永生化的禽类细胞系及其用途
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 撤回; |
| 专利有效性 | 无效专利 | 当前状态 | 撤回 |
| 申请号 | CN201080021253.7 | 申请日 | 2010-05-11 |
| 公开(公告)号 | CN103547285A | 公开(公告)日 | 2014-01-29 |
| 申请人 | 特兰斯吉恩股份有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | J-M·巴卢尔; M·卡普弗; T·芒吉; | 第一发明人 | J-M·巴卢尔 |
| 权利人 | 特兰斯吉恩股份有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 特兰斯吉恩股份有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份： | 城市 | 当前专利权人所在城市： |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：法国伊尔基希-格拉芬斯塔登 | 邮编 | 当前专利权人邮编： |
| 主IPC国际分类 | A61K39/275 | 所有IPC国际分类 | A61K39/275 ; A61K39/12 ; C12N7/02 ; A61K38/18 |
| 专利引用数量 | 3 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 24 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 永新专利商标代理有限公司 | 专利代理人 | 王健; |
| 摘要 | 本 发明 涉及经特别永生化的禽类细胞系，其表达端粒酶逆转录酶(TERT)并展现出独特的 生物 制品生产模式。更特别地，本发明涉及永生化的禽类细胞系，其能够扩增黄病毒科，但不能扩增痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP)也不能扩增修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)，或者其能扩增黄病毒科和痘病毒科二者。本发明进一步涉及所述永生化禽类细胞系的用途及生产生物制品包括病毒和 蛋白质 的相关方法。 | ||
| 权利要求 | 1.用于产生病毒的方法，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 永生化的禽类细胞系及其用途[0001] 描述 技术领域[0002] 本发明涉及用于产生生物制品包括病毒和蛋白质的细胞系领域。本发明特别涉及特定的永生化禽类细胞系，其表达端粒酶逆转录酶(TERT)及呈现出不同的生物制品产生模式。本发明更特别涉及永生化禽类细胞系，其能扩增黄病毒科病毒，但是不能扩增痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP)和修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)，或者既能扩增黄病毒科也能扩增痘病毒科病毒。本发明进一步涉及所述永生化禽类细胞系的应用及产生生物制品包括病毒和蛋白质的方法。 [0003] 发明背景 [0004] 禽类细胞多年来用于生产病毒疫苗。例如，含胚鸡卵能支持众多人和动物病毒、包括削弱了在人或哺乳动物细胞中复制潜力的明显减毒的病毒的复制。用于人病毒疫苗生产的含胚鸡卵必须证明没有限定的病毒和细菌污染物(无特定病原体或SPF)。含胚鸡卵成本较高且可以占多达40％的病毒疫苗成本。直至SPF供应商证实用于生产一批疫苗的含胚鸡卵的亲代鸡完全没有任何疾病，该批疫苗才能被发放。这种不确定性显然增加了制备这些疫苗的成本。此外，大规模感染卵及维持病毒生长的方法耗时较长，且有时在不同的疫苗批次之间有不同。 [0005] 随着细胞培养技术的开展，疫苗生产者已经用分离的鸡胚成纤维细胞(CEF)代替含胚鸡卵。大多数黄病毒科病毒疫苗例如从CEF中生产。由世界卫生组织(WHO)推荐的黄病毒科黄热病毒疫苗是从17D毒株和次代毒株中制备的，其在核苷酸序列和等价免疫原性方面略有不同(CAMACHO L.A.B.et al.，Rev Saude Publica 38(5)：671-8(2004)；DOS SANTOS CN.，Virus Res.35：35-41(1995))。关于黄病毒科病毒生产方法的实验结果已经导致建立了使用17DD病毒毒株在CEF中生产黄热病毒疫苗的有效方法学(FREIRE M.S.，Vaccine 23，2501-2512(2005))。虽然使用CEF改善了生产方 法的安全模式、效率和可靠性，但是其也是高耗时及高成本的方法。CEF的产生依赖于SPF鸡卵的可得性。CEF是通过切碎胚胎以建立和扩增存活细胞而从SPF鸡卵中制备的。对于原代动物细胞典型的是，成纤维细胞经历衰老：随着传代而增加的倍增时间以及最后所有细胞均死亡。这个过程在大约20次传代后发生。这种有限的存活限度限制了对每批CEF进行完整安全性测试。 [0006] 由于如先前所述含胚鸡卵和CEF在生产病毒疫苗中的局限性，因此在过去的几十年中一直尝试寻找新的细胞培养系统。在此方面，永生化细胞系极具吸引力。一批批的永生化细胞系可以在生产场所维持或者冷冻，且总是可以为新的产生方法所利用。此外，由于其在生产工厂是受限的，因此其不易被外源污染物污染。使用其使得可以大幅度削减生产过程所需的人工处理。所有这些性质使得成本和生产时间均降低，以及潜在的污染减少。此外永生化的细胞系可以被充分鉴定，且因此总是符合实验室管理规范及不同医疗机构的要求。例如，VERO细胞系已经被描述为是生产黄病毒科病毒疫苗的替代候选物以代替许TM 可的含胚鸡卵。活的减毒的日本脑炎病毒疫苗ChimeriVax -JEV在培养于补加胎牛血清的培养基中的VERO细胞中增殖(MONATH et al.，Biologicals，33：131-144(2005))。相似地，MATEU et al.(Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.，101(3)：289-98(2007))和TORINIWA et al.(Vaccine，4；26(29-30)：3680-9(2008))已经分别在VERO细胞系中生产了黄热病毒疫苗和日本脑炎病毒疫苗。永生化细胞系的应用不限于病毒疫苗，其也可扩展为重组蛋白质。例如，抗体和流感病毒疫苗均可以在PER.C6 细胞系(ECACC number 96022940)、通过用腺病毒类型5的E1小基因转染而永生化的人胎儿成视网膜细胞系(FALLAUX F.J.et al.，Hum.Gene Ther.9：1909-17(1998)；PAU M.G.et al.，Vaccine 19，2716-2721(2001)； YALLOP C.et al.，Animal Cell Technology meets Genomics，533-536(2005))上增殖。 [0007] 然而，仍需要可供选择的永生化细胞系。WO2007/077256提供了通过用疣鼻栖鸭(Cairina moschata)端粒酶逆转录酶(TERT)核酸分子转染使原代禽类细胞永生化的方法，其通过将TERT核酸分子靶向或者随机插入疣鼻栖鸭原代禽类细胞基因组中而进行。基于所述方法，特别是通过随机插入，我们现在鉴别了彼此具有不同性质的新的永生化禽类细胞系。 发明内容[0008] 如本文所用，除非特别指出，“一个”是指“至少一个”、“至少第一个”、“一或多个”或者“多个”所指的成分或步骤。 [0009] 如本文所用，“和/或”是指包括“和”、“或”以及“所述术语涉及的要素的所有或者任何其他组合”。 [0010] 如本文所用，“包含”是指所述产物、组合物和方法包括所指成分或者步骤，但是不除外其它成分或步骤。“基本由……组成”当用于定义产物、组合物和方法时，应意味着排除任何有实质意义的其它成分或者步骤。因此，基本由指定成分组成的组合物不排除微量污染物及药物可接受的载体。“由……组成”应意味着排除微量的其它成分或步骤。 [0011] 如本文所用，“大约”是指在指定数值或范围的20％以内，优选10％以内，更优选5％以内。 [0012] 如本文所用，“永生化禽类细胞系”是指培养增殖超出Hayflick极限的禽类细胞系(HAYFLICK L.，Clin.Geriatr.Med.1(1)：15-27(1985))。更特别地，“永生化禽类细胞系”是指能培养生长30代以上的禽类细胞系，其保持大约1-2天的培养倍增时间，且已经连续培养大约6个月以上。禽类细胞系在培养大约20-25代之后被认为是永生化的。永生化禽类细胞与转化的细胞不同，与转化的细胞不同的是永生化禽类细胞是生长抑制的(arrested)(即禽类细胞是铺满的及易于接触抑制)且具有同质成纤维细胞样形态学。 [0013] 如本文所用，术语“能扩增病毒的永生化禽类细胞系”是指本发明的永生化禽类细胞系在病毒感染后由于所述病毒在感染的细胞中繁殖性病毒复制而能增加所述病毒的量。术语“繁殖性复制(reproductive replication)”是指所述病毒在永生化禽类细胞系中的复制达到产生感染性病毒后代的程度，其中输出病毒与输入病毒的比率高于1。换句话说，“能扩增病毒”是指输出病毒与输入病毒的比率应高于1。 [0014] 如本文所用，“黄病毒科病毒”包括黄病毒属病毒、瘟病毒属病毒、肝炎病毒、GB病毒A、GB病毒A样物质、GB病毒B及GB病毒C(也称作庚型肝炎病毒)。黄病毒科病毒的分类、基因组组构及复制周期已经充分描述(LINDENBACH B.D.et al.，in D.M.Knipe thand P.M.Howley，Fields Virology 5 Edition，Eds.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia(2007))。 [0015] 如本文所用，“黄病毒属病毒”包括蜱传播的病毒簇和无载体病毒簇(KUNO G.et al.，J.Virol.72，73-83(1998))。 [0016] “蜱传播的病毒簇”包括登革热病毒、日本脑炎病毒、澳洲墨莱溪谷(Murray Valley)脑炎病毒、St.Louis脑炎病毒、West Nile病毒、黄热病毒、Kunjin病毒、Rocio病毒和Ilheus病毒。 [0017] 登革热病毒(DENV)毒株被分成四个血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4。关于DENV基因组核苷酸序列的信息也可得自公众可登陆的基因数据库如GenBank：DEN-1病毒(例如GenBank编号M23027)、DEN-2病毒(例如GenBank编号M19197、NC-001474)、DEN-3病毒(例如GenBank编号M93130)、DEN-4病毒(例如GenBank编号M14931)。 [0018] 日本脑炎病毒(JEV)包 括如下毒株：P3、SA14、S892、GP78、ThCMAr4492、ThCMAr6793、JaGAr01、Jaoars982、Subin、KE-093/83、Nakayama野生毒株、Nakayama-RFVL、Nakayama-Yoken、LNDG07-02、LNDG07-16和K94P05。