在多相生物材料上负载微生物的方法

专利类型 发明公开 法律事件 公开; 实质审查;
专利有效性 实质审查 当前状态 实质审查
申请号 CN202080050045.3 申请日 2020-07-10
公开(公告)号 CN114127279A 公开(公告)日 2022-03-01
申请人 赢创运营有限公司; 申请人类型 企业
发明人 J·E·朗; H·汤姆迪克; M·施旺; B·阿尔梅斯马尼; D·菲舍; 第一发明人 J·E·朗
权利人 赢创运营有限公司 权利人类型 企业
当前权利人 赢创运营有限公司 当前权利人类型 企业
省份 当前专利权人所在省份: 城市 当前专利权人所在城市:
具体地址 当前专利权人所在详细地址:德国埃森 邮编 当前专利权人邮编:
主IPC国际分类 C12N11/12 所有IPC国际分类 C12N11/12A61L15/28A61L15/36A61L15/60A61K8/99A61K8/73A61Q19/00A61K35/741A61K35/747A61K35/744A61P17/00A61P27/02A23L29/30A23L33/135A23L33/14
专利引用数量 0 专利被引用数量 0
专利权利要求数量 17 专利文献类型 A
专利代理机构 中国贸促会专利商标事务所有限公司 专利代理人 陈晓娜;
摘要 本 发明 涉及用于将 微 生物 或其部分负载在预合成的包含 纳米 纤维 素的多相 生物材料 上和/或其中的方法,其中所述微生物被重悬在缓冲液或培养基中并负载在所述多相生物材料中和/或其上,以及此类经负载的多相生物材料在营养、食品、药品、医疗、 化妆品 ,尤其是在 口腔 、粘膜、 皮肤 和透皮、眼、皮肤病学或女性健康应用中的用途。
权利要求

1.一种用于将生物或其部分负载在预合成的包含纳米纤维素的多相生物材料上和/或其中的方法,其中所述方法包括以下步骤:
‑合成细菌合成的纳米纤维素(BNC)多相生物材料,
‑将所述微生物重悬在缓冲液或培养基中,以及
‑通过以下任一步骤将所述微生物负载在BNC材料中和/或之上:
a)将所述多相生物材料与所述微生物以300rpm或更高、优选500rpm至3500rpm在37℃或更低、优选10℃至37℃的温度混合1‑60分钟,优选5‑10分钟,或
b)将所述微生物注入到所述多相生物材料中并在37℃或更低、优选4℃至37℃的温度孵育多至72小时,优选多至1小时,或
c)将处于所述缓冲液或培养基中的所述多相生物材料与重悬的微生物在37℃或更低的温度孵育60分钟或更短时间,优选10分钟或更短时间。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述微生物被喷涂在所述多相生物材料上。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述微生物作为营养细胞或以休眠形式、优选作为细菌孢子、或作为细胞提取物负载。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述微生物是湿的或干的和/或经预培养的或未经预培养的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述多相生物材料是湿的或干燥的或部分干燥的或在缓冲液中重新溶胀的。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纳米纤维素衍生自植物、藻类或微生物,优选衍生自驹形氏杆菌(Komagataeibacter),更优选衍生自木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacter xylinus)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细菌合成的纳米纤维素(BNC)包含分层结构,所述BNC优选地选自:
‑包含纤维素纤维或纳米晶须的网络的BNC,
‑包含两层或更多不同层的纤维素纤丝的BNC,其中每层由来自不同微生物或来自在不同条件下培养的微生物的BNC组成,
‑包含至少两个不同的纤维素网络的BNC,或
‑进一步包含聚合物的BNC复合材料
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细菌合成的纳米纤维素(BNC)是平均厚度为至少0.5mm、优选1mm至5mm、更优选2mm至3mm的BNC非织造布。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中至少两个不同的细菌纤维素网络被设计为组合均相系统或设计为由至少一个组合均相以及至少一个单相组成的分层相系统,优选地与另外的聚合物组合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在BNC的细菌合成期间添加另外的允许控制所得孔径/网目尺寸的物质,所述物质优选选自聚乙二醇(PEG)、β‑环糊精、羧甲基纤维素(CMC)、甲基纤维素(MC)和阳离子淀粉,所述阳离子淀粉优选选自2‑羟基‑3‑三甲基铵丙基淀粉氯化物和TMAP淀粉。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在后续步骤中,将负载的所述多相生物材料与分结合剂孵育进行干燥,其中所述水分结合剂是渗透和/或吸湿有效的溶液,优选地含有单糖、盐、含糖或糖样物质、聚乙烯、这些水分结合物质组的不同代表成员的组合和/或这些水分结合物质组的一种和/或多种代表成员与一种或多种表面活性剂和/或一种或多种防腐剂的组合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述微生物是选自下列的益生细菌株或益生酵母株:双歧杆菌属(Bifidobacterium),肉食杆菌属(Carnobacterium),棒状杆菌属(Corynebacterium),Cutibacterium,乳杆菌属(Lactobacillus),乳球菌属(Lactococcus),明串珠菌属(Leuconostoc),微杆菌属(Microbacterium),酒球菌属(Oenococcus),巴斯德芽菌属(Pasteuria),片球菌属(Pediococcus),丙酸杆菌属(Propionibacterium),链球菌属(Streptococcus),芽孢杆菌属(Bacillus),地芽孢杆菌属(Geobacillus),葡糖杆菌属(Gluconobacter),黄单胞菌属(Xanthonomas),念珠菌属(Candida),德巴利酵母属(Debaryomyces),有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora),克鲁维酵母属(Kluyveromyces),驹形氏酵母属(Komagataella),林德纳氏酵母(Lindnera),Ogataea,酵母属(Saccharomyces),裂殖酵母属(Schizosaccharomyces),威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces),法夫酵母(Xanthophyllomyces)和耶氏酵母(Yarrowia),微球菌属(Micrococcus),优选Cutibacterium acnes,乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus),卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus),格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri),植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum);德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrückii),罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri),副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei),发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum),表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),藤黄微球菌(Micrococcus luteus),里拉微球菌(Micrococcus lylae),南极微球菌(Micrococcus antarcticus),内生微球菌(Micrococcus endophyticus),黄色微球菌(Micrococcus flavus),土微球菌(Micrococcus terreus),南微球菌(Micrococcus yunnanensis),运动节杆菌(Arthrobacter agilis),喜盐涅斯特连科氏菌(Nesterenkonia halobia),克氏考克氏菌(Kocuria kristinae),玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea),变异考克氏菌(Kocuria varians),坐皮肤球菌(Kytococcus sedentarius),西宫皮生球菌(Dermacoccus nishinomiyaensis)或其混合物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中益生微生物选自:表皮葡萄球菌,发酵乳杆菌,DSM 32609鼠李糖乳杆菌,DSM 32758植物乳杆菌,DSM 32749德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii susp.bulgaricus),DSM 33370植物乳杆菌LN5,DSM 33377短乳杆菌(L.brevis)LN32,DSM 33368植物乳杆菌S3,DSM 33369植物乳杆菌S11,DSM 33376副干酪乳杆菌S20,DSM 33375副干酪乳杆菌S23,DSM 33374罗伊氏乳杆菌F12,DSM 33367植物乳杆菌F8,DSM 33366植物乳杆菌S4,DSM 33364植物乳杆菌S28,DSM 33363植物乳杆菌S27,DSM 
33373副干酪乳杆菌S18a,DSM 33365植物乳杆菌S18b,DSM 33362植物乳杆菌S13,DSM 
32767乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis sups.lactis),发酵乳杆菌DSM 32750,痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes),Cutibacterium acnes。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在用所述微生物负载所述多相生物材料之前或之后或平行地进行附加的步骤,其中所述多相生物材料负载以另外的成分和/或营养物,所述另外的成分和/或营养物选自基酸、脂肪酸盐、花青素、单糖和提取物,优选DHA和EPA的赖氨酸盐、鼠李糖、色氨酸
15.一种可通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的非织造的细菌合成的纳米纤维素(BNC)多相生物材料,其由至少两个不同的细菌纤维素网络组成,所述细菌纤维素网络包含至少一种活微生物。
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16.根据权利要求15所述的BNC多相生物材料,其包含浓度为至少3.00x 10个微生物细胞/克纤维素的至少一种活微生物。
17.根据权利要求15或16所述的非织造多相生物材料在营养、食品、药品、医疗、化妆品、尤其是口腔、粘膜、皮肤和透皮、眼、皮肤病学或女性健康应用中的用途。

说明书全文

在多相生物材料上负载微生物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及用于将微生物或其部分负载在预合成的包含纳米纤维素的多相生物材料上和/或其中的方法,其中所述微生物被重悬在缓冲液或培养基中并负载在所述多相生物材料中和/或之上,以及此类负载的多相生物材料在营养、食品、药品、医疗、化妆品、尤其是口腔、粘膜、皮肤和透皮、眼、皮肤病学或女性健康应用中的用途。

