培养细胞组成，每种细胞或两到三种细胞的混合物被限制于单个细胞点内。一般情况下，细胞通过共价结合粘附于载体表面。在组织需要贴附于电荷处理的载玻片时，细胞也可以通过电荷作用粘附于载体表面。这个载玻片还包括一个样本区域2和一个标签区域4。质量控制装置的具体方案之二，载玻片的标签(图1b)，它包含一个样本识别标记6，一个靶标(或抗体/探针)识别标记7，标签上还印有预先确定的特定靶标在细胞阵列中的表达模式8，这写特定的表达模式通过质控细胞阵列的分析程序也可以显示9，还可以选择标记试验日期的区域。质量控制装置的具体方案之三，提供一系列预先确定，各种靶标的在细胞阵列中表达模式8的图解(图1c)。这个图解包括，但不局限于以下三项：(A)填充有不同深浅色的实心点，以图1cA为例，最浅色的点代表背景染色(没有或不能检测到靶标/分析物)，随着实心点填充色的加深，逐级代表临界表达(+/-)，弱阳性(+)，中阳性(++)，和强阳性(+++)；(B)带有圆圈的字母用于指示所检测靶标的亚细胞定位，以图1cB为例，空心的圈指示为本底信号(阴性)，有圆圈的字母n指示为阳性信号位于细胞核，有圆圈的字母c指示为阳性信号定位于胞质，有圆圈字母的m指示为阳性信号定位于细胞膜；(C)变化的圆圈，以图表 1cC为例，虚线围成的圆圈指示为本底信号(阴性)，黑色实心线条围成的圆内有白色小点指示为细胞质信号，白色圆圈内有有黑色小点指示为细胞核信号，套有一圈黑色粗线条的圆圈指示为细胞膜信号。 [0028] 质量控制装置的具体方案之四，表面粘附有多个独立细胞点的薄膜，该薄膜的底面可以粘附于所选检测平台的测试面，例如，显微镜载玻片。 [0029] 细胞最好是呈单层粘附于载体表面，但因细胞成团生长，也可形成多层细胞。培养细胞可以在固定和处理前被放置于载体表面。这时，细胞需要在固相载体上被固定和处理。但最好还是在点样于固相载体前，通过化学试剂对细胞进行固定。处理步骤通常包括，酒精脱水、二甲苯或二甲苯替代物透明、浸蜡/包埋。这些步骤类似于组织样本的处理程序。在本发明中，准备细胞阵列所用的处理步骤可以简化，省去脱水和透明的步骤。 [0030] 质量控制装置的具体方案之五，多种类型的细胞被包埋在石蜡中制作包含有多种细胞类型的蜡块。这些细胞蜡块可进一步制作成切片，并粘附于固相载体表面。制作多种细胞类型蜡块的一种方法是将固定和处理过的细胞制作成一束束圆柱形的芯，并将它们包埋在石蜡中；另一种方法是，在可以被显微镜用薄片切片机切断的毛细管中固定和处理特定种类的细胞，多个这样的毛细管聚集成束，并包埋于石蜡中。质量控制细胞阵列可以与样本放置在同一个固相载体表面或放置于单独的载体上。这个载体可以是可粘附质量控制和/或检测样本的显微镜载玻片、透明胶片、薄膜或盖玻片。透明胶片或薄膜可由各种高分子材料，如尼龙、聚苯乙烯、聚丙烯、硝酸纤维等和玻璃制成。胶片或薄膜最好是0.001mm至0.5mm厚度的固相平面。 [0031] 质量控制装置的具体方案之六，每一独立点中的细胞，可作为某些检测的阳性对照，同时又可作为其它检测的阴性对照。本发明中的质量控制细胞阵列是一个低密度阵列，其包含的独立细胞点不超过50个，较好情况的是不超过20个细胞点，少于12个则更好。在本发明中的细胞阵列包含的细胞点的数量不多的理由是便于细胞阵列装置的制造，同时方便检测结果的观察和分析。这项发明中每一个细胞点中的细胞数量是在10至105之间，最好的在102至104之间。 [0032] 2.选择用于质量控制细胞阵列的细胞系 [0033] 具体方案之一，通过对一些列靶标的检测来确定用于质量控制细胞阵列中的细胞系。最佳方案是，由尽可能少的细胞点组成细胞阵列，同时又能对尽可能多的临床相关分析进行质量控制。在这里，分析是指检测特定的被测物、靶标或生物标记物。例如，用一种抗体通过免疫组织化学的方法检测一种靶分子蛋白是一个分析，用另一种抗体通过免疫组化化学的方法检测另一种靶分子蛋白就是另外一个分析。 [0034] 一种细胞系所指的是单一起源、经纯化的培养细胞群。近几十年间，大量肿瘤细胞系被建立，这些细胞系来自于几乎所有类型和起源的恶性肿瘤组织。ATCC目录中收录了大约1000种来自于人类恶性肿瘤的细胞系。来源于肿瘤组织或癌组织的细胞系多通过传代培养或病毒转染获得的，因此它们可表达大多数表达于原发肿瘤或癌的抗原。通过标准化的培养方法，很容易获得大量不同细胞系的培养细胞。 [0035] 培养细胞包含数千种不同的蛋白质抗原和其它生物分子。然而，在数千种不同的蛋白质和生物分子中只有少数对临床诊断和预后判断具有价值。这些分子通常被称为生物标记。在很多培养细胞中，生物标记的表达方式类似于其在病变组织细胞中的表达。在本发明中具有潜在应用价值的细胞系来源于多种恶性肿瘤，因此，其临床相关生物标记的表达或缺失与这些恶性肿瘤中肿瘤细胞的表达情况相似。 [0036] 具体方案之二，质量控制细胞阵列能够提供对照检验的靶标包含了一系列具有很高的临床参考价值的生物标记物。经鉴定，有26种生物标记物具有很高的临床参考价值，包括角蛋白(pancytokeratins)，EMA，S-100，HMB45，平滑肌特异性抗原(smooth muscle specific antigen)，雌激素受体(estrogen receptor，ER)，孕激素受体(progesterone receptor，PR)，Her2，P53，前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)，波形蛋白(vimentin)，嗜铬粒蛋白(chromogranin)，结蛋白(desmin)，CD3，CD20，CD117/c-kit，CD15，CD30，CD45，CD99，Bcl-1(cyclin D1)，Bcl-2，Ki-67，Ig kappa，Iglamda，和CEA。根据本发明的研究，上述26种细胞蛋白是日常免疫组织化学或免疫细胞化学试验的最常用的临床标记物。它们组成了质量控制细胞阵列能够提供对照检验的靶标的核心部分。 [0037] 具体方案之三，质量控制细胞阵列所能提供对照检验的靶标可扩展，涵盖以下细胞蛋白：高分子量细胞角蛋白(cytokeratin，HMW)，低分子量细胞角蛋白(cytokeratin，LMW)，细胞角蛋白7(cytokeratin 7)，细胞角蛋白20(cytokeratin 20)，EMA，S-100，HM45，MART-1，酪氨酸酶(tyrosinase)，PLAP，肝细胞特异性抗原(hepatocyte specific Ag)，肌特异性肌纤蛋白(muscle specific actin)，平滑肌特异性抗原(smooth muscle specific antigen)，ER，PR，Her2，P53，PSA，PSAP，肌形成蛋白(myogenin)，嗜铬粒蛋白(chromogranin)，突触囊泡蛋白(synaptophysin)，结蛋白(desmin)，波形蛋白(vimentin)，CD99，CD3，CD7，CD10，CD4，CD8，CD20，CD117/c-kit，CD5，CD15，CD 21，CD23，CD30，CD45，Bcl-1(cyclin D1)，Bcl-2，Ki-67，Ig kappa，Ig lamda，末端转脱氧核苷酰酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)，钙(视)网膜蛋白(calretinin)，WT-1，TTF-1，和CEA。 [0038] 具体方案之四，质量控制细胞阵列所能提供对照检验的靶标可进一步扩展，涵盖以下细胞蛋白：高分子量细胞角蛋白(cytokeratin，HMW)，低分子量细胞角蛋白(cytokeratin，LMW)，细胞角蛋白5(cytokeratin 5)，细胞角蛋白6(cytokeratin 6)，细胞角蛋白7(cytokeratin 7)，细胞角蛋白8(cytokeratin 8)，细胞角蛋白14(cytokeratin14)，细胞角蛋白18(cytokeratin 18)，细胞角蛋白19(cytokeratin 19)，细胞角蛋白 20(cytokeratin 20)，EMA，抑制素(inhibin)，乳腺珠蛋白(mamaglobin)，Ki-67，P27，P53，末端转脱氧核苷酰酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)，，耐酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRACP 5b)，TTF 1，PLAP，AFP，hCG，雌激素受体(estrogen receptor，ER)，Her2，EGFR，孕激素受体(progesterone receptor，PR)，Zap-70，P63，前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)，前列腺特异性酸性磷酸酶(prostate specific acid phosphatase，PSAP)，肝细胞特异性抗原(hepatocyte specific Ag)，嗜铬粒蛋白(chromogranin)，突触囊泡蛋白(synaptophysin)，CD1a，CD3，CD4，CD5，CD7，CD8，CD10，CD15，CD20，CD21，CD23，CD30，CD34，CD35，CD43，CD56，CD57，CD79a，CD99，CD117/c-kit，Bcl1(cyclinD1)，Bcl2，Bcl-6，间变淋巴瘤激酶-1(anaplastic lymphoma kinase-1，Alk-1)，fascin，Ig Kappa，Ig Lamda，Pax-5，P 504s，MART-1，HMB45，S-100，PAP，NF，酪氨酸酶(tyrosinase)，钙(视)网膜蛋(calretinin)，WT-1，CEA，Cox-2，肌特异性肌纤蛋白(muscle specific actin)，平滑肌肌纤蛋白(smooth muscle actin)，结蛋白(desmin)，肌形成蛋白(myogenin)，和波形蛋白(vimentin)。 [0039] 具体方案之五，质量控制细胞阵列所能提供对照检验的靶标可进一步扩展，涵盖以下细胞蛋白和生物标记物：肌特异性肌纤蛋白(muscle specific actin)，平滑肌肌纤蛋白(smooth muscle actin)，Alk-1，Bcl-1，Bcl-2，Bcl-6，BF-1，CD1a，CD3，CD4，CD5，CD7，CD8，CD10，CD15，CD20，CD21，CD22，CD23，CD25，CD30，CD31，CD34，CD35，CD38，CD43，CD44，CD45，CD56，CD57，CD68，CD79a，CD117/C-kit，CD138，CEA，嗜铬粒蛋白(chromogranin)，簇连蛋白(clusterin)，高分子量细胞角蛋白(cytokeratin，HMW)，低分子量细胞角蛋白(cytokeratin，LMW)，细胞角蛋白5(cytokeratin 5)，细胞角蛋白6(cytokeratin 6)，细胞角蛋白7(cytokeratin 7)，细胞角蛋白8(cytokeratin 8)，细胞角蛋白14(cytokeratin14)，细胞角蛋白18(cytokeratin 18)，细胞角蛋白19(cytokeratin 19)，细胞角蛋白 20(cytokeratin 20)，结蛋白(desmin)，EMA，成束蛋白(fascin)，粒酶B(granzyme