一种负泊松比结构人工椎间盘及其制备方法 |
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| 申请号 | CN202410161082.1 | 申请日 | 2024-02-05 | 公开(公告)号 | CN117695443B | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 四川大学华西医院; | 发明人 | 赵一泽; 黄勇; 王哲; 江雨林; 张利; 丰干钧; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于人工 椎间盘 技术领域，公开了一种负泊松比结构人工椎间盘及其制备方法，人工椎间盘由接枝 醛 基的负泊松比结构圆环形 支架 与位于所述圆环形支架中心孔内和包覆在所述圆环形支架表面的醛基化海藻酸钠/明胶复合 水 凝胶通过化学键结合而成；接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架是由聚己内酯制作的多个负泊松比结构同心圆环片相贴套装并连接成一体后通过醛基化处理形成。本发明所述人工椎间盘克服了现有金属人工椎间盘和正泊松比结构人工椎间盘存在的不足，其应 力 应变趋势符合软骨组织，受到纵向压缩 载荷 时发生横向收缩，醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶具有优异的抗压缩性能以及高回弹性和抗疲劳特性，与支架的结合强度显著提升。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种负泊松比结构人工椎间盘，其特征在于该人工椎间盘由接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架与位于所述圆环形支架中心孔内和包覆在所述圆环形支架表面的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶通过化学键结合而成；接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架是由聚己内酯制作的多个负泊松比结构同心圆环片相贴套装并连接成一体后通过醛基化处理形成。 |
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| 说明书全文 | 一种负泊松比结构人工椎间盘及其制备方法技术领域[0001] 本发明属于人工椎间盘技术领域，特别涉及一种负泊松比结构人工椎间盘及其制备方法。 背景技术[0002] 椎间盘是连接脊柱相邻椎体之间的软骨组织，由中央的胶状髓核和外周的纤维环构成，能够分散脊柱载荷以维持脊柱稳态。椎间盘疾病，尤其是椎间盘突出，是现代社会中最常见的脊柱疾病之一，据统计，它影响着全球数以百万计的成年人，成为导致工作能力丧失和生活质量下降的重要因素。椎间盘突出主要发生在腰椎和颈椎区域，是由于椎间盘的退化、损伤或磨损导致。随着年龄的增长，椎间盘逐渐失去水分，变得更脆弱，外部的纤维环容易发生裂纹，进而导致椎间盘内部的髓核组织突出，压迫附近的神经根或脊髓。在许多情况下，椎间盘突出的治疗包括物理治疗、药物治疗和生活方式调整。然而，对于某些患者来说，保守治疗可能无法提供长期的缓解，特别是在神经症状明显或脊柱稳定性受到威胁的情况下。因此在保守治疗失败的情况下，椎间盘手术是一种较为理想的治疗方式，其中人工椎间盘置换手术，是一种效果明确的手术方式。 [0003] 在临床上，椎间盘置换手术用的人工椎间盘通常是金属椎间盘，此种人工椎间盘虽然具有稳定的化学性质，但是由于其缺乏高弹性，因此人体脊柱承载的向压力负荷得不到充分的缓冲，长此以往会导致相邻节段疾病，包括椎体退变、新生骨赘形成、椎间盘突出等。此外，金属植入物还无法完全恢复脊柱的正常生理运动功能。 [0004] 由于金属人工椎间盘存在上述问题，因而非金属人工椎间盘的研究越来越受到重视和发展，例如，《Bioactive Materials》公开了一种3D生物打印双生长因子释放椎间盘支架〔见Bioactive Materials. 第6卷第1期（2021）179‑190〕，该椎间盘支架模型的髓核(NP)和纤维环(AF) 采用3D 生物打印墨水打印，所述3D 生物打印墨水由CTGF@PDA NPs(或 TGF‑β3@PDA NPs)、骨髓间充质干细胞和水凝胶混合形成。《Nanoscale》公开了一种仿生纳米纤维构建的组织工程椎间盘支架〔见Nanoscale. 第35卷第九期（2017）13095‑13103〕，该组织工程椎间盘支架用I型胶原同心环排列的电纺支架和藻酸盐水凝胶组合形成。然而这些仿生的人工椎间盘都是传统的正泊松比结构的设计，由于正泊松比材料在受到纵向压缩载荷时会发生横向膨胀，因此这种结构设计的人工椎间盘在植入体内一段时间后会发生塌陷，甚至内部的髓核会因挤压而破坏。 