卷曲乳杆菌及其用途
| 专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202110495851.8 | 申请日 | 2021-05-07 |
| 公开(公告)号 | CN113512509B | 公开(公告)日 | 2022-02-22 |
| 申请人 | 南方医科大学珠江医院; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 陈慕璇; 周宏伟; 周祖怡; | 第一发明人 | 陈慕璇 |
| 权利人 | 南方医科大学珠江医院 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 南方医科大学珠江医院 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：广东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：广东省广州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：广东省广州市海珠区工业大道中253号珠江医院 | 邮编 | 当前专利权人邮编：510282 |
| 主IPC国际分类 | C12N1/20 | 所有IPC国际分类 | C12N1/20 ; A61K35/747 ; A61P15/00 ; A61P15/02 ; A61P31/02 ; A61P31/04 ; A61P31/10 ; A61K8/99 ; A61Q19/10 ; A61Q17/00 ; A61L15/36 ; A61L15/46 ; A23L33/135 ; C12R1/225 |
| 专利引用数量 | 7 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 13 | 专利文献类型 | B |
| 专利代理机构 | 上海巅石知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 张琤; 游琦; |
| 摘要 | 本 申请 涉及一种卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)LC‑17218，其保藏编号为CGMCC NO.21222。所述卷曲乳杆菌LC‑17218具有较强的产酸，产H2O2能 力 ，及 阴道 上皮细胞粘附能力。本申请还涉及包含此菌株的组合物，及其用于 治疗 和/或 预防 泌尿生殖系 疾病 的用途。 | ||
| 权利要求 | 1.分离的卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌为卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）LC‑ |
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| 说明书全文 | 卷曲乳杆菌及其用途技术领域背景技术[0002] 人体女性阴道内环境是指女性阴道腔内有寄居着的微生物群所构成的微生态环境。正常情况下，女性阴道腔内寄居着大量的微生物，这些微生物在局部中发挥重要的作用，维持女性阴道健康状态。女性阴道微生物群以乳酸杆菌为主要优势菌，同时存在少量的其他厌氧菌，乳杆菌能通过产酸、过氧化氢(H2O2)维持阴道弱酸性环境从而达到抑制病原菌的生长，维持阴道正常内环境。当阴道内的乳杆菌丰度下降或者乳酸菌功能下降时，阴道中的其他厌氧菌过度增殖，使阴道微生态失衡，导致内环境紊乱，可促进病原体的感染从而导致局部炎症、病变，甚至癌症；同时，阴道局部病原体感染可增加盆腔炎、早产、流程等风险。 [0003] 然而，目前在临床上，虽然局部使用抗生素可杀灭部分病原体，但是，由抗生素使用伴随的耐药情况亦日趋严重，同时，由于抗生素在杀灭病原体的同时，也清除了阴道中的乳杆菌，使得阴道内环境亦处于失衡状态，而在停止使用抗生素后，局部细菌群落在重塑过程中，仍旧恢复治疗前的紊乱生态特征，从而使病人病情反复，进而出现难治性症状。近年来，有研究通过给予病人使用乳杆菌，以其达到改善和重塑阴道内环境的目的，然而，由于不同菌株之间存在功能差异，因而出现改善效果不加的情况。发明内容 [0004] 本申请旨在于提供一种能够在具备快速增值，同时具有较强产酸、产H2O2的能够使阴道内环境保持弱酸性环境，进而抵御其他病原菌的入侵而维持和改善阴道内环境稳态的乳杆菌，并明确及其制备方法和应用。 [0005] 一方面，本申请提供一种分离的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，其生化鉴定结果如下： [0006] [0007] [0008] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌具有以下特性中的一种或多种： [0009] (v)在有效培养条件下产生至少约10mg/L过氧化氢； [0010] (vi)在有效培养条件下产生至少约5mg/L乳酸； [0011] (vii)在有效培养条件下18h内菌液浓度达到初始浓度的约8万倍以上； [0012] (viii)能够抑制选自下组的病原菌的生长和/或活性：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、普雷沃氏菌(Prevotella corpri)、普雷沃氏菌 (Prevotella timonensis)、二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)、微小杆菌(Micrococcus luteus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、表面葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，及其任意组合。 [0013] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌的16s rRNA的核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少约99％的序列同一性。 [0014] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌的16S rRNA包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 [0015] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌在有效培养条件下生产至少约20mg/L过氧化氢。 [0016] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌在有效培养条件下生产至少约6.5mg/L乳酸。 [0017] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验对无乳链球菌抑菌圈直径到约10mm以上。 [0018] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌为卷曲乳杆菌LC‑17218，其保藏编号为CGMCC NO.21222。 [0020] 在某些实施方式中，其中所述泌尿生殖系疾病包括阴道疾病。 [0021] 在某些实施方式中，所述阴道疾病包括阴道感染。 [0022] 在某些实施方式中，所述阴道感染包括细菌性阴道病、需氧性阴道病、病毒性阴道病、酵母性阴道炎、滴虫性阴道炎、HPV感染、淋病、衣原体感染、泌尿道感染或骨盆炎性疾病。 [0023] 另一方面，本申请提供一种前述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物用于抑制致病菌。 [0024] 在某些实施方式中，所述致病菌包括：无乳链球菌、普雷沃氏菌、普雷沃氏菌、二路普雷沃氏菌、微小杆菌、粪肠球菌、表面葡萄球菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌中的任意一种或多种。 [0025] 另一方面，本申请提供一种前述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防阴道菌群紊乱。 [0026] 另一方面，本申请提供一种前述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物具有阴道上皮细胞粘附功能。 [0027] 另一方面，本申请提供一种前述的卷曲乳杆菌在制备消洗剂中的用途，所述消洗剂用于改善阴道内环境。 [0028] 在某些实施方式中，其中所述改善阴道内环境包括维持阴道酸碱度或增加阴道乳酸浓度。 [0029] 另一方面，本申请提供一种组合物，其包含前述的卷曲乳杆菌和/或其代谢产物，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体。 [0030] 另一方面，本申请提供前述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或前述的组合物在制备卫生用品的应用。 [0031] 另一方面，本申请提供一种卫生用品，其含有前述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或前述的组合物。 [0032] 在某些实施方式中，其中所述卫生用品为医疗器械。 [0033] 在某些实施方式中，其中所述医疗器械包括阴道镜、妇科自检镜、引导扩张器、窥阴器、妇科冲洗器或妇女外用抗菌器。 [0035] 另一方面，本申请提供一种食品，其包含前述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或前述的组合物。 [0036] 另一方面，本申请提供一种膳食补充剂，其包含前述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或前述的组合物。 [0037] 另一方面，本申请提供一种分离的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 [0038] 生物材料保藏信息 [0039] 本申请的菌株卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)LC‑17218从中国健康育龄妇女阴道分泌物中筛选得来，已于2020年11月23日保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCC NO.21222，该菌株的分类命名为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。 [0040] 本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。 附图说明[0042] 图1显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC17218菌株的菌落图片； [0043] 图2显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC‑17218的电镜下的形态图； [0044] 图3A显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC17218的API32生化结果； [0045] 图3B显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC‑17218的API20生化结果； [0046] 图4显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC‑17218对Streptococcus agalactiae的抑制试验结果； [0047] 图5显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC‑17218对Prevotella corpri的抑制试验结果； [0048] 图6显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC‑17218对Prevotella timonensis的抑制试验结果； [0049] 图7显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC‑17218对Prevotella bivia的抑制试验结果； [0050] 图8显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC‑17218对Micrococcus luteus的抑制试验结果； [0051] 图9显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC‑17218对Enterococcus faecalis的抑制试验结果； [0052] 图10显示的是本申请所述卷曲乳杆菌LC‑17218对Staphylococcus epidermidis的抑制试验结果。 具体实施方式[0053] 以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。 [0054] 术语定义 [0055] 在本申请中，术语“卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)”或“卷曲乳杆菌(L.crispatus)”通常是指乳杆菌属的物种。该物种通常基于核糖体的16S rRNA基因的多核苷酸序列与其它乳杆菌区别开。 [0056] 在本申请中，术语“序列同一性”通常是指在比较窗中两个多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即以核苷酸计，或者以残基计)。术语“％序列同一性”如下计算：对比比较窗内的两个最佳比对序列，确定两个序列中存在相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或氨基酸残基的位置数，得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的位置总数(即比较窗大小)，将结果乘以100，得到序列同一性百分率。术语“实质同一性”或“基本上相同”通常表示多核苷酸或氨基酸序列的一种特性，其中当与参考序列在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口上，具体地讲在至少18‑48个核苷酸(6‑16个氨基酸)位置的窗口上，经常在至少24‑48个核苷酸(8‑16个氨基酸)位置的窗口进行比较时，多核苷酸或氨基酸序列包含具有至少约85％序列同一性，例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或 95％序列同一性，更通常地至少约96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中通过在比较窗上比较参考序列和可能包含缺失或添加的序列计算出序列同一性百分比，这些序列可包括的缺失或添加总计为参考序列的20％或更少。 [0057] 在本申请中，术语“有效培养条件”通常是指卷曲乳杆菌细胞置于或暴露于其中以促进所述细胞生长的环境。因此，该术语通常是指可影响细胞生长的培养基、温度、大气条件、底物、搅拌条件等，允许约0.5至48小时的增殖时间。 [0058] 在本申请中，术语“阴道”通常是指阴道区域或分部或周围区域，包括阴唇、外阴、子宫颈、子宫、输卵管、卵巢、尿道、膀胱、肛门和直肠，包括其粘膜组织。 [0059] 在本申请中，术语“疾病”或“病症”可以互换使用，通常是指身体或某些器官的状态的任何变化，妨碍或扰乱了功能的履行，和/或在患病或与其接触的人中引起症状例如不适、机能障碍、痛苦或甚至死亡。 [0060] 在本申请中，术语“致病性的”(例如“致病菌”)通常是指能够引起疾病的物质、微生物或条件。在某些情境下，病原体还包括与疾病或病症相关，但尚未建立或尚待建立因果关系(例如，直接因果关系)的微生物(例如细菌)。在一些实施例中，并非病原体且可以是共生体的微生物可以引起疾病或生态失调或与之相关联，这取决于各种因素(例如部位的免疫状态、微生物分类群的丰度等)。此类微生物被称为“致病有机体”。 [0061] 在本申请中，术语“病原体”通常是指可能在泌尿生殖道中沉积的所有病原体，且特别是阴道加德纳氏菌、二路普雷沃氏菌、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、支原体(mycoplasmas)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、白色念珠菌和光滑念珠菌(Candida glabrata)，及可能引起肠感染的病原体，诸如例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和志贺氏菌属(Shigella)。 [0063] 在本申请中，术语“阴道菌群紊乱”或“阴道生态失调”通常是指阴道菌群正常动态平衡的失调，如与健康阴道环境相比革兰氏阳性菌的减少和/或革兰氏阴性菌的增多(例如，阴道粘膜缺乏保护性乳杆菌并且被大量不同的非乳杆菌定殖的病况，该病况可以是有症状的或无症状的)。具体紊乱或失调包括但不限于，真菌性(例如，酵母感染)、细菌性(例如，细菌性阴道病)、病毒性或寄生虫性(例如，毛滴虫)感染。所述感染包括那些被特征描述/诊断为阴道炎、阴道念珠菌病和阴道病的那些感染。一些引发这类感染的微生物的例子包括念珠菌属，特别是白色念珠菌(Candida albicans)和热带念珠菌(C.tropicalis)，和T.glabrata，加德纳菌属(阴道性的)，各种混合的厌氧细菌和消化链球菌属(Peptostreptococcus)细菌。如果不予治疗的话，这些阴道感染可以导致阴道的病理性分泌、女性患者极大的不适，和/或严重的医学后果。 [0064] 在本申请中，术语“抑制”通常是指抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。 [0065] 在本申请的，术语“分离的”在应用于核酸或蛋白质时通常表示核酸或蛋白质基本上不含与其在自然状态下缔合的其它细胞组分。例如，它可以是均质状态，并且可以在干溶液或水溶液中。纯度和均质性使用分析化学技术诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳法或高效液相色谱法典型地确定。 [0066] 术语“分离的”在应用于细菌时通常是指已经(1)与在最初生产时(无论是在自然界还是在实验环境中)与其相缔合的至少一些组分分开的细菌，和/或(2)由人工生产、制备、纯化和/或制造的细菌，例如使用人工培养条件，诸如(但不限于)在平板上和/或在发酵罐中培养。分离的细菌包括被培养的那些细菌，即使此类培养物不是单一培养物。分离的细菌可以与其最初相缔合的其它组分的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多分开。在实施方案中，分离的细菌大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约 99％纯。在某些实施方案中，本申请提供的细菌群体包括分离的细菌。在某些实施方案中，本申请提供的组合物包括分离的细菌。在某些实施方案中，施用的细菌为分离的细菌。 [0067] 在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常是指有助于向受试者施用活性剂和被受试者吸收并且可以包括在本申请的组合物中而不对患者造成显著的不良毒理学影响的物质。药学上可接受的载体的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、香料、盐溶液(诸如林格氏液)、醇、油、明胶、碳水化合物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和染料(color)等。此类制品可以被灭菌，本领域技术人员将认识到，其它药学载体也可用于本申请。 [0068] 在本申请中，术语“CFU(Colony‑Forming Units)”通常是指产品中细菌、真菌、酵母等微生物的群落总数，通常用作活菌数计算。 [0069] 术语“CFU/剂量”意指每天或每次向受试者提供的组合物/食品或膳食补充剂/药6 物中细菌存在的量。例如，在某些实施方案中，所述食品或膳食补充剂中卷曲乳杆菌以10 12 8 12 至10 CFU/剂量的量存在(例如10至10 CFU/剂量)。在此种实施方案中，如果将卷曲乳杆菌施用在食物产品中(例如，在固体饮料、酸奶中)，则每天或每次向受试者提供的食物产品 6 12 (例如固体饮料、酸奶)可含有约10至10 CFU的卷曲乳杆菌。当然，可替代地，这种细菌的量的可以分成多次施用，只要受试者在任何特定时间内(例如每24小时期间)接受的卷曲乳杆 6 12 菌的总量是从约10 至约10 CFU的细菌，即满足上述的食物产品或膳食补充剂中卷曲乳杆 6 12 8 12 菌以10至10 CFU/剂量的量存在(例如10至10 CFU/剂量)。 [0070] 在本申请中，术语“治疗和/或预防”不但包括治疗和/或预防疾病，而且通常包括预防所述疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，防止或减缓与所述疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与所述疾病相关的一种或多种症状，减少所述疾病和/或与之相关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或防止所述疾病的严重性和/或与之相关的任何症状的进一步增加，防止、减少或逆转由所述疾病以及通常对治疗患者有益的任何药理作用而引起的任何生理损害。本申请的组合物形成可行的治疗剂不需要实现完全治愈或根除疾病的任何症状或表现。如在相关领域中所认识到的，用作治疗剂的药物可降低给定疾病状态的严重程度，但不需要消除疾病的每种表现才能被认为是有用治疗剂。类似地，预防性施用的治疗构成可行的预防剂不需要完全有效地预防病症的发作。简单地在受试者中减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重程度，或通过提高另一种治疗的有效性，或通过产生另一种有益效果)，或减少疾病发生或恶化的可能性就足够了。 [0071] 在本申请中，术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且通常是指哺乳动物，如人患者和非人灵长类，以及实验用动物，如兔、大鼠和小鼠，以及其他动物。