一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN201710674039.5 | 申请日 | 2017-08-09 |
| 公开(公告)号 | CN107412762A | 公开(公告)日 | 2017-12-01 |
| 申请人 | 青岛易邦生物工程有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 刘新文; 王秀丽; 胡潇; 宫晓; 陶晓珊; 范根成; 杜元钊; | 第一发明人 | 刘新文 |
| 权利人 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：山东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：山东省青岛市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：山东省青岛市红岛经济开发区岙东南路21号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：266009 |
| 主IPC国际分类 | A61K39/17 | 所有IPC国际分类 | A61K39/17 ; A61K39/145 ; A61K39/12 ; A61K39/235 ; A61K39/39 ; A61P31/14 ; A61P31/16 ; A61P31/20 |
| 专利引用数量 | 10 | 专利被引用数量 | 1 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京科亿知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 汤东凤; |
| 摘要 | 本 发明 提供一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联 疫苗 ，包含有 抗原 和疫苗佐剂，其中抗原是新城疫Lasota病毒株,保藏编号为CCTCC NO:V201517的H9亚型禽流感病毒株、由法氏囊VP2蛋白和 氨 基酸序列为SEQ ID NO:2的禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白。本发明将新城疫Lasota病毒株、H9亚型禽流感病毒QDY株、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白、和鸡α-干扰素蛋白抗原液按比例混合后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高免疫后的 抗体 水 平，提高免疫后抗体的整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。 | ||
| 权利要求 | 1.一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，其特征在于，所述的疫苗中包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是保藏编号为CCTCC NO:V201517的H9亚型禽流感病毒株、新城疫Lasota病毒株、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白。 |
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| 说明书全文 | 一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗技术领域背景技术[0002] 新城疫是新城疫病毒引起的禽类一种以呼吸道、消化道黏膜出血为特征的高度接触性、急性败血性传染病。同时感染其他病原如H9亚型禽流感，可引起的内源性感染，将会使产蛋鸡产蛋量下降，育成鸡死亡率增加，是危害我国养禽业的主要疫病之一。 [0003] 腺病毒科(Adenoviridae)根据形态结构、免疫学特性和宿主范围可划分为两个属:哺乳动物腺病毒属(Mast adenovirus)和禽腺病毒属(Avian adenovirus)。禽腺病毒是禽腺病毒属的代表种，由12个血清型病毒株组成，感染鸡可呈明显症状或不具有明显症状。与该病毒有关的主要临床和病理症候群包括肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病和产蛋量减少。Hexon蛋白是禽腺病毒主要结构蛋白，带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，与保护性免疫反应有关。禽腺病毒Hexon在病毒颗粒表面处于易接近的位置。该区域含有大量的保守性区域，具有较高的抗原性以及很好的暴露性并具有群特异性。随着我国禽业养殖规模的不断扩大，因禽腺病毒感染导致的继发感染也日益严重，对养禽业的危害非常严重，唯一有效办法是通过接种疫苗来预防鸡群的发病。现有的禽腺病毒疫苗均为传统疫苗，是使用完整的病原体作为制苗用抗原。传统的灭活疫苗和弱毒疫苗，具有独特的优势如免疫后抗体均一，抗体效价也较高，但目前制造疫苗使用的毒株与临床流行毒株的抗原性存在较大差异，从而影响了攻毒保护效果，制约灭活疫苗的应用。