B)，HBME，血红蛋白(hemoglobin)，IgA，IgD，IgE，IgG，IgM，J-chain，Ki-67，Ig kappa，Ig lambda，LMP-1，MUM1，髓过氧化物酶(myeloperoxidase)，NSE，Ab OCT-2，S-100，Pax5，TDT，TIA-1 TRAP，TTF-1，Vs38c，波形蛋白(vimentin)，Zap-70，CD83，P62，CK18，CD163，P63，P16，Stat-3，钙(视)网膜蛋(calretinin)，BerEp4，CK5/6，泛素(ubiquitin)，酪氨酸酶(tyrosinase)，PR，ER，突触囊泡蛋白(synaptophysin)，E-钙粘蛋白(E-cadherin)，MyoD1，小眼相关转录因子抗体(microphthalmia)，MUC-1，MUC-2，层粘连蛋白(laminin)，肌形成蛋白(myogenin)，HER2，EGFR，MOC-31，CD99，TAG-72，MLH-1，MSH-2，AR，绒毛蛋白(villin)，黑色素瘤相关抗原(melanoma assoc Ag)，ACT，alpha-1抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrysin)，P27，P504s，抑制素(inhibin)，PSA，AFP，MUC-5，MUC-6，P21，纤连蛋白(fibronectin)，P53，beta-连环蛋白(beta-catenin)，CD123，CD24，CD133，腺病毒抗原(adenovirus antigens)，巨细胞病毒抗原(cytomegalovirus(CMV)antigens)，EB病毒抗原(Epstein-Barr virus(EBV)antigens)，幽门螺杆菌抗原(Helicobactor pylori antigens)，人类乳头状瘤病毒抗原(human papillomaviruses(HPV)antigens)，HBcAg，HSV I&II antigens，Her2基因扩增(Her2 gene amplification)，c-myc基因异位(c-myc gene translocation)，poly-A mRNA，Ig kappa mRNA，和Ig lambda mRNA. [0040] 具体方案之六，检测靶标组可以只包括一种或多种微生物抗原或基因。在此情况下，质量控制细胞阵列所包含的细胞点中的细胞包含一种或多种微生物的抗原或基因。同时，质量控制细胞阵列还可包含一个不含微生物抗原或基因的细胞点，作为阴性对照。 [0041] 仅仅10个细胞点就足以满足对免疫组织化学方法检测上述几组扩展的靶标进行质量控制的需要(图3)，对于每一个靶标，至少有一个细胞点呈阳性。图3所示细胞阵列，包含5个来自于恶性肿瘤细胞系的点，2点个来自淋巴瘤细胞系，黑素瘤、肉瘤和神经源性恶性肿瘤的细胞系各有1个点。 [0042] 除免疫组织化学IHC所涉及的蛋白靶标，质量控制细胞阵列也可为在原位杂交试验ISH中的核酸靶标提供对照。如，c-myc基因异位，Her2基因扩增，poly-ARNA和kappa/lambda mRNA就是原位杂交试验ISH的对照。 [0043] 在免疫组织化学IHC中，检测靶标组是蛋白质性质的抗原，可通过特异性抗体来检测。在本发明中，检测靶标组可包括所有上述标记，甚至更多，如，新发现和引入的有用临床价值的生物标记物。在这种情况下，质量控制细胞阵列必需能够包含更多数量的培养细胞系。根据特定的诊断、预后判断或研究需要，可以编制有针对性的缩减的检测靶标组。这时，构建符合质控要求的细胞阵列就只需要相对较少的细胞系了。 [0044] 为实现对所选特定的检测靶标组的质量控制，组中各成分应至少被所构建细胞阵列中的一种细胞系所表达并可以被检测到，以提供阳性对照；组中各成分也应至少不被所构建细胞阵列中的一种细胞系所表达且不能被检测到，以提供阴性对照。