背景技术

[0002] 益生菌是当以充足的量施用时对宿主赋予健康益处的活微生物(FAO‑WHO;Probiotics in food.Health and nutritional properties and guidelines for evaluation;FAO Food and Nutritional Paper 85,2006)。被最广泛研究且可商购的益生菌主要是来自乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)物种的微生物。
另外,还使用一些其他的微生物,诸如丙酸杆菌属(Propionibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和酵母。含有益生菌/合生元的制剂,诸如补充剂/化妆品/生物药品/护理产品是“被设计在基本营养功能以外具有生理益处和/或减少慢性疾病险”的系统。
[0003] 所谓的益生元定义为选择性发酵的成分,其导致胃肠道微生物群的组成和/或活性发生特定变化,从而为宿主健康带来益处。益生元通常在胃肠道运输过程中充当截留基质(entrapping matrices),在肠道中进一步释放微生物并随后作为发酵底物(Koh等人,Food Microbiol.2013Oct;36(1):7‑13)。大多数益生元是来自植物来源的复杂化合物。益生元和益生菌可以组合起来以支持后者的存活和代谢活性,并且所得产品属于合生元类别。合生元是指以协同形式(因此是合生元)组合益生菌和益生元的食品成分或膳食补充剂(Pandey等人,J Food Sci Technol.2015Dec;52(12):7577‑87)。根据本发明,术语合生元还包括益生菌与成分(“益生元”)的协同组合,通过添加的微生物选择性代谢所述成分形成具有健康益处的代谢物
[0004] 就此而言,益生菌作为有价值的成分出现用于推荐能够支持健康和福利的膳食补充剂、功能性食品和局部应用。这些是活微生物(在大多数情况下),它们被认为通过更新天然微生物群、通过竞争减少病原体或在不同的位置(肠道、皮肤、口腔、阴道)产生活性代谢物展现调控特性,从而对宿主提供有益的健康效应。然而,益生菌当应用时经常被各种条件(例如,强酸性的胃,胆汁酸或局部环境因素等)灭活,并且因此,益生菌的有效性很大程度上取决于能够到达作用位置的活细胞数。因此,用于化妆品、生物药品或食品应用的巧妙递送系统(所述系统能够截留、保护、运输和适宜地递送活性剂)的开发,从食品应用,而且尤其是局部应用的根本度来看是很重要的。
[0005] 益生菌/合生元在哺乳动物/人受试者的许多位置,例如,胃肠道、皮肤、粘膜等处的促进健康的有益效应是为人所熟知的。一个问题是将有益的益生菌/合生元以所需的量、活性的方式提供至它们的作用部位并持续以展现效应所需的时间。后一个方面对于在皮肤和粘膜(诸如内阴和外阴粘膜或口腔粘膜)上的局部应用尤其重要。在许多情况下,对于发挥全部有益的和靶向作用而且在储存持续时间内存活直至使用,益生菌/合生元需要额外的辅因子和营养物或起始材料和环境要求(如湿度等)。而且,关于所述应用,与指定的成分/原料的组合可以具有共生效应。这对用于局部应用的益生菌/合生元制剂提出了额外的挑战。用于局部应用的霜剂制剂经常仅产生瞬时利用性和有限的生物活性物质活
[0006] 因此,要解决的问题是提供简单且快速的用于益生菌微生物的负载技术并且提供制得的产品,所述产品能够:
[0007] ‑保护(经常是敏感性的)益生菌/生物活性物质,
[0008] ‑在正确的部位(例如,局部、胃肠道、阴道)达到足够高数量的有益效应,[0009] ‑截留/负载生物活性物质,使得它们在作用部位处达到对细胞或活性物质/代谢物的缓释(延长作用),
[0010] ‑当与另外的成分组合时,允许益生菌原位产生活性成分,由此产生合生元,[0011] ‑在整个储存期间保持益生菌/合生元有活力直到应用的时间,
[0012] ‑吸收环境流体(例如,卫生条,口腔应用),和
[0013] ‑提供对潜在的不良气味的掩蔽。
[0014] 用于生物医药应用的递送系统必须解决截留的生物物质方面以及这些与用户相关的方面的问题。至多递送系统本身具有支持效应,诸如细菌纳米纤维素,其毒性低,水/流体吸收容量高。本发明提供了一种方法作为解决方案,该方法产生了细菌/微生物(纳米)纤维素制剂,该制剂保护益生菌和/或另外的生物活性成分用于局部应用。
[0015] 纳米纤维素是指纳米结构的纤维素的术语。这可以是纤维素纳米晶体(CNC或NCC),也称作微纤化纤维素(MFC)的纤维素纳米纤维(CNF),或细菌纳米纤维素(BNC),BNC是指由细菌产生的纳米结构的纤维素。BNC是由诸如木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacter xylinus)的菌株产生的纳米纤丝聚合物,木糖驹形氏杆菌是在纤维素制备中提供最高效率的最佳细菌物种之一。BNC是具有诸如下列的独特特性的生物材料:化学成分纯、优异的机械强度、高柔韧性、高吸收性、因卓越的可成形性和柔软度形成任意形状和尺寸的可能性,等等。此外,所述材料是素食的和严格素食的,且包含高水分含量。
[0016] BNC的制备因其环境友好特性而越来越广泛。已经开发了许多类型的BNC用于各种应用,包括组织再生、药物递送系统、血管移植物、以及用于体外和体内组织工程的支架(Czaja等人,Biomacromolecules 2007Jan;8(1):1‑12;de Azeredo,Trends Food Sci Technol 2013 30:56–69;Almeida等人,Eur J Pharm Biopharm 2014 86:332–336;Oliveira Barud等人,Carbohydr Polym 2015 128:41–51;Martínez‑Sanz等人,J Appl Polym Sci 2016133)。取决于应用的目的,BNC因其生物相容性、生物功能性、无毒和便于灭菌可以对生物材料提供改善的机械性能(Klemm等人,Angew Chem Int Ed Engl 2011 50:
5438–5466)。
[0017] 有不同的制剂用来通过使用微生物纤维素来递送益生菌,不同之处在于:额外的聚合物的使用,固定化/截留法,得到的益生菌载量,活力,细菌细胞的有效性/类型以及一般的优点诸如处置性,对人肠道的耐受性,但没有一个制剂是用于局部应用。益生菌的生存时间应当在特定的限度内,不仅仅是在掺入在制剂中的时候。已知的系统在提供对益生菌的保护方面有所不同,在剂型和应用开始时的存活率也有所不同。实际的负载技术主要通过耗时的吸附或通过在微生物纤维素产生期间对微生物细胞的截留来实现。漫长的孵育时间具有的缺点是在孵育期间微生物进一步生长,因此最终的负载浓度不能精确确定。
[0018] 对以不同形式的BNC在模拟胃液和胆汁盐溶液中固定化的益生乳酸菌的生存进行分析,其中所述微生物的固定化通过在合成的BNC的表面上吸附细菌细胞并通过将益生菌与合成纤维素的木葡萄酸醋杆菌(G.xylinus)同时培养来进行(Zywicka等人,Food Science and Technology 68,2016,322‑328)。
[0019] 在益生乳酸菌的冷冻过程期间细菌纤维素(Nata)作为低温保护剂和载体支持物的比较评价记载在一项研究中,其中由木醋杆菌(Acetobacter xylinum)产生的细菌纤维素与其他已确定的低温保护剂(如10%脱脂乳、藻酸包封或0.85%生理盐水和蒸馏水)比较其用于益生乳酸菌的低温保护和载体支持潜力。在与粉状细菌纤维素(PBC)、10%脱脂乳、盐水或蒸馏水混合的nata立方体或细菌混悬液的存在下,将各个乳酸菌在MRS肉汤中生长,并冷冻干燥,与在全部为乳酸菌的情况下的原始细胞混悬液相比,这产生3.0个对数周期的菌落形成单位减少(Bawa等人,Food Science and Technology 43,2010,1197‑1203)。
[0020] PL415670公开了一种将微生物固定在细菌纤维素上和/或之中的方法,其特征在于将湿的或干的细菌纤维素置于乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)的混悬液(1°McFerland密度)中,并且在此混悬液中在室温25℃以180rpm振摇孵育24小时。对于乳杆菌属物种的固定化,可以使用分别在静置条件下或以180rpm振摇进行6天培养获得的膜或珠5
子形式的细菌纤维素。在PL415670中记载的固定化法允许固定约400x 10个益生菌细胞/克湿纤维素并且获得固定化在湿纤维素上的细菌的存活率在模拟胃酸的存在下在50%以
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上,在胆汁盐的存在下在90%以上,并且固定约30x 10个益生菌细胞/克干纤维素,并且获得固定化在干纤维素上的细菌的存活率在模拟胃酸的存在下在50%以上,在胆汁盐的存在下在90%以上。然而,PL415670中记载的方法要求对固定化的细菌进行长时间的预培养,并且细菌纤维素材料需要在细菌混悬液中孵育24小时,总之是耗时的方法。
[0021] CN 109528691 A记载了制备包含纤维素纳米纤维(CNF)和益生菌的微胶囊。该纳米颗粒通过将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)与包含所述纳米纤维的溶液混合来制备。此文献报道了一种微包封技术,其中在负载过程期间形成递送系统(CNF)(在一个步骤中成形和负载)。因此,所制备的CNF与益生菌混合在液体中并逐滴加入交联剂CaCl2溶液以形成益生菌‑纤维素纳米纤维核心。然后应用逐层法将所产生的核心包覆以藻酸盐和壳聚糖。
[0022] 已知技术的缺点是负载程序漫长(主要是漫长的吸附时间或共培养),这也可能导致益生菌不期望的和不受控制的繁殖。这些长的孵育时间进一步导致另外成分的不受控制的减少并且导致益生菌在BNC网络中的不均一分布。现有技术中已知的技术并不快捷,并且就被固定化的微生物而言灵活性差。

发明内容

[0023] 鉴于现有技术,本发明的优点在于所提出的方法是一种用于细菌纤维素材料负载的快速、简单和灵活/可改动的且成本有效的方法。所述负载技术是非常快速的,并且是可控的。其提供了一种可持续的节约资源的方法,使用半惰性的载体,该载体是天然的和生物相容的。得到的绒头织物结构(fleece structure)甚至包含3D结构以及高耐受性并且通过导致缓释和/或原位产生活性物质而减小了益生菌瞬时利用性。本发明还允许非常扁平的均一或甚至透明的结构,或专成形的形式。
[0024] 而且,本发明非常适合于局部或肠道应用(经口),因为在整个储存期间益生菌/合生元保持活力直至应用到皮肤上时,并且特别是当保留在皮肤上时。根据本发明的产品提供了高液体吸收能力以吸收(环境)流体(例如,用于卫生棉条、卫生护垫(pantry slips)或口腔应用)。半干燥系统也适用于本发明。而且,潜在的不良气味可以利用本发明所述的产品掩蔽。
[0025] 本发明涉及用于将微生物或其部分负载在预合成的包含纳米纤维素的多相生物材料上和/或其中的方法,其中所述方法包括以下步骤:
[0026] ‑合成细菌合成的纳米纤维素(BNC)多相生物材料,
[0027] ‑将所述微生物重悬在缓冲液或培养基中,以及
[0028] ‑通过以下任一步骤将所述微生物负载在所述BNC材料中和/或之上:
[0029] a)将所述多相生物材料与所述微生物以300rpm或更高、优选500rpm‑3500rpm在37℃或更低、优选10℃至37℃的温度混合1‑60分钟,优选5‑10分钟,或
[0030] b)将所述微生物注入到所述多相生物材料中并在37℃或更低、优选4℃‑37℃的温度孵育多至72小时,优选多至1小时,或
[0031] c)将处于所述缓冲液或培养基中的所述多相生物材料与重悬的微生物在37℃或更低的温度孵育60分钟或更短时间,优选10分钟或更短时间。
[0032] 步骤a)中的孵育时间为1‑60分钟,优选5‑10分钟。步骤a)的过程也命名为本发明的“高速法”并且通过使用涡旋混合器来实现。在优选的配置中,BNC非织造布与细菌混悬液一起以10.5(~3300rpm)的涡旋强度在室温涡旋(Vortex Genie 2)10分钟。然后去除负载的混悬液,在涡旋下将BNC非织造布洗涤10秒。