使用全病毒抗原制备的传统疫苗免疫后产生的抗体，在临床上无法区分野毒感染或是疫苗免疫产生，干扰疫情的监测。这是目前传统疫苗存在的不足。为解决传统疫苗的问题，就需要开发新的亚单位疫苗以克服现有疫苗的问题。 [0004] H9亚型禽流感属于低致病性疫病，但与其他病原特别混合感染能够提高其致病力，引起产蛋量严重下降和死亡率显著提高，给养禽业带来严重的危害。 [0005] 鸡传染性法氏囊病是由病毒引起的主要危害幼龄鸡的一种急性、高度接触性传染病，可引起严重的免疫抑制，其危害非常严重，造成较大的经济损失。本病的突出表现是鸡群突然发病，采食量锐减，死亡率增高。鸡群的饲养管理条件越差，发病年龄越小，或伴发有其他疾病，如新城疫、禽流感等，死亡率就越高。 [0006] 本发明一种新型的新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，有利于相关疾病的防制。 发明内容[0007] 本发明的目的是提供一种新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，从而弥补现有技术的不足。 [0008] 本发明的新城疫、禽流感、法氏囊和禽腺病毒四联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是保藏编号为CCTCC NO:V201517的H9亚型禽流感病毒株、新城疫Lasota病毒株、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白； [0009] 保藏编号为CCTCC NO:V201517的H9亚型禽流感病毒株，为H9亚型禽流感病毒QDY株(Avian influenza virus)，已于2015年4月29日保藏于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心。 [0010] 所述的禽腺病毒Hexon蛋白，包含有： [0011] 1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白， [0012] 2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白； [0013] 编码上述禽腺病毒Hexon蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2，[0014] 作为优选，编码上述禽腺病毒Hexon蛋白的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。 [0015] 所述的禽腺病毒Hexon蛋白由保藏编号为CCTCC M 2017069菌株X33-H表达生产； [0016] 保藏编号为CCTCC NO:M 2017069的巴斯德毕赤酵母X33-H(Pichia pastoris X33-H)，已于2017年2月27日保藏在位于中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心。 [0017] 上述疫苗中的H9亚型禽流感病毒、新城疫Lasota病毒、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白经过甲醛溶液灭活； [0018] 上述的疫苗中新城疫病毒的含量不低于105.0EID50/0.4ml；H9亚型禽流感病毒的含量不低于104.0EID50/0.4ml；法氏囊VP2蛋白琼扩效价不低于1:32/0.4ml、禽腺病毒Hexon蛋白的含量不低于50μg/0.4ml和鸡α-干扰素蛋白的效价为103.0单位/0.4ml。 [0019] 本发明将新城疫病毒Lasota株、H9亚型禽流感病毒QDY株、法氏囊VP2蛋白、禽腺病毒Hexon蛋白和鸡α-干扰素蛋白液按比例混合后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。 具体实施方式[0020] 图1：本发明突变后Hexon蛋白的氨基酸序列比对图； [0021] 图2：本发明实施例重组菌株X33-H的PCR鉴定图； 具体实施方式[0023] [0024] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明。 [0025] 实施例1：Hexon基因的扩增及序列分析 [0026] 自2010年以来，山东、江苏等地区的部分肉种鸡、蛋鸡及麻鸡出现了一种以死亡率高，解剖主要表现为肝脏肿大、心包积水为特点的疾病，经临床调查和实验室检测，初步诊断为Ⅰ群C-4型禽腺病毒引起的心包积水肝炎综合征。经调查，确信上述的发病鸡群之前已经注射过禽腺病毒疫苗，也做过中和抗体的检测。怀疑有禽腺病毒在疫苗的选择压力下发生了突变，从发病死鸡肝脏中成功分离出病毒，作为扩增的模板。 [0027] 1、扩增禽腺病毒Hexon基因 [0028] 根据NCBI中发表的Hexon基因序列，设计并合成了引物,引物的序列信息如下：primer1：5′-ATGACTGCTCTTACTCCAGATTTGAC-3′；primer2:5′- AACAGCTTGGTTTCTCAAAGCAAAG-3′。提取分离的病毒的核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行PCR扩增目的片段，经序列测定，结果核苷酸序列为SEQ ID NO:1。