然而，如果检测靶标组中包含有广泛表达的检测靶标或标记物，细胞阵列就不能为这个靶标提供阴性对照。广泛表达的检测靶标或标记物，如：PCNA，GAPDH，beta-actin以及很多其它参与细胞基本生理功能代谢调节的蛋白(看家基因相关蛋白)可表达于所有细胞系。解决这个问题的具体方案是，在细胞阵列中加入一个非人源性的细胞系，作为广泛表达的人类生物标记物的阴性对照。这项发明中细胞系选择的具体方案还包括，质量控制细胞阵列中，对于一个特定的非广泛表达的检测靶标，不超过75％，50％，25％，或10％的细胞点可产生能被检测的阳性信号。这项发明还体现在，在检测靶标组中，广泛表达的靶标被标明，且区别于组中的其他靶标。名词“可检测的水平”所指的是在检测中产生的信号强度能显示某一靶标或标记物的表达或存在，可以是色彩或荧光信号；“可检测的水平”所指的是高于背景噪音的的信号强度。“不可检测的水平”所指的是不能与背景噪音相区别的信号强度。 [0045] 这项发明的一个具体方案是，在质量控制细胞阵列中加入一个非人源性的细胞系所构成的细胞点，来为所有靶标，包括广泛表达的靶标，提供阴性对照。在这里，非人源性的细胞系并不限于某种特定的非人源性细胞系。专业的研究人员认为，根据特定检测靶标组的需要，来自多种生物体如：小鼠、牛和昆虫的细胞系均可用于本发明的细胞阵列。 [0047] 检测靶标组可以只由来源于微生物的靶标(蛋白或基因序列)组成，也可以既包括微生物靶标，又包括来源于细胞的靶标。来源于微生物的靶标可以通过用微生物直接感染培养细胞而引入细胞点中，也可以通过基因工程的方法把微生物基因或基因片段导入并表达在细胞中。 [0048] 3.质量控制细胞阵列的使用方法 [0049] 这项发明还包括这里所描述的装置使用方法。细胞阵列质控载玻片可单独使用，或点在载玻片上的测试区域，其测试区域可加载待测样本(图1a)。确认和验证免疫组织化学IHC、免疫细胞化学ICC、原位杂交ISH的试验结果可靠的方法，包括生物样本中所检测的靶标是否存在及其细胞定位。方法包括，在检测某一个或多个靶标分子时，同步处理生物标本和本发明中的细胞阵列质量控制装置。这里所用的名词“处理”所指的是执行检测靶标分子是否存在及其亚细胞定位的所有程序。如，“处理”可以是执行免疫组织化学试验IHC的程序，通过可与该蛋白特异结合的抗体来检测靶蛋白的存在。在合适的条件下，抗体与靶蛋白特异性结合，再检测与靶蛋白结合的抗体携带的信号(如：显色反应产生的色彩信号)，检测到这些信号可指示靶蛋白的存在，不能检测到信号说明靶蛋白不表达。专业的研究人员非常熟悉这样些试验步骤。在举例部分，我们提供了标准的的免疫组织化学IHC和原位杂交ISH操作流程。 [0050] 要使这个装置能被正确的使用，还需为细胞阵列和相关的检测靶标组建立一个预设的数据库。预设的数据库将以纸质材料或数字媒介的形式储存和提供。为建立预设数据库，在质控细胞阵列装置上需进行大量试验，用相关试剂对检测靶标组中的每个组分进行独立的测试。例如，为建立26分子核心检测靶标组的免疫组织化学试验数据库，将在独立的细胞阵列装置上，通过特异性抗体，按照例2中所提供的操作流程，对其中每一组分进行独立试验。质控细胞阵列中的所有细胞都将与检测试剂进行反应。对于特定的靶标，某些细胞点中的部分或所有细胞将产生阳性信号，而其它细胞点中所有细胞将产生阴性信号。 [0051] 名词“阳性信号”所指的是针对感兴趣的特定检测靶标的检测试剂所产生的信号，高于本底信号，在肉眼观察或机器检测时，易于与非特异性的背景信号区分。名词“阴性信号”所指的是针对感兴趣的特定检测靶标的检测试剂所产生的信号，在肉眼观察或机器检测时，不能与非特异性的背景信号区分。这些信号将被记录和分析，并给出数码的或数字的指示。例如，强阳性信号可转变为高像素，或记为多个“+”符号。