动物包括所有的脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如狗、猫、绵羊、母牛、猪、兔、鸡等。 [0072] 在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下约0.5％‑10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、或约10％的范围内变动。 [0073] 发明详述 [0074] 卷曲乳杆菌 [0075] 一方面，本申请提供一种分离的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，其生化鉴定结果如下： [0076] [0077] [0078] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌可以具有以下特性中的一种或多种： [0079] (i)在有效培养条件下产生至少约10mg/L过氧化氢； [0080] (ii)在有效培养条件下产生至少约5mg/L乳酸； [0081] (iii)在有效培养条件下18h内菌液浓度达到初始浓度的约8万倍以上； [0082] (iv)能够抑制选自下组的病原菌的生长和/或活性：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、普雷沃氏菌(Prevotella corpri)、普雷沃氏菌(Prevotella timonensis)、二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)、微小杆菌(Micrococcus luteus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、表面葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，及其任意组合。 [0083] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌可以在有效培养条件下产生至少约10mg/L、或至少约11mg/L、或至少约12mg/L、或至少约13mg/L、或至少约14mg/L、或至少约15mg/L、或至少约16mg/L、或约至少17mg/L、或约至少18mg/L、或约至少19mg/L、或约至少20mg/L、或至少约21mg/L、或约至少22mg/L、或约至少23mg/L、或至少约24mg/L、或至少约25mg/L的过氧化氢。例如，所述卷曲乳杆菌在有效培养条件下可以生产至少约20mg/L过氧化氢。 [0084] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌可以在有效培养条件下生产至少约5mg/L、或至少约5.1mg/L、或至少约5.2mg/L、或至少约5.3mg/L、或至少约5.4mg/L、或至少约5.5mg/L、或至少约5.6mg/L、或至少约5.7mg/L、或至少约5.8mg/L、或至少约5.9mg/L、或至少约6.0mg/L、或至少约6.1mg/L、或至少约6.2mg/L、或至少约6.3mg/L、或至少约6.4mg/L、或至少约6.5mg/L、或至少约6.6mg/L、或至少约6.7mg/L、或至少约6.8mg/L、或至少约6.9mg/L、或至少约7.0mg/L的乳酸。 [0085] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌可以在有效培养条件下18h内菌液浓度达到初始浓度的约8万倍、或9万倍、或10万倍、或11万倍、或12万倍、或13万倍、或14万倍、或15万倍、或16万倍、或17万倍、或18万倍、或19万倍、或20万倍以上。 [0086] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌的16s rRNA的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少约99％的序列同一性。例如，具有约99.1％、99.2％、99.3％、 99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。 [0087] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌的16S rRNA可以包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。例如，所述卷曲乳杆菌的16S rRNA可以是如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 [0088] 又例如，所述卷曲乳杆菌的16S rRNA可以是如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；且所述卷曲乳杆菌可以在有效培养条件下产生至少约10mg/L的过氧化氢；且所述卷曲乳杆菌可以在有效培养条件下产生至少约5mg/L的乳酸；且所述卷曲乳杆菌可以在有效培养条件下18h内菌液浓度达到初始浓度的约8万倍以上；且所述卷曲乳杆菌能够抑制以下病原菌的生长和/或活性：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、普雷沃氏菌(Prevotella corpri)、普雷沃氏菌(Prevotella timonensis)、二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)、微小杆菌(Micrococcus luteus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、表面葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，及其任意组合。 [0089] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)抑菌圈直径到约10mm以上。例如，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验可以对无乳链球菌抑菌圈直径到约10.5mm、或约11mm、约11.5mm、或约12mm、约12.5mm、或约13mm、约13.5mm、或约14mm、约14.5mm、或约15mm、约15.5mm、或约16mm、约16.5mm、或约17mm、约17.5mm、或约18mm、约19.5mm、或约20mm以上。 [0090] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验对普雷沃氏菌(Prevotella corpri)抑菌圈直径到约15mm以上。例如，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验可以对Prevotella timonensis抑菌圈直径到约15.5mm、或约16mm、约16.5mm、或约17mm、约17.5mm、或约18mm、约19.5mm、或约20mm、或约20.5mm、或约21mm、或约21.5mm、或约 22mm、或约22.5mm、或约23mm、或约23.5mm、或约24mm、或约24.5mm、或约25mm以上。 [0091] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验对普雷沃氏菌(Prevotella timonensis)抑菌圈直径到约15mm以上。