编码连接抗原的多核苷酸以及其用途
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; |
| 专利有效性 | 公开 | 当前状态 | 公开 |
| 申请号 | CN202380065743.4 | 申请日 | 2023-07-28 |
| 公开(公告)号 | CN119866224A | 公开(公告)日 | 2025-04-22 |
| 申请人 | 加拿大干细胞技术公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | S·M·拉夫黑德; M·F·马洛尼; K·布拉戈耶维奇; C·K·史密斯; | 第一发明人 | S·M·拉夫黑德 |
| 权利人 | 加拿大干细胞技术公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 加拿大干细胞技术公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份： | 城市 | 当前专利权人所在城市： |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：加拿大哥伦比亚 | 邮编 | 当前专利权人邮编： |
| 主IPC国际分类 | A61K38/00 | 所有IPC国际分类 | A61K38/00 ; A61K39/00 ; A61K39/12 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 121 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京世峰知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 王建秀; 刘小立; |
| 摘要 | 本公开提供了分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含多个连接的编码区。在一些方面，一种多核苷酸至少包含编码第一 抗原 的第一编码区和编码第二抗原的第二编码区，其中所述第一抗原和所述第二抗原并不相同，并且其中所述第一编码区和所述第二编码区是连接的。本公开还涉及此类多核苷酸在细胞中表达多种抗原并在体内诱导多抗原特异性免疫反应的用途。 | ||
| 权利要求 | 1.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含单个ORF，所述ORF具有编码第一抗 |
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| 说明书全文 | 编码连接抗原的多核苷酸以及其用途[0001] 相关申请的交叉引用 [0002] 本PCT申请要求2022年7月28日提交的美国临时申请号63/369,726的优先权权益，所述美国临时申请以引用的方式整体并入本文中。 [0004] 序列表的内容以电子方式提交(名称：4821_086PC01_SequenceListing_ST26.XML；大小：36,597字节；和创建日期：2023年7月28日)并与本申请一起提交，以引用的方式整体并入本文中。 发明领域 [0005] 本公开总体上涉及包含编码抗原的多个核苷酸序列的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)，其中所述多个核苷酸序列是连接的(例如，通过接头)。 [0006] 发明背景 [0007] 癌症仍然是现代世界的主要死亡原因之一。目前在临床上实施的标准治疗包括手术、放射、化学疗法和免疫疗法，显示出有限的成功。这些疗法通常只对早期局部肿瘤有效并且很少对晚期转移性恶性肿瘤有效，从而导致频繁复发或最终对疗法产生抗性。Sharma，P.等人，Cell 168(4)：707‑723(2017)。此外，放射和化学疗法中使用的各种剂会损害正常组织，这可导致不良副作用。因此，癌症患者仍然需要具有可接受的安全性概况和高功效的新治疗选项。 发明内容[0008] 本文提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含单个ORF，所述ORF具有编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)和编码第二抗原的第二核苷酸序列 (“第二编码区”)，其中第一编码区和第二编码区是连接的。在一些方面，第一编码区和第二编码区通过接头连接。 [0009] 在一些方面，第一编码区和第二编码区按以下顺序排列：第一编码区在第二编码区的上游。在一些方面，如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，第一编码区和第二编码区的顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。 [0010] 在一些方面，所述多核苷酸的单个ORF还包含一个或多个编码额外抗原的额外核苷酸序列(“额外编码区”)。在一些方面，所述额外抗原：(i)与第一抗原不同，(ii)与第二抗原不同，或(iii)与第一抗原和第二抗原均不同。