例如，“+++”表示强性，“++”表示中阳性，“+”表示弱阳性性，“+/-”表示不确定的阳性，“-”表示阴性。除反应细胞中的靶标表达水平的信号强度，在分析过程中，还能显示和记录检测靶标组中各组分的亚细胞定位。在获得检测靶标组所有组分在质量控制细胞阵列的所有细胞点中表达的定量或半定量结果以及亚细胞定位的信息之后，我们就建立了所需的预设数据库。数据库可通过纸质材料储存，包括但不仅仅是：目录、图表或图片集。数据库也可以通过一个数字媒介被储存和呈现，例如电脑显示器和CD/DVD。 [0052] 如检测靶标组中所包含的靶标在质量控制细胞阵列的细胞点中形成典型的阳性信号，可作为独立验证，证明在生物样品中检测靶标的操作是正确无误的。当生物样品产生阴性结果时，如无着色或荧光信号，这样的对照显得尤为重要。质量控制细胞阵列产生的阳性结果可以确认上述结果是真正的阴性结果，而非程序的错误或试剂质量的问题所造成的。因为生物样本和质量控制细胞阵列被粘附于同一张显微镜载玻片上，并在同样的条件下，与同样试剂接触，因此形成可靠的验证。 [0053] 另一个具体方案包括，在生物样本中确定靶分子亚细胞定位的分析方法。方法包括，在免疫组织化学IHC或原位杂交试验ISH中，如上所述，同时处理生物样本和质量控制细胞阵列。处理结果表现为靶分子在生物样本的细胞和质量控制细胞阵列的细胞中特定亚细胞区域存在或不存在。生物样本中靶分子所产生的可检测信号的亚细胞定位与其在质量控制细胞阵列中的细胞点中所产生信号的亚细胞定位进行比较。 [0054] 亚细胞的定位包括，但不局限于：细胞核、细胞质、细胞膜和核膜。特定靶标的表达水平和它们的亚细胞定位在质量控制细胞阵列的特定细胞系中是不变的，在设计和制作质量控制细胞阵列之时即被确定并记录。对生物样品以及质量控制细胞阵列进行某一试验程序，检测特定靶分子的结果可以与预先确定并记录的，质量控制细胞阵列中该分子在细胞中的亚细胞定位和表达水平进行比较。如这次试验在质量控制细胞阵列中的结果与预先确定并记录的某特定靶标的数据一致，证明这次试验的操作是成功的，这次试验在生物样本中的结果可信，可以发出报告。如这次试验在质量控制细胞阵列中的结果与预先确定并记录的某特定靶标的数据不一致，则说明这次试验的操作存在问题，该试验在生物样本中的结果不可信，不能发出报告。 [0055] 本发明还包括一个商品化的试剂盒。试剂盒由：质量控制细胞阵列装置，通过阵列可实现质量控制的一组检测靶标的信息，预先确定并记录的包括质量控制细胞阵列中每个细胞点中每一个检测靶标的表达水平和亚细胞定位信息的数据库。靶标的表达水平可以通过数码像素来定量或“+”符号的数量来半定量。例如，“+++”代表强阳性，“++”代表阳性，“+”代表弱阳性，“+/-”代表不确定，“-”代表阴性。其中还包含有一个记录了每个检测目标在每个点的表达水平的表格或电脑文档，以及打印出来的通过扫描获得的或是数字版的每个检测目标在每个点的表达水平的图像结果。 [0056] 例1包含在质量控制细胞阵列中的细胞系的选择与被控制的检测靶标组是有紧密关系的。在这个例子中，11个细胞系被选择出来制作成一个11个点的质量控制细胞阵列，包括细胞系Hela(宫颈腺癌)，LS174T(结肠直肠腺癌)，SW480(腺癌，结肠直肠的)，BT474(乳房导管癌)，MCF-7(乳腺癌)，22Rv1(前列腺癌)，Ragi(B细胞，伯基特淋巴瘤)，HuT 78(T细胞淋巴瘤)，Jurkat(T细胞白血病)，SK-UT-1(肉瘤)，SW1353(肉瘤)，和CaC1(黑素瘤)。这11种从质量控制细胞阵列选出的细胞系，涵盖目标蛋白质的26个成员的核心组，在某种程度上，每一个目标蛋白质在这个核心组中，在至少一个细胞系中都表示出一个可发觉的水平，同时目标蛋白质在至少一个细胞系中表现出一个不可发觉的水平。 [0057] 例2免疫组织化学(IHC) [0058] 在这个例子中，一个生物样本(包括质量控制细胞阵列)被抗体处理(首要的和次要的)，已处理过的给色原体彩色胶片显影，然后最后给复染色。 [0059] A.去石蜡化 [0060] 当使用石蜡植入的组织切片时，去石蜡化必须被执行，作为代表性的是经过五轮二甲苯的2分钟浸泡，两次100％酒精，一次95％的酒精使再水化，然后在室温下空气干化五分钟。 [0061] B.抗原获取 [0062] 在IHC着色中使用特定的抗体的技巧众所周知，是需要通过一个抗原获取程序预处理福尔马林固着组织切片，通常是在抗原获取溶液中通过加热或蛋白化解酶处理。在抗原获取之后，样本，包括质量控制细胞阵列，被用含5％的混合正常羊或马血清在室温中孵化20-30分钟。 [0063] C.最初的和继发的抗原反应 [0064] 紧接着通过血清的孵化，样本被用PBS冲洗。预稀释的最初的抗原血清或抗体(大约150-200mu.L)被应用于每一个样本。样本被通过抗原血清或抗体在室温下孵化2-4小时，或在一个潮湿的40摄氏度的环境中孵化2小时，或者可以在一个室温的潮湿的环境中孵化一整夜。在孵化后的在载玻片上的样本，将会通过PBS在染色碟中冲洗3次。 [0065] 冲淡的次级的抗体(大约150-200mu.L)被应用在每一个在载玻片上的样本。这被在一个40摄氏度的潮湿的环境中孵化30分钟。在孵化后的样本，将会通过PBS在染色碟中冲洗3次。 [0066] D.内生过氧化物酶活动的移除 [0067] 在载玻片上的样本接着被放置入一个含3％过氧化氢和1％叠氮化钠的500mlPBS溶液中，并在室温下孵化15分钟来移除内生过氧化物酶活动。在通过过氧化氢PBS孵化后的在载玻片上的样本，将会通过PBS在染色碟中冲洗3次。 [0068] E.彩色胶片显影 [0069] ABC合成物(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，Calif.)通过使用PBS稀释它们的活跃集中。这活跃集中(大约150-200mu.L)适用于每一个在载玻片上的样本。ABC溶液的孵化是在一个40摄氏度的潮湿的环境中30分钟。孵化后的在载玻片上的样本，将会通过PBS在染色碟中冲洗3次。 [0070] DAB溶液是通过添加100mg DAB至100mL PBS和添加50.mu.L含30％H2O2的溶液来准备的。大约150-200.mu.L的DAB溶液被添加至每一个在载玻片上的样本中。彩色胶片显影可以通过显微镜观察来监视。有色的沉淀将会在正细胞上形成。颜色在2-5分钟后开始显现，通常在10分钟内达到足够的成像，但20-30分钟的孵化可能需要被用来给比较软弱的着色样本。为了停止发展，在载玻片上的样本将会通过去离子水在染色碟中冲洗3次。 [0071] F.相反着色 [0072] 在载玻片上的样本浸入Harris的苏木精中10-50秒，并通过蘸入去离子水三次来清洗，然后浸在0.2％氢氧化铵溶液中30秒，并通过蘸入去离子水三次来清洗。它们浸入95％乙醇中两次，每次2分钟，接下来浸入100％乙醇中两次，每次2分钟，最后，这个载玻片通过浸入二甲苯中两次，每次2分钟来清洁。 [0073] 例3原位杂交 [0074] 在这个例子中，生物样本同质量控制细胞阵列(今后也当作样本引用)在载玻片上，通过维生素或异羟基洋地黄毒甙元标记探针，与反维生素或反异羟基洋地黄毒甙元抗体发生化学反应。这个样本因此被着色。 [0075] A.去石蜡化 [0076] 在载玻片上的样本通过放入二甲苯中四次，每次5分钟，100％乙醇中两次，每次1分钟，和95％乙醇中两次，每次1分钟来去石蜡化。去石蜡化的组织切片载玻片然后通过含RNase Block(BioGenex，San Ramon，Calif.)去离子水被清洁和冲洗。 [0077] B.安装好的组织样本的蛋白酶K处理 [0078] 大约150-200.mu.L的新鲜的冲淡的蛋白酶K溶液被放置在每一个在载玻片的样本上，并在室温下孵化15分钟。