例如，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验可以对Prevotella timonensis抑菌圈直径到约15.5mm、或约16mm、约16.5mm、或约17mm、约17.5mm、或约18mm、约19.5mm、或约20mm、或约20.5mm、或约21mm、或约21.5mm、或约22mm、或约22.5mm、或约23mm、或约23.5mm、或约24mm、或约24.5mm、或约25mm以上。 [0092] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验对二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)抑菌圈直径到约15mm以上。例如，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验可以对Prevotella bivia抑菌圈直径到约15.5mm、或约16mm、约16.5mm、或约17mm、约17.5mm、或约18mm、约19.5mm、或约20mm、或约20.5mm、或约21mm、或约21.5mm、或约22mm、或约22.5mm、或约23mm、或约23.5mm、或约24mm、或约24.5mm、或约25mm、或约25.5mm、或约26mm、或约26.5mm、或约27mm、或约27.5mm、或约28mm、或约28.5mm、或约29mm、或约29.5mm、或约30mm以上。 [0093] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验对微小杆菌(Micrococcus luteus)抑菌圈直径到约15mm以上。例如，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验可以对Micrococcus luteus抑菌圈直径到约15.5mm、或约16mm、约16.5mm、或约17mm、约17.5mm、或约18mm、约19.5mm、或约20mm、或约20.5mm、或约21mm、或约21.5mm、或约 22mm、或约22.5mm、或约23mm、或约23.5mm、或约24mm、或约24.5mm、或约25mm以上。 [0094] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)抑菌圈直径到约10mm以上。例如，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验可以对Enterococcus faecalis抑菌圈直径到约10.5mm、或约11mm、约11.5mm、或约12mm、约12.5mm、或约13mm、约13.5mm、或约14mm、约14.5mm、或约15mm、约15.5mm、或约16mm、约16.5mm、或约17mm、约17.5mm、或约18mm、约19.5mm、或约20mm以上。 [0095] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验对表面葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)抑菌圈直径到约10mm以上。例如，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验可以对Staphylococcus epidermidis抑菌圈直径到约10.5mm、或约11mm、约11.5mm、或约12mm、约12.5mm、或约13mm、约13.5mm、或约14mm、约14.5mm、或约15mm、约15.5mm、或约16mm、约16.5mm、或约17mm、约17.5mm、或约18mm、约19.5mm、或约20mm以上。 [0096] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌为卷曲乳杆菌LC‑17218，其保藏编号为CGMCC NO.21222。 [0097] 用途和组合物 [0098] 另一方面，本申请提供一种前述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物可以用于治疗和/或预防泌尿生殖系疾病。 [0099] 在某些实施方式中，其中所述泌尿生殖系疾病包括阴道疾病。 [0100] 在某些实施方式中，所述阴道疾病包括阴道感染。例如，细菌性阴道病、需氧性阴道病、病毒性阴道病、酵母性阴道炎、滴虫性阴道炎、HPV感染、淋病、衣原体感染、泌尿道感染或骨盆炎性疾病。 [0101] 另一方面，本申请提供一种前述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物可以用于抑制致病菌。 [0102] 在某些实施方式中，所述致病菌可以包括：无乳链球菌、普雷沃氏菌、普雷沃氏菌、二路普雷沃氏菌、微小杆菌、粪肠球菌、表面葡萄球菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌中的任意一种或多种。 [0103] 另一方面，本申请提供一种前述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物可以用于治疗和/或预防阴道菌群紊乱。 [0104] 另一方面，本申请提供一种前述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物可以具有阴道上皮细胞粘附功能。例如，所述卷曲乳杆菌菌株可以具有至少约50％的阴道上皮细胞(VEC)内聚力值(cohesion value)百分比。在本申请中，“VEC内聚力值百分比”一般被定义为至少一个乳杆菌细胞粘附的VEC占鉴定的组的VEC总数的百分比。用于测定可接受的VEC内聚力值的方法是本领域熟知的，并且可以见于美国专利第6,468,526号和美国专利第6,093,394号。还参见Kwok,等人,J.Urol.2006,176:2050‑2054。 [0105] 另一方面，本申请提供一种前述的卷曲乳杆菌在制备消洗剂中的用途，所述消洗剂可以用于改善阴道内环境。 [0106] 在某些实施方式中，其中所述改善阴道内环境可以包括维持阴道酸碱度或增加阴道乳酸浓度。 [0107] 另一方面，本申请提供一种组合物，其可以包含前述的卷曲乳杆菌和/或其代谢产物，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体。 [0108] 在某些实施方式中，所述的卷曲乳杆菌通常以约105至约1012CFU/剂量(例如，约5 6 7 8 9 10 10CFU/剂量、约10CFU/剂量、约10CFU/剂量、约10CFU/剂量、约10CFU/剂量、约10 CFU/ 11 12 剂量、约10 CFU/剂量、或约10 CFU/剂量)的活细胞施用，或者作为以液体、半固体或冻干形式的相应培养物的无细胞上清液施用。 [0109] 在某些实施方式中，所述载体为药学上可接受的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。所述填充剂可以为微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或多种；所述润湿剂可以为乙醇或甘油中的一种或多种；所述崩解剂可以为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种；所述粘合剂可以为淀粉糊、糖浆、饴糖、炼蜜或液状葡萄糖中的一种或多种；所述润滑剂可以为硬脂酸镁、硬脂酸富马酸钠、滑石粉或二氧化硅中的一种或多种。 [0110] 在某些实施方式中，所述组合物的剂型可以包括软胶囊、栓剂、凝胶剂、外用溶液剂、洗剂或搽剂。 [0111] 在某些实施方式中，所述的组合物可以配置用于经口、阴道、尿道和/或直肠施用。例如，组合物可以以冻干剂、乳膏、糊剂、凝胶液体或栓剂、胶囊或片剂、触针的形式滴注，用于肠道、尿道或阴道应用。示例性阴道施用包括局部、唇下、真皮内、肌肉内、腔内、皮下或吹入，或者可以通过直接注射或提供喷雾进行。 [0112] 用于阴道递送的示例性剂型可以包括栓剂(例如，阴道栓)、乳膏、软膏、凝胶(润滑剂)、溶液、悬浮液、乳液、阴道环、卫生棉条、垫、冲洗剂、海绵、杯剂、子宫内避孕器(IUD)、膀胱内输液剂、条、喷雾剂、泡沫、片剂、胶囊、丸剂、贴片、丸粒、盖、膜、纤维、涂药器、粘合剂、罩(例如安全套)或羊膜腔外输液剂。在一些实施例中，适合阴道递送的剂型能够在给予后维持特定形状或稠度。在一些实施例中，适合阴道递送的剂型可以在给予后溶解或改变形式。 [0113] 另一方面，本申请提供前述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或前述的组合物在制备卫生用品的应用。 [0114] 另一方面，本申请提供一种卫生用品，其可以含有前述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或前述的组合物。 [0115] 在某些实施方式中，其中所述卫生用品可以为医疗器械。例如，阴道镜、妇科自检镜、引导扩张器、窥阴器、妇科冲洗器或妇女外用抗菌器。 [0116] 在某些实施方式中，其中所述卫生用品可以包括洗剂、护垫、纸巾、棉塞、凝胶、软膏、乳膏、喷雾剂或沐浴露。 [0117] 另一方面，本申请提供一种食品，其可以包含前述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或前述的组合物。食品可以是液体、固体、悬浮液或粉末的形式。 [0118] 在某些实施方式中，所述卷曲乳杆菌可以经被囊化或者包衣。 [0119] 在某些实施方式中，所述食品包含选自燕麦片粥、乳酸发酵食物、抗性淀粉、饮食纤维、糖类、蛋白质和糖基化蛋白质的载体材料。例如，所述食品选自面包、乳制品(例如，酸奶，风味发酵乳，乳酸菌饮料，奶酪)、汁、健康条(health bar)、涂抹料(spreads)、饼干、糖果和谷类。 [0120] 另一方面，本申请提供一种膳食补充剂，其可以包含前述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或前述的组合物。在某些实施方式中，所述膳食补充剂可以被配制用于口服施用。 [0121] 在某些实施方案中，所述膳食补充剂可以为丸剂、粉剂、胶囊剂、片剂、颗粒粉剂、盖膜剂(opercula)、口溶性颗粒剂、小袋剂、糖衣丸剂或液体剂的形式。 [0122] 在某些实施方案中，食物产品或膳食补充剂还可包括但不限于下列物质中的一种或任何组合：益生菌(例如益生细菌)，膳食纤维、益生元、蛋白质(例如酶)，碳水化合物，脂类物质(例如脂肪)，维生素，矿物质，植物成分(例如植物提取物)，氨基酸，免疫调节剂，乳汁替代物，或者短双歧杆菌或其后代的代谢物或提取物。在某些实施方案中，还可将本申请的组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质、稳定剂、助流剂、填充剂等食品中可接受的辅料进行组合。 [0123] 另一方面，本申请提供一种分离的核酸，所述核酸可以包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 [0124] 另一方面，本申请还提供了以下实施方式： [0125] 1.一种分离的卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，其生化鉴定结果如下： [0126] [0127] 2.根据实施方式1所述的分离的卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌具有以下特性中的一种或多种： [0128] (i)在有效培养条件下产生至少约10mg/L过氧化氢； [0129] (ii)在有效培养条件下产生至少约5mg/L乳酸； [0130] (iii)在有效培养条件下18h内菌液浓度达到初始浓度的约8万倍以上； [0131] (iv)能够抑制选自下组的病原菌的生长和/或活性：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、普雷沃氏菌(Prevotella corpri)、普雷沃氏菌(Prevotella timonensis)、二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)、微小杆菌(Micrococcus luteus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、表面葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，及其任意组合。 [0132] 3.根据实施方式1‑2中任一项所述的分离的卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌的16s rRNA的核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少约99％的序列同一性。 [0133] 4.根据实施方式1‑3中任一项所述的分离的卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌的16S rRNA包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 [0134] 5.根据实施方式1‑4中任一项所述的分离的卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌在有效培养条件下生产至少约20mg/L过氧化氢。 [0135] 6.根据实施方式1‑5中任一项所述的分离的卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌在有效培养条件下生产至少约6.5mg/L乳酸。 [0136] 7.根据实施方式1‑6中任一项所述的分离的卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌在体外培养双层抑制实验对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)抑菌圈直径到约10mm以上，对Prevotella corpri抑菌圈直径到约15mm以上，对Prevotella timonensis抑菌圈直径到约15mm以上，对Prevotella bivia抑菌圈直径到约15mm以上，对Micrococcus luteus抑菌圈直径到约15mm以上，对Enterococcus faecalis抑菌圈直径到约10mm以上，和/或对Staphylococcus epidermidis抑菌圈直径到约10mm以上。 [0137] 8.根据实施方式1‑7中任一项所述的分离的卷曲乳杆菌，所述卷曲乳杆菌为卷曲乳杆菌LC‑17218，其保藏编号为CGMCC NO.21222。 [0138] 9.实施方式1‑8中任一项所述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防泌尿生殖系统疾病。 [0139] 10.根据实施方式9所述的应用，其中所述泌尿生殖系统疾病包括阴道疾病。 [0140] 11.根据实施方式10所述的应用，所述阴道疾病包括阴道感染。 [0141] 12.