在一些方面，所述多核苷酸的单个ORF包含至少两个额外编码区、至少三个额外编码区、至少四个额外编码区、至少五个额外编码区、至少六个额外编码区、至少七个额外编码区、至少八个额外编码区、至少九个额外编码区或至少十个额外编码区。在一些方面，所述额外编码区与第一编码区或第二编码区连接。在一些方面，所述额外编码区通过接头与第一编码区或第二编码区连接。 [0011] 在一些方面，第一编码区、第二编码区和额外编码区按以下顺序排列：(a)(第一编码区)‑L1‑(第二编码区)‑L2‑(额外编码区)；(b)(第一编码区)‑L1‑(额外编码区)‑L2‑(第二编码区)；或(c)(额外编码区)‑L1‑(第一编码区)‑L2‑(第二编码区)；其中L1是第一接头并且L2是第二接头。在一些方面，第一接头和第二接头是相同的。在一些方面，第一接头和第二接头并不相同。在一些方面，如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，第一编码区、第二编码区和第三编码区的顺序是不同的。 [0012] 在一些方面，第一抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第二抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，所述额外抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第一抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，第二抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，所述额外抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。 [0014] 在一些方面，KRAS抗原包含如与相应野生型KRAS抗原的氨基酸序列相比序列不同的氨基酸序列。在一些方面，如与相应野生型KRAS抗原的氨基酸序列相比，KRAS抗原的氨基酸序列具有小于约99％、小于约98％、小于约97％、小于约96％、小于约95％、小于约94％、小于约93％、小于约92％、小于约91％、小于约90％、小于约85％或小于约90％的序列同一性。在一些方面，KRAS抗原的氨基酸序列包含选自以下的氨基酸取代：K5E、K5N、G10GG、G10V、G12A、G12C、G12D、G12F、G12I、G12L、G12R、G12S、G12V、G13C、G13D、G13E、G13R、G13V、V14I、L19F、T20M、Q22E、Q22H、Q22K、Q22R、Q25H、N26Y、F28L、E31K、D33E、P34L、P34Q、P34R、I36M、R41K、D57N、T58I、A59T、G60D、G60R、G60S、G60V、Q61A、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P、Q61R、E63K、S65N、R68S、Y71H、T74A、L79I、R97I、Q99E、M111L、K117N、K117R、D119G、S122F、T144P、A146P、A146T、A146V、K147E、K147T、R149K、L159S、I163S、R164Q、I183N、I84M或它们的组合。 1‑16 2‑19 2‑22 2‑29 1‑16 在一些方面，KRAS抗原包含以下一种或多种：G12D 、G12D 、G12D 、G12D 、G12V 、 2‑19 3‑17 3‑42 G12V 、G12V 或G12V 抗原。 [0015] 在任何上述多核苷酸中，在一些方面，接头包含肽接头。在一些方面，肽接头包含G4S接头或EAAAK接头。 [0016] 本公开的一些方面涉及一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含单个ORF，所述ORF具有编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)、编码第二抗原的第二核苷酸序列(“第二编码区”)以及编码第三抗原的第三核苷酸序列(“第三编码区”)，其中第一编码区通过第一接头与第二编码区连接，并且其中第二编码区通过第二接头与第三编码区连 接。在一些方面，第一编码区、第二编码区以及第三编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应 多核苷酸。 [0017] 本文还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)、编码第二抗原的第二核苷酸序列(“第二编码区”)、编码第三抗原的第三核苷酸序列(“第三编码区”)以及编码第四抗原的第四核苷酸序列(“第四编码区”)，其中第一编码区通过第一接头与第二编码区连接，其中第二编码区通过第二接头与第三区连接，并且其中第三编码区通过第三接头与第四编码区连接。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区以及第四编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。 [0018] 本文还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)、编码第二抗原的第二核苷酸序列(“第二编码区”)、编码第三抗原的第三核苷酸序列(“第三编码区”)、编码第四抗原的第四核苷酸序列(“第四编码区”)以及编码第五抗原的第五核苷酸序列(“第五编码区”)，其中第一编码区通过第一接头与第二编码区连接，其中第二编码区通过第二接头与第三编码区连接，其中第三编码区通 过第三接头与第四编码区连接，并且其中第四编码区通过第四接头与第五编码区连接。在 一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区以及第五编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包 含天然存在的相应多核苷酸。 [0019] 本文还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)、编码第二抗原的第二核苷酸序列(“第二编码区”)、编码第三抗原的第三核苷酸序列(“第三编码区”)、编码第四抗原的第四核苷酸序列(“第四编码区”)、编码第五抗原的第五核苷酸序列(“第五编码区”)以及编码第六抗原的第六核苷酸序列(“第六编码区”)，其中第一编码区通过第一接头与第二编码区连接，其中第二编码区通过第二接头与第三编码区连接，其中第三编码区通过第三接头与第四编码区连接，其中第 四编码区通过第四接头与第五编码区连接，并且其中第五编码区通过第五接头与第六编码 区连接。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区以及第六编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同 的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。 [0020] 本文还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)、编码第二抗原的第二核苷酸序列(“第二编码区”)、编码第三抗原的第三核苷酸序列(“第三编码区”)、编码第四抗原的第四核苷酸序列(“第四编码区”)、编码第五抗原的第五核苷酸序列(“第五编码区”)、编码第六抗原的第六核苷酸序列(“第六编码区”)以及编码第七抗原的第七核苷酸序列(“第七编码区”)，其中第一编码区通过第一接头与第二编码区连接，其中第二编码区通过第二接头与第三编码区连接，其中第 三编码区通过第三接头与第四编码区连接，其中第四编码区通过第四接头与第五编码区连 接，其中第五编码区通过第五接头与第六编码区连接，并且其中第六编码区通过第六接头 与第七编码区连接。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区以及第五编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。 [0021] 本文还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)、编码第二抗原的第二核苷酸序列(“第二编码区”)、编码第三抗原的第三核苷酸序列(“第三编码区”)、编码第四抗原的第四核苷酸序列(“第四编码区”)、编码第五抗原的第五核苷酸序列(“第五编码区”)以及编码第六抗原的第六核苷酸序列(“第六编码区”)，其中第一编码区通过第一接头与第二编码区连接，其中第二编码区通过第二接头与第三编码区连接，其中第三编码区通过第三接头与第四编码区连接，其中第 四编码区通过第四接头与第五编码区连接，并且其中第五编码区通过第五接头与第六编码 区连接。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区以及第六编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同 的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。 [0022] 本文还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)、编码第二抗原的第二核苷酸序列(“第二编码区”)、编码第三抗原的第三核苷酸序列(“第三编码区”)、编码第四抗原的第四核苷酸序列(“第四编码区”)、编码第五抗原的第五核苷酸序列(“第五编码区”)、编码第六抗原的第六核苷酸序列(“第六编码区”)以及编码第七抗原的第七核苷酸序列(“第七编码区”)，其中第一编码区通过第一接头与第二编码区连接，其中第二编码区通过第二接头与第三编码区连接，其中第 三编码区通过第三接头与第四编码区连接，其中第四编码区通过第四接头与第五编码区连 接，其中第五编码区通过第五接头与第六编码区连接，并且其中第六编码区通过第六接头 与第七编码区连接。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区以及第五编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。 [0023] 本文还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)、编码第二抗原的第二核苷酸序列(“第二编码区”)、编码第三抗原的第三核苷酸序列(“第三编码区”)、编码第四抗原的第四核苷酸序列(“第四编码区”)、编码第五抗原的第五核苷酸序列(“第五编码区”)、编码第六抗原的第六核苷酸序列(“第六编码区”)、编码第七抗原的第七核苷酸序列(“第七编码区”)以及编码第八抗原的第八核苷酸序列(“第八编码区”)，其中第一编码区通过第一接头与第二编码区连接，其中第二编码区通过第二接头与第三编码区连接，其中第三编码区通过第三接头与第四编码区连 接，其中第四编码区通过第四接头与第五编码区连接，其中第五编码区通过第五接头与第 六编码区连接，其中第六编码区通过第六接头与第七编码区连接，并且其中第七编码区通 过第七接头与第八编码区连接。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区、第六编码区、第七编码区以及第八编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相 应多核苷酸。 [0024] 本文提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)、编码第二抗原的第二核苷酸序列(“第二编码区”)、编码第三抗原的第三核苷酸序列(“第三编码区”)、编码第四抗原的第四核苷酸序列(“第四编码区”)、编码第五抗原的第五核苷酸序列(“第五编码区”)、编码第六抗原的第六核苷酸序列(“第六编码区”)、编码第七抗原的第七核苷酸序列(“第七编码区”)、编码第八抗原的第八核苷酸序列(“第八编码区”)以及编码第九抗原的第九核苷酸序列(“第九编码区”)，其中第一编码区通过第一接头与第二编码区连接，其中第二编码区通过第二接头与第三编码区连接，其 中第三编码区通过第三接头与第四编码区连接，其中第四编码区通过第四接头与第五编码 区连接，其中第五编码区通过第五接头与第六编码区连接，其中第六编码区通过第六接头 与第七编码区连接，其中第七编码区通过第七接头与第八编码区连接，并且其中第八编码 区通过第八接头与第九编码区连接。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区、第六编码区、第七编码区、第八编码区以及第九编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包 含天然存在的相应多核苷酸。 [0025] 本文提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码第一抗原的第一核苷酸序列(“第一编码区”)、编码第二抗原的第二核苷酸序列(“第二编码区”)、编码第三抗原的第三核苷酸序列(“第三编码区”)、编码第四抗原的第四核苷酸序列(“第四编码区”)、编码第五抗原的第五核苷酸序列(“第五编码区”)、编码第六抗原的第六核苷酸序列(“第六编码区”)、编码第七抗原的第七核苷酸序列(“第七编码区”)、编码第八抗原的第八核苷酸序列(“第八编码区”)、编码第九抗原的第九核苷酸序列(“第九编码区”)以及编码第十抗原的第十核苷酸序列(“第十编码区”)，其中第一编码区通过第一接头与第二编码区连接，其中第二编码区通过第二接头与第三编码区连接，其中第三编码区通过第三接头与第四编码 区连接，其中第四编码区通过第四接头与第五编码区连接，其中第五编码区通过第五接头 与第六编码区连接，其中第六编码区通过第六接头与第七编码区连接，其中第七编码区通 过第七接头与第八编码区连接，其中第八编码区通过第八接头与第九编码区连接，并且其 中第九编码区通过第九接头与第十编码区连接。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区、第六编码区、第七编码区、第八编码区、第九编码区以及第十编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不 同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。 [0026] 在任何上述多核苷酸中，在一些方面，第一抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第二抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第三抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第四抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第五抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第六抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第七抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第八抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第九抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，第十抗原是约25个氨基酸长。 [0027] 在一些方面，第一抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，第二抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，第三抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，第四抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，第五抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，第六抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，第七抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，第八抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，第九抗原包含癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。在一些方面，第十抗原包含癌症抗 原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。 [0028] 在一些方面，癌症抗原包含KRAS抗原。在一些方面，非自身抗原来源于选自以下的病原体：人乳头瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、乙型肝炎病毒(HBV)抗原或它们的组合。在一些方面，KRAS抗原包含如与相应野生型KRAS抗原的氨基酸序列相比序列不同的氨基酸序列。在一些方面，如与相应野生型KRAS抗原的氨基酸序列相比，KRAS抗原的氨基酸序列具有小于约99％、小于约98％、小于约97％、小于约96％、小于约95％、小于约 94％、小于约93％、小于约92％、小于约91％、小于约90％、小于约85％或小于约90％的序列同一性。在一些方面，第一KRAS抗原的氨基酸序列包含选自以下的氨基酸取代：K5E、K5N、G10GG、G10V、G12A、G12C、G12D、G12F、G12I、G12L、G12R、G12S、G12V、G13C、G13D、G13E、G13R、G13V、V14I、L19F、T20M、Q22E、Q22H、Q22K、Q22R、Q25H、N26Y、F28L、E31K、D33E、P34L、P34Q、P34R、136M、R41K、D57N、T58I、A59T、G60D、G60R、G60S、G60V、Q61A、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P、Q61R、E63K、S65N、R68S、Y71H、T74A、L79I、R97I、Q99E、M111L、K117N、K117R、D119G、S122F、T144P、A146P、A146T、A146V、K147E、K147T、R149K、L159S、I163S、R164Q、I183N、I84M或它们 1‑16 2‑19 2‑22 2‑29 的组合。在一些方面，KRAS抗原包含以下一种或多种：G12D 、G12D 、G12D 、G12D 、 1‑16 2‑19 3‑17 3‑42 G12V 、G12V 、G12V 或G12V 抗原。 [0029] 在一些方面，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九接头中的任一个均包含肽接头。在一些方面，肽接头包含G4S接头或EAAAK接头。 [0030] 对于本文所述的任何多核苷酸，在一些方面，所述多核苷酸还包含以下组分中的一种或多种：(1)内部核糖体进入位点(IRES)，(2)内含子序列，(3)同源臂，(4)启动子，(5)增强子，(6)UTR，(7)编码信号肽的序列，(8)翻译起始序列，(9)连接核苷的3′加尾区，(10) 5′帽，(11)编码2A核糖体跳跃肽的序列，或(12)(1)至(11)的任何组合。在一些方面，所述多核苷酸还包含至少一个修饰的核苷。在一些方面，所述至少一个修饰的核苷包含6‑氮杂‑胞苷、2‑硫代‑胞苷、α‑硫代‑胞苷、假异胞苷、5‑氨基烯丙基‑尿苷、5‑碘‑尿苷、N1‑甲基‑假尿苷、5，6‑二氢尿苷、α‑硫代‑尿苷、4‑硫代‑尿苷、6‑氮杂‑尿苷、5‑羟基‑尿苷、脱氧‑胸苷、假尿苷、肌苷、α‑硫代‑鸟苷、8‑氧代‑鸟苷、O6‑甲基‑鸟苷、7‑脱氮杂‑鸟苷、N1‑甲基腺苷、2‑氨基‑6‑氯‑嘌呤、N6‑甲基‑2‑氨基‑嘌呤、6‑氯‑嘌呤、N6‑甲基‑腺苷、α‑硫代‑腺苷、8‑叠氮基‑腺苷、7‑脱氮杂‑腺苷、吡咯并‑胞苷、5‑甲基‑胞苷、N4‑乙酰基‑胞苷、5‑甲基‑尿苷、5‑碘‑胞苷或它们的组合。 [0031] 在一些方面，本文所述的多核苷酸是mRNA。 [0032] 本文还提供了一种载体，所述载体包含本文所述的任何多核苷酸。本公开的一些方面涉及细胞，所述细胞包含本文所述的任何多核苷酸。在一些方面，所述细胞包含干细 胞、体细胞或两者。在一些方面，干细胞包含诱导性多潜能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞、组织特异性干细胞、间充质干细胞或它们的组合。在一些方面，体细胞包含血细胞。