同时改善女性私护健康和皮肤衰老的格氏乳杆菌及其组合物专利检索-··含微生物专利检索查询-专利查询网

同时改善女性私护健康和皮肤衰老的格氏乳杆菌及其组合物

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202311478046.X	申请日	2023-11-07
公开(公告)号	CN117625443A	公开(公告)日	2024-03-01
申请人	江南大学;	申请人类型	学校
发明人	崔树茂; 毛丙永; 林如梦; 张秋香; 唐鑫; 赵建新; 陈卫;	第一发明人	崔树茂
权利人	江南大学	权利人类型	学校
当前权利人	江南大学	当前权利人类型	学校
省份	当前专利权人所在省份：江苏省	城市	当前专利权人所在城市：江苏省无锡市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：江苏省无锡市新吴区净慧东道66号(江南大学国家大学科技园)	邮编	当前专利权人邮编：214000
主IPC国际分类	C12N1/20	所有IPC国际分类	C12N1/20 ; A61K35/747 ; A61P15/02 ; A61P31/04 ; A61P17/18 ; A23L33/135 ; A61L15/36 ; A61L15/46 ; C12R1/225
专利引用数量	0	专利被引用数量	2
专利权利要求数量	10	专利文献类型	A
专利代理机构	哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司	专利代理人	赵巧娜;
摘要	本发明公开了同时改善女性私护健康和皮肤衰老的格氏乳杆菌及其组合物，属于微生物技术领域。本发明自健康女性阴道分泌物中筛选得到了一株格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313，此格氏乳杆菌CCFM1313及同时含有上述格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316或其发酵液的组合物具有修复阴道炎引起的氧化损伤相关症状，缓解皮肤衰老的作用。因此，格氏乳杆菌CCFM1313、及同时含有上述格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316或其发酵液的组合物在改善和修复阴道炎产生的氧化损伤，以及由阴道炎引起的皮肤健康问题的产品中，具有巨大的应用前景。
权利要求	1.一株格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313，已于2023年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63709。 2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的格氏乳杆菌CCFM1313或其发酵液或其裂解液；或所述微生物菌剂中同时含有权利要求1所述的格氏乳杆菌CCFM1313或其发酵液或其裂解液、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1316或其发酵液或其裂解液；所述副干酪乳酪杆菌CCFM1316，于2023年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63712。 3.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的格氏乳杆菌CCFM1313或含有权利要求2所述的微生物菌剂。 4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药品、保健品或卫生用品。 5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述食品包括膳食补充剂、普通食品、保健品；所述卫生用品包括卫生湿纸巾、卫生巾、卫生护垫、卫生栓、卫生棉、阴道洗液、女士抗菌/抑菌洗剂。 6.权利要求1所述的格氏乳杆菌CCFM1313或其发酵液或其裂解液，或含有权利要求2所述的微生物菌剂在制备缓解和/或治疗细菌性阴道炎或抗衰老的产品中的应用。 7.含有权利要求1所述的格氏乳杆菌CCFM1313或其发酵液或其裂解液、副干酪乳酪杆菌CCFM1316或其发酵液或其裂解液的组合物在制备缓解和/或治疗细菌性阴道炎或抗衰老的产品中的应用。 8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述产品为药品、保健品或卫生用品。 9.根据权利要求8所述的产品，所述卫生用品包括卫生湿纸巾、卫生巾、卫生护垫、卫生栓、卫生棉、阴道洗液、女士抗菌/抑菌洗剂。 10.权利要求1所述的格氏乳杆菌CCFM1313或其发酵液或其裂解液或同时含有权利要求1所述的格氏乳杆菌CCFM1313或其发酵液或其裂解液、副干酪乳酪杆菌CCFM1316或其发酵液或其裂解液的组合物在制备具有以下任一用途的微生物制剂中的应用： (1)在上调细胞Nrf2 mRNA表达，提高细胞上清Nrf2含量； (2)降低阴道炎小鼠阴道上皮细胞脱落； (3)改善小鼠阴道病理表征； (4)改善小鼠阴道氧化应激：激活Nrf2/SOD1通路，增加阴道组织Nrf2与SOD水平； (5)增强小鼠皮肤抗衰老能力：下调MAPK/AP‑1/MMP‑1mRNA表达。
