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一种麻鸭胚胎成 纤维细胞系及其构建方法与应用

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202411276258.4	申请日	2024-09-12
公开(公告)号	CN118956738A	公开(公告)日	2024-11-15
申请人	广州百赛生物医药科技有限公司;	申请人类型	企业
发明人	朱辉; 邵宝顺; 杨义芬; 方琳; 柳国权;	第一发明人	朱辉
权利人	广州百赛生物医药科技有限公司	权利人类型	企业
当前权利人	广州百赛生物医药科技有限公司	当前权利人类型	企业
省份	当前专利权人所在省份：广东省	城市	当前专利权人所在城市：广东省广州市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：广东省广州市黄埔区开源大道188号十三栋901房	邮编	当前专利权人邮编：510700
主IPC国际分类	C12N5/077	所有IPC国际分类	C12N5/077 ; C12N7/00 ; C12N7/02 ; C12Q1/02 ; C12Q1/04 ; A61K39/235 ; A61K39/17 ; A61K39/145 ; A61P31/14 ; A61P31/20 ; C12R1/93
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	10	专利文献类型	A
专利代理机构	广州嘉权专利商标事务所有限公司	专利代理人	张艳杰;
摘要	本发明属于生物医药领域，具体涉及一种麻鸭胚胎成纤维细胞系及其构建方法与应用。本发明通过发明人的大量创造性劳动，首次在麻鸭胚胎上分离获得成纤维细胞系，并成功无血清悬浮驯化，名称为麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs，于2024年6月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2024191。该细胞系可用于培养、分离、检测禽类病毒，制备禽类疫苗，筛选用于预防或治疗禽类病毒感染所致的疾病的药物。
权利要求	1.一株麻鸭胚胎成纤维细胞系，名称为麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs，于2024年6月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2024191。 2.权利要求1所述的麻鸭胚胎成纤维细胞系的构建方法，包括以下步骤： 1)分离鸭胚的躯干部分，剪碎成组织块； 2)加入第一培养基混匀，培养，传代10～20代； 3)使用无血清培养基培养，传代5～15代，得到麻鸭胚胎成纤维细胞。 3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述第一培养基包括4～8v/v％胎牛血清、和基础培养基。 4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述基础培养基包括MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基中的至少一种。 5.权利要求1所述的麻鸭胚胎成纤维细胞系在1)～8)中任一项中的应用： 1)培养病毒； 2)制备培养病毒的产品； 3)分离病毒； 4)制备分离病毒的产品； 5)非诊断治疗目的地检测病毒； 6)制备检测病毒的产品； 7)制备病毒疫苗； 8)药物筛选；所述药物为用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述病毒包括禽流感病毒、新城疫病毒、和禽腺病毒中的至少一种。 7.一种培养病毒的方法，将病毒接种至权利要求1所述的麻鸭胚胎成纤维细胞系中，培养。 8.一种制备病毒疫苗的方法，将病毒接种至权利要求1所述的麻鸭胚胎成纤维细胞系中，培养，灭活，得到病毒疫苗。 9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述病毒包括禽流感病毒、新城疫病毒、和禽腺病毒中的至少一种。 10.一种病毒疫苗，通过权利要求8或9所述的方法制备得到。
说明书全文	一种麻鸭胚胎成纤维细胞系及其构建方法与应用技术领域 [0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种麻鸭胚胎成纤维细胞系及其构建方法与应用。背景技术 [0002] 家禽业在我国的养殖生产中占据重要地位，并已成为我国农村经济主要支柱产业。2014‑2019年全国家禽存栏量在60亿只左右波动；2020年全国家禽产能规模大幅提升，家禽存栏量67.8亿只，比上年末增加2.6亿只，同比增长3.99％。随着现代专业化、集约化、规模化养禽技术的不断推进，我国已成为全球养禽大国，但伴随着规模的扩大，禽病的问题也日益凸显出来，一些重大家禽疫病仍是影响成活率和养殖效益、阻碍国内家禽业健康发展的关键因素之一。因此，重大家禽疫病的新型疫苗研发意义重大。 [0003] 细胞基质的选择是疫苗研发的重要一环。在生产中，细胞基质给病毒提供营养，以便病毒大量增殖，进而为制备疫苗提供原料。目前在疫苗生产中常用的细胞基质种类分为原代细胞、二倍体细胞、传代细胞等。