关于JEV基因组核苷酸序列的信息也可得自公众可登陆的基因数据库如GenBank，例如GenBank编号AF045551。 [0019] West Nile病毒(WNV)毒株包括基因型NY99和WN02。关于WNV基因组核苷酸序列的信息也可得自公众可登陆的基因数据库如GenBank，例如GenBank编号M12294、NC-001563。 [0020] 黄热病毒(YFV)毒株包括如下毒株：Asibi、French viscerotropic virus(FVV)、B4.1、Rendu、Dak1279、17D、17DD、17D-204、Colombia 88、F-204和 C-204(HAHN et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84，2019-2023(1987)；WANG et al.，J.of Gen.Virol.76，2749-2755(1995)；BALLINGER-CRABTREE & MILLER，J.of Gen.Virol.71，2115-2121(1990))；WANG H.et al.，J.of Gen.Virol.78，1349-1352(1997)；CAMACHO L.A.B.et al.，Rev Saude Publica 38(5)：671-8(2004)；DOS SANTOS CN.，Virus Res.35：35-41(1995)；GALLER R.et al.，Braz.J.Med.Biol.Res.volume 30(2)， 157-168(1997)。对黄热病毒(YFV)已经在遗传学水平进行研究(RICE et al.，Science 229：726-733(1985))及已经确定了关于基因型和表型的信息(MARCHEVSKY et al.，Am.J.Trop.Med.Hyg.52：75-80(1995))。关于YFV基因组核苷酸序列的信息也可以得自公众可登陆的基因数据库如GenBank，例如GenBank编号X03700、NC-002031。 [0021] “蜱传播的病毒簇(virus cluster)”是指蜱媒脑炎病毒(TBEV)(也称作蜱媒脑膜脑炎病毒)，其包括三种亚型：西方亚型(也称作中欧脑炎病毒)、远东亚型(也称作俄罗斯春季/夏季脑炎病毒)以及西伯利亚亚型(KAISER和REINHARD，Infectious Disease Clinics of North America.22(3)：561-575(2008))。关于TBEV基因组核苷酸序列的信息也可得自公众可登陆的基因数据库如GenBank，例如GenBank编号U27495、NC-001672。TBEV也包括构建的活嵌合疫苗，其含有毒性远东俄罗斯TBEV的C-preM-E或者preM-E结构蛋白基因，其余的非结构蛋白基因和5′-和3′-非编码序列衍生自DEN4[分别为TBEV(CME)/DEN4和TBEV(ME)/DEN4](PLETNEV et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10532-10536，(1992))。 [0022] “无载体病毒簇”包括Apoi病毒、细胞融合因子病毒(cell fusing agent virus)、San Perlita病毒、Jutiapa病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠白质脑炎病毒、Modoc病毒、Cowbone Ridge病毒、Sal Vieja病毒、Bukalasa bat病毒、Dakar bat病毒、Rio Bravo病毒、Carey Island病毒、Phnom Penh bat病毒及Batu Cave病毒(KUNO G.et al.，J.Virol.，7273-83(1998))。关于无载体病毒基因组核苷酸序列的信息也可得自公众可登陆的基因数据库如GenBank。例如对于Apoi病毒，如GenBank编号AF160193、NC-003676。 [0023] 如本文所用，“瘟病毒属病毒”包括边界病病毒(BDV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪瘟病毒(CSFV)。BDV包括3个基因型：BDV-1至-3(BECKER et al.Virology 31196-104(2003))。BVDV包括BVDV 1型(BVDV-1)和BVDV 2型(BVDV-2)(HEINZ et al.in Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses，859-868，Edited by M.H.V.Van Regenmortel，C.M.Fauquet，D.H.L.Bishop & 8 other editors.San Diego：Academic Press(2000))。 [0024] 如本文所用，“肝炎病毒”包括丙型肝炎病毒(HCV)。大量的系统发生学分析已经将HCV分离株分成6个主要基因型(1-6)，含有不同的亚型(a、b、c等)(SIMMONS et al.，Hepatology 42，962-973(2005))。举例的基因型1a的HCV分离株包括但不限于HCV-1(CHOO et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2451-2455(1991))、-J1(OKAMOTO et al.，Nucleic Acids Res.20，6410-6410(1992)) 和 -H(INCHAUSPE et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.88，10292-10296(1991))。举例的基因型1b的HCV分离株包括但不限于HCV-JA (KATO et al.，Proc.Natl.Acad.，Sci.87，9524-9528(1990))和BK(TAKAMIZAWA et al.，J.Virol.65， 1105-1113(1991))。举例的基因型1c的HCV分离株包括但不限于HCV-G9(OKAMOTO et al.，J.Gen.Virol.45，629-635(1994))。举例的基因型2a的HCV分离株包括但不限于HCV-J6(OKAMOTO et al.，J.Gen.Virol.72，2697-2704(1991))。举例的基因型2b的HCV分离株包括但不限于HCV-J8(OKAMOTO et al..Virology 188，331-341(1992))。举例的基因型2c的HCV分离株包括但不限于HCV-BEBE1(NAKO et al.，J.Gen.Virol.141， 701-704(1996))。举例的基因型3a的HCV分离株包括但不限于HCV-NZL1(SAKAMOTO et al.，J.Gen.Virol.75，1761-1768(1994))。举例的基因型3b的HCV分离株包括但不限于HCV-Tr(CHAYAMA et al.，J.Gen.Virol.75，3623-3628(1994))。举例的基因型4a的HCV分离株包括但不限于HCV-ED43(CHAMBERLAIN et al.，J.Gen.Virol.78，1341-1347(1997))。 举例的基因型5a的HCV分离株包括但不限于HCV-EUH1480(CHAMBERLAIN et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.236，44-49(1997))。举例的基因型6a的HCV分离株包括但不限于HCV-EUHK2(ADAMS et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.234，393-396(1997))。 [0025] 如本文所用，“痘病毒科病毒”包括正痘病毒、羊痘病毒、禽痘病毒、副痘病毒和兔属病毒(Leporipoxviruses)，及其衍生物。 [0026] 正痘病毒包括水牛痘病毒、骆驼痘病毒、牛痘病毒、小鼠脱脚病病毒、猴痘病毒、兔痘病毒、天花病毒、痘苗病毒(W)，及其衍生物，如修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)。 [0027] 羊痘病毒包括绵羊痘病毒、山羊痘病毒和结节性皮肤病病毒。 [0028] 禽痘病毒包括金丝雀痘病毒和鸟痘病毒。 [0030] 本领域可获得各种痘病毒科病毒的基因组序列，例如，Western reserve痘苗病毒、痘苗病毒Copenhagen、修饰的痘苗病毒Ankara、牛痘病毒、金丝雀痘病毒、小鼠脱脚病病毒、粘液瘤病毒基因组可得自Genbank(编号分别为NC_006998、M35027、U94848、NC_003663、NC_005309、NC_004105、NC_001132。)。 [0031] 如本文所用，“痘苗病毒”(VV)包括VV毒株：Dairen I、IHD-J、L-IPV、 LC16M8、LC16MO、Lister、LIVP、Tashkent、WR 65-16、Wyeth、Ankara、Copenhagen(COP)(GOEBEL et al.(1990)；Genbank编号M35027.1)、Tian Tan、Western Reserve(WR)、修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)、包含缺陷的J2R基因的VV(见WEIR and MOSS 1983；Genbank编号AAA48082)、包含缺陷的F2L基因的VV(见WO2009/065547)、包含缺陷的I4L和/或F4L基因的VV(见WO2009/065546)，及其衍生物。 [0032] 如本文所用，“修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)”是指通过VV毒株Ankara在CEF上连续传代产生的高度减毒的VV(MAYRA.et al.，Infection 3，6-14(1975))及其衍生物。MVA病毒保藏在Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)，保藏号为N°I-721。MVA在SUTTER et MOSS(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10847-10851(1992))中进行了充分描述。对MVA的基因组已经作图并测序(ANTOINE et al.，Virol.244， 365-396(1998)，可得自Genbank编号U94848)。 [0033] 根据第一个实施方案，本发明涉及生产病毒的方法，包括如下步骤： [0034] (a)提供永生化禽类细胞系； [0035] (b)用所要生产的病毒感染所述永生化禽类细胞系；以及 [0036] (c)在使病毒能够扩增的条件下培养所述感染的禽类细胞系； [0037] 其中所述永生化禽类细胞系选自2008年6月5日在欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)以保藏号08060502保藏的永生化禽类细胞系、在ECACC以保藏号08060501保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物。 [0038] 根据另一实施方案，本发明涉及表达禽类端粒酶逆转录酶(TERT)的永生化禽类细胞系，其选自在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)以保藏号08060502保藏的永生化禽类细胞系、在ECACC以保藏号08060501保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物。这些细胞系已经从原代疣鼻栖鸭细胞中产生，如WO2007/077256所述通过将禽类TERT核酸分子(SEQ ID NO：1)随机插入疣鼻栖鸭原代禽细胞基因组中进行。令人惊奇地，这些表达禽类端粒酶逆转录酶(TERT)的永生化禽类细胞系具有不同性质，更特别由于其病毒毒株扩增特点而彼此不同。 [0039] 根据一个特定的实施方案，本发明的永生化禽类细胞系能扩增至少一种黄病毒科病毒毒株，而不能扩增痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP) (GOEBEL et al.1990；Genbank编号M35027.1)和修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)，保藏号N°I-721)。 [0040] 用于确定永生化的禽类细胞系是否能或者不能扩增一种特定的病毒毒株的测定方法的详细信息在下文进一步描述。 [0041] 根据优选的实施方案，能扩增至少一种黄病毒科毒株而不能扩增痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP)及修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)的本发明的永生化禽类细胞系是表达禽端粒酶逆转录酶(TERT)的永生化禽类细胞系或者其衍生物，保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，编号为08060502。 [0042] 根据优选的实施方案，以保藏号08060502保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的永生化禽类细胞系及其衍生物能扩增至少一种黄病毒科病毒，所述病毒选自黄热病毒毒株(YFV)和日本脑炎病毒毒株(JEV)，更特别选自YFV 17D毒株(例如ref.507，保藏在HPA培养物中心)和JEV Nakayama野生毒株(例如ref.502，保藏在HPA培养物中心)。 [0043] 根据优选的实施方案，以保藏号08060502保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的永生化禽类细胞系及其衍生物能扩增黄热病毒毒株(YFV)和日本脑炎病毒毒株(JEV)。 [0044] 根据另一特殊实施方案，本发明的永生化禽类细胞系能扩增(i)至少一种黄病毒科病毒毒株及(ii)至少一种痘病毒科毒株。 [0045] 根据优选的实施方案，能扩增至少一种黄病毒科病毒毒株和至少一种痘病毒科病毒毒株的本发明的永生化禽类细胞系是表达禽端粒酶逆转录酶(TERT)的永生化禽类细胞系及其衍生物，以保藏号08060501保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。 [0046] 根据优选的实施方案，以保藏号08060501保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的永生化禽类细胞系及其衍生物能扩增(i)至少一种黄病毒科病毒，所述病毒选自黄热病毒毒株(YFV)和日本脑炎病毒毒株(JEV)，更特别选自YFV 17D毒株(例如ref.507，保藏在HPA培养物中心)和JEV Nakayama野生毒株(例如ref.502，保藏在HPA培养物中心)；及(ii)至少一种痘病毒科病毒毒株，所述病毒选自痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP)(GOEBEL et al.1990；Genbank编号M35027.1)和修饰的痘苗病毒Ankara (MVA)(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)，保藏号N°I-721)。 [0047] 根据优选的实施方案，以保藏号08060501保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的永生化禽类细胞系及其衍生物能扩增黄热病毒毒株(YFV)和日本脑炎病毒毒株(JEV)、痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP)及修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)。 [0048] 本发明的保藏的疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系的衍生物是指通过例如如下方式衍生自保藏的疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系的永生化禽类细胞系： [0049] -对所述保藏的永生化禽类细胞系(ECACC 08060502或ECACC 08060501)进行亚克隆； [0050] -使所述保藏的疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系(ECACC 08060502或ECACC08060501)适应特定的培养基(例如使得所述细胞系悬浮生长的培养基)和/或适应特定的培养条件(例如温度，％CO2)； [0051] -缺失或者突变疣鼻栖鸭的参与岩藻糖修饰的一或多个基因(HARUEIMAI-NISHIYA et al.，BMC Biotechnology(2007))，以产生非岩藻糖基化的蛋白质，及更特别产生非岩藻糖基化的抗体(根据优选的实施方案，所述保藏的永生化禽类细胞系的衍生物是通过缺失或者突变α1，6-岩藻糖转移酶(FUT8)和/或GDP-甘露糖4，6-脱水酶(GMD)基因获得的)； [0052] -缺失或者突变疣鼻栖鸭的参与干扰素抗性的一或多个基因，以降低所述细胞系的免疫应答(根据优选的实施方案，所述保藏的疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系的衍生物是通过缺失或者突变选自如下的基因而获得的：STAT1基因、STAT2基因、STAT3基因和STAT5基因)； [0053] -过表达疣鼻栖鸭的一或多个抗凋亡基因，或者用一或多个外源抗凋亡基因转化，以使得所述细胞系对于培养条件更具抗性，特别是维持铺满(根据优选的实施方案，所述抗凋亡基因选自p19E1B人腺病毒基因、bcl-2基因、mcl-1基因、Bcl-xL基因、Bcl-w基因、a1基因、ICP34.5单纯疱疹病毒基因和p35杆状病毒基因)； [0054] -过表达疣鼻栖鸭的参与控制细胞周期的一或多个基因，使用适于增加增殖速度的载体进行(根据优选的实施方案，所述参与控制细胞周期的基因选自p53基因、p21基因、p27基因和p57基因)； [0055] -通过用编码感兴趣的病毒的受体的一或多个基因转化而修饰所述细 胞系的病毒敏感谱，目的是繁殖这些病毒(根据优选的实施方案，编码感兴趣的病毒的受体的基因是编码麻疹病毒CD46受体的基因)。 [0056] 根据优选的实施方案，所述ECACC 08060502衍生物能扩增至少一种黄病毒科病毒毒株，而不能扩增痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP)及修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)。 [0057] 根据优选的实施方案，所述ECACC 08060501衍生物能扩增(i)至少一种黄病毒科病毒毒株，及(ii)至少一种痘病毒科病毒毒株。 [0058] 根据优选的实施方案，本发明的永生化的禽类细胞系是粘附细胞系。 [0059] 根据另一优选的实施方案，本发明的永生化的禽类细胞系是在存在或者不存在(微)载体的条件下悬浮增殖的非粘附细胞系。根据本发明使用的(微)载体可以由如下材料制成：葡聚糖、胶原、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、明胶、玻璃、纤维素、聚乙烯和TM TM/或塑料。(微)载体可商购，例如Cytodex 微载体(Pharmacia)、Cytopore 微载体TM (GE Healthcare Life Sciences)、Hillex 微载体(SoIoHiII Enginnering)、Nunc 2D TM TM TM MicroHex 微载体、Nunclon (Thermo Fisher Scientific)、ProNectin 微载体(SoIoHiII TM TM Enginnering)、Fibra-Cell discs(New Brunswick Scientific)、BioNocll 微 载 体TM (Cesco Bioengineering)以及CultiSpher-S 微载体(Percell Biolytica)。 [0060] 本发明还涉及本发明的永生化禽类细胞系在病毒和蛋白质产生中的应用。 [0061] 如本文所用，“病毒“包括选自如下的病毒：黄病毒科病毒、痘病毒科病毒、流感病毒、副粘病毒科病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(如Rous肉瘤病毒(RSV)、人免疫缺陷病毒(HIV))、嗜肝DNA病毒病毒(如乙型肝炎病毒)、疱疹病毒(如HSV-1、HSV-2)、呼肠病毒(例如轮状病毒)、冠状病毒(例如人SARS-CoV、HCoV-NL63)以及甲病毒属(例如屈曲病毒(chikungunya)；Ross river病毒(RRV)。所述病毒可以是野生型、减毒的、重组和/或温度敏感性病毒。 [0062] 所述黄病毒科病毒和痘病毒科病毒已经在上文定义。 [0063] 根据本发明，所述黄病毒科病毒是野生型、减毒的、重组的和/或温度敏感性黄病毒科病毒。 [0064] 根据本发明，所述痘病毒科病毒是野生型、减毒的、重组和/或温度敏感性痘病毒科病毒。 [0065] 如本文所用，“减毒的病毒“是指已经被修饰使其在制定对象中的病原性显著降低的任何病毒。优选地，所述病毒被减毒为从临床观点看无病原性的程度，即暴露于该病毒的对象与对照对象相比不呈现出统计学显著的病理水平增加。减毒野生型黄病毒科病毒病原体的一些实验方法已经有描述(见例如PUGACHEV et al.，Int.J.Parasitol.33：567-582(2003))。例如，发现在嵌合的黄病毒科病毒的包膜蛋白包括YFV的壳体和非结构蛋白以及JEV、DENV或者West Nile病毒的膜和包膜蛋白的某些氨基酸中的突变降低趋内脏现象(见例如WO2003/103571 and WO2004/045529). [0066] 如本文所用，“重组病毒“是指在其基因组中包含外源序列的病毒。