发明内容[0006] 本发明所述负泊松比结构人工椎间盘，由接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架与位于所述圆环形支架中心孔内和包覆在所述圆环形支架表面的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶通过化学键结合而成；接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架是由聚己内酯制作的多个负泊松比结构同心圆环片相贴套装并连接成一体后通过醛基化处理形成。 [0007] 所述负泊松比结构，包括内凹结构、手性结构、旋转多边形结构、折纸结构、穿孔板结构和片状褶皱结构。其中，内凹结构是通常使用的负泊松比结构。负泊松比材料在轴向压缩时会发生横向收缩变形，在物体撞击时，负泊松比材料会因冲击物体产生纵向压缩而形成横向收缩，接触点附近的材料向物体汇聚从而使接触点局部密度增加出现致密化，以增加材料压痕阻力，不易产生压陷凹痕。 [0008] 上述负泊松比结构的人工椎间盘中，聚己内酯制作的负泊松比结构同心圆环片的厚度为2mm 2.5mm，数量为5个 6个。~ ~ [0009] 上述负泊松比结构的人工椎间盘中，由聚己内酯制作的多个负泊松比结构同心圆环片相贴套装并连接成一体的负泊松比结构圆环形支架，其外径、中心孔孔径和高度根据患者椎间盘的尺寸确定。 [0010] 上述负泊松比结构的人工椎间盘中，表面包覆有海藻酸钠/明胶复合水凝胶的负泊松比结构圆环形支架对应于椎间盘的纤维环（AF），位于所述圆环形支架中心孔内的海藻酸钠/明胶复合水凝胶对应于椎间盘的髓核（NP）。 [0011] 本发明所述负泊松比结构人工椎间盘的制备方法，步骤如下： [0012] （1）负泊松比结构圆环形支架的制备； [0013] 以聚己内酯粉末为原料，通过3D打印得到由聚己内酯制作的多个负泊松比结构同心圆环片相贴套装并连接成一体的负泊松比结构圆环形支架； [0014] （2）负泊松比结构圆环形支架的醛基化处理； [0015] 将1,6‑己二胺溶于异丙醇中配制成质量浓度10%的1,6‑己二胺异丙醇溶液，将步骤（1）制备的负泊松比结构圆环形支架浸泡在所述1,6‑己二胺异丙醇溶液中，在室温下磁搅拌10h 12h，然后用去离子水超声清洗去除未反应的1,6‑己二胺，再放入真空干燥箱中在~37 ℃干燥10h 12h，得到的氨解支架； ~ [0016] 将氨解支架放入质量浓度2%的戊二醛水溶液中于室温浸泡10h 12 h，然后用去离~子水超声清洗去除未反应的戊二醛，再放入真空干燥箱中于37℃干燥20h 24h，得到接枝醛~ 基的负泊松比结构圆环形支架； [0017] （3）醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶的制备； [0018] 将海藻酸钠溶于无水乙醇中配制成浓度0.2g/mL的海藻酸钠乙醇溶液，将氧化剂高碘酸钠溶于去离子水中配制成浓度0.1g/mL 0.12 g/mL的高碘酸钠水溶液，将海藻酸钠~乙醇溶液与高碘酸钠水溶液按体积比1：9 10 计量，然后将计量好的高碘酸钠水溶液在搅~ 拌下加入海藻酸钠乙醇溶液，并在避光环境中继续搅拌6h 8h得反应液，随后将反应液离心~ 后收集沉淀物，并用无水乙醇重复离心洗涤去除未反应的高碘酸钠，再经冷冻干燥得到醛基化海藻酸钠粉末； [0019] 将醛基化海藻酸钠粉末和硼砂溶于37℃去离子水中，配制成醛基化海藻酸钠质量浓度为4%、硼砂质量浓度为2%的混合液，将明胶溶于50℃ 55℃的去离子水中配制成质量浓~度12%的明胶水溶液，按明胶水溶液所含明胶与混合液所含醛基化海藻酸钠的质量比为1：1 3计量明胶水溶液和混合液，然后将明胶水溶液在搅拌下加入混合液并混合均匀，在37℃~ 下静置 6h 8 h，再于室温静置20h 24 h，即得到醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶； ~ ~ [0020] （4）负泊松比结构人工椎间盘的形成； [0021] 将接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架置于醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶中，在37℃下静置6h 8h后再于室温静置 20h 24 h，在此过程中，醛基化海藻酸钠/明胶复~ ~合水凝胶进入接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架中心孔并包覆其表面，醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶中的氨基与接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架上的醛基发生席夫碱反应形成亚胺键实现化学键结合，即形成负泊松比结构人工椎间盘。 [0023] 本发明所述人工椎间盘克服了现有金属人工椎间盘和正泊松比结构人工椎间盘存在的不足，其应力应变趋势符合软骨组织，受到纵向压缩载荷时发生横向收缩，醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶具有优异的抗压缩性能以及高回弹性和抗疲劳特性，与支架的结合强度显著提升。 [0024] 本发明具有以下有益效果： [0025] 1、由于本发明中的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶由明胶和醛基化海藻酸钠通过亚胺键结合，因而具有优异的抗压缩性能以及高回弹性和抗疲劳特性（见实施例2）。 [0026] 2、实验表明，本发明所述方法制备的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶和负泊松比结构人工椎间盘均具有良好的生物相容性（见实施例2）。 [0027] 3、由于本发明所述负泊松比结构人工椎间盘由接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架与位于所述圆环形支架中心孔内和包覆在所述圆环形支架表面的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶通过化学键结合而成，因而不仅呈现出与复合水凝胶一致的粘弹性行为，符合软骨组织的应力应变趋势，刚度达到 3.87± 0.75 MPa，与椎间盘力学需求相当，在受到纵向压缩载荷时会发生横向收缩，而且复合水凝胶与支架的结合强度显著提升，可有效避免物理结合在载荷作用下发生分相的问题。 [0028] 4、由于本发明所述负泊松比结构人工椎间盘具有优良的力学性能和生物相容性，且复合水凝胶与支架的结合强度好，因而替代退变的椎间盘可获得良好的治疗效果。 [0030] 图1是本发明中一个负泊松比结构圆环片的示意图。 [0031] 图2是图1所示圆环片上的负泊松比结构放大图。 [0032] 图3是本发明中由聚己内酯制作的负泊松比结构圆环形支架的示意图，其中，H表示负泊松比结构圆环形支架的高度。 [0033] 图4是图3的俯视图，其中，d表示负泊松比结构圆环形支架的中心孔的孔径，D表示负泊松比结构圆环形支架的外径。 [0034] 图5是本发明所述负泊松比结构人工椎间盘的一种示意图。 [0035] 图6是图5的俯视图。 [0036] 图7是本发明实施例1制备的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶A1G2循环压缩测试的第一次循环曲线和第二次循环曲线图。 [0037] 图8是本发明实施例1制备的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶A1G2循环压缩测试循环加载 8 次后的形貌图。 [0038] 图9是本发明实施例1制备的负泊松比结构圆环形支架‑vPCL、醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶A1G2和负泊松比结构人工椎间盘‑vPCL‑A1G2压缩测试图，其中，（a）图是压缩应力应变曲线，（b）图是压缩弹性模量示意图。 [0039] 图10是本发明实施例1制备的接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架‑vPCL‑GA、醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶A1G2和负泊松比结构人工椎间盘‑vPCL‑A1G2的细胞相容性测试图，其中，（a）图是共培养 1、3 和 5 天后大鼠髓核（NP） 细胞的染色荧光图，（b）图是的活细胞计数结果图，（c）图是CCK‑8 法对细胞增殖情况的检测图。 [0040] 图中，1—负泊松比结构圆环形支架，1‑1—同心圆环片，1‑2—连接条，2—位于圆环形支架中心孔内的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶，3—包覆在圆环形支架表面的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶。 具体实施方式[0041] 下面通过实施例并结合附图对本发明所述负泊松比结构人工椎间盘及其制备方法作进一步说明。 [0042] 下述实施例中，聚己内酯（PCL）粉末购自中国深圳易生实业有限公司，海藻酸钠和明胶购自上海阿拉丁生化科技有限公司，高碘酸钠和硼砂购自成都金山化学试剂有限公司，其它化学试剂均通过市场购买。 [0043] 实施例1 [0044] 本实施例中的负泊松比结构人工椎间盘如图5、图6所示，由接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架1与位于圆环形支架中心孔内的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶2和包覆在圆环形支架表面的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶3通过化学键结合而成；所述接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架1是由聚己内酯制作的五个负泊松比结构同心圆环片1‑1相贴套装并由连接条1‑2连接成一体后通过醛基化处理形成；五个负泊松比结构同心圆环片的厚度相同，均为2mm，负泊松比结构圆环形支架1的外径D为4cm，中心孔的孔径d为2 cm，高度H为1.2cm。 [0045] 上述负泊松比结构人工椎间盘制备方法的步骤如下： [0046] （1）负泊松比结构圆环形支架的制备； [0047] 以聚己内酯粉末为原料，根据上述结构设计，通过3D打印得到由聚己内酯制作的五个负泊松比结构同心圆环片相贴套装并连接成一体的负泊松比结构圆环形支架（命名为‑vPCL 支架），如图3、图4所示，负泊松比结构圆环片如图1所示，负泊松比结构圆环片的负泊松比结构如图2所示，为一种内凹结构； [0048] （2）负泊松比结构圆环形支架的醛基化处理； [0049] 将1,6‑己二胺溶于异丙醇中配制成质量浓度10%的1,6‑己二胺异丙醇溶液，将步骤（1）制备的负泊松比结构圆环形支架浸泡在所述1,6‑己二胺异丙醇溶液中，在室温下磁搅拌12h，然后用去离子水超声清洗去除未反应的1,6‑己二胺，再放入真空干燥箱中在37 ℃干燥12h，得到的氨解支架 [0050] 将氨解支架放入质量浓度2%的戊二醛水溶液中于室温浸泡12 h，然后用去离子水超声清洗去除未反应的戊二醛，再放入真空干燥箱中于37℃干燥24h，得到接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架（命名为‑vPCL‑GA 支架）； [0051] （3）醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶的制备； [0052] 将海藻酸钠溶于无水乙醇中配制成浓度0.2g/mL的海藻酸钠乙醇溶液，将氧化剂高碘酸钠溶于去离子水中配制成浓度0.1g/mL的高碘酸钠水溶液，将海藻酸钠乙醇溶液与高碘酸钠水溶液按体积比1：10 计量，然后将计量好的高碘酸钠水溶液在搅拌下加入海藻酸钠乙醇溶液，并在避光环境中继续搅拌6h得反应液，随后将反应液离心后收集沉淀物，并用无水乙醇重复三次离心洗涤去除未反应的高碘酸钠，再于‑ 80℃冷冻干燥24h得到醛基化海藻酸钠粉末； [0053] 将醛基化海藻酸钠粉末和硼砂溶于37℃去离子水中，配制成醛基化海藻酸钠质量浓度为4%、硼砂质量浓度为2%的混合液，将明胶溶于50℃的去离子水中配制成质量浓度12%的明胶水溶液，按明胶水溶液所含明胶与混合液所含醛基化海藻酸钠的质量比为1：2计量明胶水溶液和混合液，然后将明胶水溶液在搅拌下加入混合液并混合均匀，在37℃下静置 6h，再于室温静置24 h，即得到醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶（命名为A1G2）； [0054] （4）负泊松比结构人工椎间盘的形成； [0055] 将接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架置于醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶中，在37℃下静置6h后再于室温静置 24 h， 在此过程中，醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶进入接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架中心孔并包覆其表面，醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶中的氨基与接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架上的醛基发生席夫碱反应形成亚胺键实现化学键结合，即形成负泊松比结构人工椎间盘（命名为‑vPCL‑A1G2）。 [0056] 实施例2 [0057] 1、力学性能测试 [0058] 力学性能测试根据 ISO 844:2004 标准，采用万能力学试验机（SHIMADZU，AG‑IC 50K日本）进行测试，压缩速度设置为2 mm/min。 [0059] （1）将实施例1步骤（3）制备的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶A1G2进行循环压缩测试，具体操作：将实验样品加载至 80%应变再卸载至 0%，并循环 8 次。测试结果见图7、图8。 [0060] 从图7可以看出，第一次循环曲线和第二次的循环曲线闭合良好，表明实施例1制备的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶具有优异的抗疲劳特性。 [0061] 从图8可以看出，实验样品在循环加载 8 次后仍维持完整的形貌，表明实施例1制备的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶具有优异的抗压缩性能。 [0062] （2）将实施例1步骤（1）制备的负泊松比结构圆环形支架‑vPCL、步骤（3）制备的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶A1G2和步骤（4）制备的负泊松比结构人工椎间盘‑vPCL‑A1G2进行压缩测试，测试结果见图9。 [0063] 从图9（a）可以看出，人工椎间盘‑vPCL‑A1G2对应的压缩应力应变曲线变化趋势介于支架‑vPCL和复合水凝胶A1G2之间，由于复合水凝胶的引入，人工椎间盘‑vPCL‑A1G2呈现出与复合水凝胶一致的粘弹性行为，符合软骨组织的应力应变趋势；当实验样品压缩达到 40 %形变时，人工椎间盘‑vPCL‑A1G2的压缩强度明显高于复合水凝胶 A1G2胶，但却低于支架‑vPCL，这是由于在人工椎间盘‑vPCL‑A1G2上下两端均被复合水凝胶覆盖，起到了缓冲作用，但刚开始施加应力时，人工椎间盘‑vPCL‑A1G2上下两端覆盖的复合水凝胶会首先发生较大程度的变形，而后再带动被包覆的支架一起发生形变，这也是人工椎间盘‑vPCL‑A1G2受压过程中初始 10 %应变阶段应力几乎未出现变化，而在应变达到 20 %之后应力大幅上升的原因。 [0064] 从图9（b）可以看出，人工椎间盘‑vPCL‑A1G2的压缩模量低于支架‑vPCL，但显著强于复合水凝胶A1G2。值得强调的是，人工椎间盘‑vPCL‑A1G2的刚度达到 3.87± 0.75 MPa，与椎间盘等天然纤维软骨严苛的力学需求相当。 [0065] 2、体外细胞实验 [0066] （1）细胞提取与培养 [0067] 实验动物为雄性 SD 大鼠（6‑8 周龄，200‑250g），购自于成都达硕动物实验动物有限公司。 [0068] 将雄性 SD 大鼠采用过量 10%水合氯醛进行安乐死处理。在无菌条件下分离出腰椎节段和腰椎间盘，用显微镊取出髓核组织，随后置于质量浓度0.25%的胰蛋白酶溶液中于 37℃下消化 30 min，然后转入质量浓度 0.1% 的II型胶原酶中于 37 ℃下震荡消化 4 h。 所得悬浮液在 1000 rpm下离心 5 min，沉淀物重新悬浮于含有质量浓度10% PBS、质量浓度1%青霉素/链霉素的α‑MEM 中，并置于37℃的体积浓度5% CO2培养箱中培养，隔天更换一次。待细胞铺满培养瓶底部面积 80%以上时，吸弃培养基，用 PBS缓冲液冲洗髓核细胞后加入胰蛋白酶并放入培养箱孵化 2 min。待消化完成后加入培养基终止消化并将细胞悬液吹打分散均匀，以 1：2 比例传代分瓶，取第三代大鼠髓核细胞用于后续实验。 [0069] （2）细胞相容性实验 [0070] 将实施例1步骤（2）制备的接枝醛基的负泊松比结构圆环形支架‑vPCL‑GA、步骤（3）制备的醛基化海藻酸钠/明胶复合水凝胶A1G2、步骤（4）制备的负泊松比结构人工椎间5 盘‑vPCL‑A1G2用紫外辐照灭菌后置于 48 孔板中，将第三代大鼠髓核（NP）细胞以 2×10 个/孔的密度分别接种于上述实验样品上，并置于恒温培养箱（37℃，5 v. % CO2）中培养，隔天换液。大鼠髓核（NP）细胞分别与实验样品共培养 1、3、5 天后，采用活死细胞染色试剂盒（Live/dead staining，凯基生物有限公司，中国）对细胞染色，并于倒置荧光显微镜（Olympus IX83，日本）下观察活/死细胞形态。通过 CCK‑8 试剂盒（凯基生物有限公司，中国）测定细胞在实验样品上的增殖情况。大鼠髓核（NP）细胞在实验样品上分别培养 1、3、5 天后，吸弃培养基，在每孔中加入培养基配制的质量浓度10%的 CCK‑8 溶液于 37℃、5v.% CO2 的培养箱孵育 2 h 后，将 100μL上清液转移至 96 孔板中，采用酶标仪（BioTek，美国）在 450 nm 波长处测定吸光度值。将细胞培养板上培养的大鼠髓核（NP）细胞作为空白对照，命名为 NC 组。实验结果见图10。 [0071] 从图10（a）可以看出，与对照组相比，复合水凝胶A1G2、支架‑vPCL‑GA和人工椎间盘‑vPCL‑A1G2共培养的细胞均呈现出较强的细胞活力，且细胞形态饱满，呈现纺锤体形态，细胞间通过伸展的伪足互相连接，表明三组样品各组分均无明显细胞毒性，且未见死细胞。 [0072] 从图10（b）可以看出，三组样品与对照组NC之间在不同时间点的活细胞数量没有显著性差异。 [0073] 从图10（c）可以看出，细胞在复合水凝胶A1G2和人工椎间盘‑vPCL‑A1G2中的增殖水平接近，且与对照组NC相比未表现出显著性差异，表明复合水凝胶A1G2、支架‑vPCL‑GA和人工椎间盘‑vPCL‑A1G2在第 1、3、5 天细胞增殖情况良好。 |
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