[0033] 在步骤b)中,孵育时间多至72小时,优选多至1小时。通常,对于根据b)的注入法,对于微生物的负载不需要长的孵育时间。因此,在优选的实施方案中,孵育时间为1秒‑1小时,优选1秒‑10分钟,更优选1秒‑60秒。
[0034] 用于合成细菌合成的纳米纤维素(BNC)多相生物材料的方法公开在US 2015/0225486中。
[0035] 优选使用非织造BNC生物材料,例如,如记载于WO 2018 215598A1。根据本发明,非织造BNC材料尤其是BNC纤维的非织造布。根据本发明,术语“非织造BNW”和“BNC绒头织物”可以互换使用。
[0036] 在优选的实施方案中,微生物被喷涂在所述多相生物材料上。在优选的实施方案中,细菌混悬液或细菌粉末以优选的配置进行喷涂。优选将细菌混悬液在所述BNC非织造布上喷涂1分钟或更少时间。
[0037] 在用于将微生物或其部分负载在预合成的包含纳米纤维素的多相生物材料上和/或其中的方法的有利配置中,将微生物负载在BNC材料中和/或之上通过以下任一方法实现:
[0038] a)将所述多相生物材料与所述微生物在37℃或更低的温度、优选10℃‑37℃的温度,以300rpm或更高、优选500rpm‑3500rpm混合1‑60分钟,优选5‑10分钟,或[0039] b)将所述微生物注入到所述多相生物材料中,并在37℃或更低的温度、优选4℃‑37℃的温度孵育多至72小时,优选多至1小时。
[0040] 利用选项a)和b),微生物更好地分布在多相生物材料中,并且微生物更充分地附着于多相生物材料。
[0041] 本发明涉及使用细菌纤维素负载细菌的方法,所述细菌纤维素是用于暂时固定细菌的载体的成分,其中暂时固定的细菌在局部应用(例如,在皮肤或粘膜上)中提供有益效应。其提供了用来获得将益生菌/合生元掺入/截留/暂时固定/负载在细菌纤维素中的用于化妆品、生物医药或个人护理中的局部应用的制剂的方法,提供例如透皮、抗炎、舒缓、抗皱/抗衰老、抑制病原体或调节、酸化、去红血丝,或其他改善外观的效应。实例特别是益生菌/合生元面膜、贴片、卫生护垫、卫生棉条等。
[0042] 载体作为益生菌/合生元的栖息地起作用。在其中被固定化的生物物质用于触发生物合成和释放代谢物、酶或释放细菌细胞本身以有益地影响各自的局部环境(例如,皮肤、口腔、阴道)。
[0043] 细菌纤维素是三维网络,且是固定和俘获微生物和另外的物质的载体。固定化的生物物质(包括微生物)用于生物活性代谢物(例如,抗微生物剂,代谢性生物活性物质)的原位/体内生物合成,触发微生物和生物活性物质的释放和/或用作用于发酵过程的固定化的微型工厂。
[0044] 应用领域可以是化妆品(改善外观,例如改善红斑痤疮或痤疮中的红血丝),以及医药应用(阴道菌群失调)和女性卫生用品或其他消费品。
[0045] 在优选的实施方案中,微生物作为营养细胞或以休眠的形式、优选作为细菌孢子、或作为细胞提取物负载。在本发明的有利配置中,微生物被干燥,优选喷雾干燥或冷冻干燥或以粉状形式使用。
[0046] 许多细菌可以通过内生孢子、外生孢子(微生物囊肿)、分生孢子或缺少特化细胞结构的减少代谢活性的状态在不利条件下生存,所述不利条件诸如温度、干燥和抗生素。来自野生的样品中多至80%的细菌似乎是无代谢活性的,它们中的许多可以复苏。这样的休眠状态负责大多数自然界生态系统的高多样性水平。内生孢子是由厚壁菌门的某些细菌产生的休眠的、坚韧的和非复制性结构。内生孢子形成通常由缺少营养物触发,并且通常发生于革兰氏阳性细菌中。在内生孢子形成中,细菌在其细胞壁内分裂,然后一侧包裹另一侧。内生孢子能够使细菌在休眠状态更长时间地存活,甚至是几个世纪。当环境变得更有利时,内生孢子可以将自己再激活成营养状态。许多类型的细菌不能变成内生孢子形式。可以形成内生孢子的细菌的实例包括芽孢杆菌属和梭菌属(Clostridium)。内生孢子由细菌的DNA、核糖体和大量的吡啶二羧酸组成,吡啶二羧酸是似乎有助于内生孢子维持休眠状态的能力的孢子特异性化学物质,它占孢子干重达10%。
[0047] 在本发明的备选配置中,微生物是湿的或干的和/或经预培养的或未经预培养的。所述多相生物材料是湿的或干燥的或部分干燥的或在缓冲液中再溶胀的。
[0048] 当纳米纤维素来源于植物、藻类或微生物时,其是优选的,优选来自驹形氏杆菌属(Komagataeibacter),更优选来自木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacter xylinus)。木糖驹形氏杆菌是公知有能力产生纤维素的细菌物种。自此它已知有几个其他名字,主要是木醋杆菌(Acetobacter xylinum)和木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)。据此目前的名字,在2012年建立了新属:驹形氏杆菌属(Komagataeibacter)。
[0049] 对于本发明,优选使用平均厚度为至少0.5mm的BNC非织造布来负载微生物。特别优选BNC非织造布的平均厚度为1mm‑5mm,更优选2mm‑3mm。显示当BNC非织造布具有的平均厚度为2mm‑3mm时可以实现负载的BNC非织造布更好的再溶胀性。
[0050] 在本发明的具体实施方案中,纳米纤维素是包含分层结构的细菌合成的纳米纤维素(BNC),其优选地选自:
[0051] ‑包含纤维素纤维或纳米晶须的网络的BNC,
[0052] ‑包含两层或更多不同层的纤维素纤丝的BNC,其中每层由来自不同微生物或来自在不同条件下培养的微生物的BNC组成,
[0053] ‑包含至少两个不同的纤维素网络的BNC,或
[0054] ‑进一步包含聚合物的BNC复合材料
[0055] 纤维素纳米晶须(NW),也称作纤维素纳米晶体或纳米晶体纤维素,呈现了一种重要的纳米级别的材料,该材料在不同的应用中具有极大的前景( 等人,Acta Chem Scand 3,649‑650,1949)。NW是纤维素不完全降解的结果( 等人,Cellulose 25,1939‑1960,2018)。
[0056] 在本发明的有利实施方案中,至少两种不同的细菌纤维素网络被设计为组合均相系统或设计为分层相系统,所述分层相系统由至少一个组合均相以及至少一个单相组成,优选地与另外的聚合物组合。
[0057] 优选的方法记载于EP2547372。当至少两个不同的产生纤维素的细菌菌株一起制备或分开制备时,特别优选在共同的培养基中一起合成为几个不同的细菌纤维素网络,其中多相生物材料的BNC结构和BNC特性受所述至少两个不同的细菌菌株的选择、它们的制备和接种的影响以及通过影响合成条件而受影响,其中所述细菌纤维素网络作为组合均相系统或作为分层相系统合成,所述分层系统由至少一个组合均相以及至少一个单相组成。此外,优选所述至少两个不同的细菌纤维素网络彼此单独地制备且随后置于一起,以及一起合成。在组合合成的有利配置中,所述至少两个不同的细菌纤维素网络在接种前已经置于一起。
[0058] 在本发明的优选配置中,在BNC的细菌合成期间添加另外的允许控制所得孔径/网目尺寸的物质,所述物质优选地选自聚乙二醇(PEG)、β‑环糊精、羧甲基纤维素(CMC)、甲基纤维素(MC)和阳离子淀粉,优选地选自2‑羟基‑3‑三甲基铵丙基淀粉氯化物和TMAP淀粉。
[0059] 此修饰作用允许为要负载的微生物特异地定制BNC。作为细菌纤维素的显著益处,通过纤维素分子的自组装形成的控制特性的纤维网络和孔径体系可以在生物合成期间使用添加剂进行原位修饰。这允许使孔径尺寸适应于待负载的微生物的尺寸。加入聚乙二醇(PEG)4000导致孔径尺寸减小。在β‑环糊精或PEG 400的存在下,可以实现显著增加的孔径。令人惊讶地是,这些辅助底物充当可去除的辅料,不掺入至BC样品中。相反,羧甲基纤维素和甲基纤维素作为添加剂形成结构修饰的复合材料。使用阳离子淀粉(2‑羟基‑3‑三甲基铵丙基淀粉氯化物,TMAP淀粉),通过在BC预聚物中掺入淀粉衍生物,获得双网络BC复合材料(Hessler&Klemm,Cellulose 16(5):899‑910,2009)。
[0060] 在本发明的有利配置中,在后续步骤中,负载的多相生物材料与水分结合剂孵育进行干燥,其中所述水分结合剂是渗透和/或吸湿有效的溶液,优选地含有单糖、盐、含糖或糖样物质、聚乙烯、这些水分结合物质组的不同代表成员的组合和/或这些水分结合物质组的一种和/或多种代表成员与一种或多种表面活性剂和/或一种或多种防腐剂的组合。
[0061] 加入水分结合剂的目的是干燥并保留几乎完全重构纤维素结构的溶胀性,并且对水分结合剂的吸附效应施加了一致性,在此吸附剂暴露后,无论材料有任何结构变化,材料都被干燥。干燥的方法记载于WO2013060321A2。
[0062] 作为水分结合剂,使用渗透和/或吸湿有效的溶液,优选地含有单糖、盐、含糖或糖样物质、聚氧乙烯、这些水分结合物质组的不同代表成员的组合和/或这些水分结合物质组的一种和/或多种代表成员与一种或多种表面活性剂和/或一种或多种防腐剂的组合。优选使用的水分结合剂是葡萄糖、氯化镁、糖。在优选的配置中,为了进一步修饰再溶胀行为,除了水分结合剂以外还使用含有表面活性剂和/或防腐剂的溶液。
[0063] 水分结合溶液具有的渗透活性和/或吸湿的物质的浓度可以为0.01%至饱和极限,优选5‑20%。优选使用表面活性剂和/或防腐剂,其与浓度为0.01%至饱和极限、优选0.01‑10%的渗透和/或吸湿有效的溶液组合使用。
[0064] 用所述水分结合剂处理的纤维素或含纤维素材料可以进行风干或真空干燥。
[0065] 在优选的配置中,待接受水分结合溶液的吸附效应的纤维素或含纤维素材料浸入到该水分结合溶液中。在备选的配置中,将该水分结合溶液喷涂、滴入、刷抹或浇到待接受该水分结合溶液的吸附效应的纤维素或含纤维素材料上。备选地,为了其吸附剂暴露的目的,还在除纤维素培养过程以外加入水分结合剂。
[0066] 在优选的实施方案中,微生物是选自下列的益生细菌株或益生酵母株:双歧杆菌属(Bifidobacterium),肉食杆菌属(Carnobacterium),棒状杆菌属(Corynebacterium),Cutibacterium,乳杆菌属(Lactobacillus),乳球菌属(Lactococcus),明串珠菌属(Leuconostoc),微杆菌属(Microbacterium),酒球菌属(Oenococcus),巴斯德芽菌属(Pasteuria),片球菌属(Pediococcus),丙酸杆菌属(Propionibacterium),链球菌属(Streptococcus),芽孢杆菌属(Bacillus),地芽孢杆菌属(Geobacillus),葡糖杆菌属(Gluconobacter),黄单胞菌属(Xanthonomas),念珠菌属(Candida),德巴利酵母属(Debaryomyces),有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora),(Kluyveromyces),驹形氏酵母属(Komagataella),林德纳氏酵母(Lindnera),Ogataea,酵母属(Saccharomyces),裂殖酵母属(Schizosaccharomyces),威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces),法夫酵母(Xanthophyllomyces)和耶氏酵母(Yarrowia),优选Cutibacterium acnes,乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus),卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus),格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),藤黄微球菌(Micrococcus luteus),里拉微球菌(Micrococcus lylae),南极微球菌(Micrococcus antarcticus),内生微球菌(Micrococcus endophyticus),黄色微球菌(Micrococcus flavus),土微球菌(Micrococcus terreus),南微球菌(Micrococcus yunnanensis),运动节杆菌(Arthrobacter agilis),喜盐涅斯特连科氏菌(Nesterenkonia halobia),克氏考克氏菌(Kocuria kristinae),玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea),变异考克氏菌(Kocuria varians),坐皮肤球菌(Kytococcus sedentarius),西宫皮生球菌(Dermacoccus nishinomiyaensis)或其混合物。