根据实施方式11所述的应用，所述阴道感染包括：细菌性阴道病、需氧性阴道病、病毒性阴道病、酵母性阴道炎、滴虫性阴道炎、HPV感染、淋病、衣原体感染、泌尿道感染或骨盆炎性疾病。 [0142] 13.实施方式1‑8中任一项所述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物用于抑制致病菌。 [0143] 14.根据实施方式13所述的应用，其中所述致病菌包括：无乳链球菌、普雷沃氏菌、普雷沃氏菌、二路普雷沃氏菌、微小杆菌、粪肠球菌、表面葡萄球菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌中的任意一种或多种。 [0144] 15.实施方式1‑8中任一项所述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防阴道菌群紊乱。 [0145] 16.实施方式1‑8中任一项所述的卷曲乳杆菌在制备药物中的用途，所述药物具有阴道上皮细胞粘附功能。 [0146] 17.实施方式1‑8中任一项所述的卷曲乳杆菌在制备消洗剂中的用途，所述消洗剂用于改善阴道内环境。 [0147] 18.根据实施方式17所述的用途，其中所述改善阴道内环境包括维持阴道酸碱度或增加阴道乳酸浓度。 [0148] 19.组合物，其包含实施方式1‑8中任一项所述的卷曲乳杆菌和/或其代谢产物，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体。 [0149] 20.实施方式1‑8中任一项所述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或实施方式19所述的组合物在制备卫生用品的应用。 [0150] 21.卫生用品，其含有实施方式1‑8中任一项所述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或实施方式19所述的组合物。 [0151] 22.根据实施方式21所述的卫生用品，其中所述卫生用品为医疗器械。 [0152] 23.根据实施方式21所述的卫生用品，其中所述卫生用品包括洗剂、护垫、卫生巾、卫生棉条、纸巾、棉塞、凝胶、软膏、乳膏、喷雾剂或沐浴露。 [0153] 24.食品，其包含实施方式1‑8中任一项所述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或实施方式19所述的组合物。 [0154] 25.膳食补充剂，其包含实施方式1‑8中任一项所述的卷曲乳杆菌，其代谢产物，和/或实施方式19所述的组合物。 [0155] 26.一种分离的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 [0156] 不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的卷曲乳杆菌、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。 [0157] 实施例 [0158] 试剂与材料 [0159] 试剂 [0160] [0161] 仪器 [0162]仪器名称 型号 品牌或生产厂家 多功能酶标仪 SynergyHTX BioTek 真空泵 A30 Gene science 低温气浴摇床 Forma Shake Forma Shake 台式高速离心机 3K15 Sigma 厌氧/微需氧培养箱 A35 Whitley Science 需氧培养箱 Precision Thermo Scientific [0163] 实施例1：卷曲乳杆菌的筛选及菌种鉴定 [0164] 将健康人的阴道分泌物采用一次性无菌拭子采集，采用直接涂布法接种于MRS培养基，37℃厌氧培养18‑36h，得到多个菌落；如图1所示，单个菌落呈圆形、白色不透明、大而扁平、无光泽。分别提取多个所述单菌落的DNA，并扩增、测定所述单菌落的16S rDNA序列，将测定结果与乳杆菌的16S rDNA序列进行比对，经一系列功能实验(产乳酸试验、产过氧化氢试验)筛选得到所述能够改善人体阴道内环境的卷曲乳杆菌，命名为LC‑17218，该菌的16S测序序列如SEQ ID NO:1所示，电镜下的形态图如图2所示。 [0165] 卷曲乳杆菌的筛选方法具体包括以下步骤： [0166] 1.增殖能力试验 [0167] a.使用无菌接种环从MRS固体培养基中刮取乳杆菌菌苔，转移到MRS液体培养基中制成菌悬液； [0168] b.使用移液器吸取200μL的菌悬液于96孔酶标板中(注意不要有气泡，以免影响吸光度测量结果)； [0169] c.使用酶标仪在波长为570nm测定96孔板中菌悬液的吸光度，使其菌液吸光度为9 OD＝1.0(此时菌液浓度为10 CFU/mL)；随后，将确定了浓度的菌悬浮液按1:20的体积比例加入到MRS液体培养中(常规为1mL菌悬液加入装有19mLMRS液体培养基的50mL离心管中)，轻柔混匀，再次测量菌悬液的吸光度(OD:0h)； [0170] d.将离心管拧紧盖子，放入厌氧罐中并固定好位置，在厌氧灌内放入厌氧产生包，盖好厌氧罐，并使用真空泵取出厌氧罐中氧气，最后放入Forma Shake摇床，于37℃，180转/分钟的条件下培养18h； [0171] e.将培养18h的细菌培养物吸取200μL于96孔板中使用酶标仪于波长570nm测定其吸光度(OD：18h)。 [0172] 比较培养前后的OD570值，结果如表1所示，卷曲乳杆菌LC‑17218能够快速增殖。在9 MRS条件下18h内，菌液浓度达到初始浓度的8万倍(约为10CFU/mL)以上。 [0173] 表1 [0174] [0175] 2.产乳酸试验 [0176] 通过使用博世生物技术提供的D‑乳酸测试盒进行检测：①按测试盒说明书的配制方法配制乳酸预混液并梯度稀释得到一系列浓度梯度的标准品溶液；②配制足量试剂工作液(注意设置样品对照组)；③按每孔20μL样品和80μL工作液混合反应；④测定读取时间为0时的565nm光密度(OD0)(520‑600nm)及在20min培养后的光密度(OD20)；⑤对照标准曲线用OD值测定样品中的乳酸浓度。 [0177] 3.产过氧化氢试验 [0178] 通过使用德国默克过氧化氢测试条，将其显色与比色卡进行比对来判断菌株产过氧化氢的能力：将在摇床振荡培养18h的细菌培养物以5500r/min的转速离心10min，使用无菌一次性吸管吸取其培养液上清100μL，滴于德国默克过氧化氢测试条的样品孔，30s后观察颜色，并与比色卡进行比对，判断该菌株产过氧化氢的能力。 [0179] 卷曲乳杆菌LC‑17218产乳酸试验、产过氧化氢试验结果见表2，与对照菌1(16S测序序列如SEQ ID NO:2所示)和对照菌2(16S测序序列如SEQ ID NO:3所示)相比，其具有良好的产酸和H2O2能力。 [0180] 表2 [0181]样品 D‑乳酸浓度(mg/L) H2O2(mg/L) 体外培养代谢pH值 LC‑17218 6.59 25 3.1 对照菌1 3.80 0 4.7 对照菌2 6.01 1 4.7 [0182] 实施例2：卷曲乳杆菌的生化鉴定 [0183] 采用法国梅里埃公司生产的API32和API20对菌株LC‑17218进行生化鉴定，结果如图3A‑3B所示，具体结果如下： [0184] 1.该菌不产脲素酶，不分解脲素； [0186] 3.该菌不产α半乳糖苷酶，不分解4‑邻硝基苯‑αD‑吡喃半乳糖； [0187] 4.该菌产β半乳糖苷酶，能够分解4‑邻硝基苯‑β‑吡喃半乳糖； [0188] 5.该菌不产β半乳糖苷酶‑6‑磷酸，不分解4‑邻硝基苯‑βD‑吡喃半乳糖苷‑6‑磷酸‑2‑环己胺(CHA)； [0189] 6.