消化后，在载玻片上的样本被500mL的PBS通过RNase Block在染色碟上冲洗5分钟。样本通过浸入一个染色碟中接连以下溶液来脱水：500mL蒸馏水外加RNase Block10秒钟，500mL 50％的乙醇加上RNase Block10秒钟，500mL的95％的乙醇10秒钟，和500mL 100％乙醇10秒钟。整个载玻片在室温下干燥5分钟。 [0079] C.用维生素或异羟基洋地黄毒甙元做标记探针的杂交 [0080] 包含维生素或异羟基洋地黄毒甙元标记寡核苷酸探针的杂交溶液被放置在每一个载玻片的样本上。这需要大约50-100.mu.L的溶液。载玻片被放置在一个烤箱中或一个加热块上，以95摄氏度8-10分钟，来改变核酸的习性。这个步骤消除了mRNA顺序的发夹环或翻胶。在改变本性的步骤后，载玻片被在45摄氏度下，在一个潮湿环境中孵化一整夜。接着杂交步骤，载玻片被在染色碟中清洗2次。SSC(标准化的柠檬酸盐溶液)在37摄氏度下5分钟，接下来被在1倍的SSC在37摄氏度下5分钟冲洗。这接下来被在0.2倍的SSC在60摄氏度下冲洗30分钟。最后，这个载玻片被PBS冲洗2次，每次2-5分钟。 [0081] D.信号检测 [0082] 载玻片被垂直的放入染色碟中，含500mL的5％混合标准山羊和马的血清，在室温下20分钟。预冲淡的老鼠反维生素或老鼠反异羟基洋地黄毒甙元抗体(150-200.mu.L)应用于每一个在载玻片的样本上。这个含有抗体的在载玻片上的样本在40摄氏度的潮湿的环境下孵化2小时。在有反维生素或反异羟基洋地黄毒甙元抗体孵化后，这个在载玻片上的样本被在染色碟上通过PBS清洗3次。 [0083] E.次级抗体的应用 [0084] 预冲淡的二级抗体(大约150-200.mu.L)被应用在每一个在载玻片的样品中，并在40摄氏度的潮湿的环境中孵化30分钟。孵化后，在载玻片上的样本被PBS在着色碟上清洗3次。 [0085] F.内生过氧化物酶活动的移除 [0086] 在载玻片上的样本被放置进含500mL的PBS含3％过氧化氢和0.1％叠氮化钠的着色碟中，并在室温下孵化15分钟。在通过过氧化氢PBS孵化后的在载玻片上的样本，被PBS在着色碟上冲洗3次。 [0087] G.ABC合成物“ELITE”的应用 [0088] ABC合成物通过使用PBS稀释它们的活跃集中。这活跃集中(大约150-200mu.L)适用于每一个在载玻片上的样本，并在一个40摄氏度的潮湿的环境中孵化30分钟。孵化后的在载玻片上的样本，将会通过PBS在染色碟中冲洗3次。 [0089] H.使用二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)的色原体彩色胶片显影 [0090] DAB溶液通过添加100mg DAB至100mL PBS中和添加50.mu.L的含30％的H2O2准备的。大约150-200.mu.L的DAB溶液被添加到每一个在载玻片上的样本中。彩色胶片显影可以在显微镜下通过DAB观察在载玻片上的样本来监视。有色的沉淀将会在正细胞上形成。颜色在2-5分钟后开始显现，通常在10分钟内达到足够的成像，但20-30分钟的孵化可能需要被用来给比较软弱的着色样本。为了停止发展，在载玻片上的样本将会通过去离子水在染色碟中冲洗3次。 [0091] I.对比染色 [0092] 在载玻片上的样本浸入Harris的苏木精中10-50秒，并通过蘸入去离子水三次来清洗。载玻片然后被浸在0.2％氢氧化铵溶液中30秒，并通过蘸入去离子水三次来清洗。它们浸入95％乙醇中两次，每次2分钟，接下来浸入100％乙醇中两次，每次2分钟，最后，这个载玻片通过浸入二甲苯中两次，每次2分钟来清洁。 |
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