[0067] 进一步优选使用表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、DSM 32609鼠李糖乳杆菌、DSM 32758植物乳杆菌、DSM 32749德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii susp.bulgaricus)、DSM 33370植物乳杆菌LN5、DSM 33377短乳杆菌(L.brevis)LN32、DSM 33368植物乳杆菌S3、DSM 33369植物乳杆菌S11、DSM 33376副干酪乳杆菌(L.paracasei)S20、DSM  33375副干酪乳杆菌S23、DSM  33374罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)F12、DSM 33367植物乳杆菌F8、DSM 33366植物乳杆菌S4、DSM 33364植物乳杆菌S28、DSM 33363植物乳杆菌S27、DSM 33373副干酪乳杆菌S18a、DSM 33365植物乳杆菌S18b、DSM 33362植物乳杆菌S13、DSM 32767乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis sups.lactis)、发酵乳杆菌DSM 32750、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、Cutibacterium acnes。
[0068] 在本发明的进一步优选的实施方案中,在用所述微生物负载所述多相生物材料之前或之后或平行地进行附加的步骤,其中所述多相生物材料负载以另外的成分和/或营养物,所述成分和/或营养物选自基酸、脂肪酸盐、花青素、单糖和提取物、优选DHA和EPA的赖氨酸盐、鼠李糖、色氨酸。这些另外的成分可以提供具有健康益处的代谢物,所述代谢物来源于微生物的代谢,或可以选择性地被微生物发酵并且可以归类为益生元。这种包含益生微生物和一种或多种如上文所定义的成分/益生元的组合物可以命名为合生元(synbiotic)。
[0069] 本发明的另一方面涉及可通过本发明所述的方法得到的包含纳米纤维素的非织造多相生物材料,所述纳米纤维素由至少两个不同的细菌纤维素网络组成,所述多相生物材料包含至少一种活微生物。
[0070] 在有利的配置中,所述多相生物材料包含浓度为至少3.00x 107个微生物细胞/克纤维素的至少一种活微生物。
[0071] 本发明还涉及根据本发明所述的非织造多相生物材料在食品、口腔、粘膜、皮肤和透皮,眼、营养、化妆品、皮肤病学、口腔或女性健康应用中的用途。
[0072] 此类纤维素产品例如,涉及在医疗(z.B.植入物材料、伤口敷料、皮肤替代材料)、药品(例如,药物递送系统)和技术应用(诸如滤器和膜系统)中的用途。
[0073] 因此,可以以最小的时间和技术‑经济成本提供纤维素和含纤维素材料,而不损害纤维素上的应力,不损失任何负载的材料(诸如药物、益生菌、添加剂等)的稳定性和效应。

具体实施方式

[0074] 工作实施例实施例1:掺入益生菌不使用附加的聚合物(预培养后)
[0075] A)关于尺寸(表面、体积、厚度、重量)对负载前的BNC的表征和灭菌
[0076] 所有BNC绒头织物保存在4℃(或当包装时在室温)并平衡至室温持续30分钟。使用游标卡尺在绒头织物的3个不同位置处测量直径和高度。BNC绒头织物的直径和高度以及体积(V)的平均值和标准差使用下式1计算:
[0077] V=πr2 h(1)π=3.14,r:半径,h:高度。
[0078] 此外,每个BNC绒头织物的表面积(A)应用式2确定:
[0079] A=2πrh+2πr2(2)π=3.14,r:半径,h:高度。
[0080] 数据表示为所有测量值的均值±标准差。
[0081] 对根据当地实验室的标准化方法合成的标准BNC绒头织物进行BNC绒头织物尺寸的表征。BNC绒头织物显示重量为1.16±0.06g,直径为1.6±0.07cm,高度为0.5±0.04cm。3 2
对每个BNC绒头织物在1.2±0.1cm的体积时检测到的表面积为7.24±0.27cm。
[0082] 用作面膜或贴片或卷绕形式的薄BNC绒头织物特征在于1‑4mm的厚度,至多2‑3mm高的厚度,以确保最适的再溶胀性。
[0083] B)用益生菌混悬液负载BNC绒头织物
[0084] 益生菌培养物和混悬液的制备(乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌)
[0085] 对于乳酸乳球菌,在无菌条件下,2个无菌的100ml玻璃Erlenmeyer烧瓶装入20ml pH 6.2±0.2的无菌MRS肉汤培养基。对于枯草芽孢杆菌,2个无菌的100ml玻璃Erlenmeyer烧瓶装入20ml pH 7‑7.2的无菌TSB培养基。约2mg的乳酸乳球菌粉加入至MRS培养基中并混合,其中一个烧瓶利用益生菌株制备,一个利用MRS空白组制备。随后,将5μl枯草芽孢杆菌冷冻混悬液加入至TSB培养基中并混合。一个烧瓶利用益生菌株制备,一个利用TSB空白组制备。在无菌条件下制备益生菌培养物并在37℃以100rpm振摇孵育8小时;在相同条件下孵育对照MRS培养基。8小时后,将培养物从培养箱转移到层流工作台,混合并使用无菌的1ml移液管将500μl的每种培养物收集在无菌的2ml Eppendorf杯中。使用UV比色皿和光密度分光光度计(Biophotometer)在600nm的波长测量采集样品的光密度(OD600),每个测量三次,8
与空白MRS或TBS培养基比较。计算制备浓度为OD600 0.5=10个细胞/ml(负载比=1g BNC:
10ml负载溶液)的益生菌混悬液的体积,将最终计算的体积装入50ml无菌试管中,使用相应的培养基(乳酸乳球菌为MRS,枯草芽孢杆菌为TSB)或盐水NaCl 0.9%将最终体积补足至
10ml,之后混合。
[0086] I.通过高速法(涡旋)用益生菌混悬液负载BNC绒头织物
[0087] 将BNC绒头织物加入至50ml试管中的益生菌混悬液(乳酸乳球菌,枯草芽孢杆菌)中。将对照BNC绒头织物加入到无菌培养基或盐水中。将试管以10.5(~3300rpm)的涡旋强度在室温涡旋(Vortex Genie 2)10分钟。去除负载混悬液,在涡旋下将BNC绒头织物在10ml盐水中洗涤10秒。
[0088] II.通过注入法用益生菌混悬液负载BNC绒头织物
[0089] 如上所述制备BNC绒头织物。以108个细胞/125μl的浓度制备益生菌混悬液。将注射器针头插入到BNC绒头织物的中央并注入所述体积(5个单位)。
[0090] III.通过喷涂用益生菌混悬液(预培养和未预培养的)负载BNC绒头织物
[0091] 如上所述制备BNC绒头织物。以OD600 0.5=108个细胞/ml的浓度制备乳酸乳球菌和巨大芽孢杆菌每个的10ml在盐水中的益生菌混悬液(预培养)。使用无菌玻璃试剂喷涂器(无菌玻璃试剂喷涂器。Art Nr:11526914.Fischer scientific,德国)将5ml益生菌混悬液均匀地喷涂在BNC(面膜、贴片或其他形式)上。对于粉状形式的益生菌的负载,程序如下:在层流工作台(Heraeus HS 18/2)中在无菌条件下,使用天平(Sartorius H95 Basic)在无菌2ml Eppendorf中称重100mg益生菌(例如乳酸乳球菌)粉。备选地,在层流工作台中在无菌条件下利用粉状形式在MRS肉汤培养基和盐水中以OD600:1McFarland的浓度通过将乳酸乳球菌粉加入至50ml离心管中的35ml MRS或盐水中并混合来制备益生菌混悬液(例如,乳酸乳球菌)。然后使用无菌玻璃试剂喷涂器(无菌玻璃试剂喷涂器。Art Nr:11526914.Fischer scientific,德国)将乳酸乳球菌粉‑混悬液喷涂在BNC绒头织物上。
[0092] 不同负载技术的概述显示在图1中:通过高速法(涡旋)和核壳法(注入)测定负载能力的示意性图示。将益生菌培养物(P)离心并以OD600 0.5重悬于盐水NaCl 0.9%(步骤1)并通过高速法(HS)(3300rpm,10min,22℃)或直接注入(I)(125μl,OD600 0.5)(步骤2)负载在BNC上。将负载的BNC和对照益生菌在37℃和100rpm再培养18小时(步骤3),随后测定OD600(步骤4)。
[0093] 实施例2:用益生菌混悬液(乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌)(利用预培养)
[0094] 通过涡旋和注入负载法负载BNC绒头织物的负载能力
[0095] A)负载的表征:负载容量、位置、分布均一性
[0096] 将益生菌培养物在37℃和100rpm振摇孵育8小时。之后,将它们在4000rpm离心8
10min并重悬于盐水NaCL 0.9%中。OD600调整为0.5=10个细胞/ml盐水。如实施例1所述根据BI和BII通过涡旋或注入法用益生菌培养物负载BNC。测定通过高速法(涡旋)和核壳法(注入)的负载能力的示意性图示显示在图1中。BNC绒头织物负载以OD600为0.5McFarland
8
(对应~10个细胞/ml)的益生菌,然后将它们在生长培养基中在37℃和100rpm再培养18小
8
时。通过与通过向生长培养基加入相同数量的益生菌OD600 0.5McFarland(对应~10个细胞/ml)制备的标准益生菌培养物的OD600比较测量再培养的BNC的OD600来确定负载能力。在微生物学中,McFarland标准用作调整细菌混悬液的浊度的参照,使得细菌的数目将在给定的范围内以便使微生物测试标准化。
[0097] 负载的益生菌的数量是确定所开发的形式的效率的决定性因素并且同样限定益生菌的活性。调查负载的益生菌的数目以评估所采用的程序的负载能力并且测量从负载的BNC绒头织物释放的益生菌的数目。在等渗溶液中进行负载过程以抑制实验期间益生菌的增殖。将负载益生菌的BNC绒头织物在合适的培养基中再培养,与在相同条件和浓度下培养的游离益生菌相比较。
[0098] 确定高速法(涡旋)和核壳法(注入)对枯草芽孢杆菌的负载能力。BNC绒头织物负8
载以OD600为0.5McFarland(对应~10个细胞/ml)的益生菌,然后将它们在TSB生长培养基中在37℃和100rpm再培养8小时。通过与通过向生长培养基加入相同数量的OD600 
8
0.5McFarland(对应~10 个细胞/ml)制备的标准枯草芽孢杆菌培养物的OD600比较测量再培养的BNC的OD600来确定负载能力。负载益生菌的BNC绒头织物的瓶子中的浊度明显地表示益生菌从BNC绒头织物到培养基中的释放和增殖。两种益生菌均表现出与高速法相比注入法具有较高的负载能力。乳酸乳球菌显示通过涡旋法的负载能力为10.1%±2.2%,相比之下,通过注入法的负载能力为36.2%±4.7%。枯草芽孢杆菌显示通过涡旋法的负载能力为
22.14%±3.1%,通过注入法的负载能力为42.85%±5.4%。
[0099] B)通过微生物的自发荧光检测负载位置
[0100] 活/死细胞染色液的制备
[0101] 根据生产厂商的说明书制备活/死细胞BacLight细菌活力试剂盒L7012。
[0102] 对于乳酸乳球菌和枯草芽孢杆菌,计算制备50ml OD600=0.5的混悬液的益生菌培养物的体积,将最终体积在室温以4000rpm离心15min。将沉淀物重悬于1ml纯净水中,加入1ml最终制备的活/死细胞染色液,混合,并在暗处在室温孵育15min。15min后,将染色的益生菌以4000rpm在室温离心10min。去除染色液,并将染色的益生菌重悬于30ml无菌盐水并涡旋10秒以洗涤染色的益生菌。将重悬的益生菌以4000rpm在室温离心10min并重悬于50ml无菌盐水。
[0103] 对BNC绒头织物中益生菌分布的可视化