原代细胞的优点在于获取方便，但容易受到外源性污染，并且因为原代细胞无法连续传代，需多次制备细胞，批次之间的差异大，细胞均一性控制难度大。二倍体细胞与原代细胞相比，具有连续传代的能力。而传代细胞来源于动物，如BHK细胞、MDCK细胞，具有无限传代、容易培养、容易放大等特性，生产成本相对较低。但由于某些传代细胞来源于肿瘤细胞，存在一定的生物安全风险隐患；另一方面，目前采用的大部分传代细胞来源为哺乳动物，细胞基质异源性问题会影响禽类疫苗的免疫原性。 [0004] 现阶段关于禽源细胞系的研究，仅停留在初步阶段，即将动物组织取出后利用胰蛋白酶、红细胞裂解液等液体反复消化组织块分离制备原代细胞，持续传代等方式获得禽源细胞系。该方法复杂繁琐，耗时较长，对细胞损伤较大，且分离的原代细胞无法脱离血清的依赖。同时大部分的原代细胞无法持续传代至超15代以上，此外贴壁培养的模式限制了后续工业化生产的扩大，存在较多短板。发明内容 [0005] 本发明第一方面的目的，在于提供一种细胞系。 [0006] 本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的细胞系的构建方法。 [0007] 本发明第三方面的目的，在于提供麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞系在兽用疫苗研发中应用，包括但不限于禽流感H9病毒，新城疫病毒，禽四型腺病毒。 [0008] 本发明第四方面的目的，在于提供一种培养病毒的方法。 [0009] 本发明第五方面的目的，在于提供一种病毒疫苗的方法。 [0010] 本发明第六方面的目的，在于提供一种病毒疫苗。 [0011] 为了实现本发明上述的目的，本发明采取的技术方案是： [0012] 本发明的第一个方面，提供一株麻鸭胚胎成纤维细胞系，名称为麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞(DEF‑Sfs)，于2024年6月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2024191。 [0013] 本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面的麻鸭胚胎成纤维细胞系构建方法，包括以下步骤： [0014] 1)分离鸭胚的躯干部分，剪碎成组织块； [0015] 2)加入第一培养基混匀，培养，传代10～20代； [0016] 3)使用无血清培养基培养，传代5～15代，得到麻鸭胚胎成纤维细胞系。 [0017] 优选地，所述第一培养基包括4～8v/v％胎牛血清、和基础培养基。 [0018] 优选地，所述基础培养基包括MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基中的至少一种。 [0019] 在本发明的一些实施方式中，所述构建方法包括： [0020] 1)DEF贴壁细胞的分离：于超净工作台中将10日龄鸭胚取出，去除头部等部位，用手术剪刀将躯干部分剪碎，随后加入少量5v/v％胎牛血清的MEM，吹打破碎组织块，利用300目细胞筛网去除较大团块，转入培养瓶中培养，培养条件为37℃，5％CO2； [0021] 2)DEF贴壁细胞的传代培养：DEF原代细胞分离静止培养6h后，利用不同细胞贴壁速度不一致的原理，将未贴壁细胞及含部分团块的上清弃去，仅留下已贴壁的细胞，补加新鲜5％胎牛血清的MEM，持续培养，细胞长成单层后，采用胰蛋白酶将DEF消化传代，持续传代至15代以上，得到贴壁细胞； [0022] 3)DEF无血清悬浮驯化：将采用5v/v％胎牛血清的MEM培养的贴壁细胞进行胰蛋白酶消化后，收集细胞悬液，800rpm 5min离心，弃去上清，留下细胞沉淀，用无血清培养基(BSL‑01培养基，广州百赛生物医药科技有限公司)重新悬浮，调整细胞密度调整至1.0×6 10cells/mL，培养条件为37℃，5％CO2，130r/min摇床培养，细胞培养48h后，800rpm 5min沉淀细胞，采用新鲜无血清BSL‑01培养基重悬，调整细胞密度持续传代。在细胞无血清驯化中如出现较大细胞粘团，可于超净工作台静置5min，取上清液进行细胞离心传代，持续培养传代至25代以上，得到无血清全悬浮培养型麻鸭胚胎成纤维细胞系DEF‑Sfs。 [0023] 优选地，步骤1)中所述组织碎块的大小为1～2cm3/个。 [0024] 优选地，所述培养的条件为31～39℃、4～6％ CO2；进一步为33～37℃、5％ CO2。 [0025] 本发明的第三个方面，在于提供本发明第一方面的麻鸭胚胎成纤维细胞系在1)～8)中任一项中的应用： [0026] 1)培养病毒； [0027] 2)制备培养病毒的产品； [0028] 3)分离病毒； [0029] 4)制备分离病毒的产品； [0030] 5)非诊断治疗目的地检测病毒； [0031] 6)制备检测病毒的产品； [0032] 7)制备病毒疫苗； [0033] 8)药物筛选； [0034] 所述药物为用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。 [0035] 优选地，所述病毒包括禽流感病毒、新城疫病毒、和禽腺病毒中的至少一种。 [0036] 优选地，所述禽流感病毒包括H9亚型禽流感病毒。 [0037] 优选地，所述禽腺病毒为禽四型腺病毒。 [0038] 在本发明的一些实施方式中，提供本发明第一方面的麻鸭胚胎成纤维细胞系在制备培养禽类病毒的产品中的应用； [0039] 本发明第一方面的麻鸭胚胎成纤维细胞系在分离禽类病毒中的应用； [0040] 本发明第一方面的麻鸭胚胎成纤维细胞系在制备分离禽类病毒的产品中的应用； [0041] 本发明第一方面的麻鸭胚胎成纤维细胞系在非诊断治疗目的地检测禽类病毒中的应用； [0042] 本发明第一方面的麻鸭胚胎成纤维细胞系在制备检测禽类病毒的产品中的应用； [0043] 本发明第一方面的麻鸭胚胎成纤维细胞系在制备禽类疫苗中的应用。 [0044] 本发明的第四个方面，提供一种培养病毒的方法，将病毒接种至本发明第一个方面的麻鸭胚胎成纤维细胞系中培养。 [0045] 优选地，所述病毒包括禽流感病毒、新城疫病毒、和禽腺病毒中的至少一种。 [0046] 优选地，所述禽流感病毒包括H9亚型禽流感病毒。 [0047] 优选地，所述禽腺病毒为禽四型腺病毒。 [0048] 优选地，所述培养的条件为31～39℃、4～6％ CO2；进一步为33～37℃、5％ CO2。 [0049] 本发明的第五个方面，提供一种制备病毒疫苗的方法，将病毒接种至本发明第一个方面的麻鸭胚胎成纤维细胞系中，培养，灭活，得到病毒疫苗。 [0050] 优选地，所述病毒包括禽流感病毒、新城疫病毒、和禽腺病毒中的至少一种。 [0051] 优选地，所述禽流感病毒包括H9亚型禽流感病毒。 [0052] 优选地，所述禽腺病毒为禽四型腺病毒。 [0053] 优选地，所述培养的条件为31～39℃、4～6％ CO2；进一步为33～37℃、5％ CO2。 [0054] 本发明的第六个方面，提供一种病毒疫苗，通过本发明第五个方面的方法制备得到。 [0055] 本发明的有益效果是： [0056] 本发明通过发明人的大量创造性劳动，首次在麻鸭胚胎上分离获得成纤维细胞系，并成功无血清悬浮驯化，名称为麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs，于2024年6月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2024191。该细胞系可用于培养、分离、检测禽类病毒，制备禽类疫苗，筛选用于预防或治疗禽类病毒感染所致的疾病的药物。附图说明 [0057] 图1为本发明第20代麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs的生长状态结果。 [0058] 图2为本发明麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs的生长曲线结果。 [0059] 图3为麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs接种禽流感H9病毒病毒72h的细胞病变结果。 [0060] 图4为麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs接种新城疫病毒58h的细胞病变结果。 [0061] 图5为麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs接种禽四型腺病毒72h的细胞病变结果。具体实施方式 [0062] 以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。 [0063] 实施例1麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs的建立 [0064] 1.原代麻鸭胚胎成纤维细胞的快速分离、培养 [0065] (1)将受精的麻鸭胚置于孵化器中孵化至10日龄，在强光灯下进行筛选，挑选较为健壮的胚蛋，同时标记出气室轮廓； [0066] (2)将胚蛋消毒后，于无菌操作台中沿着气室轮廓敲碎蛋壳，撕开壳膜，暴露胚体，用弯头镊轻挑起胚头，取出胚体，放入无菌平皿中； [0067] (3)将胚体头部、四肢等部位去掉，撕去明显血管，采用手术剪将躯干部分剪碎，随后加入少量5v/v％胎牛血清的MEM，吹打破碎组织块，利用300目细胞筛网去除较大团块，转入培养瓶中培养，培养条件为37℃，5％CO2； [0068] (4)细胞分离培养后6h，轻轻晃动细胞瓶，将上清弃去，包含未贴壁的细胞及红细胞等杂物将，仅留下已贴壁的细胞，补加新鲜5v/v％胎牛血清的MEM，持续培养，细胞长成单层后，采用胰蛋白酶将麻鸭胚胎成纤维细胞(DEF)消化传代，持续传代至15代，得到DEF贴壁细胞。 [0069] 2.麻鸭胚胎成纤维细胞的悬浮驯化 [0070] 将采用5v/v％胎牛血清的MEM培养的DEF贴壁细胞进行胰蛋白酶消化后，收集细胞悬液，800rpm 5min离心，弃去上清，留下细胞沉淀，用无血清培养基(BSL‑01培养基，广州市6 百赛生物医药科技有限公司)重新悬浮，调整细胞密度至1.0×10cells/mL，培养条件为37℃，5％CO2，130r/min摇床培养，细胞无血清悬浮驯化中如出现较大细胞粘团，可于超净工作台静置5min，取上清液进行细胞离心传代，持续培养传代至25代，得到麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞。 [0071] 上述麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞构建过程中每进行5次传代，则冻存细胞，建立细胞库。 [0072] 上述麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞传代至第20代时，命名为麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs，于2024年6月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2024191。 [0073] 图1为实施例1麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs。图2为实施例1中麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs生长曲线图。 [0074] 实施例2麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs接种禽流感H9病毒测试 [0075] 取麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs第20代细胞，置于37℃、5％CO2、130r/min培6 养48h，加入新鲜培养基将细胞稀释至4×10 cells/mL，同时按5v/v‰接种禽流感H9病毒‑8.0 (病毒滴度HA＝9log2,EID50＝10 /0.1mL)，并加入终浓度为3ug/mL的TPCK胰酶，调整温度至35℃，培养72h后收获病毒液，检测HA。结果表明，麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞系对禽流感H9病毒敏感，HA≥8Log2。图3为实施例2中麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs接种禽流感H9病毒72h的细胞病变图，细胞开始大量死亡，细胞碎片增多。 [0076] 上述毒株已在Qi,Xuefeng et al.“Down‑regulation of cellular protein heme oxygenase‑1inhibits proliferation of avian influenza virus H9N2 in chicken oviduct epithelial cells.”The Journal of general virology vol.99,1(2018):36‑43.doi:10.1099/jgv.0.000986文献中公开。 [0077] 实施例3麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs接种新城疫病毒测试 [0078] 取麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs第20代细胞，置于37℃、5％CO2、130r/min培6 养48h，加入新鲜培养基将细胞稀释至4×10 cells/mL，同时按3v/v‰接种新城疫病毒(病‑8.0 毒滴度HA＝9log2,EID50＝10 /0.1mL)，并加入终浓度为3ug/mL的TPCK胰酶，调整温度至 35℃，培养58h后收获病毒液，检测HA。结果表明，麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞系对新城疫病毒敏感，HA≥9Log2。图4为实施例3中麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs接种新城疫病毒58h的细胞病变图，细胞大量死亡，尚存活细胞较少，不透亮，细胞碎片较多。 [0079] 上述毒株已在Wang,Jing‑Yu et al.“Characterization of emerging Newcastledisease virus isolates in China.”Virology journal vol.12 119.7Aug.2015,doi:10.1186/s12985‑015‑0351‑z文献中公开。 [0080] 实施例4麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs接种禽四型腺病毒测试 [0081] 取麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs第20代细胞，置于37℃、5％CO2、130r/min培‑7.5养72h，直接接入1v/v‰的禽四型腺病毒(病毒滴度TCID50＝10 /0.1mL)，培养50h后收获病毒液，检测TCID50。结果表明，麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞系对禽四型腺病毒敏感，TCID50≥‑8.17 10 /0.1mL。图5为实施例4中麻鸭胚胎成纤维悬浮细胞DEF‑Sfs接种禽四型腺病毒72h后的细胞病变图， [0082] 上述毒株已在Wen,Bo et al.“Transcriptome Analysis Reveals the Potential Role of Long Noncoding RNAs in Regulating Fowl Adenovirus Serotype 4‑Induced Apoptosis in Leghorn Male Hepatocellular Cells.”Viruses vol.13,8 1623.17Aug.2021,doi:10.3390/v13081623文献中公开。

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