与NCBI中已公布的禽腺病毒的HEXON基因进行核苷酸序列比对分析，结果同源性约为99％；推导的氨基酸第7位(D变V)、37位(I变F)、100位(D变A)、178位(V变E)、312位(V变L)发生变异，同源性分析约为98.6％(图1为YBAV-4株HEXON蛋白的氨基酸序列比对图)。结果表明，分离的病毒为新的禽腺病毒，含有新的Hexon基因。 [0029] 2、设计并合成禽腺病毒Hexon基因 [0030] 分析Hexon基因的抗原特性，根据毕赤酵母表达的密码子偏爱性，定点突变后，设计合成用于Hexon蛋白表达的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，送生物公司合成后为模板，用引物primer3和primer4进行PCR扩增，目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-H。 [0031] 合成一对引物,引物的序列信息如下： [0032] primer3：5′-gggggtaccATGACTGCTCTTACTCCAG-3′； [0033] primer4:5′-gcggccgcTTGCAAAGTAGCAGTCTTG-3′。 [0034] 实施例2：Hexon蛋白的重组表达 [0035] 1.重组禽腺病毒Hexon蛋白的制备方法 [0036] 包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组Hexon蛋白的诱导和提取纯化。 [0037] a.构建表达载体： [0038] 将阳性克隆质粒pMD18-T-H和表达载体pPICZα载体分别用KpnI和NotI双酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别获得约510bp和3.3kb片段,在16℃定向连接构建pPICZα-H表达载体；测序验证序列和读码框无误后,将质粒线性化后，电转化入毕赤酵母感受态细胞。 [0039] b.构建表达菌株： [0040] 电转化后，30℃培养2～3天。挑取单菌落于YPD液体培养基(含新霉素)中，37℃摇床振荡培养16小时后，10000r/min离心5min，收集菌体后，用液氮冻10min-沸水浴煮5min，重复3次，12000r/min离心10min离心取上清作为模板，进行PCR鉴定,PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，52℃1min，72℃1min，共进行32个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，可以扩增出约500bp条带。检测结果表明，Hexon基因重组到毕赤酵母基因组中。将PCR检测阳性的重组菌株分别接种含3mL BMGY培养基试管中，30℃摇床培养过夜后，离心收集菌体，用6mlBMMY培养基悬浮菌体，置于30℃摇床诱导培养，每24小时取样并加入甲醇(终浓度0.5％)，连续诱导168小时，检测所有样品的蛋白表达情况。将蛋白表达量高的阳性的表达菌株命名为X33-H，已于2017年2月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017069)，图2是重组菌株的PCR鉴定图。 [0041] c.重组Hexon蛋白的诱导和提取纯化： [0042] 将阳性重组菌株分别转接到含30mL BMGY培养基的250mL培养瓶中，30℃摇床培养至OD600约为5～6时，3000r/min离心5min收取菌体沉淀，用BMMY培养基悬浮并稀释至OD600约为1.0，30℃摇床诱导培养，每24h补加甲醇至终浓度0.5％，30℃诱导培养96h。4℃,9000rpm离心5min，保留上清液，收集的上清加入30％的硫酸铵沉淀、浓缩后，用PBS重溶蛋白。加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮8分钟后，用12％的分离胶进行SDS-PAGE鉴定。(图3中 1、2、3、4为Hexon蛋白表达产物沉淀，M为分子量标准蛋白质。) [0043] 实施例3：制苗用抗原的制备 [0044] 1.制苗用禽流感抗原液的制备 [0045] 1.1病毒液的制备 将保藏编号为CCTCC NO:V201517的H9亚型禽流感病毒QDY株，经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml,36℃～37℃孵育，每日照胚2次,取24小时后死亡的鸡胚,至96小时无论死亡与否全部收获，置4～8℃冷却12～24小时,收获鸡胚液，混合于无菌容器中，置2～8℃保存。收获后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于108.0EID50； [0047] 2.制苗用新城疫抗原液的制备 [0048] 2.1新城疫(Lasota)病毒的繁殖 将生产用毒种(Lasota株)按1：10000比例稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，照胚将已死亡的鸡胚和仍健活的鸡胚分开，气室向上直立，置于2～8℃冷却4～24小时,收获鸡胚液，混合于无菌容器中，置2～8℃保存。收获后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于108.4EID50。 [0049] 2.2灭活 将检验合格的毒液置于灭菌容器内，加入10％福尔马林溶液至终浓度为0.2％，37℃灭活18小时。 [0050] 3.制苗用禽腺病毒Hexon蛋白的制备 将毕赤酵母X33-H菌株接种于含博莱霉素的YPD液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时。然后划线接种于加有博莱霉素的YPD固体培养基，选取典型菌落2～3个混合于少量YPD液体培养基中，置30℃摇床中振荡培养18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为一级种子。取一级种子接种于BMGY液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时，经镜检后，置2～8℃保存。按发酵罐容积60％(V/V)加入BMGY不完全液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至32℃，加入YNB和生物素，接种禽腺病毒Hexon蛋白生产用二级种子液，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度30℃，维持DO值(溶氧量)在20％。培养24小时后的菌液补加甲醇,甲醇的补加速度为2ml/h/L诱导表达培养，按照以上发酵控制参数及工艺诱导表达120小时；发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的上清，加入硫酸铵沉淀蛋白后，按12000r/min离心30分钟收获沉淀，加入适量的生理盐水溶解蛋白沉淀。 [0051] 4.制苗用鸡α干扰素蛋白的制备 发酵罐通气培养，按发酵罐容积70％配制培养基，用1mol/L NaOH调节pH值至7.0～7.2，按培养基总体积0.02％加入消泡剂。灭菌后按1％～2％接种量接种生产用菌种，按总体积0.1％的比例加入10％的硫酸卡那霉素注射液，36℃培养，2.5小时后，每隔10分钟取样测OD600nm值，待菌液的OD600nm值达到0.6～0.8之间时，再按总体积0.1％的比例加入10％的硫酸卡那霉素注射液，同时加入灭菌0.5mol/Lα-乳糖溶液，使其终浓度达到0.03mol/L，诱导表达5小时。整个培养过程中通过调节进气量和搅拌速度来控制溶氧35％～50％。培养结束后，快速冷却发酵液至15℃以下。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体湿重加10ml生理盐水进行菌体重悬，超声波破菌，破菌时温度控制在15℃以下。在显微镜下检查破菌液，待99％以上菌体破碎后停止破菌。破碎后的菌液离心，收集上清液，硫酸铵法提取纯化鸡α干扰素蛋白，经过滤除菌，4℃保存备用。 [0052] 5.灭活 将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。 [0053] 6.制苗用法氏囊VP2蛋白的制备 生产法氏囊VP2蛋白的菌株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)鉴定、保管，菌株保藏编号NO：M204038。 [0054] 6.1菌液培养 用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种二级种子菌液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2Mα-乳糖，使终浓度达到0.02M，再继续培养5～8h。开始小量通气，逐渐增大气量。 [0055] 6.2纯粹检验及活菌计数 菌液培养完成后取样作纯粹检验及活菌计数。，按《中华人民共和国兽药典》进行。 [0056] 6.3破菌 培养结束用沉淀离心设备收集菌体。收集的菌体用PBS液清洗2次。将收集的菌体按1克湿菌加4毫升PBS液进行重悬。在4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液，3000r/min，离心30min，收集上清液。 [0057] 6.4灭活 将收集的上清液中按比例加入10％的甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，37℃灭活12小时，以灭活残存的大肠杆菌。取少量样品进行半成品检验。2～8℃保存，不超过7天；-15℃以下保存，不超过60天。 [0058] 7.半成品检验 [0059] (1)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。 [0060] (2)禽流感病毒含量测定 将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度，分别尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察96小时。测定每个鸡胚尿囊液的血凝效价，血凝效价不小于24，判为感染并计算EID50。 [0061] (3)新城疫病毒含量测定 方法同(2)。 [0062] (3)禽腺病毒Hexon蛋白含量测定 按Bradford法检测蛋白含量。 [0063] (4)法氏囊VP2蛋白含量测定 取上清按琼脂扩散试验检测其效价。 [0064] (5)灭活检验 将灭活后的病毒液尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察96小时。