如本文所用，“外源序列”是指在亲代病毒中非天然存在的核酸分子。“重组病毒”可以是指这样的病毒，其中一或多个结构蛋白已经由真核、原核、病毒来源的外源核酸序列(例如第二种病毒的结构蛋白)置换。因此，根据本发明，“重组病毒”也可以一般性地称作“嵌合病毒”或者“杂交病毒”。注意，在黄病毒科病毒的情况中，嵌合的黄病毒科病毒可以由第一种黄病毒科病毒组成(例如YFV，如先前描述的YFV 17D毒株)，其中prM和E蛋白已经由第二种病毒(例如先前描述的JEV、WNV、DENV、St.Louis脑炎病毒或者TBEV)的prM和E蛋白置换。TM ChimeriVax 技术已经用于产生医学重要的黄病毒科病毒的嵌合的疫苗候选物。其应用YFV 17D疫苗病毒作为载体，其中prM-E基因由来自异源黄病毒科病毒如JEV、DENV、WNV或者St.Louis脑炎病毒的prM-E基因置换(MONATH et al.，Vaccine 20：1004-1018(2002)； PUGACHEV et al.，Int.J.Parasitol.33：567-582(2003)；GUIRAKHOO et al.，J.Virol.78： TM 4761-4775(2004))。包含来自SA14-14-2病毒的prM-E基因的ChimeriVax -JEV疫苗(即在中国使用的活的减毒的JEV疫苗)在临床前和临床I期和II期临床试验中成功检测。相似TM 地，用ChimeriVax -WNV疫苗候选物已经进行了成功的I期临床试验，其包含来自WNV(即NY99毒株)的prM-E序列，具有三个特定氨基酸改变掺入E蛋白中以增强减毒(ARROYO et al.，J.Virol.78：12497-12507(2004))。作为其他实例，嵌合的黄病毒科病毒也可以是如在 WO2006/068307、WO2002/102828、EP0977587、WO98/37911、WO93/06214、US7569383 和WO01/39802描述的嵌合的黄病毒科病毒。 [0067] 有利地，所述重组病毒可进一步包含为外源序列表达必需的元件。表 达必需的元件包括使得核苷酸序列转录为RNA以及mRNA翻译为多肽所需的序列元件，特别是在由重组病毒感染的细胞中有效的启动子序列和/或调节序列，以及任选使得所述多肽在细胞表面分泌或者表达所需的序列。这些元件可以是可诱导或者组成型的。当然，使启动子适应选择的重组病毒以及宿主细胞。所述文献提供了关于这种启动子序列的大量信息。所述元件可另外包括改良外源序列表达或者其在宿主细胞中维持的额外元件。可以特别提及的是内含子序列、分泌信号序列、核定位序列、重启IRES型翻译的内部位点、转录终止poly A序列。 [0068] 如本文所用，“温度敏感性病毒”是指病毒衍生物，在野生型正常生长的温度或者高于该温度条件下其生长被削弱。例如可以列举的是BOYD O.et al.(Virology Apr10；399(2)：221-30(2010))、EP 0 157 528(天花温度敏感性病毒)和DRILLIEN R.et al.(Virology 119，372-381(1982))所述温度敏感性病毒。 [0069] 根据本发明，“Flu病毒”(也称作流感病毒)包括A型流感病毒及其亚型、B型流感病毒及其亚型和C型流感病毒。“A型流感病毒言行”包括HA与NA蛋白的可能的不同组合。在A型流感病毒中已经鉴别的19种HA蛋白(分为H1-H15)和9种NA蛋白(分为N1-N9)。例如A型流感病毒亚型可以是H1N1病毒、H1N2病毒、H3N2病毒、H3N8病毒、H5N1病毒、H7N2病毒、H7N3病毒、H7N7病毒和H9N2病毒。关于流感病毒基因组核苷酸序列的进一步信息可得自各种可登陆的基因数据库，如 www.flugenome.org/.。关于A型流感病毒基因组核苷酸序列的进一步信息也可以得自各种可登陆的基因数据库，如GenBank、EMBL或者LANL，例如J02144、J02146、J02148、J02151、V00603、V01099、V01104、V01106。关于B型流感病毒基因组核苷酸序列的进一步信息也可以得自公众可登陆的基因数据库，如GenBank、EMBL或者LANL，例如J02094、J02095、J02096、K00423、K01395、M20168、M20170、M20172。关于C型流感病毒基因组核苷酸序列的进一步信息也可以得自公众可登陆的基因数据库，如GenBank、EMBL或者LANL，例如K01689、M10087、M17700。关于减毒的流感病毒的进一步信息可见于HICKLING J.(A review of production for influenza virus vaccines，and their suitability for deployment in developing countries for influenza pandemic preparedness，Initiative for vaccine research， World Health Organisation(WHO)(2006)；www.who.int/vaccine) 以 及RUDENKO L.G.et al.(Vaccine 19(2-3)，308-318(2000))。关于减毒的低温适应的和温度敏感的流感病毒疫苗如FluMist (Medlmmune疫苗)的进一步信息可例如见于GLEZEN W.(Expert Rev.Vaccines 3(2)： 131-9(2004))。 [0070] 根据本发明，“副粘病毒科病毒”包括禽副粘病毒属病毒(Avulaviruses)、亨尼帕病毒(Henipaviruses)、麻疹病毒属病毒(Morbilliviruses)、呼 吸系病毒(Respiroviruses)、Rubula病 毒 属 病 毒(Rubulaviruses)、肺 炎 病 毒 属 病 毒(Pneumoviruses)和变性非病毒(Metapneumoviruses)。Avulaviruses包括新城疫病毒(NDV)，也称作禽副粘病毒1(APMV-1)。Henipaviruses包括Hendra病毒(HeV)和Nipah病毒(NiV)。Morbilliviruses包括麻疹病毒(MV)毒株：Edmonston B毒株(ENDERS J.F.and T.C.PEEBLES，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.86：277-286(1954))、Edmonston A和B减毒的毒株(GRIFFIN D.and Bellini W.，in B.Fields，D.Knipe et al.(ed.)，Virology，vol.2.，1267-1312，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia(1996))、Schwarz/Moraten减毒的毒株(GRIFFIN D.and Bellini W.，Measles virus，in B.Fields，D.Knipe，et al.(ed.)，Virology，vol.2.，1267-1312，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia(1996)；购TM 自Aventis Pasteur under Rouvax )以及如在EP0540135、WO2008/086042或WO99/49017中描述的减毒的MV毒株。Respiroviruses包括Sendai病毒(SeV，也称作鼠副流感病毒1)、牛副流感病毒3(BPIV-3)、人副流感病毒1(HPIV-1)和人副流感病毒3(HPIV-3)。 Rubulaviruses包括人副流感病毒2(HPIV-2)、人副流感病毒4a(HPIV-4a)、人副流感病毒 4b(HPIV-4b)以及腮腺炎病毒。Pneumoviruses包括人呼吸道合胞病毒A2(HRSV-A2)、人呼吸道合胞病毒B1(HRSV-B1)以及任呼吸道合胞病毒S2(HRSV-S2)。Metapneumoviruses包括人metapneumovirus(HMPV)。 [0071] 如本文所用，“蛋白质”包括： [0072] -抗体(例如利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、米妥珠单抗(milatuzumab)、依库珠单抗(eculizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、戈利木单抗(golimumab)、ramcirumab、巴品珠单抗(bapineuzumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、奥马佐单抗(omalizumab)、那他珠单抗 (natalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、阿昔单抗(abciximab)、依法珠单抗(efalizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、优特克单抗(ustenkinumab))； [0073] -受体配体(例如激素、细胞因子、生长因子)； [0074] -激素(例如促肾上腺皮质激素(ACTH)、抗利尿激素(ADH，vasopressin)、心房钠尿肽(ANP)、降血钙素、胆囊收缩素(CCK)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、胰高血糖素、促性腺激素释放激素(GnRH)、生长激素释放激素(GHRH)、催产素、促胰液素、生长激素抑制素、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促红细胞生成素(EPO)、促卵泡激素(FSH)、生长激素(GH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、胰岛素、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、黄体生成素(LH)、甲状旁腺素(PTH)、催乳素(PRL)、血小板生成素、甲状腺刺激激素(TSH)、睾酮、二氢睾酮(DHT)、雄烯二酮、脱氢表雄酮(DHEA)、睾酮、骨化醇、骨化二醇、雌二醇、皮质醇、醛固酮、黄体酮、肾上腺素(epinephrine)、多巴胺、褪黑激素、去甲肾上腺素(NE)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、血清素)； [0075] -细胞因子(例如白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL10、IL-11、IL-12、IL13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33)；趋化因子(CC趋化因子配体1(CCL-1)、CCL-2、CCL-3(也称作巨噬细胞炎症蛋白1 apha(MIP-1α))、CCL-4(也称作巨噬细胞炎症蛋白1beta(MIP-1α))、CCL-5(也称作RANTES)、CCL-6、CCL-7、CCL-8、CCL-9、CCL-10、CCL-11、CCL-12、CCL-13、CCL-14、CCL-15、CCL-16、CCL-17、CCL-18、CCL-19、CCL-20、CCL-21、CCL-22、CCL-23、CCL-24、CCL-25、CCL-26、CCL-27、CCL-28、CXC