[0104] 将BNC绒头织物转移到50ml试管中,加入1%浓度的5ml亚甲基蓝染色液并在室温保持10min。去除亚甲基蓝溶液,每次用30ml盐水在涡旋下洗涤BNC绒头织物三次。之后,通过涡旋法用盐水中的活/死细胞染色液染色的益生菌负载亚甲基蓝染色的BNC绒头织物。作为对照,将亚甲基蓝染色的BNC绒头织物浸泡在10ml盐水中,并在相同条件下混合。去除负载混悬液,将BNC绒头织物在10ml盐水中在涡旋下洗涤。利用Moleculight,绒头织物在俯视视野和横截面中发光,并拍摄照片。
[0105] 通过采用荧光染色法检测益生菌在BNC绒头织物中的分布。BNC用亚甲基蓝染色以消除其自发荧光。活/死细胞染色液‑染色的益生菌然后通过涡旋法和注入法掺入到BNC绒头织物中,并使用荧光检测照相机检测。俯视图和横截面的照片表明乳酸乳球菌均匀地分布在整个横截面中,仅稍稍有朝向预聚体的趋势,预聚体因其带有较大孔径的较疏松结构可以摄取更多物质。枯草芽孢杆菌则显示了掺入到预聚体中的强烈趋势,这可能与其较大的菌体尺寸有关。
[0106] 通过扫描电子显微镜(SEM)评价负载均一性和分布
[0107] 固定负载的BNC绒头织物并使用临界点干燥进行干燥,然后将它们溅涂,并通过扫描电子显微镜(SEM)观察。后续程序如下执行:BNC绒头织物在3ml/孔的固定溶液(在二甲胂酸钠缓冲液M,pH 7.4中的2.5%戊二和4%甲醛)中在室温固定10小时。之后,去除固定溶液,在盐水中洗涤BNC绒头织物三次,然后在递增浓度的乙醇系列梯度(30%,50%,70%,80%,90%,100%和100%)中每个梯度15min完成脱水过程。在Leica EM CPD300自动临界点干燥机(Leica)中通过临界点干燥将BNC绒头织物干燥。然后将BNC片封固在SEM样品架上并在溅射敷器(BAL‑TEC SCD005溅射镀敷器)上使用惰性气体(氩)在真空下用金溅射镀敷(层厚度30nm),然后分析它们并使用Sigma‑VP‑扫描电子显微镜(Carl Zeiss,德国)使用In‑lens‑检测器在5kV操作进行显微镜成像。
[0108] 通过扫描电子显微术(SEM)与天然的未负载的BNC绒头织物在不同的截面进行比较来确定通过涡旋法负载后BNC绒头织物中益生菌的分布。未负载和益生菌负载的BNC绒头织物两者均在戊二醛和甲醛的混合物中固定,以在完成干燥和SEM成像之前稳定最终形式并保持负载的益生菌的位置。对BNC绒头织物的显微镜检分析显示负载的益生菌在BNC绒头织物的表面上广泛分布,如图2中所示。此外,负载的益生菌在横截面和垂直截面上均匀地分布,证实了应用涡旋法在BNC绒头织物内部负载的均一性。
[0109] 图2显示了通过涡旋法制备的乳酸乳球菌负载的BNC绒头织物的SEM显微照片(顶部,左侧)。在不同的截面检查乳酸乳球菌负载的BNC绒头织物;在表面上(顶部,右侧),在横截面上(底部,右侧)和垂直截面上(底部,左侧)。使用in‑lens‑检测器以一定的放大倍数在5kV拍摄显微照片。
[0110] 实施例3:使用纯乳酸乳球菌粉在不事先培养(无预培养)的情况下通过涡旋法负载BNC绒头织物
[0111] 在层流工作台中在无菌条件下在MRS肉汤培养基和盐水中以OD600为1McFarland的浓度通过将乳酸乳球菌粉加入至50ml离心管中的35ml MRS或盐水中并混合来制备乳酸乳球菌混悬液。将每个混悬液在未进行预孵育的情况下分配在3个离心管中,每个50ml离心管分配10ml。随后,将灭菌的BNC绒头织物加入到管中并如前所述通过涡旋法进行负载。负载的BNC绒头织物在盐水中洗涤,并转移到30ml透明玻璃瓶中的10ml MRS中。作为对照,通过将来自OD600:1McFarland乳酸乳球菌混悬液的5μl添加到30ml透明玻璃瓶中的10ml MRS中而制备乳酸乳球菌培养物。将瓶子拍照(Canon PowerShot SX620HS)并在培养箱(Infors HT Multitron Standard)中在37℃和100rpm培养24小时。在24小时后,将瓶子转移到层流工作台,拍照(Canon PowerShot SX620HS)并如前所述测量光密度(OD600)。使用无菌玻璃涂棒将来自每个瓶子的25μl铺展在MRS琼脂平板的表面上并在37℃孵育(Heraeus 6000)48小时,并对琼脂平板上生长的菌落拍照(Canon PowerShot SX620HS)。
[0112] 在前面的实验中,在后续实验中使用和负载到BNC中前涂布的益生菌总是在肉汤培养基中培养直至晚期对数生长期。设计实验以研究事先没有在肉汤培养基中培养而从粉末直接负载到BNC绒头织物中的益生菌的活力和生存率。使用通过将乳酸乳球菌粉以OD600:1McFarland加入到下列每个中制备的乳酸乳球菌混悬液通过涡旋法负载BNC绒头织物:MRS肉汤培养基和盐水NaCl 0.9%等渗溶液。
[0113] 在培养后乳酸乳球菌负载的BNC绒头织物的视觉控制表明在培养瓶中有明显的浊度,代表细胞生长。来自MRS和盐水混悬液的负载的乳酸乳球菌保持了相当大的活力和生存能力,并且显示在孵育24小时后有生长,如通过测量的OD600证实的。来自MRS和盐水混悬液的负载的乳酸乳球菌在标准条件下培养后显示OD600分别为1.71±0.15McFarland和1.6±0.13McFarland。这些数据与来自MRS‑琼脂平板的观察结果(显示乳酸乳球菌菌落的典型生长)很相符。
[0114] 当采用压缩空气将乳酸乳球菌粉直接喷涂在BNC绒头织物上时,获得类似的结果。
[0115] 实施例4:通过三种不同的方法(涡旋、注入和喷涂)将枯草芽孢杆菌孢子粉负载在BNC上
[0116] 使用光密度分光光度计(Biophotometer)以OD600为0.5McFarland的浓度在层流工作台中在无菌条件下在无菌0.9%NaCl中制备50ml枯草芽孢杆菌孢子混悬液。如前所述通过涡旋法用枯草芽孢杆菌孢子混悬液负载BNC绒头织物。如前所述通过注入法以OD600为0.5的浓度用枯草芽孢杆菌孢子混悬液负载另外的BNC绒头织物。如前所述通过喷涂法用枯草芽孢杆菌孢子负载另外的BNC绒头织物。
[0117] 所有三种不同的负载技术都适用于芽孢杆菌属的孢子形式,因为在SEM显微照片中证实细菌细胞相同的分布。通过三种不同的技术负载的细菌孢子的再培养显示在培养基中和在琼脂平板上都有活力。
[0118] 实施例5:乳杆菌属及其混合物的负载
[0119] 使用下列的菌株:发酵乳杆菌,ID 51611,鼠李糖乳杆菌,DSM32609,植物乳杆菌,DSM 32758。
[0120] 将所述菌株在37℃和100rpm振摇的需氧标准条件下在MRS肉汤培养基中培养,然后将它们悬浮在Tris‑镁盐缓冲液pH 7.4+50%甘油中,并装入冻存管中并保存于‑80℃直至使用。然后在MRS琼脂平板上鉴定需氧培养的菌株和它们的几种混合物,并如前所述在固定和通过临界点干燥机干燥后通过SEM显微镜检表征。
[0121] 在层流工作台(Heraeus HS 18/2)中在无菌条件下,4个无菌100ml玻璃Erlenmeyer培养瓶装入20ml pH 6.2±0.2的无菌MRS肉汤培养基。将5μl每种乳杆菌属菌株加入到一个培养瓶中,一个培养瓶保持为MRS空白组,将培养瓶在轨道振摇培养箱(Infors HT Multitron Standard)中在37℃和100rpm培养8小时。将培养瓶转移到层流工作台(Heraeus  HS  18/2)中,使用无菌等渗盐水0.9%NaCl和光密度分光光度计
(Biophotometer)将每个菌株的浓度调整到OD600为0.1McFarland。将15μl最后调整的细菌混悬液加入到30ml无菌透明玻璃瓶中的15ml MRS肉汤培养基中,每种乳杆菌属菌株制备3瓶。在30ml无菌玻璃瓶中的另外15ml MRS肉汤培养基中,将不同的乳杆菌属菌株以每种5μl混合,对如下每种混合物制备3瓶:
[0122] 发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌
[0123] 发酵乳杆菌+植物乳杆菌
[0124] 鼠李糖乳杆菌+植物乳杆菌
[0125] 发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌+植物乳杆菌
[0126] 在孵育前测量已制备的单一培养物和混合培养物的pH值,并将每瓶的5ml转移到20ml玻璃烧杯中并使用pH计(Mettler Toledo 1140)检测pH值。所有瓶子在轨道振摇培养箱(Infors HT Multitron Standard)中在37℃和100rpm同时培养8小时。在培养8小时后,将瓶子转移到层流工作台(Heraeus HS 18/2),如上所述再次测量(Mettler Toledo 1140)每个培养物的pH值。
[0127] 用乳杆菌属菌株(发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌)的不同混合物负载BNC绒头织物并评价培养的BNC的pH变化:制备每个乳杆菌属菌株的培养物,并如上所述使用盐水将每个菌株90ml的浓度调整为OD600为0.5McFarland。在单独的50ml管中,如上所述将不同的乳杆菌属菌株培养物彼此混合。如前所述通过涡旋法(以及如前所述通过喷涂负载)将3个BNC绒头织物单独地负载以每个乳杆菌属菌株以及它们的混合物。在层流工作台(Heraeus HS 18/2)中在无菌条件下,将每个负载的BNC加入到30ml无菌透明玻璃瓶中的
15ml MRS肉汤培养基中,并在孵育前如上所述测量pH值(pH计,Mettler Toledo 1140)。所有培养瓶在轨道振摇培养箱(Infors HT Multitron Standard)中在37℃和100rpm培养8小时。在培养8小时后,将瓶子转移到层流工作台(Heraeus HS 18/2),如上所述再次测量(Mettler Toledo 1140)pH值。
[0128] 如前所述将通过涡旋法和喷涂法负载乳杆菌属的BNC绒头织物固定、干燥并通过SEM观察。
[0129] 在37℃和100rpm振摇的典型培养条件下在选择性MRS肉汤培养基和MRS‑琼脂平板上在需氧环境中研究乳杆菌属菌株的生长行为。所有乳杆菌属菌株,即,发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌在肉汤培养基中生长,证明在MRS‑琼脂上的球形菌落具有各种生长汇合率。菌落是白色的并且显示有光滑的表面。在MRS‑琼脂上生长的发酵乳杆菌的SEM显微照片显示了典型的细长的芽孢杆菌属形式,大小范围为1.5‑3μm,细胞宽度为0.5–0.7μm,为单个细胞或以成对的和短链的方式聚集成群。类似地,鼠李糖乳杆菌显示了杆状形式1.0–2.7μm长,0.4–0.8μm宽,而植物乳杆菌显示了长棒状,具有圆形端部,2.5–5.5μm长和0.6–
0.9μm宽。此外,乳杆菌属菌株的不同混合物在肉汤培养基中共培养,并在琼脂‑MRS上光学观察和通过SEM显微镜检生长的菌落。
[0130] 在标准条件下培养8小时后研究乳杆菌属生长对培养基的pH值的作用。特别地,所有单个菌株和混合物基本上都减小培养基的pH值,如表1中所示。
[0131] 表1:在培养前和培养8小时后乳杆菌属菌株的单一培养物和混合培养物的pH值[0132]
[0133] 对于发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌,pH值从培养前的6.0±0.03分别显著地减小到8小时培养后的4.57±0.01、4.21±0.09和4.35±0.1(P≤0.002)。另外,乳杆菌属菌株的所有混合物还表现出pH值大幅度减小(P≤0.001),发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌+植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌+植物乳杆菌和发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌+植物乳杆菌的pH值分别为4.35±0.07、4.37±0.03、4.1±0.08和4.4±0.1。与每个单一菌株的培养相比,所报告的混合培养物的pH值的减小是统计学显著的(P<0.05),仅鼠李糖乳杆菌+植物乳杆菌的混合物与各个菌株的单一培养物相比pH值没有很大的差异(P>0.05)。