说明书全文	同时改善女性私护健康和皮肤衰老的格氏乳杆菌及其组合物技术领域 [0001] 本发明涉及同时改善女性私护健康和皮肤衰老的格氏乳杆菌及其组合物，属于微生物技术领域。背景技术 [0002] 阴道病是一种育龄妇女常见的阴道感染性疾病，具有复发率高、临床症状不典型的特点，临床容易漏诊。 [0003] 侵入阴道环境中的致病菌通过黏附于生殖道上皮细胞，释放毒素造成细胞线粒体损伤，产生大量活性氧(ROS)，促使机体氧化还原反应系统失衡，造成氧化损伤。转录因子核因子‑红细胞相关因子2(Nrf2)是一个重要的抗氧化转录因子，在正常情况下，Nrf2在细胞质中保持低水平，研究证明，益生菌通过对Nrf2 信号通路的激活，能够提高Nrf2基因和蛋白表达量，增加细胞的抗炎和抗氧化能力。同时，Nrf2可与超氧化物歧化酶(SOD)协同增效，诱导氧化应激反应。MAPK是一种胞内苏氨酸蛋白激酶，可以在胞外被ROS激活，激活转录因子AP‑1从而进一步调控MMPs的转录，尤其是MMP家族的间质胶原酶(MMP‑1)、基质分解素‑1(MMP‑3)和明胶酶(MMP‑9)，导致胶原蛋白和弹性蛋白的降解。 [0004] 目前，用于治疗阴道炎选用的药物主要包括硝基咪唑类(甲硝唑、替硝唑)和林可霉素类(克林霉素)。然而抗生素无法修复由于氧化应激受损的阴道环境，使阴道炎复发的风险高居不下。 [0005] 有研究表明在复发性阴道炎的治疗中，辅以使用乳杆菌活菌胶囊，可显著降低复发率。此外，通过对3项单一菌株和包含相应单菌的复合益生菌配方的功效进行对比，结果发现单一或复合益生菌均能有效促进小鼠免疫机能，且复合益生菌治疗效果更显著。因此多菌株联合使用可能产生协同效应，增强菌株的生存能力，对机体进行持续稳定而全面地调节。 [0006] 目前，市面上销售的用于治疗阴道炎的本土益生菌产品十分有限。康白等于1989年从健康妇女阴道分泌物中分离筛选出一株德氏乳杆菌DM8909菌株，通过初步试验(《乳杆菌DM8909菌株抑制小鼠阴道感染的研究》，中国微生态学杂志，2003)和临床数据(《德氏乳杆菌DM8909菌株对细菌性阴道病治疗的Ⅱ期临床试验研究》，中国微生态学杂志，2001)表明该菌具有良好的益生特性和治疗细菌性阴道病的效果。此外，部分专利涉及了针对阴道炎的益生菌组合物，主要以调节阴道炎症因子为主(CN110339216A、CN111647525A)。然而，未有报道就抗氧化能力评价益生菌组合物的效果，并且未见其对阴道炎造成的氧化损伤做相应研究。因此，还未有阐明机制、明确能够用于缓解细菌性阴道炎及阴道炎引起的阴道氧化损伤与皮肤健康的格氏乳杆菌及其组合物。发明内容 [0007] 本发明提供一株能够缓解阴道炎，改善阴道炎引起的氧化损伤，以及由阴道炎引起的皮肤健康问题的格氏乳杆菌；格氏乳杆菌CCFM1313在体外具有良好的激活Nrf2表达提高阴道上皮细胞培养上清中Nrf2浓度的能力，具有潜在缓解阴道炎氧化应激的能力。选择SPF级BALB/c小鼠、雌性、7周龄、体重18‑20g。小鼠在适应期后连续三天注射戊酸雌二醇，进行诱导发情处理。用阴道加徳纳菌连续侵染5天，每天一次。所述侵染的具体操作手法为配10 置10 CFU/mL阴道加德纳菌菌悬液，剂量为20μL/只。用枪头吸取20μL菌悬液，缓缓注入小鼠阴道内，将小鼠倒立，停留1‑2分钟，放入笼中。将阴道炎模型的小鼠分为模型组、干预组，其 9 中，干预组灌胃100μL浓度为10 CFU/mL的益生菌菌悬液，其中组合物是将CCFM1313与CCFM1316以1：1复配，模型组仅单纯地进行阴道加德纳菌侵染，不接受后期干预，干预组进行阴道加德纳菌侵染后，接受益生菌进行后期干预；另外，设置空白对照组，其中，空白对照组没有进行阴道加德纳菌感染，且不接受益生菌后期干预；实验过程中，通过分析小鼠阴道内阴道加德纳菌定植情况、阴道上皮细胞脱落情况、抗氧化因子(Nrf2)分泌、抗氧化通路(Nrf2/SOD1)表达以及组织病理情况，评判小鼠细菌性阴道炎治疗效果，同时检测小鼠皮肤组织MAPK/AP‑1/MMP‑1mRNA表达评价对小鼠由阴道炎引起的皮肤衰老的干预效果。 [0008] 本发明提供了一株格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313，于2023年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63709。 [0009] 本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313或其发酵液，或其裂解液。 [0010] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为液体制剂、粉剂或颗粒制剂。 [0011] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313冻干粉。 [0012] 在本发明的一种实施方式中，上述微生物菌剂中，所述格氏乳杆菌6 6 (Lactobacillus gasseri)CCFM1313的添加量至少为：10CFU/mL或10CFU/g。 [0013] 本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313或其发酵液或其裂解液；或所述微生物菌剂中同时含有上述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313或其发酵液或其裂解液、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1316或其发酵液或其裂解液； [0014] 所述副干酪乳酪杆菌CCFM1316，于2023年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63712。 [0015] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为液体制剂、粉剂或颗粒制剂。 [0016] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为同时含有格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1316混合物的冻干粉。 [0017] 在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1316是按照1：6 6 1的比例混合后得到的，所述微生物菌剂中的活菌数至少为：10CFU/mL或10CFU/g。 [0018] 本发明提供了一种产品，所述产品中含有上述格氏乳杆菌CCFM1313或含有上述微生物菌剂。 [0019] 在本发明的一种实施方式中，上述产品中，所述格氏乳杆菌(Lactobacillus 6 6 gasseri)CCFM1313的添加量至少为：10CFU/mL或10CFU/g。 [0020] 在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品、保健品或卫生用品。 [0021] 在本发明的一种实施方式中，所述食品包括膳食补充剂、普通食品、保健品；所述卫生用品包括卫生湿纸巾、卫生巾、卫生护垫、卫生栓、卫生棉、阴道洗液、女士抗菌/抑菌洗剂。 [0022] 在本发明的一种实施方式中，所述药品包含上述组合物以及药学上允许的载体。 [0023] 在本发明的一种实施方式中，所述载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。 [0024] 在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、栓剂或口服液。 [0025] 在本发明的一种实施方式中，所述药品包括经口有肠溶衣的片剂和胶囊、口服液；阴道用栓剂、片剂、明胶胶囊、喷雾剂、乳膏、凝胶。 [0026] 本发明提供了一种产品，所述产品中同时含有上述格氏乳杆菌CCFM1313或其发酵液或其裂解液、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1316或其发酵液或其裂解液；所述副干酪乳酪杆菌CCFM1316，于2023年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63712。 [0027] 在本发明的一种实施方式中，所述产品中，格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1316是按照1：1的比例6 6 混合后得到的，所述微生物菌剂中的活菌数至少为：10CFU/mL或10CFU/g。 [0028] 在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品、保健品或卫生用品。 [0029] 在本发明的一种实施方式中，所述食品包括膳食补充剂、普通食品、保健品；所述卫生用品包括卫生湿纸巾、卫生巾、卫生护垫、卫生栓、卫生棉、阴道洗液、女士抗菌/抑菌洗剂。 [0030] 在本发明的一种实施方式中，所述药品包含上述组合物以及药学上允许的载体。 [0031] 在本发明的一种实施方式中，所述载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。 [0032] 在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、栓剂或口服液。 [0033] 在本发明的一种实施方式中，所述药品包括经口有肠溶衣的片剂和胶囊、口服液；阴道用栓剂、片剂、明胶胶囊、喷雾剂、乳膏、凝胶。 [0034] 本发明还提供了上述格氏乳杆菌CCFM1313或含有上述微生物菌剂在制备缓解和/或治疗细菌性阴道炎或抗衰老或卵巢保养的产品中的应用。 [0035] 在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品、保健品或卫生用品。 [0036] 在本发明的一种实施方式中，所述食品包括膳食补充剂、普通食品、保健品；所述卫生用品包括卫生湿纸巾、卫生巾、卫生护垫、卫生栓、卫生棉、阴道洗液、女士抗菌/抑菌洗剂。 [0037] 在本发明的一种实施方式中，所述药品包含上述组合物以及药学上允许的载体。 [0038] 在本发明的一种实施方式中，所述载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。 [0039] 在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、栓剂或口服液。 [0040] 在本发明的一种实施方式中，所述药品包括经口有肠溶衣的片剂和胶囊、口服液；阴道用栓剂、片剂、明胶胶囊、喷雾剂、乳膏、凝胶。 [0041] 本发明还提供了含有上述格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316或其发酵液的组合物在制备缓解和/或治疗细菌性阴道炎或抗衰老的产品中的应用。 [0042] 在本发明的一种实施方式中，所述组合物中，格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1316是按照1：6 6 1的比例混合后得到的，所述微生物菌剂中的活菌数至少为：10CFU/mL或10CFU/g。 [0043] 在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品、保健品或卫生用品。 [0044] 在本发明的一种实施方式中，所述食品包括膳食补充剂、普通食品、保健品；所述卫生用品包括卫生湿纸巾、卫生巾、卫生护垫、卫生栓、卫生棉、阴道洗液、女士抗菌/抑菌洗剂。 [0045] 在本发明的一种实施方式中，所述药品包含上述组合物以及药学上允许的载体。 [0046] 在本发明的一种实施方式中，所述载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。 [0047] 在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、栓剂或口服液。 [0048] 在本发明的一种实施方式中，所述药品包括经口有肠溶衣的片剂和胶囊、口服液；阴道用栓剂、片剂、明胶胶囊、喷雾剂、乳膏、凝胶。 [0049] 本发明还提供了上述格氏乳杆菌CCFM1313或同时含有上述格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316或其发酵液的组合物在制备具有以下任一用途的微生物制剂中的应用： [0050] (1)在上调细胞Nrf2 mRNA表达，提高细胞上清Nrf2含量； [0051] (2)降低阴道炎小鼠阴道上皮细胞脱落； [0052] (3)改善小鼠阴道病理表征； [0053] (4)改善小鼠阴道氧化应激：激活Nrf2/SOD1通路，增加阴道组织Nrf2与SOD水平； [0054] (5)下调小鼠阴道炎症因子TNF‑α含量； [0055] (6)增强小鼠皮肤抗衰老能力：下调MAPK/AP‑1/MMP‑1mRNA表达。 [0056] 有益效果 [0057] 本发明自健康女性阴道分泌物中筛选得到了一株格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313，此格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313及同时含有上述格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316或其发酵液的组合物具有修复阴道炎引起的氧化损伤相关症状，缓解皮肤衰老的作用，具体体现在： [0058] (1)上调细胞Nrf2 mRNA表达，提高细胞上清Nrf2含量； [0059] (2)降低阴道炎小鼠阴道上皮细胞脱落； [0060] (3)改善小鼠阴道病理表征； [0061] (4)改善小鼠阴道氧化应激：激活Nrf2/SOD1通路，增加阴道组织Nrf2与SOD水平； [0062] (5)降低小鼠阴道炎症因子TNF‑α含量； [0063] (6)增强小鼠皮肤抗衰老能力：下调MAPK/AP‑1/MMP‑1mRNA表达； [0064] 因此，格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313、及同时含有上述格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316或其发酵液的组合物在改善和修复阴道炎产生的氧化损伤，以及由阴道炎引起的皮肤健康问题的产品中，具有巨大的应用前景。 [0065] 生物材料保藏 [0066] 一株格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313，分类学命名为：Lactobacillus gasseri，已于2023年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63709，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。 [0067] 一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1316，分类学命名为：Lacticaseibacillus paracasei，已于2023年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63712，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。