chemokin 1(CXCL-1)、CXCL-2、CXCL-3、CXCL-4(也称作血小板因子4(PF4))、CXCL-5、CXCL-6、CXCL-7、CXCL-8、CXCL-9、CXCL-10、CXCL-11、CXCL-12、CXCL-13、CXCL-14、CXCL-15、CXCL-16、CXCL-17、C趋化因子1(XCL-1)、XCL-2；CX3C趋化因子1(CX3CL-I)、干扰素(IFN-α；IFN-β；IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α；TNF-β))； [0076] -生长因子(例如表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态生成蛋白(BMP)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、 粒细胞集落刺激因子(G-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人多能粒细胞集落刺激因子(hPG-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、胰岛素样生长因子(IGF)、myostatin(GDF-8)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子(TGF-α)、转化生长因子beta(TGF-β)、胎盘生长因子(PIGF))、抗原(例如MHC抗原、白细胞功能相关抗原-1(LFA-1))； [0077] -细胞粘附分子(例如细胞间细胞粘附分子(ICAM-1)、神经细胞粘附分子(NCAMs)、血管细胞粘附分子(VCAM-1)、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)、nectins、突触细胞粘附分子(SynCAMs))； [0078] -血液凝固因子(例如因子VIII、因子IX、tPA)； [0079] -酶(例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、葡聚糖酶、糊精酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、戊聚糖、木聚糖酶、转化酶、乳糖酶、柚(皮)苷酶、果胶酶、支链淀粉酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、氨基肽酶、内肽酶、枯草杆菌蛋白酶、氨基酰化酶(aminoacylase)、谷氨酰胺酶、溶菌酶、青霉素酰基转移酶、异构酶、醇脱氢酶、过氧化氢酶、氯化物过氧化物酶、过氧化物酶、乙酰乳酸脱羧酶、组氨酸酶、环糊精糖基转移酶)； [0080] 其片段及组合。 [0081] 根据一特殊实施方案，本发明涉及以保藏号08060502在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物在生产病毒和蛋白质中的应用。 [0082] 根据优选的实施方案，本发明涉及以保藏号08060502在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物在生产病毒中的应用，所述病毒是黄病毒科病毒，优选选自黄热病毒毒株(YFV)和日本脑炎病毒毒株(JEV)，更特别选自YFV 17D毒株和JEV Nakayama野生毒株。 [0083] 实施例3描述了生产YFV 17D毒株和JEV Nakayama野生毒株的优选方法。 [0084] 根据另一优选的实施方案，本发明涉及以保藏号08060502在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物在生产蛋白质中的应用，所述蛋白质选自例如细胞因子、抗体和激素，更特别选自 IL-2、利妥昔单抗和促红细胞生成素(EPO)。产生IL-2的优选方法在实施例5中描述。产生利妥昔单抗的优选方法在实施例6中描述。 产生EPO的优选方法在实施例7中描述。 [0085] 根据另一特殊实施方案，本发明涉及以保藏号08060501在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物在生产病毒和蛋白质中的应用。 [0086] 根据优选的实施方案，本发明涉及以保藏号08060501在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物在生产病毒中的应用，所述病毒是黄病毒科病毒，优选选自黄热病毒毒株(YFV)和日本脑炎病毒毒株(JEV)，根更特别选自YFV 17D毒株和JEV Nakayama野生毒株。实施例3描述了产生YFV 17D毒株和JEV Nakayama野生毒株的优选方法。 [0087] 根据另一优选的实施方案，本发明涉及以保藏号08060501在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物在生产病毒中的应用，所述病毒是痘病毒科病毒，优选选自痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP)和修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)。实施例4描述了产生VV-COP和MVA的优选方法。 [0088] 根据另一优选的实施方案，本发明涉及以保藏号08060501在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物在生产蛋白质中的应用，所述蛋白质如选自细胞因子、抗体和激素，特别选自IL-2、利妥昔单抗和促红细胞生成素(EPO)。生产IL-2的优选方法在实施例5中描述。生产利妥昔单抗的优选方法在实施例6中描述。生产EPO的优选方法在实施例7中描述。 [0089] 本发明还涉及生产病毒的方法，包括如下步骤： [0090] a)用病毒感染以保藏号08060502在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物；及 [0091] b)在使得病毒扩增的条件下培养感染的禽类细胞系。 [0092] 本发明进一步涉及生产及纯化野生型、减毒的和/或重组正痘病毒的方法，包括如下步骤： [0093] a)制备包装细胞培养物； [0094] b)用正痘病毒感染所述包装细胞培养物； [0095] c)培养所述感染的包装细胞直至后代正痘病毒产生； [0096] d)在存在一或多种核酸酶的条件下保温； [0097] e)从培养上清和/或包装细胞中回收正痘病毒； [0098] f)在合适条件下将单价盐加入在步骤e)中回收的正痘病毒中，以抑制所述核酸酶活性及避免所述正痘病毒与步骤g)中阴离子交换吸附剂吸附； [0099] g)将在步骤f)中获得的混合物与阴离子交换吸附剂在合适条件下接触，以捕获核酸； [0100] h)在合适条件下澄清在步骤g)中获得的混合物以除去细胞碎片； [0101] i)用包含单价盐的溶液在合适条件下洗涤所述阴离子交换吸附剂，以回收流经液(flow through)中剩余的正痘病毒； [0102] j)将在步骤h)中获得的流经液和在步骤i)中获得的流经液浓缩； [0103] k)对包含在步骤j)中获得的正痘病毒的级分进行渗滤； [0104] 其中所述包装细胞是疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系，其包含编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列，见专利申请WO 2007/077256所述。特别优选的是如下永生化禽类细胞系：T3-17490，以保藏号08060502在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏(见图2、3和4)，或者其衍生物；T6-17490，以保藏号08060501在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏(见图5、6和7)，或者其衍生物。 [0105] 根据优选的实施方案，所述病毒是黄病毒科病毒，优选选自黄热病毒毒株(YFV)和日本脑炎病毒毒株(JEV)，特别选自YFV 17D毒株和JEV Nakayama野生毒株。实施例3描述了生产YFV 17D毒株和JEV Nakayama野生毒株的优选方法。 [0106] 根据另一特殊实施方案，本发明涉及生产病毒的方法，包括如下步骤： [0107] a)用病毒感染以保藏号08060501在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏的永生化禽类细胞系及其衍生物；及 [0108] b)在使得病毒扩增的条件下培养感染的禽类细胞系。 [0109] 根据优选的实施方案，所述病毒是黄病毒科病毒，优选选自黄热病毒毒株(YFV)和日本脑炎病毒毒株(JEV)，特别选自YFV 17D毒株和JEV Nakayama野生毒株。实施例3描述了生产YFV 17D毒株和JEV Nakayama野生毒株的优选方法。 [0110] 根据另一优选的实施方案，生产的病毒是痘病毒科，优选选自痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP)及修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)。实施例4 描述了生产VV-COP和MVA的优选方法。 [0111] 本发明的禽类细胞系优选在30℃与37℃之间的温度下感染，更优选在37℃下感染，如实施例3和4所述。本发明的用病毒感染细胞系的步骤a)是在合适的细胞培养基中进行。所述细胞培养基可例如是Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM，Invitrogen)或者Basal Medium Eagle(BME，Invitrogen)，其可任选补加例如血清(如胎牛血清(FCS))和/或氨基酸(如L-谷氨酰胺)。所述细胞培养基也可以是无动物产物的培养基。已经描述了许多无动物产物的培养基，其中一些可商购，如293 SFM II；293-F TMCells，SFM Adapted；293-H Cells，SFM Adapted；293fectin Transfection Reagent； TM TM TM CD 293 AGT ；CD 293 Medium；FreeStyle 293 Expression System；FreeStyle 293 TM TM Medium；FreeStyle 293-F Cells，SFM Adapted；VP-SFM；VP-SFM AGT ；Adenovirus Expression Medium(AEM)Growth Medium for PER.C6(R)Cells；CD 293 AGT(TM)； TM CD 293 Medium；COS-7L Cells，SFMAdapted；EPISERF Medium；OptiPro SFM(均购自Invitrogen)。