测定每个鸡胚尿囊液的血凝效价，血凝效价不小于24，判为感染并计算EID50。 [0065] 实施例4：疫苗制备和检验 [0066] (一)疫苗制备 [0067] 经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。 [0069] 2.水相制备 将灭活的鸡新城疫病毒抗原液、H9亚型禽流感抗原液使用生理盐水分别稀释至不低于4×105.0EID50/0.1ml、4×104.0EID50/0.1ml。将灭活的法氏囊VP2蛋白琼扩效价稀释至不低于1:32/0.1ml。将鸡α干扰素蛋白使用生理盐水稀释成4.4×103.0单位/0.1ml。将灭活的禽腺病毒Hexon蛋白使用生理盐水稀释至不低于200μg/0.1ml。分别取灭活的新城疫病毒抗原液、H9亚型禽流感抗原液、法氏囊VP2蛋白液、禽腺病毒Hexon蛋白、鸡α干扰素蛋白液各1份，混合配成制苗用抗原液。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用抗原液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。 [0070] 3.乳化 取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。 [0071] (二)疫苗成品检验 [0072] 1.性状 [0073] 外观 疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。 [0074] 剂型 为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。 [0075] 稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。 [0076] 黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。 [0077] 2.装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。 [0078] 3.无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。 [0079] 4.安全检验 用7日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射四联疫苗1.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。 [0080] 5.效力检验 [0081] 用21日龄SPF鸡40只，每只颈部皮下注射四联疫苗，0.4ml/只，另取40只同日龄鸡不免疫作对照，免后28日，攻毒。 [0082] 5.1对H9亚型禽流感的攻毒保护 于免疫后28日，免疫组和对照组各取10只，攻毒6株各地方分离株，10倍稀释后每只静脉注射0.1ml。结果表明，四联疫苗能抵御各地方分离毒的攻击(参见表1)。 [0083] 表1 对地方流行毒株的攻毒保护 [0084] [0085] [0086] 5.2新城疫部分效力检验 于免疫后28日，免疫组和对照组各取10只，每只鸡肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒(CVCC AV1611株)105.0ELD50，观察14日，记录免疫组和对照组情况。结果，使用四联灭活疫苗免疫组均能抵抗新城疫强度的攻击，保护率为100％。 [0087] 表2 新城疫的攻毒保护结果 [0088] [0089] 5.3禽腺病毒部分效力检验 21日龄SPF鸡60只，每只颈部皮下注射三联灭活疫苗，0.3ml/只，另取60只同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，免疫组和对照组均肌肉注射攻毒6株各地方分离株，病毒含量均≥105.0TCID50/0.1ml，每只0.2ml，攻毒后观察14日，记录发病死亡情况。结果表明，禽腺病毒Hexon蛋白制备的灭活疫苗，能抵御各地方禽腺病毒分离株的攻击(参见表3)。本发明制备的Hexon蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫效果，可以保护免疫鸡抵抗禽腺病毒的攻击。 [0090] 并且，用目前市场上出售的禽腺病毒疫苗进行免疫，再用本发明的Hexon蛋白的出发病毒进行攻毒实验，结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明的疫苗的免疫效果。 [0091] 表3 对地方流行毒株的攻毒保护 [0092] [0093] 5.4法氏囊部分效力检验 于免疫后28日，免疫组和对照组各取10只鸡点眼攻毒法氏囊强毒液(含106.0LD50/0.1ml)，每只0.1ml，攻毒后观察7日，记录发病死亡情况。结果表明，用四联疫苗免疫鸡群能够抵抗病毒的攻击，不出现临床症状。对照组10/10发病死亡。详见表4。 [0094] 表4 疫苗免疫后的攻毒保护效果 [0095] [0096] 本发明制备的四联疫苗具有良好的免疫效果，可以保护免疫鸡抵抗新城疫、禽流感和禽腺病毒的攻击。 |
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