附图说明 [0068] 图1：不同菌体裂解物对阴道上皮细胞VK2/E6E7氧化反应的影响图；其中，a为培养上清Nrf2含量；b为Nrf2 mRNA的表达影响；与模型组比较，p<0.05，p<0.01，p<0.001。 [0069] 图2：动物实验设计方案流程图。 [0070] 图3：阴道上皮细胞脱落情况图；*p<0.0001。 [0071] 图4：小鼠阴道组织病理学评价图。 [0072] 图5：格氏乳杆菌对阴道抗氧化靶点的影响图；其中，a为Nrf2 mRNA的表达影响；b为SOD1 mRNA的表达影响；与模型组比较，p<0.05，*p<0.001，*p<0.0001。 [0073] 图6：格氏乳杆菌对阴道抗氧化反应的影响图；其中，a为抗氧化因子Nrf2浓度的影响；b为抗氧化酶SOD浓度的影响；与模型组比较，p<0.05，***p<0.0001。 [0074] 图7：格氏乳杆菌对阴道炎症因子TNF‑α含量的影响图；与模型组比较，p<0.05，*p<0.1。 [0075] 图8：格氏乳杆菌对皮肤衰老的影响图；其中，a为MAPK mRNA的表达影响；b为AP‑1mRNA的表达影响；c为MMP‑1mRNA的表达影响；与模型组比较，p<0.05，p<0.01，p< 0.001，***p<0.0001。具体实施方式 [0076] 下述实施例中所涉及的阴道上皮细胞VK2/E6E7：由人民医院妇产科惠赠。阴道加德纳菌采用阴道加德纳菌ATCC 14018，购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心GDMCC。 [0077] 下述实施例中所涉及的培养基如下： [0078] MRS培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、吐温‑80 1mL这几种成分，pH6.2～6.4。 [0079] BHI培养基：胰蛋白胨10.0g/L、牛心浸粉17.5g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖3.0g/L、十二水合磷酸氢二钠2.5g/L、酵母粉10.0g/L、麦芽糖1.0g/L，pH7.2～7.4；待温度凉至55℃左右，添加10％无菌胎牛血清。 [0080] 细胞培养基：89％(v/v)DMEM培养基+10％(v/v)胎牛血清+1％(v/v)100×青霉素[0081] 和链霉素混合溶液(混合溶液中青霉素含量10000U/mL，链霉素浓度10mg/mL)。 [0082] 格氏乳杆菌CCFM1313菌液：将格氏乳杆菌CCFM1313在MRS液体培养基中以2％接种9 量接种，于37℃培养箱培养24h后调节菌悬液浓度为1×10CFU/mL。 [0083] 阴道加德纳菌悬液：将阴道加德纳菌株ATCC 14018在BHI培养基中在37℃，培养10 24h时间，调节菌悬液浓度为10 CFU/mL。 [0084] 下述实施例中所涉及的检测方法如下： [0085] Nrf2含量的检测： [0086] 采用ELISA法检测上清中的Nrf2含量。同时每孔用PBS迅速洗涤3次，每孔加入500μLTrizol，反复吹打并收集以提取RNA，并使用RTPCR反转录试剂盒逆转录为cDNA，通过实时‑ΔΔCt荧光定量法检测VK2/E6E7细胞中基因的表达情况，利用2 公式计算Nrf2 mRNA表达量，其中内参为GAPDH，引物描述在表1。 [0087] 表1引物及序列 [0088] [0089] 益生菌组合作用计算公式： [0090] 益生菌组合作用计算公式采用金正均Q值法：Q＝Ea+b/(Ea+Eb‑Ea×Eb),其中Ea+b为A和B联合时的作用时检测指标数值变化率，Ea和Eb分别是A和B单独作用时检测指标数值变化率。式中分子代表“实测合并效应”，分母代表“期望合并效应”，Q是两者之比，Q<0.85为拮抗作用，0.85≤Q<1.15为相加作用，Q≥1.15为协同作用(《金正均Q值法评价苦参碱联合阿霉素对人乳腺癌细胞的协同作用》时珍国医国药，2018)。 [0091] 小鼠阴道中阴道上皮细胞脱落情况 [0092] 从第17天小鼠阴道灌洗液中取出10μL样品溶液，移至玻片上，用吸管尖端外壁轻轻涂抹。涂片标本用固定剂保存，用Diff‑Quik染色法(一种对瑞氏染色法进行改进的快速染色法)染色。在显微镜下，从每个样本(1只小鼠)中捕获5个视野，并从每张图像中计数上皮细胞以确定平均值。在400倍光学显微镜下评价上皮细胞的脱落情况 [0093] 小鼠阴道组织病理学分析 [0094] 实验结束时，处死小鼠并切除阴道。一部分阴道组织用于组织病理学检查。阴道组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片成5mm厚切片，苏木精伊红染色(H&E)。阴道组织样本在病理切片扫描仪(Panoramic MIDI，3DHistech Ltd，Budapest，Hungary)下放大40倍进行观察。 [0095] 小鼠阴道组织抗氧化相关基因Nrf2/SOD1 mRNA表达情况 [0096] 采用Trizol法提取小鼠阴道组织总RNA，用Nanodrop检测OD260/OD280的数值，将1μg总RNA通过逆转录试剂盒反转录成20μL cDNA，以ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix‑ΔΔCt用于荧光定量PCR反应体系配置。