如实施例3和4所述，用于本发明禽类细胞系的优选细胞培养基是BME(Invitrogen)，其中补加了FCS和L-谷氨酰胺。 [0112] 本发明的细胞系用病毒感染，感染复数(MOI)依赖于生产的病毒。例如，将黄病毒科病毒接种在本发明的禽类细胞系中，MOI优选在大约0.001-0.1之间。更特别地，当生产的黄病毒科病毒是YFV或JEV时，MOI优选为大约0.001，如实施例3、图7A、图8A、图9A和图10A所述。再例如，将痘病毒科病毒接种在本发明禽类细胞系中，MOI优选在大约 0.0001-0.1之间。更特别地，当生产的痘病毒科病毒是VV-COP时，MOI优选为大约0.0001，如实施例4和图11B所述。当生产的痘病毒科病毒是MVA时，MOI优选为大约0.05，如实施例4和图11A所述。 [0113] 然后将感染的细胞系在使得病毒扩增的条件下培养(即步骤b))，意味着病毒基因组被转录、翻译成病毒蛋白质及包装进感染性病毒颗粒中。 [0114] 感染的细胞系可以在存在或者不存在(微)载体(如前文定义)的条件下作为粘附于表面的细胞或者悬浮培养。细胞系培养可以例如在培养皿、滚瓶或者在生物反应器中进行，使用分批、补料分批、连续系统、中空纤维等进行。本发明感染的禽类细胞系优选在30℃至37℃之间的温度下培养，根更有选在37℃下培养，如实施例3和4所述。培养感染的禽类细胞系的 步骤b)是在合适的细胞培养基中进行，所述培养基与用于感染禽类细胞系的培养基(步骤a))可以相同或者不同。感染的禽类细胞系根据病毒优选培养1-6天。 例如，当生产的病毒是YFV时，感染的禽类细胞系优选培养1-3天，如图7A和图9A所示。 再例如，当生产的病毒是JEV时，感染的禽类细胞系优选培养1-4天，如图8A和图10A所示。再例如，当生产的病毒是VV-COP或者MVA时，感染的禽类细胞系优选培养1-4天，如图 11(A-B)所示。 [0115] 根据本发明，感染步骤a)可以在合适细胞培养基中培养本发明细胞系之后进行，所述培养基与用于感染禽类细胞系的细胞培养基(在步骤a)中)即与用于培养感染的禽类细胞系的细胞培养基(在步骤b)中)可以相同或不同。优选在感染之前将所述禽类细胞系在30℃至37℃、优选37℃下培养1-3天，更优选培养1天，如实施例3和4所述。 [0116] 根据本发明，培养感染的细胞系的步骤b)可后接在存在一或多种核酸酶(即核酸内切酶或者核酸外切酶)的条件下保温的步骤，以降解溶液中存在的核酸(例如DNA、RNA)。本发明优选使用的核酸酶是核酸内切酶。可用于本发明中的核酸内切酶可基于其底物而分类：脱氧核糖核酸酶(DNase)，其降解DNA；核糖核酸酶(RNase)，其降解RNA；以及核酸内切酶，其降解DNA和RNA。核酸内切酶DNase包括但不限于DNase I、DNase II和内切脱氧核糖核酸酶(endodeoxyribonuclease)IV。核酸内切酶RNase包括但不限于RNase I、RNase III、RNAse E、RNAse F和RNAse P。降解DNA和RNA的核酸内切酶包括但不限于Benzonase(R)。本发明使用的核酸内切酶是Benzonase Benzonase 通过水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键而降解核酸(例如DNA、RNA)。基于完全消化，溶液中存在的所有游离的核酸(例如DNA、RNA)被还原为5′-一磷酸终止的寡核苷酸，其长度为3-8个碱基。Benzonaze 无蛋白酶解活性。本发明使用的Benzonaze 优选是药物可接受的。药物可接受的Benzonaze 可商购(例如Eurogentec under the reference ME-0280-10；Merck under the reference例如1.01653.0001)。根据本发明，使用的核酸酶的浓度在 5-100U/ml范围内，优选在5-50U/ml范围内，更优选10U/ml。 [0117] 然后从上清和/或从细胞中回收生产的病毒。当生产的病毒从细胞中回收时(即仅从细胞中回收，或者从细胞及从上清中回收)，回收生产的病毒的 步骤可以在破坏细胞膜之后进行。这个步骤使得病毒从细胞中释出。细胞膜的破坏可以通过本领域技术人员熟知的各种技术实施。这些技术包括但不限于冷冻/解冻、低渗裂解、超声处理(使用超声波破碎仪进行)以及微流体化(使用微流体仪进行)。超声波破碎仪可商购自例如Heraeus PSP、Biologies、Misonix或者GlenMills。本发明优选使用的超声波破碎仪是SONITUBE20kHz SM 20-120-3型和SONITUBE 35kHz SM 35-400-3型(Heraeus PSP)。微流体仪可商购自例如Microfluidics Corporation。禽类细胞膜也可以通过使用SLM Aminco French press破坏。所述细胞膜也可以通过使用高速均质器破坏。高速均质器可商购自例如Silverson Machines或者Ika-Labotechnik。 [0118] 根据本发明的特定实施方案，然后纯化回收的病毒。纯化生产的病毒的方法可包括例如一或多个如下步骤： [0119] -澄清，以在合适条件下除去细胞碎片。所述澄清可以通过例如深度过滤进行。深度过滤包括但不限于使用一或多种可商购的产品如Sartopure 得自Sartorius(例如Sartopure PP2)；CUNO Incorporated AP系列深度滤膜(例如AP01)； CUNO Incorporated CP系列深度滤膜(例如CP10、CP30、CP50、CP60、CP70、CP90)； CUNO Incorporated HP系列深度滤膜(例如HP10、HP30、HP50、HP60、HP70、HP90)；CUNO Incorporated Calif系列深度滤膜(例如CA10、CA30、CA50、CA60、CA70、CA90)；CUNO Incorporated SP系列深度滤膜(例如SP10、SP30、SP50、SP60、SP70、SP90)；CUNO Delipid and Delipid Plus filters；Millipore Corporation CE系列深度滤膜(例如CE15、CE20、CE25、CE30、CE35、CE40、CE45、CE50、CE70、CE75)；Millipore Corporation DE系列深度滤膜(例如DE25、DE30、DE35、DE40、DE45、DE50、DE55、DE560、DE65、DE70、DE75)；Millipore TM TM Corporation HC滤膜(例如A1HC、B1HC、COHC)；CUNO PolyNet Filters(例如PolyNet PB P050、P100、P200、P300、P400、P500、P700)；Millipore Clarigard and Polygard滤膜； CUNO Life Assure滤膜；ManCel Associates深度滤膜(例如PR 12 UP、PR12、PR 5 UP)； 以及PALL或SeitzSchenk Incorporated滤膜。为了改良可利用的深度过滤单位的澄清能力，可以将两或多个单位组合以降低孔径。在这个实施方案中，待澄清的混合物经过第一个深度过滤单位，其中最大的污染物被保留，随后经过第二个深度过滤 单位。为此，优选通过深度过滤进行澄清，更优选通过孔径为8μm的滤膜组合孔径为5μm的滤膜。本发明优选使用的孔径为8μm和5μm孔径的滤膜是Sartopure 滤膜，购自Sartorius(Sartopure PP2)。所述深度过滤优选以1L/分钟流速进行。 [0120] -浓缩，其可以通过例如微滤或者超滤进行。微滤是压力驱动膜过滤过程，其浓缩和纯化大分子。更特别地，使溶液经过选择其孔径以拒绝病毒滞留及使得小分子(如蛋白质)经过该滤膜渗透的滤膜。微滤降低了提取溶液的体积。本发明使用的滤膜优选是经受压热器作用的可商购滤膜，例如Prostak Microfiltration Modules(Millipore)。 [0121] -渗滤，其是改良的微滤(如前所述)，并包括用溶液稀释包含所述病毒的级分以降低所述级分中杂质浓度。包含所述病毒的级分的稀释可以从所述级分中洗去更多的杂质。应理解所述渗滤可以分批、半连续或者连续模式进行。所述渗滤可有利地用于改变包含病毒的缓冲液。例如，其可以用于用药物可接受的缓冲液交换纯化过程中的缓冲液。用于本发明渗滤中的滤膜可以拒绝病毒滞留并使小分子(如蛋白质)通过该滤膜渗透。这种滤膜优选是可经受热压器作用的可商购的滤膜，如Prostak Microfiltration Modules(Millipore)。 [0122] -层析，使用阳离子或者阴离子交换吸附剂进行，优选阴离子交换吸附剂。阴离子交换吸附剂的官能团可以是伯胺、仲胺、叔胺或者季胺基团，例如二甲基氨基乙基(DMAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、三甲基氨基乙基(TMAE)、三乙基氨基乙基(TEAE)、基团-R-CH(OH)-CH2-N+-(CH3)3(也称作Q基团；见Streamline resins，Pharmacia)，或者其他基团如聚乙烯亚胺(PEI)，其在pH7.0-9.0范围内具有或者将具有正电荷。所述阴离子交换吸附剂可以由但不限于如珠形成基质或者膜组成。当阴离子交换吸附剂由珠形成基质组成时，所述基质可以是例如琼脂糖、亲水性聚合物、纤维素、葡聚糖或者硅石。将链(例如葡聚糖链)与基质结合。如前述官能团通过化学稳定键(例如醚键)附着于所述链。由本发明使用的珠形成基质组成的阴离子交换吸附剂晕眩是可经受热压器作用的，如UNOsphere Q(BioRad)，UNOsphere S(BioRad)、STREAMLINE(TM)Q Sepharose XL(Amersham TMBiosciences)、STREAMLINE SP Sepharose JO XL(Amersham Biosciences) 或 者BioSepra Q hyperZ(Pall Corporation)。当所述阴离子交换 吸附剂存在于膜中时，所述膜的孔径低于病毒。 [0123] 产生的野生型、弱化的、重组和/或温度敏感性病毒可以进一步失活，以便病毒粒外层保持完整，但是复制功能破坏。制备所述“完全杀死的病毒”可以通过加热或者使用化合物进行。使用的化合物包括甲醛或者β-丙內酯和福尔马林(CHERTOVA E.et al.，AIDS Vaccine(2001))。 [0124] 根据一个特定实施方案，本发明涉及产生蛋白质的方法，包括如下步骤 [0125] a)将在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)以保藏号08060502保藏的永生化禽类细胞系与至少一种重组载体接触，所述载体包含编码至少一种蛋白质的核苷酸序列； [0126] b)在使得所述蛋白质产生的条件下培养所述禽类细胞系。 [0127] 根据另一特定实施方案，本发明涉及产生蛋白质的方法，包括如下步骤： [0128] a)将在欧洲细胞培养物保藏中心以保藏号08060501保藏的永生化禽类细胞系与至少一种重组载体接触，所述载体包含编码所述蛋白质的核苷酸序列； [0129] b)在使得所述蛋白质产生的条件下培养所述禽类细胞系。 [0130] 根据本发明，所述重组载体可以是质粒或者病毒来源，及在合适情况中可以与改良载体转染效力和/或稳定性的一或多种物质组合。这些物质在技术人员可获得的文献中广泛论证(见例如FEIGNER et al.，Proc.West.Pharmacol.Soc.32，115-121(1987)；HODGSON and SOLAIMAN，Nature Biotechnology 14，339-342(1996)；REMY et al.，Bioconjugate Chemistry，5，647-654(1994))。根据本发明，重组载体是表达载体。其通常为本领域技术人员已知，其中许多载体可以商购，也可以使用遗传操纵技术构建或者修饰。 [0131] 根据本发明优选的实施方案，所述重组载体是质粒。优选地，本发明中使用的质粒含有复制起源。所述质粒可另外包含选择基因，其使得转染的细胞被选择或者鉴别(营养缺陷型突变的互补、编码抗生素抗性基因等)。所述质粒可含有另外的元件，以改良其在本发明永生化禽类细胞系中的维持和/或其稳定性。举例的质粒在实施例5、6和7中描述。 [0132] 根据本发明优选的实施方案，产生的蛋白质是细胞因子，更特别是白 细胞介素，更优选是IL-2。产生IL-2的优选方法在实施例5中描述。 [0133] 根据本发明另一优选的实施方案，产生的蛋白质是抗体，更特别是利妥昔单抗。利妥昔单抗(Rituxan 或者MabThera )是嵌合的鼠/人抗-CD20单克隆抗体。产生利妥昔单抗的优选方法在实施例6中描述。 [0134] 根据本发明另一优选实施方案，产生的蛋白质是激素，更优选是红细胞生成素(EPO)。产生EPO的优选方法在实施例7中描述。 [0135] 根据本发明的优选实施方案，产生蛋白质和病毒的方法没有动物产物(除了本发明禽类细胞系之外)，且适于无菌工业规模生产，以保证完全顺应疫苗无菌性的要求。 [0136] 如本文所用，“动物产物”是指任何化合物或者化合物集合，其在活的生物体中产生或者由动物细胞产生。 [0137] 本发明还涉及纯化的通过前述方法获得的野生型、弱化的、重组和/或温度敏感性病毒。 [0138] 本发明还涉及纯化的通过前述方法获得的完全杀死的病毒。 [0139] 本发明还涉及通过前述方法获得的纯化的蛋白质。 [0140] 本发明还涉及药物组合物，更特别涉及疫苗，其包含纯化的通过前述方法获得的野生型、弱化的、重组的、温度敏感性和/或完全杀死的病毒。 [0141] 本发明还涉及药物组合物，其包含通过前述方法获得的纯化的蛋白质。 [0142] 如本文所用，“药物组合物”是指包含药物可接受的载体的组合物。所述药物可接受的载体优选是等渗、低渗或者弱高渗溶液，及具有相对较低的离子浓度，例如葡萄糖溶液。此外，这种载体可含有任何溶剂或者水性或者部分水性液体，如无热原无菌水。另外可以对所述药物组合物的pH进行调节及缓冲，以符合在体内使用的要求。所述药物组合物也可包括药物可接受的稀释液、佐剂或者赋形剂，以及增溶剂、稳定剂和防腐剂。对于注射给予，优选在水溶液、非水溶液或者等渗溶液中的配制物。其可以在液体或者干燥形式(粉末、冻干形式等)单一剂量或者多重剂量形式提供，在使用时用合适的稀释液重建。 [0143] 附图简述 [0144] 图1示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502(第39代)光学显微镜图像。 [0145] 图2示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502生长曲线(第7至75代)。 [0146] 图3示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502群体倍增时间进化(从第7至75代)。 [0147] 图4示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060501(第45代)光学显微镜图像。 [0148] 图5示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060501生长曲线(从第15至51代)。 [0149] 图6示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060501群体倍增时间进化(从第16至51代)。 [0150] 图7(A-B)示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502(图7A)和VERO细胞系(图7B)的黄病毒科病毒产生模式(黄热病毒17D(MOI 0.001))。 [0151] 图8(A-B)示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502(图8A)和VERO细胞系(图8B)的黄病毒科病毒产生模式(日本脑炎病毒Nakayama野生株(MOI 0.001))。 [0152] 图9(A-B)示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060501(图9A)和VERO细胞系(图9B)的黄病毒科病毒产生模式(黄热病毒17D(MOI 0.001))。 [0153] 图10(A-B)示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060501(图10A)和VERO细胞系(图10B)的黄病毒科病毒产生模式(日本脑炎病毒Nakayama野生株(Mol 0.001))。 [0154] 图11(A-B)示出疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060501的痘病毒科病毒产生模式(痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP)(图11B)和修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)(图11A))。 [0155] 图12(A-C)示出从疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060501(图12C)和从CHO K1细胞系(图12A)及从CHO DG44细胞系(图12B)中产生利妥昔单抗。 [0156] 图13示出从疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502(T3)和ECACC08060501(T6)中产生红细胞生成素(EPO)。 [0157] 为了例证本发明，提供了如下实施例。所述实施例不以任何方式限制本发明范围。 实施例 [0158] 实施例1：永生化的疣鼻栖鸭细胞系ECACC 08060502. [0159] 疣鼻栖鸭细胞ECACC 08060502(第39代)具有同源的成纤维细胞样形态(图1)。静态的单层直至100％铺满仍稳定，并受到接触抑制。该细胞经测试为支原体污染阴性并且微生物污染也是阴性。该细胞系生长曲线(从第7至75代)(图2)显示出从第19至75代的连续指数生长期。针对群体倍增时间(PDT)的演变，观测到进行性的稳定化和降低，特别是可以注意到PDT在最后10代期间在48小时记录之下是稳定的(图3)。通过累加2个指数生长期计算了群体倍增的相应数字(群体倍增水平，PDL)：在75次传代期间，所述细胞经历了至少147次群体倍增(PD)。原代细胞在进入衰老之前可经历的群体倍增的次数，是组织和物种依赖性的。通常认为上限位于50-60PD之间。因而疣鼻栖鸭细胞系ECACC 08060502远远超过Hayflick极限，因此其被称为是永生化细胞系。 [0160] N.B.： [0161] -群体倍增水平(PDL)是指细胞世代的数目(生物量2倍增加)。PDL计算：PDL＝Ln(最终/初始细胞数)/Ln(2)； [0162] -群体倍增时间(PDT)，也称作世代时间，是一个群体倍增所需要的时间。PDT计算：PDT＝Δt*Ln(2)/Ln(最终/初始细胞数)。 [0163] 实施例2：永生化的疣鼻栖鸭细胞系ECACC 08060501. [0164] 疣鼻栖鸭细胞ECACC 08060501(第45代)具有同源的成纤维细胞样形态(图4)。静态的单层直至100％铺满仍稳定，并受到接触抑制。该细胞经测试为支原体污染阴性并且微生物污染也是阴性。该细胞系生长曲线(从第15至51代)(图5)显示出从第19代的连续指数生长期。在此期间测量的群体倍增时间(PDT)进行性降低。平均PDT从94小时(第 20代至35代)至52小时(第36-51代)(图6)。经计算相应于51代的群体倍增(PDL)的数目为至少71次群体倍增。疣鼻栖鸭细胞系ECACC 08060501因此远远超过Hayflick极限，因而被称为是永生化细胞系。 [0165] N.B.： [0166] -群体倍增水平(PDL)是指细胞世代的数目(生物量2倍增加)。PDL计算：PDL＝Ln(最终/初始细胞数)/Ln(2)； [0167] -群体倍增时间(PDT)，也称作世代时间，是一个群体倍增所需要的时间。PDT计算：PDT＝Δt*Ln(2)/Ln(最终/初始细胞数)。 [0168] 实施例3：黄病毒科病毒的产生 [0169] 3.1黄热病毒(YFV)的产生 [0170] 对疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502和08060501的YFV扩增能力进行了评估，并将其与作为黄病毒科病毒繁殖参照的VERO细胞系进行了比较。疣鼻栖鸭细胞系在补加10％胎牛血清(FCS)和4mM L-谷氨酰胺的Basal Medium Eagle(Invitrogen)中生长，VERO细胞系在补加5％FCS的Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(Invitrogen)中生长。感染在相同培养基中进行。在这个实验中评估了黄热病毒17D疫苗株(YFV17D)(Stamaril(TM)，Sanofi Pasteur)。疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502和 5 5 5 08060501及VERO分别以4.10、2.10 和6.10 个细胞接种在6孔平板中，并且在潮湿气氛中于37℃，5％CO2下培养24小时。然后除去培养基，细胞用250μl在培养基中稀释的YFV 17D病毒以MOI 0.0001感染。在1小时吸收步骤之后，除去剩余的病毒悬液，细胞用PBS洗涤3次，向每孔中加入2ml培养基。在37℃、5％CO2感染24、48和72小时后从上清回收病毒，澄清用于滴定。感染的细胞层用胰蛋白酶解聚，洗涤并固定在玻片上。在所述玻片上进行间接免疫荧光分析以确定感染细胞百分比。 [0171] 在用对数病毒稀释液感染的VERO细胞上经免疫组织化学测定进行滴定。感染5天后，固定细胞，用特异性多克隆IA(免疫腹水)保温，用过氧化物酶标记的第二抗体揭示。用DAB底物获得比色反应。观测染色的感染灶并计数，病毒效价计算为感染灶形成单位(FFU)/ml。 [0172] 结果：如图7(A-B)所示，仅24小时后用疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC08060502获得的YFV 17D的病毒效价(图7A)与用VERO细胞系获得的病毒效价(图7B)相比就高3log以上。