该菌产α葡萄糖苷酶，可分解4‑邻硝基苯‑α； [0190] 7.该菌不产β葡萄糖苷酶，不分解4‑邻硝基苯‑βD‑吡喃葡萄糖苷酶； [0191] 8.该菌不产α阿拉伯糖苷酶，不分解4‑邻硝基苯‑αL‑吡喃阿拉伯呋喃糖苷； [0192] 9.该菌不产β葡萄糖苷酸酶，不分解4‑邻硝基苯‑βD‑萄糖醛酸苷； [0193] 10.该菌不产β‑N‑乙酰基‑βD‑氨基葡萄糖苷酶，不分解4‑邻硝基苯‑N‑乙酰基‑βD‑氨基葡萄糖苷； [0194] 11.该菌产甘露糖发酵(MNE)，可分解D‑甘露糖； [0195] 12.该菌产甘露糖发酵(RAF)，可分解D‑棉子糖； [0196] 13.该菌不产谷氨酸脱羧酶，不分解谷氨酸； [0197] 14.该菌不产α岩藻糖苷酶，不分解4‑邻硝基苯‑αL‑吡喃岩藻糖苷； [0199] 16.该菌微产吲哚，可分解L‑色氨酸； [0200] 17.该菌产碱性磷酸酶，可分解2‑萘酚‑磷酸； [0201] 18.该菌产精氨酸芳香基酶，可分解L‑精氨酸‑β‑萘酚胺； [0202] 19.该菌产脯氨酸芳香基酶，可分解L‑脯氨酸‑β‑萘酚胺； [0203] 20.该菌不产亮氨酰甘氨酸芳香基酶，不分解L‑亮氨酰‑L‑甘氨酸‑β‑萘酚胺； [0204] 21.该菌产苯丙氨酸芳香基酶，可分解L‑苯丙氨酸‑β‑萘酚胺； [0205] 22.该菌产亮氨酸芳香基酶，可分解L‑亮氨酸‑β‑萘酚胺； [0206] 23.该菌不产焦谷氨酸芳香基酶，不分解焦谷氨酸‑β‑萘酚胺； [0207] 24.该菌产酪氨酸芳香基酶，不分解L‑酪氨酸‑β‑萘酚胺； [0208] 25.该菌产丙氨酸芳香基酶，可分解L‑丙氨酰‑L‑丙氨酸‑4‑硝基苯； [0209] 26.该菌微产甘氨酸芳香基酶，可分解L‑甘氨酸‑β‑萘酚胺； [0210] 27.该菌微产组氨酸芳香基酶，可分解L‑组氨酸‑β‑萘酚胺； [0211] 28.该菌微产谷氨酰谷氨酸芳香基酶，可分解L‑谷氨酰‑L‑谷氨酸‑β‑萘酚胺； [0212] 29.该菌产丝氨酸芳香基酶，可分解L‑丝氨酸‑β‑萘酚胺。 [0213] 29.该菌可分解葡萄糖产酸； [0214] 30.该菌可分解甘露醇产酸； [0215] 31.该菌可分解乳糖(来源‑牛)产酸； [0216] 32.该菌可分解蔗糖产酸； [0217] 33.该菌可分解麦芽糖产酸； [0218] 34.该菌可分解柳醇产酸； [0219] 35.该菌可分解木糖产酸； [0220] 36.该菌可分解阿拉伯糖产酸； [0221] 37.该菌不产水解(蛋白酶)(明胶)，不分解明胶(来源‑牛)； [0223] 39.该菌可分解甘油产酸； [0224] 40.该菌可分解纤维二糖产酸； [0225] 41.该菌微分解松叁糖产酸； [0226] 42.该菌微分解山梨醇产酸； [0227] 43.该菌微分解鼠李糖产酸； [0228] 44.该菌可分解海藻糖产酸。 [0229] 实施例3：卷曲乳杆菌的抑菌试验 [0230] 卷曲乳杆菌LC‑17218抑制Streptococcus agalactiae(无乳链球菌)能力、抑制Prevotella corpri(普雷沃氏菌)能力、抑制Prevotella timonensis(普雷沃氏菌)能力、抑制Prevotella bivia(二路普雷沃氏菌)能力、抑制Micrococcus luteus(微小杆菌)能力、抑制Enterococcus faecalis(粪肠球菌)能力和抑制Staphylococcus epidermidis(表面葡萄球菌)能力试验。 [0231] (1)乳杆菌接种无菌纸片厌氧培养18h： [0232] a.使用无菌接种环从MRS固体培养基中刮取乳杆菌菌苔，转移到无菌PBS缓冲溶液8 中制成菌悬液并使用酶标仪测定菌悬液在波长为570nm的吸光度，调其菌液浓度为10CFU/mL(OD＝0.5)； [0233] b.使用无菌尖头镊子将高压无菌的纸片均匀贴于MRS平板上，使用移液器和无菌Tip头吸取10μL的菌悬液滴加于纸片上，待菌液被MRS平板完全吸收后倒置放于厌氧箱厌氧培养18h； [0234] (2)病原菌混入BHI培养基层培养18h： [0235] a.使用无菌接种环从血平板中刮取病原菌菌苔，转移到无菌PBS缓冲溶液中制成8 菌悬液并使用酶标仪测定菌悬液在波长为570nm的吸光度，调其菌液浓度为10 CFU/mL(OD＝0.5)； [0236] b.将菌液浓度为108CFU/mL的病原菌以每100mL BHI琼脂培养基的量加入400μL菌液的比例将BHI培养基(事先冷却保温至50‑55℃)与菌液充分混合； [0237] c.将混有病原菌的BHI琼脂培养基按15mL/个倒入事先培养18h已有乳杆菌生长的MRS平板上，待培养基凝固后倒置，根据病原菌的需氧要求放入37℃培养箱培养，18h后测量抑菌圈大小并登记数据。结果如图4‑图10和表3所示，本申请的卷曲乳杆菌LC‑17218能够显著抑制多种病原菌。 [0238] 表3 [0239] [0240] [0241] 实施例4：卷曲乳杆菌的抗生素敏感试验 [0242] a.使用无菌接种环从MRS固体培养基中刮取乳杆菌菌苔，转移到MRS体液培养基中8 制成菌悬液，并使用酶标仪测定菌悬液在波长为570nm的吸光度，调其菌液浓度为10 CFU/mL(OD＝0.5)； [0243] b.使用移液器和无菌Tip头吸取100μL的菌悬液滴加于MRS平板上，使用无菌涂菌棒使菌液均匀涂布至菌液完全被平板吸收； [0244] c.将OXOID药敏片(克林霉素、甲硝唑、替硝唑、氨苄西林)贴于涂有待测菌株的平板上，放于37℃厌氧箱中培养，24h后观察平板，测量平板抑菌圈并登记数据。 [0245] 结果表明，卷曲乳杆菌LC‑17218在体外可被克林霉素、甲硝唑、替硝唑、氨苄西林所抑制。 [0246] 实施例5：利用三代测序技术对细菌耐药基因测序分析 [0247] a.单菌制备：将卷曲乳杆菌LC‑17218在MRS培养基，37℃厌氧培养18‑27h，得到多个菌落；刮取菌落进行一步分析； [0248] b.使用核酸提取试剂盒对细菌进行裂解和DNA提取，所提细菌全基因组DNA经打断，ExoVII消化，损伤修复，末端修复，与接头连接，酶反应消化，片段分选等步骤，最终获得哑铃型文库，经Qubit设备和Agilent 2100生物分析仪检测后，进行PacBio Sequel进行测序； [0249] c.测序下机数据使用SPAdes3.15.2软件，以默认参数，经误读矫正、基于迭代k‑mer值的组装、错配矫正等步骤，将测序数据(fastq文件)组装为contigs。使用ResFinder4.1软件，以其自带的耐药基因数据库为参考，并以默认参数(90％的序列相似度和60％最小长度)检索contigs中的耐药基因并注释。 [0250] 分析结果如表4所示，卷曲乳杆菌LC‑17218未携带相关耐药基因，多种抗菌剂对其均具有抑制能力。 [0251] 表4 [0252] [0253] [0254] [0255] [0256] 综上，本申请的卷曲乳杆菌具有较强的体外增殖能力，遗传特性稳定(传代稳定，各代形态学、生化学、代谢物及药敏特性一致)，易于工业化生产和存储，该菌还具有高效的产酸和产H2O2能力，该卷曲乳杆菌及其无细胞上清液均在体内/外能够抑制多种病原菌增殖，并且该菌具有良好的阴道上皮细胞粘附能力，可以显著改善调节阴道微环境，抑制阴道致病菌的作用，同时生物相容性好，安全无毒。因此，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)LC‑17218和/或其代谢产物在制备预防和/或治疗泌尿生殖系疾病的产品(如药品、医疗器械或卫生用品等)中，具有良好的应用前景。 |
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