[0134] 此外,单一乳杆菌属菌株和它们的几种混合物负载在BNC绒头织物中,并通过SEM观察,接着将负载的BNC绒头织物在MRS培养基中培养以确定pH值的变化。因此,在所有负载的BNC培养物中也检测到pH值的大幅度减小(P<0.001,表2)。对于发酵乳杆菌‑负载的BNC、鼠李糖乳杆菌‑负载的BNC和植物乳杆菌‑负载的BNC,培养前单一乳杆菌属负载的BNC的培养基的pH值在培养8小时后分别从6.0±0.01减小到4.59±0.02,4.13±0.03和4.05±0.06。另外,乳杆菌属混合物‑负载的BNC显示pH值明显减小,对于发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌‑负载的BNC、发酵乳杆菌+植物乳杆菌‑负载的BNC、鼠李糖乳杆菌+植物乳杆菌‑负载的BNC和发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌+植物乳杆菌负载的BNC,分别显示pH值为4.28±0.05、
4.38±0.01、4.09±0.04和4.33±0.02。
[0135] 此外,与未负载的培养菌株相比,将单一乳杆菌属菌株或乳杆菌属菌株的混合物负载到BNC中显示对pH值没有很大的作用(P>0.05)。负载的和未负载的乳杆菌属菌株两者显示在标准的需氧条件下培养8小时后培养基的pH值均类似地减小,提示益生菌负载在BNC绒头织物中对它们的行为没有影响。
[0136] 表2:单一乳杆菌属‑负载的BNC和乳杆菌属混合物‑负载的BNC在培养前和培养8小时后的pH值
[0137]
[0138] 当乳杆菌属菌株通过如前所述的喷涂技术负载时获得类似的结果(参见表3)。
[0139] 表3:单一乳杆菌属‑负载的BNC和乳杆菌属混合物‑负载的BNC在培养前和培养8小时后的pH值
[0140]
[0141] 利用单独德氏乳杆菌(L.delbrueckii)DSM 32749以及与德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌DSM 32609和植物乳杆菌DSM 32758的组合通过涡旋法和喷涂法获得了在对pH值的效应以及特别是关于病原体抑制方面的类似结果。因为德氏乳杆菌显示在需氧条件下的弱生长且偏好厌氧条件,在厌氧条件下完成预培养和pH减小的培养。
[0142] 实施例6:通过喷涂和涡旋技术制备耐储藏产品(巨大芽孢杆菌)
[0143] BNC的制备和灭菌,益生菌的负载
[0144] 在两个500ml玻璃瓶中在层流工作台(Heraeus HS 18/2)中在无菌条件下,将BNC(面膜、贴片或其他形式)浸泡在50ml MRS或TSB的肉汤培养基中或0.9%NaCl+5%葡萄糖的等渗混合物中。BNC在媒介物(medium)( 85T table‑horizontal)中在121℃和1bar高压灭菌15min。将BNC瓶转移到层流工作台(Heraeus HS 18/2)中,从媒介物中移出BNC,直接包裹在复合箔中,用焊缝(Famos F108)将箔密封。培养基‑或NaCl/葡萄糖负载的BNC然后进行电子束灭菌和无菌包装
[0145] 对于10ml益生菌的负载,乳酸乳球菌和巨大芽孢杆菌两者在盐水中以OD600 0.5=8
10 个细胞/ml的浓度制备细菌混悬液。使用无菌玻璃试剂喷涂器将5ml益生菌混悬液喷涂在BNC上。还如上文所述通过涡旋法进行负载。
[0146] 使用冻干机(Epsilon 2‑4LSC,Martin Christ,Osterode,德国)将负载的BNC冷冻干燥1‑6天,优选3‑5天,至残余含水量为3%‑14%的(水分分析仪;Ohaus MB45,Ohaus Corporation,USA)。为了确保干燥过程期间的平整度,将BNC绒头织物置于两张箔之间。残余含水量测定为13.92%±0.85%。
[0147] 为了长期保存(在室温或4℃或>30℃的温度)以确保再溶胀性(和稳定性),将冻干的负载的BNC包装在几乎不透水/不透湿的材料中,例如,将干燥的负载面膜包封在面膜包装袋(薄膜组成:PET/PE‑/ALU/PE–12/15/9/50μm)并使用焊缝(Famos)热密封或包封在内包装箔和面膜包装袋中。
[0148] 负载的BNC的再培养
[0149] 将负载的BNC转移到30ml无菌玻璃瓶中的肉汤培养基(用于乳酸乳球菌喷涂的面膜切片的是MRS,用于巨大芽孢杆菌喷涂的面膜切片的是TSB)中,并在轨道振摇培养箱(Infors HT Multitron Standard)中在37℃和100rpm再培养8小时;在相同的条件下孵育MRS和TSB的空白组。8小时后,将培养物从培养箱转移到层流工作台(Heraeus HS 18/2),对培养瓶拍照,在混合后,使用无菌的1ml移液管将500μl每种培养物收集在无菌的2ml Eppendorf杯中。使用UV比色皿和光密度分光光度计(Biophotometer)在600nm的波长测量收集的样品的OD600 nm光密度,每个样品测量三次,与空白组MRS或TSB培养基比较。使用接种环将切片培养物铺展在琼脂平板上(用于乳酸乳球菌混悬液喷涂和涡旋的面膜切片的是MRS‑琼脂,用于巨大芽孢杆菌混悬液喷涂和涡旋的面膜切片的是TSB‑琼脂),并将平板在37℃孵育24小时(Incubator Heraeus 6000),然后对琼脂平板拍照。
[0150] 负载的BNC的再溶胀
[0151] 将一个冻干的BNC面膜浸泡在玻璃烧杯中的水(或备选地在具有另外的活性成分的溶液中)中并在室温再溶胀10min,并评价再溶胀的面膜的卷绕能力。将另一个冻干的BNC面膜卷绕,之后将卷绕好的BNC在250ml玻璃烧杯中的水中浸泡10min。将第三个冻干的BNC卷绕并将其转移到50ml试管中,然后向试管中加入20ml水,在室温保持10min。
[0152] 对乳酸乳球菌和巨大芽孢杆菌研究益生菌在唇部面膜(唇膜,lip mask)上负载的效率。将面膜与相应的肉汤培养基一起进行高压灭菌,接着进行电子束灭菌,并在其表面上喷涂益生菌混悬液。然后将喷涂益生菌的面膜冷冻干燥以保持益生菌和BNC材料的稳定性。将冻干的益生菌负载的BNC在肉汤培养基中再培养。对培养瓶的光学观察显示了因负载的益生菌的生长导致的浑浊度。冻干的乳酸乳球菌负载的BNC显示在培养8小时后的OD600为
2
0.66±0.03McFarland。报告的OD600描述了来自1cm面膜表面的乳酸乳球菌的数量。另外,在MRS‑琼脂平板上所铺展的混悬液的照片显示了与所测量的OD600相关的处于汇合生长的乳酸乳球菌特征性的典型白色球状菌落。结果证实了负载的乳酸乳球菌的存活能力以及从面膜释放后增殖的能力。
[0153] 冻干的巨大芽孢杆菌‑负载的切片表现出来自1cm2面膜表面的较高的浑浊度,OD600为1.65±0.02McFarland。在TSB‑琼脂上生长的菌落证明用于巨大芽孢杆菌鉴定的颜色为白色奶油状的光滑的不规则大菌落,并确保负载的巨大芽孢杆菌的稳定性和存活能力。
[0154] 采用几种方法和形式研究等渗混合物负载的BNC面膜在水中的再溶胀能力。首先,将冻干的负载的BNC面膜在玻璃烧杯中的100ml水中再溶胀,直至面膜完全被再溶胀。在所有方法中,BNC均在室温下在10分钟内成功地再溶胀。
[0155] 对于通过涡旋的负载,获得类似的结果。
[0156] 实施例7:负载的益生菌的释放
[0157] 负载的益生菌从BNC载体的释放对于在效应部位处的有效生物学活性是至关重要的。因此,通过涡旋和注入法制备的益生菌负载的BNC绒头织物在相应的肉汤培养基中培养以评价在多至48小时的某些时间点时它们的释放和增殖曲线。结果表明因负载的益生菌的释放和增殖所引起的在培养基中益生菌计数的不断增加,如图3中所示。
[0158] 图3示出了采用涡旋(顶部)和注入(底部)两种负载法制备的乳酸乳球菌负载的BNC绒头织物(左)在MRS肉汤培养基中的释放曲线,枯草芽孢杆菌负载的BNC绒头织物(右)在TSB肉汤培养基中的释放曲线。结果作为三次独立测量的均值给出并呈现至8小时用于可视化的目的。
[0159] 通过涡旋法负载的乳酸乳球菌和枯草芽孢杆菌在肉汤培养基中1小时后已经可检测到,并且显示后续快速增殖达5小时,接着是稳定增加,如图3中所示(顶部)。相反,注入法提供了负载的益生菌的较延迟释放的可能性,益生菌在3小时后检测到(如图3中所示,底部),接着是规律的增殖。值得注意的是,与通过涡旋和注入法的乳酸乳球菌的数量分别是OD600为0.44±0.2McFarland和OD600为0.38±0.2McFarland相比,通过涡旋和注入法的枯草芽孢杆菌菌株在8小时后表现出较高的报告数量,分别是OD600为2.5±0.1McFarland和OD600为2.4±0.2McFarland。结果清晰地说明BNC作为递送益生菌的适宜载体的效率。
[0160] 实施例8:来自冻干的BNC的益生菌的再培养
[0161] 评价通过再培养在不同的孵育时间后冻干的益生菌负载的BNC绒头织物(通过涡旋法、注入法和喷涂法利用乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌制备)的稳定性:1天,1周和1个月,3个月,6个月。冻干的对照和益生菌负载的BNC绒头织物与肉汤培养基孵育(用于乳酸乳球菌负载的BNC的是MRS,用于枯草芽孢杆菌负载的BNC的是TSB)。培养物在轨道振摇培养箱中在37℃和100rpm振摇孵育8小时,测定光密度OD600,与对照培养基比较。图4示出了在1天、1周和1个月储存期后在TSB中培养8小时后通过涡旋法(顶部)和注入法(底部)制备的冻干的枯草芽孢杆菌负载的BNC绒头织物的培养物中枯草芽孢杆菌的定量测定。结果以每个样品三次独立测量的均值±标准差给出。
[0162] 巨大芽孢杆菌的6个月储存期的结果总结在图5中。图5示出了在室温经历6个月储存期后冻干的通过涡旋法(顶部)和注入法(底部)制备的巨大芽孢杆菌负载的BNC绒头织物经培养的定量测定。结果以三次独立测量的均值±标准差给出。
[0163] 巨大芽孢杆菌的结果总结在表4中。
[0164] 表4:对在室温经历6个月储存期后冻干的通过涡旋法和注入法制备的巨大芽孢杆菌负载的BNC绒头织物经培养后测量的OD600 nm
[0165]
[0166] *结果以三次独立测量的均值±标准差给出
[0167] 图6显示了在室温经历6个月储存期后冻干的通过涡旋法(顶部)和注入法(底部)制备的乳酸乳球菌负载的BNC绒头织物经培养的定量测定。结果以三次独立测量的均值±标准差给出。
[0168] 图7示出了在没有进行预培养的情况下使用乳酸乳球菌粉在MRS肉汤培养基和盐水等渗溶液中的混悬液通过涡旋法制备的乳酸乳球菌负载的BNC绒头织物经培养的定量测定。结果以每个样品三次独立测量的均值±标准差给出。结果总结在表5中。
[0169] 表5:对在室温经历6个月储存期后冻干的通过涡旋法和注入法制备的乳酸乳球菌负载的BNC经培养后测量的OD600 nm
[0170]
[0171] *结果以三次独立测量的均值±标准差给出
[0172] 此外,益生菌乳酸乳球菌和枯草芽孢杆菌在修饰的BNC绒头织物中的负载能力与标准BNC绒头织物进行比较并评价。
[0173] 图8示出了与标准绒头织物相比,使用纤维素在酶消化后对修饰的BNC绒头织物中负载的益生菌的定量测定。结果以每个样品三次独立测量的均值±标准差给出。
[0174] 对于通过喷涂负载,获得类似的结果。
[0175] 实施例9:制备过程和用于局部应用的包含益生菌/合生元的基于细菌纤维素的产品
[0176] 对于局部应用,潜在产品包括:薄面膜,贴片,3D BNC产品:面部面膜和唇部面膜,以及卫生产品,诸如卫生护垫、卫生棉条和卫生巾
[0177] 预合成的BNC(作为面膜、贴片或其他3D产品,例如,棉塞)通过负载培养基或NaCl/葡萄糖溶液,还结合负载营养物和技术辅助材料来制备。在层流工作台中在无菌条件下将BNC(例如,面膜)浸泡在玻璃瓶中(Heraeus HS 18/2,在50ml培养基中,例如MRS和TSB)。备选地,BNC面膜浸泡在0.9%NaCl+5%葡萄糖的等渗混合物中,并如实施例6中所述将负载的面膜冷冻干燥并灭菌。然后使用不同的技术将制备好的BNC负载以益生菌和活性成分营养物:
[0178] 通过喷涂负载BNC面膜:
[0179] 在盐水中制备益生菌(例如,乳酸乳球菌和巨大芽孢杆菌)的10ml益生菌混悬液,浓度为OD600 0.5。使用无菌玻璃试剂喷涂器将5ml益生菌混悬液均匀地喷涂在BNC(例如面膜)上。
[0180] 通过涡旋负载BNC面膜:
[0181] 将BNC绒头织物加入至50ml试管中的益生菌混悬液中,对每个益生菌菌株制备3个试管,将BNC绒头织物加入到无菌培养基或盐水中。使用多试管支架(SI‑V506垂直50ml试管支架)以涡旋强度10.5将试管在室温涡旋(Vortexer Genie 2)10min。去除负载混悬液,将BNC在10ml盐水中在涡旋下洗涤10秒。
[0182] 负载的BNC面膜的干燥
[0183] 使用冻干机(Epsilon 2‑4lsc Christ)将益生菌负载的BNC面膜干燥。一起冻干保证了用于再溶胀能力的3D结构。在冷冻干燥期间将面膜/贴片放置在底部箔与顶部箔之间以确保干燥的BNC绒头织物的最适平整度。
[0184] 使用冻干机(Epsilon 2‑4LSC,Martin Christ,Osterode,德国)将负载的BNC冷冻干燥1‑6天,优选3‑5天,至残余含水量为3%‑14%(水分分析仪;Ohaus MB45,Ohaus Corporation,USA)。当在干燥期间BNC没有达到规定的最大14%的残余含水量时,则再溶胀能力受到不利影响,稳定性会缩短。
[0185] 包装
[0186] 为了长期保存(在室温或4℃或>30℃的温度)以确保再溶胀性(和稳定性),将冻干的负载的BNC包装在几乎不透水/不透湿的材料中。用于包装箔的包装材料是由聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、铝(Al)和聚乙烯(PE)组成的铝复合箔,例如,将干燥的负载面膜包封在面膜包装袋(例如PET/PE‑ws/ALU/PE–12/15/9/50μm)并使用焊缝(Famos)热密封或包封在内包装箔(PET,50μm)和面膜包装袋中。用于包装箔的包装材料是由聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、铝(Al)和聚乙烯(PE)组成的铝复合箔(Tesseraux,Buerstadt,德国或Gruber Folien,Straubing.德国)。
[0187] 产品的用途
[0188] 在使用BNC面膜前,BNC面膜需要从包装中取出,并在使用前例如用水再溶胀以使BNC材料软化以进行使用和再活化益生菌,或利用包含活性成分的液体(在抗炎面膜的情况下)再溶胀以软化BNC面膜并再活化益生菌和活化益生菌。
[0189] 实施例10:抗炎面膜产品:用巨大芽孢杆菌负载(通过喷涂技术和涡旋)的BNC,用于局部抗炎用途
[0190] 材料:
[0191] 作为用于抗炎局部应用的菌株,使用巨大芽孢杆菌菌株,尤其是巨大芽孢杆菌DSM 32963&DSM 33300&DSM 33336。此外,将BNC负载以抗炎ω‑3赖氨酸盐 该抗
炎ω‑3赖氨酸盐含有大约32重量%的L‑赖氨酸和大约65重量%的多不饱和脂肪酸,主要是二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)。
[0192] 将BNC面膜合成、清洗和灭菌,然后将它们用0.9%NaCl和5%葡萄糖的等渗混合物负载。在层流工作台(Heraeus HS 18/2)中在无菌条件下将25μl巨大芽孢杆菌冷冻保存的混悬储备液加入到250ml玻璃Erlenmeye瓶中的150ml TSB肉汤培养基中,将瓶用软木塞封闭,并在轨道振摇培养箱(Infors HT Multitron Standard)中在37℃和100rpm培养8小时。8小时后,将培养物转移到层流工作台(Heraeus HS 18/2),将培养物分配在3x 50ml离心管中,并使用管式离心机(Eppendorf centrifuge 5804R)在室温和4000rpm离心20min。去除上清液,并将沉淀物重悬在事先加温的(37℃)无菌等渗盐水(0.9%NaCl)中。使用光密度分光光度计(Biophotometer)将巨大芽孢杆菌混悬液的光密度在盐水中调整到OD600 0.5。
[0193] 在层流工作台(Heraeus HS 18/2)中在无菌条件下并通过使用塑料镊子,将每个面膜转移到内包装箔(PET,50μm)上。通过使用无菌玻璃试剂喷涂器在每个表面上均匀地喷涂5ml,用巨大芽孢杆菌在盐水中的混悬液负载面膜。用第二张内包装箔(PET,50μm)覆盖负载的面膜,然后在冻干机(Sublimator 3x4x5,Zirbus technology GmbH,Germany)中冷冻干燥5天直至最大14%的残余含水量。在冻干后,将面膜包裹在面膜包装袋中并使用焊缝(Famos)热密封,并将包装的产品储存。对在4℃、RT、30℃和40℃储存进行稳定性测试。
[0194] 为了分析冻干的等渗混合物‑和巨大芽孢杆菌‑负载的唇部面膜在6个月储存期后在不同温度下的再溶胀能力和稳定性,将面膜用0.9%NaCl+5%葡萄糖的等渗混合物以及用益生菌巨大芽孢杆菌负载,然后冷冻干燥并如前所述在4℃保存封装在铝复合箔中。如实施例6中所述评价再溶胀能力和巨大芽孢杆菌稳定性。
[0195] 对于BNC唇部面膜的再溶胀能力的评价和负载的巨大芽孢杆菌在30℃和40℃2个月储存期后的存活能力,将面膜在室温在20ml水中再溶胀10min。在层流工作台(Heraeus HS 18/2)中在无菌条件下,将面膜打开,并将来自每个面膜的三个切片(1x1cm)在轨道振摇培养箱(Infors HT Multitron Standard)中在10ml TSB肉汤培养基中在37℃和100rpm培养8小时,接着测量所获得的培养物的光密度进行定量测定,并铺展在TSB‑琼脂平板上进行定性观察。
[0196] 等渗混合物‑和巨大芽孢杆菌‑负载BNC面膜的再溶胀能力在冻干后和在4℃保存6个月后或在RT保存5个月进行研究。因此,面膜切片保持了很大的再溶胀能力并且显示体积显著增加。面膜切片在7‑10min内快速地恢复到初始形状并且显示重量从0.019±0.001g显著增加至0.27±0.019g(P=0.001),并证实了在4℃保存所研究的时间期间所制备的BNC面膜的再溶胀能力。
[0197] 表6总结了冻干的等渗混合物‑和巨大芽孢杆菌‑负载的唇部面膜在4℃在6个月储存期内的再溶胀能力。干燥的切片保持了再溶胀能力并且表现出在4℃保存至所提到的储存期后在室温在水中在7‑10min内显著的重量增加(P<0.05)。所观察到的在时间间隔期间检测到的重量增加的变化性全部都是统计学上不显著的(P>0.05)。还在6个月储存期后评价在BNC面膜中负载的巨大芽孢杆菌的稳定性和活力。负载的BNC面膜的培养切片显示在标准培养条件下有明显的浊度,证明了显著的生长。
[0198] 表7总结了冻干的等渗混合物‑和巨大芽孢杆菌‑负载的唇部面膜切片在4℃在6个月储存期内经培养的定量测定。培养的切片还表现出负载的巨大芽孢杆菌的显著的活力和活性,并报告了相当大的生长数量,OD600为1.48±0.24McFarland。在3个月储存期后检测到测量的生长数量的显著增加(P=0.035),这种增加可能与巨大芽孢杆菌的负载数目增加有关或与益生菌混悬液在BNC面膜的表面上的不均匀喷涂有关。表6:在4℃储存6个月来自冻干保存的等渗混合物‑和巨大芽孢杆菌负载的唇部面膜的干燥和再溶胀切片的重量[0199]
[0200] *结果以三次独立测量的均值±标准差给出。
[0201] 显示了再溶胀性和通过测试再培养后的活力的稳定性。当面膜在包装时不足够干燥,则可以检测到真菌生长。当在冷冻干燥程序后面膜完全干燥到14%的最大残余含水量时,则这种情况不会发生。
[0202] 表7.对在4℃储存6个月在TSB肉汤培养基中培养的冻干的等渗混合物‑和巨大芽孢杆菌‑负载的唇部面膜切片的测量的OD600nm
[0203]
[0204] *结果以三次独立测量的均值±标准差给出。
[0205] 对于在适宜的冷冻干燥和包装后在室温、30℃和40℃的储存,关于再溶胀性和活力获得相似的结果。包装在箔内是合适的,但在包装到密封的外箔中之前采用2个内箔获得更好的结果(如前所述)。
[0206] 制备用于测量特异性促消退调节剂(SPM)和它们的前体的来自等渗混合物和巨大芽孢杆菌‑负载的BNC唇部面膜的样品。两个BNC唇部面膜负载以等渗混合物和巨大芽孢杆菌,然后冷冻干燥和再溶胀,第一个冻干的BNC面膜使用(1)0.01%脂质体 水性混悬液负载,(2)第二个面膜用0.01%粉末 水溶液负载。然后,将来自再溶
胀的面膜的切片在TSB肉汤培养基中和在TSB‑琼脂平板上在标准条件下培养。备选地,两个BNC唇部面膜首先负载以等渗混合物。之后,将巨大芽孢杆菌以OD600为0.5McFarland的浓度加入到下面的每个中;(1)0.01%脂质体 水性混悬液,和(2)0.01%粉末
水溶液。之后,将巨大芽孢杆菌‑ 混合物喷涂在面膜上,然后冷冻
干燥和在水中再溶胀。来自再溶胀面膜的切片如上文所述在TSB肉汤培养基中和在TSB‑琼脂平板上培养。
[0207] 来自未负载的BNC面膜的切片在肉汤TSB中和在TSB‑琼脂上培养,作为对照。然后制备在肉汤TSB培养基中和在TSB‑琼脂上培养的切片用于测量SPM和它们的前体。在50ml试管中将肉汤培养基在甲醇中以2:1V/V稀释。将带有培养的切片(2x2 cm)的琼脂转移到另一个50ml试管中,并加入8ml甲醇,然后将肉汤培养基和琼脂样本在‑20℃冷却60min并在4500rpm离心10min。最后,将上清液收集在单独的试管中用于与使用相同程序制备的培养的未负载的BNC面膜的对照相比较进行SPM的定量和定性测定。
[0208] 在肉汤培养基中和在琼脂平板上研究从在BNC唇部面膜上负载的巨大芽孢杆菌‑混合物产生特异性促消退调节剂(SPM)和它们的前体。采用两种顺序途径将两种 形式(即,脂质体和粉末)与巨大芽孢杆菌负载在BNC面膜上。在第一种方
式(A)中,脂质体 混悬液或粉末 溶液用来再溶胀冻干的巨大芽孢
杆菌‑负载的BNC面膜。而在第二种方式(B)中, 混悬液/溶液与巨大芽孢杆菌
混合并喷涂在BNC面膜上,然后冷冻干燥,接着用水再溶胀。随后,来自再溶胀的巨大芽孢杆菌‑和 ‑负载的BNC唇部面膜的切片在TSB肉汤培养基中和在TSB‑琼脂平板上培养,以与在TSB培养基中和在TSB‑琼脂上培养的未负载BNC面膜对照相比测定SPM的产生。因此,通过超高效液相色谱质谱法UPLC‑MS测量由脂氧合酶、胞浆型磷脂酶A2、环氧合酶1或2产生的几种脂质调节剂。
[0209] SPM已知具有天然的消退炎症的活性。因此,上述得到的抗炎面膜/贴片用于皮肤或粘膜上的局部抗炎治疗。最显著地,产生下列的SPM:
[0210] 17‑HDHA 17‑羟基二十二碳六烯酸,14‑HDHA 14‑羟基二十二碳六烯酸,13‑HDHA 13‑羟基二十二碳六烯酸,7‑HDHA 7‑羟基二十二碳六烯酸,4‑HDHA 4‑羟基二十二碳六烯酸,15‑HEPE 15‑羟基二十碳五烯酸,12‑HEPE 12‑羟基二十碳五烯酸,11‑HEPE 11‑羟基二十碳五烯酸,5‑HEPE 5‑羟基二十碳五烯酸,15‑HETE 15‑羟基二十碳四烯酸,12‑HETE 12‑羟基二十碳四烯酸,11‑HETE 11‑羟基二十碳四烯酸,8‑HETE 8‑羟基二十碳四烯酸,5‑HETE 
5‑羟基二十碳四烯酸,AA花生四烯酸,EPA二十碳五烯酸,DHA二十二碳六烯酸,PD1保护素(Protectin)D1,AT‑PD1阿司匹林triggert‑保护素D1,PDX保护素DX,RvD5消退素D5,MaR1 Maresin 1,MaR2 Maresin 2,t‑LTB4反式‑白三烯B4,LTB4白三烯B4,20‑OH‑LTB4 20‑羟基‑白三烯B4,PGE2前列腺素E2,PGF2a前列腺素F2α,TXB2血栓素B2,LXA4脂氧素A4,AT‑LXA4阿司匹林triggert‑脂氧素A4,LXA5脂氧素A5,RvD1消退素D1,RvD4消退素D4。
[0211] 实施例11:用于抑制金黄色葡萄球菌的含有枯草芽孢杆菌的BNC贴片/面膜[0212] 采用三种不同的方法进行负载(如前所述,涡旋、喷涂和注入)。
[0213] 对于上清液制备,将35ml最后培养的每种巨大芽孢杆菌DSM 32963和枯草芽孢杆菌DSM 33561的细菌混悬液在50ml离心管中使用管式离心机(Eppendorf离心机5804R)以4500rpm在4℃离心30min。将上清液收集在50ml注射器中并使用注射器式滤器0.2μm将其过滤到另一个50ml离心管中。
[0214] 在层流工作台(Heraeus HS 18/2)中在无菌条件下,将金黄色葡萄球菌以OD600为0.1McFarland的浓度加入到30ml无菌玻璃瓶中的10ml不含巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌两者的无益生菌上清液中。将5ml金黄色葡萄球菌以OD600为0.1McFarland的浓度加入到