以GAPDH作为内参基因，基于2 方法计算目的基因表达量，引物见表2。 [0097] 表2引物及序列 [0098] [0099] 小鼠阴道组织抗氧化因子Nrf2与抗氧化酶SOD分泌情况 [0100] 取20mg小鼠阴道组织来测定细胞因子，180μL用预冷的PBS对阴道组织进行匀浆处理。在4℃下，以3000r/min对样品离心15min，取阴道组织上清液按试剂盒说明书进行Nrf2与SOD浓度测定(南京森贝佳生物科技有限公司)。 [0101] 小鼠皮肤组织中MAPK/AP‑1/MMP‑1mRNA表达情况 [0102] 采用Trizol法提取小鼠背部皮肤组织总RNA，用Nanodrop检测OD260/OD280的数值，将1μg总RNA通过逆转录试剂盒反转录成20μL cDNA，以ChamQ Universal SYBR qPCR ‑ΔΔCtMaster Mix用于荧光定量PCR反应体系配置。以GAPDH作为内参基因，基于2 方法计算MAPK/AP‑1/MMP‑1基因表达量，引物见表3。 [0103] 表3引物及序列 [0104] [0105] 实施例1：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313分离鉴定方法[0106] 具体步骤如下： [0107] 1、筛选 [0108] 样本来源于健康成年女性阴道分泌物，将样本经预处理后，在30％甘油中保存于‑80℃冰箱，取出解冻后，混匀并吸取0.5mL样本加到4.5mL生理盐水中，以含有9g/L生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取副干酪乳酪杆菌的典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到格氏乳杆菌CCFM1313；其中，格氏乳杆菌的典型菌落呈圆形、乳白色。 [0109] 2、鉴定 [0110] 提取菌株CCFM1313的基因组，将菌株的16S rDNA进行扩增和测序(由上海美吉生物医药科技有限公司进行，CCFM1313扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)： [0111] 再将菌株的16S rDNA扩增的核苷酸序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为格氏乳杆菌，命名为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)CCFM1313。 [0112] 实施例2：乳杆菌体外调控细胞氧化应激的能力 [0113] 具体步骤如下： [0114] (1)菌悬液的制备 [0115] 分别将德氏乳杆菌DM8909、格氏乳杆菌CCFM1313接种至MRS固体培养基中，在37℃隔水式恒温培养箱中培养2448h，得到单菌落；挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，于37℃培养1218h，得到培养液； [0116] 将培养液以2％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃培养12h，得到种子液；将种子液以35％(v/v)接种于MRS液体培养基中进行扩培，于温度为37℃培养1824h，9 7 分别得到浓度为1.58×10CFU/mL的徳氏乳杆菌菌液以及1.01×10CFU/mL的格氏乳杆菌菌液。分别将菌液于高压均质机高压均质(800‑1200MPa，5次)，分别获得菌体裂解物。 [0117] 将阴道上皮细胞VK2/E6E7以2.5×104个/mL，每孔2mL接种于12孔板上，培养细胞24h后，设置对照组和处理组，处理组添加LPS浓度为1.25μg/mL的无血清培养基，对照组添加完全培养基，24h后弃去旧培养基，使用PBS冲洗3遍，对照组加入5％ MRS培养基；处理组加入等体积菌体裂解物：分别吸取2mL含格氏乳杆菌CCFM1313菌体裂解物、德氏乳杆菌DM8909菌体裂解物的培养基加入到12孔板里，培养24h，每个样品三个平行。结束后收集上清，采用ELISA法检测上清中的Nrf2含量。结果如图1所示。 [0118] 结果显示： [0119] (1)图1中的a可知，与对照组Nrf2含量106.10ng/L相比，模型组为89.60ng/L，Nrf2含量显著下降，德氏乳杆菌DM8909菌体裂解物、格氏乳杆菌CCFM1313菌体裂解物干预后的Nrf2含量分别为111.10ng/L、116.10ng/L，与德氏乳杆菌DM8909相比，由格氏乳杆菌CCFM1313干预的组别显著地上升了阴道上皮细胞的Nrf2含量(p<0.001)。 [0120] (2)图1中的b可知，以对照组的Nrf2 mRNA的表达量为1，模型组的表达量为0.59，相比对照组显著上升，德氏乳杆菌DM8909菌体裂解物、格氏乳杆菌CCFM1313菌体裂解物干预后的Nrf2 mRNA表达量分别为0.43、1.92，和其它组别相比格氏乳杆菌CCFM1313干预组显著上调了Nrf2 mRNA的表达(p<0.01)。 [0121] 通过细胞实验结果可知，由格氏乳杆菌CCFM1313可提高Nrf2含量、并上调Nrf2表达，具有改善阴道组织氧化应激的能力。 [0122] 实施例3：格氏乳杆菌CCFM1313在缓解小鼠阴道炎中的应用 [0123] 具体步骤如下： [0124] (1)菌悬液的制备 [0125] 分别将乳杆菌接种至MRS固体培养基中，在37℃隔水式恒温培养箱中培养2448h，得到单菌落；挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，于37℃培养12 18h，得到培养液； [0126] 将培养液以2％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃培养12h，得到种子液；将种子液以35％(v/v)接种于MRS液体培养基中进行扩培，于温度为37℃培养18 24h9 得到浓度为～10CFU/mL的菌液。 [0127] 组合物的制备： [0128] 格氏乳杆菌CCFM1313与副干酪乳酪杆菌CCFM1316以体积比为1：1的比例进行复配9 得到组合物，组合物中的活菌数为1×10CFU/mL。 [0129] (2)动物实验，具体实验流程见图2及表4： [0130] 表4：实验方案和分组： [0131] [0132] SPF级BALB/c小鼠，雌性，7周龄、体重18‑20g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(生产许可证号SCXK(京)2012‑0001)。 [0133] 根据体重随机将小鼠分成5组，参照表2，所有组小鼠整个实验过程中正常饲养。 [0134] 细菌性阴道炎模型组和干预组都需经历连续3天(1‑3天)的颈部皮下注射100μL戊酸雌二醇溶液(0.5mg戊酸雌二醇溶于过滤除菌的100μL芝麻油中)诱导发情。连续5天(3‑7天)的阴道加德纳菌的侵染(侵染的具体操作手法为用枪头吸取阴道加德纳菌的菌悬液20μL，缓缓注入小鼠阴道内，将小鼠倒立，停留1‑2分钟，放入笼中)。 [0135] 实验周期为18天(第1～18天)： [0136] 诱导发情：1‑3天颈部皮下注射100μL戊酸雌二醇溶液(0.5mg戊酸雌二醇溶于过滤除菌的100μL芝麻油中)诱导发情。 [0137] 侵染实验(造模期)：第3天开始，空白对照组小鼠阴道接种20μL PBS，其余小鼠阴10 道接种20μL活菌数为10 CFU/mL的阴道加德纳菌菌悬液。接种后将小鼠倒置1～2分钟，防止细菌流出，连续5天，直至第7天结束阴道加德纳菌接种。 [0138] 干预实验：从第8天开始，具体如下： [0139] 空白对照组：每天灌胃一次100μL PBS； [0140] 模型组小鼠：每天灌胃一次100μL PBS； [0141] 格氏乳杆菌CCFM1313组：小鼠每天灌胃一次100μL、109CFU/mL格氏乳杆菌CCFM1313菌悬液； [0142] 副干酪乳酪杆菌CCFM1316组：小鼠每天灌胃一次100μL、109CFU/mL副干酪乳酪杆菌CCFM1316菌悬液； [0143] 组合物组：小鼠每天灌胃一次100μL、109CFU/mL组合物菌悬液； [0144] 在干预结束(第17天)用枪头每次吸取50μL磷酸缓冲溶液对小鼠阴道吹吸进行取样，最终采集300μL阴道灌洗液，用于后续分析小鼠阴道中阴道上皮细胞脱落情况。 [0145] 同时，在第18天，对所有实验小鼠进行处死并剥离阴道组织与背部皮肤组织用于后续实验组织病理学分析，检测阴道组织中抗氧化因子(Nrf2)分泌、抗氧化酶(SOD)含量、抗氧化通路(Nrf2/SOD1)表达以及皮肤组织中与胶原蛋白降解有关通路(MAPK/AP‑1/MMP‑1)表达。 [0146] (3)实验结果： [0147] 1)小鼠阴道中阴道上皮细胞脱落情况 [0148] 在400倍光学显微镜下评价上皮细胞的脱落情况；结果如图3所示。 [0149] 结果显示：模型组上皮细胞脱落严重(39.33±2.67个/视野)，而空白对照组每个视野下约10.67个细胞。与模型组相比，格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316及组合物均显著缓解了阴道上皮细胞的脱落情况(p<0.0001)，各组每个视野下约29.17、21.25及28.00个细胞。 [0150] 2)小鼠阴道组织病理学分析 [0151] 通过对小鼠阴道组织进行HE染色，可以有效评估各组别小鼠阴道织的炎症情况。结果如图4所示。 [0152] 结果显示：空白对照组阴道上皮光滑连续，组织结构完整，未见明显炎性细胞浸润。模型组阴道黏膜上皮连续性差，表层细胞糜烂，形成孔洞，黏膜下间质充血，大量炎性细胞浸润到上皮和间质中，真皮层可见结缔组织增生修复，多量的纤维细胞及胶原纤维交错排列。在适当的益生菌干预一段时间后，黏膜下间质充血得到改善，尤其是组合物干预组恢复上皮连续性、减少炎症细胞浸润。CCFM1313及其组合物的染色结果显示，其真皮层纤维细胞排列紧密，结缔组织形态恢复正常组织形态。 [0153] 3)小鼠阴道组织抗氧化相关基因Nrf2/SOD1 mRNA表达情况 [0154] 检测Nrf2/SOD1 mRNA表达情况，结果如图5所示。 [0155] 结果显示： [0156] 由图5中的a可知，以对照组的Nrf2 mRNA的表达量为1，模型组的表达量为0.10，相比对照组显著下降，格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316、组合物干预后的Nrf2 mRNA表达量分别为2.94、1.35、3.85，组合物干预组更大地上调了Nrf2 mRNA的表达(比模型组上调了3.75倍)，其它组别至多上调了2.85倍；其中，组合物Q值为11.99，可见组合物达到协同效果。 [0157] 由图5中的b可知，以对照组的SOD1 mRNA的表达量为1，模型组的表达量为0.20，相比对照组显著下降，德格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316、组合物干预后的SOD1 mRNA表达量分别为1.20、0.58、0.89，和益生菌干预组均显著地提高了SOD1mRNA的表达。 [0158] 综合上述，格氏乳杆菌CCFM1313及其组合物能显著促进阴道组织抗氧化能力，且组合物能够达到协同的效果。 [0159] 4)小鼠阴道组织抗氧化因子Nrf2与抗氧化酶SOD分泌情况 [0160] 取阴道组织上清液按试剂盒说明书进行Nrf2与SOD浓度测定(南京森贝佳生物科技有限公司)。结果如图6所示。 [0161] 结果显示： [0162] 由图6中的a可知，显示了阴道组织中抗氧化因子Nrf2的浓度。结果表明，与对照组相比，模型组小鼠阴道组织分泌的Nrf2(15.95ng/L)显著下降(p<0.05)。益生菌干预后Nrf2含量均显著上升，格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316、组合物干预后的Nrf2浓度分别为24.79、30.29、55.67ng/L，且组合物Q值为2.61，表现出协同作用。 [0163] 由图6中的b可知，显示了阴道组织中抗氧化酶SOD的浓度。结果表明，与对照组(76.08pg/mL)相比，模型组小鼠阴道组织分泌的SOD(68.49pg/mL)显著下降(p<0.05)。益生菌干预后，仅组合物SOD含量显著上升(p<0.0001)，格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316、组合物干预后的SOD浓度分别为76.54、71.85、92.59pg/mL，且组合物Q值为2.13，表现出协同作用。 [0164] 5)小鼠阴道组织中TNF‑α含量情况 [0165] 取阴道组织上清液按试剂盒说明书进行TNF‑α浓度测定(南京森贝佳生物科技有限公司)。结果如图7所示。 [0166] 结果显示： [0167] 由图7可知，显示了阴道组织中炎症因子TNF‑α的浓度。结果表明，与对照组(167.18ng/mL)相比，模型组小鼠阴道组织分泌的TNF‑α(243.35ng/mL)显著上升(p<0.1)。益生菌干预后，组织TNF‑α含量显著下降，其中格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316、组合物干预后的SOD浓度分别为165.33、186.43、173.43ng/mL，并且格氏乳杆菌CCFM1313干预组最大程度地使TNF‑α含量下降(比模型组下降了32.06％)。 [0168] 6)小鼠皮肤组织中MAPK/AP‑1/MMP‑1mRNA表达情况 [0169] 取背部皮肤组织检测MAPK/AP‑1/MMP‑1mRNA表达情况。结果如图8所示。 [0170] 结果显示： [0171] 由图8中的a可知，以对照组的MAPK mRNA的表达量为1，模型组的表达量为5.61，相比对照组显著上升(p<0.0001)，格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316、组合物干预后的MAPK mRNA表达量分别为0.98、1.41、1.61，均显著下调目的基因的表达(p<0.0001)，证明阴道炎小鼠确有皮肤健康风险，口服益生菌有助于抵御这种风险。 [0172] 由图8中的b可知，以对照组的AP‑1mRNA的表达量为1，模型组的表达量为1.17，相比对照组有所上升，格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316、组合物干预后的AP‑1mRNA表达量分别为1.30、0.48、0.31，格氏乳杆菌CCFM1313的表达量虽比模型组要高但未造成显著性变化，说明格氏乳杆菌单菌在AP‑1mRNA表达上没有调控下调的效果，然而副干酪乳酪杆菌CCFM1316(p<0.01)、组合物(p<0.001)均显著降低了MAPK mRNA的表达，其中组合物Q值为1.18，可见组合后在下调AP‑1mRNA表达上显示协同作用。 [0173] 由图8中的c可知，以对照组的MMP‑1mRNA的表达量为1，模型组的表达量为1.41，相比对照组显著上升(p<0.05)，格氏乳杆菌CCFM1313、副干酪乳酪杆菌CCFM1316、组合物干预后的MMP‑1mRNA表达量分别为1.06、0.99、1.27，相比模型组，益生菌干预组均降低了MMP‑1mRNA的表达。 [0174] 综合上述，格氏乳杆菌CCFM1313及其组合物，且组合物能够达到协同效果，能显著改善由阴道炎引起的皮肤衰老问题。 [0175] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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