如图9(A-B)所示，仅24小时和48小时后用疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC 08060501获得的YFV 17D的病毒效价(图9A)与用VERO细胞系获得的病毒效价(图9B)相比就高4log。 [0173] 3.2日本脑炎病毒(JEV)的产生 [0174] 评估了疣鼻栖鸭 永生化禽类细胞系ECACC 08060502和08060501的JEV扩增能力并与黄病毒科繁殖的参照的VERO细胞系进行了比较。疣鼻栖鸭细胞系在补加10％胎牛血清(FCS)和4mM L-谷氨酰胺的Basal Medium Eagle(Invitrogen)中生长，VERO细胞系在补加5％FCS的Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(Invitrogen)中生长。感染在相同培养基中进行。在这个实验中评估了日本脑炎Nakayama野生毒株(collection of Centre National de Ia Recherche Scientifique(CNRS))。疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系5 5 5 ECACC 08060502和08060501及VERO分别以4.10、2.10 和6.10 个细胞接种在6孔平板中，并且在潮湿气氛中于37℃，5％CO2下培养24小时。然后除去培养基，细胞用250μl在培养基中稀释的JEV Nakayama野生毒株以MOI 0.0001感染。在1小时吸收步骤之后，除去剩余的病毒悬液，细胞用PBS洗涤3次，向每孔中加入2ml培养基。在37℃、5％CO2感染 24、48和72小时后从上清回收病毒，澄清用于滴定。感染的细胞层用胰蛋白酶解聚，洗涤并固定在玻片上。在所述玻片上进行间接免疫荧光分析以确定感染细胞百分比。 [0175] 在用对数病毒稀释液感染的VERO细胞上经免疫组织化学测定进行滴定。感染5天后，固定细胞，用特异性多克隆IA(免疫腹水)保温，用过氧化物酶标记的第二抗体揭示。 用DAB底物获得比色反应。观测染色的感染灶并计数，病毒效价计算为感染灶形成单位/ml。 [0176] 结果：如图8(A-B)所示，96小时后用疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC08060502获得的EV Nakayama野生毒株的病毒效价(图8A)与用VERO细胞系获得的病毒效价(图8B)相比高3log以上。如图10(A-B)所示，72小时和96小时后用疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC 08060501获得的EV Nakayama野生毒株的病毒效价(图10A)与用VERO细胞系获得的病毒效价(图10B)相比分别高1log和8log。 [0177] 实施例4：痘病毒科的产生 [0178] 4.1修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)的产生 [0179] 评估了疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502和08060501的MVA扩增能力并与通常用作MVA生产基质的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)进行了比较。选择表达eGFP的MVA(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)，保藏号I-721)以促进病毒繁殖跟踪和滴定。疣 鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502和08060501及6 2 CEF以2.10 细胞接种在25cm 的T型瓶中并且在潮湿气氛中于37℃，5％CO2下培养24小时。然后除去培养基(Basal Medium Eagle(BME)，补加10％胎牛血清(FCS)和4mM L-谷氨酰胺)，细胞用500μl在PBS 1％阳离子，1％FCS中稀释的MVA病毒以MOI 0.05感染。 30分钟吸附步骤后，除去剩余的病毒悬液，细胞用PBS洗涤一次，然后向每个瓶中加入5ml BME 10％FCS。在37℃，5％CO2下感染0、24、48、72和96小时后，病毒通过冻融步骤从细胞和上清回收。回收的病毒悬液在滴定前超声处理以避免聚集。 [0180] 在接种在6cm孔培养皿中的用对数病毒稀释液感染的并覆盖琼脂的CEF上一式三份进行滴定。72小时后，表达eGFP的MVA的噬斑形成单位用荧光双目显微镜观测并计数。疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC 08060502不扩增MVA。 [0181] 结果：如图11A所示，疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC 08060501能使得MVA扩增，其相当于用经典CEF基质获得的扩增。疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC08060501和CEF均在48小时感染后达到最高病毒效价。同时，在两种细胞中均观测到明显的细胞病变效应(数据未示出)。 [0182] 4.2痘苗病毒株Copenhagen(VV-COP)的产生 [0183] 评估了疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502和08060501的VV-COP扩增能力并与通常用作VV-COP生产基质的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)进行了比较。包含缺陷的J2R基因(参见WEIR和MOSS 1983；Genbank登录号AAA48082)的VV-COP毒株(GOEBEL et al.1990；Genbank登录号M35027.1)用于本实验。疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC6 2 08060502和08060501及CEF以14.10 细胞接种在175cm 的T型瓶中并且在潮湿气氛中于 37℃，5％CO2下培养24小时。然后除去培养基(Basal Medium Eagle(BME)，补加10％胎牛血清(FCS)和4mM L-谷氨酰胺)，细胞用5ml在PBS 1％阳离子，1％FCS中稀释的VV-COP病毒以MOI 0.0001感染。30分钟吸附步骤后，向每个瓶中加入35ml BME 10％FCS。在 37℃，5％CO2下感染24、48、72和96小时后，病毒通过冻融步骤从细胞和上清回收。回收的病毒悬液在滴定前超声处理以避免聚集。 [0184] 在接种在6孔平板中的BHK21细胞上一式三份进行滴定。细胞用对数 病毒稀释液感染，在病毒吸收1小时后加入液体培养基。24小时后，除去培养基，细胞用结晶紫和中性红混合物覆盖。细胞染色之后，用双目显微镜观测病毒的噬斑形成单位并计数。疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC 08060502不扩增VV-COP。 [0185] 结果：如图11B所示，疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC 08060501能使得VV-COP扩增，即使与用经典CEF基质获得的扩增相比效率较低。 [0186] 实施例5：IL-2的产生 [0187] 来自疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC 08060502和08060501的上清用IL-2(CMV启动子)表达质粒(pTG8363：克隆在pCiNeo质粒中的人类IL2，CMV启动子)瞬时转染。 [0188] 在24、48、72和96小时后收集上清。IL-2经ELISA定量(Quantikine，RD Systems)并且在CTLL测定中确定功能性。 [0189] 结果：两种细胞系ECACC 08060502和08060501均产生功能性IL-2。产生的量在两种细胞系之间是等价的。另外，生产水平不依赖于所用的转染方法，范围从4865IU/mL(CTLL)和＞5211ng/mL(ELISA)(相应于比活性为23.1IU/ng)，至5672IU/mL(CTLL)和308ng/mL(相应于比活性为18.4IU/ng)。因此在细胞系中产生的IL-2的测量的比活性至少等价于针对IL-2(人类，Jurkat-衍生的)的13.16IU/ng WHO国际标准。 [0190] 实施例6：rituxan的产生 [0191] 重链和轻链由GeneArt合成，相应的表达质粒基于pCI-Neo载体(Promega)组装。用特异性“low IgG FCS”进行瞬时基因表达。疣鼻栖鸭永生化的禽类细胞系ECACC08060502和08060501在10％low IgG FCS versus classic FCS中扩增5天。未观测到对细胞生长的负面作用。收集来自细胞系ECACC 08060502和08060501的上清并用IgG ELISA(总人类IgG，Bethyl)评估单克隆抗体的量。 [0192] 结果：在瞬时和非优化条件下，在细胞系ECACC 08060502中产生多达0.5μg/ml，在细胞系ECACC 08060501中产生多达2.5μg/ml。在CHO标准细胞系(CHO K1(图12A)和CHO DG44(图12B)，一种二氢叶酸还原酶缺陷CHO克隆)或者在细胞系ECACC 08060501(图12C)中瞬时产生的Rituxan被纯化以分析和比较相应的糖基化模式。质谱分析(图 12(A-C))显示在CHO表达的Rituxan和细胞系ECACC 08060501表达的Rituxan之 间没有岩藻糖基化差异。 [0193] 实施例7：促红细胞生成素(EPO)的产生 [0194] 用 得 自Invitrogen(GeneStorm Human Clones，ref HK 1000 RG001720，Invitrogen)的商业可得质粒进行表达瞬时测定，该质粒中人类EPO是在pCMV启动子的控制下。 [0195] 根据厂商指导评估了三种转染试剂：Lipofectamine2000(Invitrogen)，Superfect(Qiagen)和 Fugene6(Roche)；以 及 电 穿 孔 装 置 (Nucleofector，Basic Fibroblast kit，Amaxa)。来自疣鼻栖鸭永生化禽类细胞系ECACC 08060502和08060501的上清在48、72和96小时后收集，经ELISA定量人类EPO。 [0196] 结果：在两种细胞系中，最大表达水平在使用Fugene6转染试剂及随后的Nucleofector System 96小时之后获得(图13)。在瞬时及非优化条件下产生了多达0.5μg/ml。 |
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