30ml无菌玻璃瓶中的5ml浓度为OD600 0.1McFarland的巨大芽孢杆菌混悬液或枯草芽孢杆菌混悬液中。通过将浓度为300μg/ml的庆大霉素加入到TSB培养基中,然后加入浓度为OD600 
0.1McFarland的金黄色葡萄球菌制备阳性对照。将培养瓶在轨道振摇培养箱(Infors HT Multitron Standard)中在37℃和100rpm孵育18小时。18小时后,将培养瓶转移到层流工作台(Heraeus HS 18/2)中并拍照。将每个瓶子中的5μl使用接种环铺展在TSB‑琼脂上,并将琼脂平板在37℃孵育24小时(Incubator Heraeus 6000)并将琼脂平板拍照。
[0215] 对于琼脂扩散测试,使用无菌盐水NaCl 0.9%将巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的OD600调整至0.1McFarland。使用无菌盐水NaCl 0.9%将金黄色葡萄球菌的OD600调整至0.5McFarland。通过无菌玻璃涂棒将20μl金黄色葡萄球菌铺展在Mueller‑Hinton琼脂平板的表面上。在琼脂平板上使用1ml移液器尖端的背侧熔融多个孔。将小体积的Mueller‑Hinton琼脂在沸水浴中熔化,然后将其中的100μl用来封闭每个形成的孔的底部。琼脂在孔的底部凝固后,用100μl下列物质填充孔:阴性对照,无菌盐水NaCl 0.9%,阳性对照,庆大霉素300μg/ml,不含巨大芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的上清液,巨大芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌混悬液。将琼脂平板在37℃孵育24小时(Incubator Heraeus 6000),之后拍照,并确定抑制带。
[0216] 通过琼脂扩散测试评价枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌负载的‑BNC对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抗菌活性。因此,如上所述在TSB肉汤培养基中制备枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌混悬液。制备不含枯草芽孢杆菌的上清液并通过涡旋法用枯草芽孢杆菌负载BNC绒头织物。3个BNC绒头织物使用枯草芽孢杆菌在TSB培养基中的混悬液进行负载,3个BNC绒头织物使用枯草芽孢杆菌在盐水中的混悬液负载。进一步地,3个BNC绒头织物使用不含枯草芽孢杆菌的上清液负载,3个BNC绒头织物用庆大霉素负载作为阳性对照,并且用等渗盐水负载的3个BNC绒头织物作为阴性对照。使用无菌盐水NaCl 0.9%将金黄色葡萄球菌的OD600调整至0.5McFarland,使用分光光度计(Biophotometer)测定光密度。通过无菌玻璃涂棒将20μl金黄色葡萄球菌铺展在Mueller‑Hinton琼脂平板的表面上。将最后的对照和负载的BNC绒头织物加入到Mueller Hinton琼脂的表面上:1.阴性对照:盐水‑负载的BNC,2.阳性对照:庆大霉素‑负载的BNC,3.在TSB培养基中枯草芽孢杆菌‑负载的BNC,4.在盐水中枯草芽孢杆菌‑负载的BNC,5.不含枯草芽孢杆菌的上清液‑负载的BNC。将琼脂平板在37℃孵育24小时(Incubator Heraeus 6000),之后拍照,并确定抑制带。
[0217] 在负载到BNC前测试每种益生菌巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抑制活性。仅枯草芽孢杆菌有效地抑制金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌与下列的每种孵育:通过在24小时内培养制备的益生菌混悬液和不含益生菌的上清液。从共培养测试获得的结果显示在制备的培养物中有浑浊。为了分类生长的菌株并检测抑制效应,将浑浊的混悬液与每个益生菌和金黄色葡萄球菌菌株的对照一起铺展在琼脂平板上。琼脂平板的照片表明巨大芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。巨大芽孢杆菌混悬液和不含巨大芽孢杆菌的上清液对金黄色葡萄球菌都不表现出任何抑制作用。而检测到枯草芽孢杆菌DSM 33561对金黄色葡萄球菌有显著的抑制。仅在测试的平板的表面上观察到枯草芽孢杆菌菌落,而在枯草芽孢杆菌混悬液和不含枯草芽孢杆菌的上清液平板上都没有检测到任何金黄色葡萄球菌菌落的生长。这些结果得到了琼脂孔扩散测试的进一步加强。巨大芽孢杆菌平板显示在庆大霉素孔上的抑制带,而在巨大芽孢杆菌混悬液或不含巨大芽孢杆菌的上清液上没有检测抑制带。枯草芽孢杆菌混悬液显示了与枯草芽孢杆菌菌落在孔上的生长有关的半径为0.5±0.1mm的抑制带。然而,与共培养测试的结果相反,不含枯草芽孢杆菌的上清液的孔显示没有抑制带,这可能与在所用体积的上清液中有效分子的浓度低有关。对于另外的枯草芽孢杆菌菌株,从共培养测试获得的结果得到了标准琼脂孔扩散测试的进一步加强。可以检测到在不含枯草芽孢杆菌的上清液和含有枯草芽孢杆菌细胞的孔周围有明显的抑制带,与孔边缘周围的大量生长有关。
[0218] 在将细菌培养物负载到BNC上后,通过两个标准测试(即,共培养测试和琼脂孔扩散测试)显示枯草芽孢杆菌对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抗菌活性。使用TSB肉汤培养基和等渗盐水作为负载溶液,通过涡旋、喷涂和注入法将益生菌(枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌)负载到BNC中。在BNC绒头织物中负载的枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抗菌活性表现为:利用涡旋法(3‑4mm的抑制带)和喷涂法(5mm的抑制带)使用TSB肉汤培养基和盐水两者负载的BNC绒头织物周围都有显著抑制带,但通过注入法负载的BNC绒头织物周围没有抑制带,对于巨大芽孢杆菌,任一种负载法也没有抑制带。同时,枯草芽孢杆菌菌落在BNC附近生长。在通过涡旋法(1‑3)和喷涂法(>2mm)使用不含枯草芽孢杆菌的上清液负载的BNC周围也检测到抑制带。令人惊奇地,对于BNC上的枯草芽孢杆菌产生的抑制作用,不含细胞的提取物也是有效的,与通过涡旋法或喷涂法完成负载时负载的枯草芽孢杆菌DSM 33561的无细胞提取物上的无抑制带相反。结果总结在表8中。
[0219] 表8:在具有BNC和没有BNC的情况下通过扩散测试检测枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌细胞和无细胞上清液(通过检测抑制带>2mm)对金黄色葡萄球菌的抑制作用的总结[0220]
[0221] 对另外的枯草芽孢杆菌菌株(即枯草芽孢杆菌DSM 33353和DSM 33298)检测到类似的抑制结果。
[0222] 实施例12:用于含有乳杆菌属或乳球菌属的女性/阴道健康产品的BNC上的益生菌。
[0223] 将单一益生菌或混合物负载在BNC(薄层或3D结构)上,例如作为卫生护垫、卫生巾中的层,或卷制成卫生棉条或作为三维结构用作卫生棉条或棉塞,这考虑了BNC的再溶胀能力和对益生菌的载体/负载能力。负载的益生菌有助于通过减小pH、产生H2O2或抑制泌尿生殖道病原体来维持阴道环境。对于那些应用,使用下面的菌株:鼠李糖乳杆菌,DSM 32609,发酵乳杆菌,植物乳杆菌,DSM 32758,德氏乳杆菌保加利亚亚种DSM32749。
[0224] 对扁平的和卷绕的BNC在水中的再溶胀能力的评价
[0225] 对于卫生棉条或卫生护垫的层形式的产品,将4个BNC绒头织物(10X10cm)浸泡在400ml 0.9%NaCl+5%葡萄糖的等渗混合物中,然后如前所述高压灭菌和冷冻干燥。将冻干的BNC绒头织物浸泡在250ml玻璃烧杯中的100ml水中,在室温再溶胀10min,然后评价再溶胀面膜的卷绕能力。将第二个冻干的BNC面膜卷绕并在250ml玻璃烧杯中的100ml水中浸泡
10min。将第三个冻干的BNC绒头织物卷绕并将其转移到50ml试管中,然后向试管中加入
20ml水,在室温保持10min。将第四个冻干的BNC绒头织物卷绕并将其转移到50ml试管中,将该试管倒置在皮氏培养皿中,然后向皮氏培养皿中加入20ml水,在室温保持10min。
[0226] 应用几种方式和形式研究在水中在室温下等渗混合物负载的BNC绒头织物的再溶胀能力。首先,将冻干的负载的BNC面膜在玻璃烧杯中的100ml水中再溶胀,10min后面膜完全再溶胀,显示了在再溶胀后进行卷绕的柔性和能力。
[0227] 其次,将冻干的负载的面膜卷绕,然后在室温在玻璃烧杯中的水中10min完成再溶胀。在再溶胀过程期间将面膜拆卷并在水中10min后恢复到初始的扁平形式。此外,将第三个冻干的负载的BNC绒头织物卷绕,并使用类似阴道腔的管在水中再溶胀。该绒头织物完全再溶胀并填充整个管,而将绒头织物放置在倒置于皮氏培养皿中的充满水的管中提供较慢的再溶胀,仅在绒头织物与流体接触的底部部分开始再溶胀而没有拆卷。因此,对应用来说优选对扁平的或卷绕的BNC绒头织物进行短期的预湿润使其能够使用和容易再溶胀。
[0228] 用乳杆菌属菌株负载BNC
[0229] 乳杆菌属物种及其混合物的负载和pH减小记述于实施例5。
[0230] 当通过如前文所述的喷涂技术负载乳杆菌属菌株时,对于细菌细胞在BNC非织造布上的分布,获得类似的结果。
[0231] 对于德氏乳杆菌保加利亚亚种DSM 32749,还显示适合用于女性健康,尤其是与植物乳杆菌DSM 32758组合,或还包含鼠李糖乳杆菌DSM 32609的三菌株组合时。在此情况下,对实验方案进行适应性改动以适合其优选的厌氧培养。在MRS培养基中在厌氧条件下进行培养。所有菌株还能够在模拟阴道分泌物(MSVF)中生长。
[0232] 此外,乳杆菌属物种和/或乳球菌属物种的其他菌株可以单独使用或组合用于产品,尤其是当显示用于女性健康的潜力(例如,通过降低pH,产生H2O2或抑制病原体,例如,尿道致病性大肠杆菌)时。
[0233] 在优选的实施方案中,所述菌株选自:DSM 33370植物乳杆菌LN5,DSM 33377短乳杆菌LN32,DSM 33368植物乳杆菌S3,DSM 33369植物乳杆菌S11,DSM 33376副干酪乳杆菌S20,DSM 33375副干酪乳杆菌S23,DSM 33374罗伊氏乳杆菌F12,DSM 33367植物乳杆菌F8,DSM 33366植物乳杆菌S4,DSM 33364植物乳杆菌S28,DSM 33363植物乳杆菌S27,DSM 33373副干酪乳杆菌S18a,DSM 33365植物乳杆菌S18b,DSM 33362植物乳杆菌S13,DSM 32767乳酸乳球菌乳酸亚种,发酵乳杆菌DSM 32750。
[0234] 实施例13:用于祛痘面膜的含有痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne/Cutibacterium acne)的BNC面膜/贴片
[0235] 通过涡旋和喷涂负载技术将葡萄糖/NaCl‑制备的BNC非织造布(作为贴片或面膜)负载以痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes),如前面在实施例9中所述冻干并包装用于储存。再溶胀和稳定性测试显示了所述工艺也适用于此产品应用。此产品实施例在应用面膜/贴片后通过痤疮丙酸杆菌对致病性痤疮微生物群的有益影响而聚焦于局部祛痘应用。
[0236] 实施例14:用于再平衡/影响皮肤微生物群的含有表皮葡萄球菌的BNC面膜/贴片[0237] 通过涡旋和喷涂负载技术将葡萄糖/NaCl‑制备的BNC非织造布(作为贴片或面膜)负载以表皮葡萄球菌,然后如前面在实施例9中所述冻干并包装用于储存。再溶胀和稳定性测试显示了所述工艺也适用于此产品应用。此产品实施例在应用面膜/贴片后通过表皮葡萄球菌对局部微生物群组成的有益影响而聚焦于对皮肤微生物群的局部再平衡。
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