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卷曲乳杆菌菌株及其用途

专利类型	发明授权	法律事件	公开; 实质审查; 授权; 权利转移;
专利有效性	有效专利	当前状态	授权
申请号	CN201310002837.5	申请日	2013-01-05
公开(公告)号	CN103911305B	公开(公告)日	2016-04-13
申请人	欣力菲生物医药技术(天津)有限公司;	申请人类型	企业
发明人	张文杰;	第一发明人	张文杰
权利人	欣力菲生物医药技术(天津)有限公司	权利人类型	企业
当前权利人	杭州核力欣健实业股份有限公司	当前权利人类型	企业
省份	当前专利权人所在省份：天津市	城市	当前专利权人所在城市：天津市滨海新区
具体地址	当前专利权人所在详细地址：天津市滨海新区开发区洞庭路220号天津市国际生物联合研究院实验楼十三层S1316	邮编	当前专利权人邮编：300457
主IPC国际分类	C12N1/20	所有IPC国际分类	C12N1/20 ; A61K35/747 ; A61P31/04 ; A61P15/02 ; A61L15/36 ; C12R1/225
专利引用数量	3	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	10	专利文献类型	B
专利代理机构	北京润平知识产权代理有限公司	专利代理人	王凤桐; 周建秋;
摘要	本发明提供了一种菌株，该菌株为卷曲乳杆菌（Lactobacilluscrispatus）的菌株，其特征在于，该菌株的保藏号为CGMCC No.6360。本发明还提供了上述菌株在制备用于预防和/或治疗阴道炎的药物中的用途、在制备阴道护理用品中的用途和在制备外生殖器卫生用品中的用途。通过上述技术方案，本发明能够有效地实现对多种致病菌的拮抗作用。此外，本发明的菌株还具有更高的对阴道上皮细胞的粘附能力。因而本发明的菌株能够较好地满足实际的临床应用需求。
权利要求	1.一种菌株，该菌株为卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）的菌株，其特征在于，该菌株的保藏号为CGMCC No.6360。 2.根据权利要求1所述的菌株，其中，该菌株具有SEQ ID NO：1所示的16S rDNA序列。 3.权利要求1或2所述的菌株在制备用于预防阴道炎的药物中的用途。 4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述阴道炎为细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、幼儿性阴道炎、月经性阴道炎、老年性阴道炎和混合感染性阴道炎中的至少一种。 5.根据权利要求3所述的用途，其中，所述阴道炎为白色念珠菌（Candida albicans）、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的至少一种引发的阴道炎。 6.权利要求1或2所述的菌株在制备用于治疗阴道炎的药物中的用途。 7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述阴道炎为细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、幼儿性阴道炎、月经性阴道炎、老年性阴道炎和混合感染性阴道炎中的至少一种。 8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述阴道炎为白色念珠菌（Candida albicans）、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的至少一种引发的阴道炎。 9.权利要求1或2所述的菌株在制备阴道护理用品中的用途。 10.权利要求1或2所述的菌株在制备外生殖器卫生用品中的用途。
说明书全文	卷曲乳杆菌菌株及其用途技术领域 [0001] 本发明涉及医药微生物技术领域，具体地，涉及一种卷曲乳杆菌的菌株以及该菌株的用途。背景技术 [0002] 健康妇女阴道中存在着一些优势菌群，这些优势菌群对维持阴道正常菌群的平衡起着关键的作用。优势菌群通过分泌乳酸、过氧化氢、细菌素等物质起到杀灭致病菌的作用。同时，在阴道粘膜上皮细胞的竞争黏附作用起到生物屏障的作用，阻止了致病菌在阴道的繁殖。 [0003] 但是抗生素的使用、不良卫生习惯、环境、放化疗、精神压力等诸多原因可以破坏阴道正常菌群平衡，使优势菌群数量减少，致病菌大量繁殖，而导致各种阴道疾病如细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、幼儿性阴道炎、月经性阴道炎、老年性阴道炎、混合感染性阴道炎等。 [0004] 通过外源菌的介入来恢复阴道乳杆菌优势，从而达到正常阴道菌群的平衡状态是预防和/或治疗阴道炎症的一种有效手段。但是，已知的外源菌对致病菌的拮抗作用仍然较弱，难以满足实际的临床应用需求。发明内容 [0005] 本发明的目的是提供一种对致病菌的拮抗作用较强的外源菌菌株，该菌株能够较好地满足实际的临床应用需求。 [0006] 为了实现上述目的，本发明的发明人从志愿者的阴道中分离得到了一株乳杆菌，出乎意料地发现该乳杆菌菌株具有较强的对致病菌的拮抗作用，由此得到了本发明。 [0007] 一方面，本发明提供了一种菌株，该菌株为卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）的菌株，其特征在于，该菌株的保藏号为CGMCC No.6360。 [0008] 另一方面，本发明还提供了上述菌株在制备用于预防阴道炎的药物中的用途。 [0009] 另一方面，本发明还提供了上述菌株在制备用于治疗阴道炎的药物中的用途。 [0010] 另一方面，本发明还提供了上述菌株在制备阴道护理用品中的用途。 [0011] 另一方面，本发明还提供了上述菌株在制备外生殖器卫生用品中的用途。 [0012] 通过上述技术方案，本发明能够有效地实现对多种致病菌的拮抗作用。此外，本发明的菌株还具有更高的对阴道上皮细胞的粘附能力以及更高的产乳酸能力。因而本发明的菌株能够较好地满足实际的临床应用需求。 [0013] 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。 [0014] 生物保藏 [0015] 本发明的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）菌株，于2012年7月17日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.6360。具体实施方式 [0016] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。 [0017] 一方面，本发明提供了一种菌株，该菌株为卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）的菌株，其特征在于，该菌株的保藏号为CGMCC No.6360。 [0018] 其中，该菌株具有SEQ ID NO：1所示的16S rDNA序列。16S rDNA序列是编码16S rRNA的DNA序列，在菌株的分类和/或鉴定上具有重要的参考价值。 [0019] 其中，该菌株在MRS固体培养基上的菌落形态为圆形菌落，直径0.5-0.75mm，表面粗糙，在显微镜下呈革兰氏染色阳性短杆菌。 [0020] 其中，该菌株的培养条件可以采用已知的卷曲乳杆菌的培养方法，例如，该菌株可以在MRS液体培养基和MRS固体培养基上正常生长。其中，该菌株的生长温度可以为常规的温度，例如，生长温度可以为36-38℃。 [0021] 本发明中，MRS液体培养基是指由10g的蛋白胨、5g的酵母膏、10g的牛肉膏、20g的葡萄糖、5g的乙酸钠、2g的柠檬酸铵、1mL的吐温-80、0.58g的MgSO4·7H2O、0.25g的MnSO4·4H2O、2g的K2HPO4和1000mL的蒸馏水混合，调节pH值为6.2-6.4并且经121℃高压蒸汽灭菌后得到的培养基。 [0022] 本发明中，MRS固体培养基是指由10g的蛋白胨、5g的酵母膏、10g的牛肉膏、20g的葡萄糖、5g的乙酸钠、2g的柠檬酸铵、1mL的吐温-80、0.58g的MgSO4·7H2O、0.25g的MnSO4·4H2O、2g的K2HPO4、20g的琼脂粉和1000mL的蒸馏水混合，调节pH值为6.2-6.4并且经121℃高压蒸汽灭菌后得到的培养基。 [0023] 另一方面，本发明还提供了上述菌株在制备用于预防阴道炎的药物中的用途。 [0024] 其中，所述阴道炎可以为细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、幼儿性阴道炎、月经性阴道炎、老年性阴道炎和混合感染性阴道炎中的至少一种。 [0025] 其中，所述阴道炎可以为白色念珠菌（Candida albicans）、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的至少一种引发的阴道炎。 [0026] 其中，上述菌株可以通过如下方式发挥预防阴道炎的作用：（1）在MRS液体培养基中接种上述菌株，并且培养为菌体浓度为107个菌体/每mL，即得到上述菌株的培养液（；2）用无菌卫生棉球蘸取上述培养液，擦拭阴道，每天1-2次，每次使用3-10mL的培养液。即，上述菌株的培养液即可作为用于预防阴道炎的药物。 [0027] 另一方面，本发明还提供了上述菌株在制备用于治疗阴道炎的药物中的用途。 [0028] 其中，所述阴道炎为细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、幼儿性阴道炎、月经性阴道炎、老年性阴道炎和混合感染性阴道炎中的至少一种。 [0029] 其中，所述阴道炎可以为白色念珠菌（Candida albicans）、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的至少一种引发的阴道炎。 [0030] 其中，上述菌株可以通过如下方式发挥治疗阴道炎的作用：（1）在MRS液体培养基中接种上述菌株，并且培养为菌体浓度为107个菌体/每mL，即得到上述菌株的培养液（；2）用无菌卫生棉球蘸取上述培养液，擦拭阴道，每天1-2次，每次使用3-10mL的培养液。即，上述菌株的培养液即可作为用于治疗阴道炎的药物。 [0031] 另一方面，本发明还提供了上述菌株在制备阴道护理用品中的用途。 [0032] 另一方面，本发明还提供了上述菌株在制备外生殖器卫生用品中的用途。 [0033] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。 [0034] 测试实施例1 [0035] 按照文献（16S rDNA快速鉴定血液制品中污染细菌的测序方法的建立，应燕玲等，中华微生物学和免疫学杂志，2009年10期）中的方法，对本发明的卷曲乳杆菌菌株CGMCC No.6360的16S rDNA的序列进行测序，测序结果证实对本发明的卷曲乳杆菌菌株具有SEQ ID NO：1所示的16S rDNA序列。 [0036] 实施例1 [0037] 本实施例用于说明本发明的菌株对白色念珠菌（Candida albicans）的拮抗作用。本实施例中所用的白色念珠菌为购自ATCC的商品号为10231的菌株。 [0038] 将卷曲乳杆菌CGMCC No.6360用MRS液体培养基培养为菌体浓度1×107CFU/mL的培养液，命名为培养液A。 [0039] 将白色念珠菌（Candida albicans）用MRS液体培养基培养为菌体浓度1×107CFU/mL的培养液，命名为培养液B。 [0040] 将上述培养液A和上述培养液B等体积混合作为实验组，将单独的上述培养液B作为对照组。 [0041] 分别将1mL的实验组和对照组培养液，接种到150mL的MRS液体培养基中，37℃下培养24小时，得到共培养的培养液。 [0042] 分别取实验组和对照组的共培养培养液100μL，接种到15mL白色念珠菌选择性培养基平板中（沙氏葡萄糖琼脂培养基，购自青岛高科技园海博生物技术有限公司，货号：HB0235-5）中，37℃下选择培养24小时，然后对白色念珠菌进行计数。 [0043] 计数结果显示，实验组的白色念珠菌菌体浓度仅为7.76×105CFU/mL，而对照组的白色念珠菌菌体浓度高达4.67×106CFU/mL。 [0044] 对比例1 [0045] 按照实施例1的方法进行测试，不同的是，将实施例1中的卷曲乳杆菌CGMCC No.6360分别替换为购自ATCC的商品号为33820的卷曲乳杆菌。 [0046] 计数结果显示，对于购自ATCC的商品号为33820的卷曲乳杆菌，实验组的白色念珠菌菌体浓度也达到了1.95×106CFU/mL，而对照组的白色念珠菌菌体浓度仍为4.67×6 10CFU/mL。 [0047] 实施例2 [0048] 本实施例用于说明本发明的菌株对大肠杆菌（Escherichia coli）的拮抗作用。本实施例中所用的大肠杆菌为购自ATCC的商品号为35218的菌株。 [0049] 将卷曲乳杆菌CGMCC No.6360用MRS液体培养基培养为菌体浓度1×107CFU/mL的培养液，命名为培养液A。 [0050] 将大肠杆菌（Escherichia coli）用MRS液体培养基培养为菌体浓度1×107CFU/mL的培养液，命名为培养液B。 [0051] 将上述培养液A和上述培养液B等体积混合作为实验组，将单独的上述培养液B作为对照组。 [0052] 分别将1mL的实验组和对照组培养液，接种到150mL的MRS液体培养基中，37℃下培养24小时，得到共培养的培养液。 [0053] 分别取实验组和对照组的共培养培养液100μL，接种到15mL大肠杆菌选择性培养基平板中（曙红亚甲基蓝琼脂培养基，购自青岛高科技园海博生物技术有限公司，货号：HB7010）中，37℃下选择培养24小时，然后对大肠杆菌进行计数。 [0054] 计数结果显示，实验组的大肠杆菌菌体浓度仅为2.19×107CFU/mL，而对照组的大肠杆菌菌体浓度高达2.04×108CFU/mL。 [0055] 对比例2 [0056] 按照实施例2的方法进行测试，不同的是，将实施例1中的卷曲乳杆菌CGMCC No.6360分别替换为购自ATCC的商品号为33820的卷曲乳杆菌。 [0057] 计数结果显示，对于购自ATCC的商品号为33820的卷曲乳杆菌，实验组的大肠杆菌菌体浓度也达到了7.76×107CFU/mL，而对照组的大肠杆菌菌体浓度仍为2.04×108CFU/mL。 [0058] 实施例3 [0059] 本实施例用于说明本发明的菌株对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的拮抗作用。本实施例中所用的金黄色葡萄球菌为购自ATCC的商品号为25923的菌株。 [0060] 将卷曲乳杆菌CGMCC No.6360用MRS液体培养基培养为菌体浓度1×107CFU/mL的培养液，命名为培养液A。 [0061] 将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）用MRS液体培养基培养为菌体浓度1×107CFU/mL的培养液，命名为培养液B。 [0062] 将上述培养液A和上述培养液B等体积混合作为实验组，将单独的上述培养液B作为对照组。 [0063] 分别将1mL的实验组和对照组培养液，接种到150mL的MRS液体培养基中，37℃下培养24小时，得到共培养的培养液。 [0064] 分别取实验组和对照组的共培养培养液100μL，接种到15L的金黄色葡萄球菌选择性培养基平板上（甘露醇氯化钠琼脂培养基，购自青岛高科技园海博生物技术有限公司，货号：HB4128-1）中，37℃下选择培养24小时，然后对金黄色葡萄球菌进行计数。 [0065] 计数结果显示，实验组的金黄色葡萄球菌菌体浓度仅为1.02×107CFU/mL，而对照组的金黄色葡萄球菌菌体浓度高达7.94×107CFU/mL。 [0066] 对比例3 [0067] 按照实施例1的方法进行测试，不同的是，将实施例1中的卷曲乳杆菌CGMCC No.6360分别替换为购自ATCC的商品号为33820的卷曲乳杆菌。 [0068] 计数结果显示，对于ATCC的商品号为33820的卷曲乳杆菌，实验组的金黄色葡萄球菌菌体浓度也达到了3.89×107CFU/mL，而对照组的金黄色葡萄球菌菌体浓度仍为7.94×7 10CFU/mL。 [0069] 根据实施例1-3和对比例1-3的结果可以看出，本发明的卷曲乳杆菌CGMCC No.6360对白色念珠菌（Candida albicans）、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有优异的拮抗作用。 [0070] 实施例4 [0071] 本实施例按照文献（王红艳，嗜酸乳杆菌对生殖道上皮细胞的黏附和黏附拮抗作用的研究，中华微生物学和免疫学杂志，2004年10月第24卷第10期）中的方法测定本发明的卷曲乳杆菌CGMCC No.6360对阴道上皮细胞的粘附能力。 [0072] 经测定，本发明的卷曲乳杆菌CGMCC No.6360对阴道上皮细胞的粘附指数为16.24±2.17。 [0073] 对比例4 [0074] 按照实施例4的方法测定购自ATCC的商品号为33820的卷曲乳杆菌。 [0075] 经测定，购自ATCC的商品号为33820的卷曲乳杆菌对阴道上皮细胞的粘附指数为10.37±1.85。 [0076] 根据实施例4和对比例4的结果可以看出，本发明的卷曲乳杆菌CGMCCNo.6360具有更高的对阴道上皮细胞的粘附能力。 [0077] 实施例5 [0078] 本实施例按照文献（樊永红,王丽,柳丹,等.米根霉发酵液中乳酸含量的测定方法研究[J].生物技术，2007，17（1）：54-55）中的方法测定本发明的卷曲乳杆菌CGMCC No.6360的乳酸含量。 [0079] 结果本发明的卷曲乳杆菌CGMCC No.6360的乳酸含量为6.8057g/L。 [0080] 对比例5 [0081] 按照实施例5的方法测定购自ATCC的商品号为33820的卷曲乳杆菌的乳酸含量。 [0082] 经测定，购自ATCC的商品号为33820的卷曲乳杆菌的乳酸含量是6.7834g/L。 [0083] 根据实施例5和对比例5的结果可以看出，本发明的卷曲乳杆菌CGMCC No.6360具有更高的产乳酸能力。 [0084] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。 [0085] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。 [0086] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

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