在一些方面，血细胞包含PBMC。在一些方面，PBMC包含免疫细胞。在一些方面，免疫细胞包含T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)、NKT细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、DC2.4树突状细胞或它们的组合。在一些方面，所述细胞已经在一组参数下穿过收缩部，从而引起细胞内的扰动，使得所述多核苷酸在与细胞接 触时通过扰动进入细胞。 [0034] 本文提供了一种制备多核苷酸的方法，所述方法包括酶促或化学合成本文所述的任何多核苷酸。 [0035] 本文还提供了一种诱导多种抗原在细胞中表达的方法，所述方法包括在细胞内将本文所述的多核苷酸递送至细胞。在一些方面，所述多种抗原在细胞内递送后同时在细胞 中表达。在一些方面，在细胞内将所述多核苷酸递送至细胞包括使包含细胞的细胞悬浮液 在一组参数下穿过收缩部，从而引起细胞内的扰动，使得所述多核苷酸在与细胞接触时通 过扰动进入细胞。 [0036] 在一些方面，所述方法还包括使细胞与所述多核苷酸接触。在一些方面，使细胞与所述多核苷酸接触包括将细胞悬浮液与所述多核苷酸一起孵育，使得细胞和所述多核苷酸接触。在一些方面，接触发生在细胞悬浮液穿过收缩部之前。在一些方面，接触发生在细胞悬浮液穿过收缩部期间。在一些方面，接触发生在细胞悬浮液穿过收缩部之后。 [0037] 在一些方面，用于使细胞穿过收缩部的参数组选自细胞密度；压力；收缩部的长度、宽度和/或深度；收缩部的直径；细胞的直径；温度；收缩部的入口角；收缩部的出口角； 接近区域的长度、宽度和/或宽度；收缩部的表面特性(例如，粗糙度、化学改性、亲水性、疏水性)；操作流动速度；有效载荷浓度；细胞悬浮液的粘度、同渗容摩、盐浓度、血清含量和/或pH；在收缩部中的时间；在收缩部中的剪切速率；有效载荷的类型，或它们的组合。 [0038] 在一些方面，细胞密度是至少约6x107个细胞/mL、至少约7x107个细胞/mL、至少约7 7 8 8 8x10 个细胞/mL、至少约9x10 个细胞/mL、至少约1x10 个细胞/mL、至少约1.1x10个细胞/ 8 8 8 mL、至少约1.2x10个细胞/mL、至少约1.3x10个细胞/mL、至少约1.4x10个细胞/mL、至少约 8 8 8 8 1.5x10个细胞/mL、至少约2.0x10个细胞/mL、至少约3.0x10个细胞/mL、至少约4.0x10 个 8 8 8 细胞/mL、至少约5.0x10个细胞/mL、至少约6.0x10个细胞/mL、至少约7.0x10 个细胞/mL、 8 8 9 至少约8.0x10个细胞/mL、至少约9.0x10个细胞/mL或至少约1.0x10个细胞/mL或更高。在 一些方面，压力是至少约30psi、至少约35psi、至少约40psi、至少约45psi、至少约50psi、至少约55psi、至少约60psi、至少约65psi、至少约70psi、至少约75psi、至少约80psi、至少约 85psi、至少约90psi、至少约95psi、至少约100psi、至少约110psi、至少约120psi、至少约 130psi、至少约140psi或至少约150psi。 [0039] 在一些方面，收缩部含于微流体芯片内。在一些方面，收缩部的直径是细胞的直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些方面，收缩部的宽度在约0μm至约10μm之间。在一些方面，收缩部的宽度小于约1μm、小于约2μm、小于约3μm、小于约4μm、小于约5μm、小于约6μm、小于约7μm、小于约8μm、小于约9μm或小于约10μm。在一些方面，收缩部的长度在约0μm至约100μm之间。在一些方面，收缩部的长度小于约0.1μm、小于约0.2μm、小于约0.3μm、小于约0.4μm、小于约0.5μm、小于约0.6μm、小于约0.7μm、小于约0.8μm、小于约0.9μm、小于约1μm、小于约2.5μm、小于约5μm、小于约7.5μm、小于约 10μm、小于约12.5μm、小于约15μm、小于约20μm、小于约30μm、小于约40μm、小于约50μm、小于约60μm、小于约70μm、小于约80μm、小于约90μm或小于约100μm。在一些方面，收缩部的深度在至少约1μm至至少约120μm之间。在一些方面，收缩部的深度是至少约2μm、至少约3μm、至少约4μm、至少约5μm、至少约10μm、至少约20μm、至少约30μm、至少约40μm、至少约50μm、至少约60μm、至少约70μm、至少约80μm、至少约90μm、至少约100μm、至少约110μm或至少约120μm。 [0040] 在一些方面，使包含细胞的细胞悬浮液穿过多个收缩部。在一些方面，所述多个收缩部包含至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约75个、至少约100个、至少约150个、至少约200个、至少约250个、至少约300个、至少约350个、至少约400个、至少约450个、至少约500个、至少约550个、至少约600个、至少约650个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约850个、至少约900个、至少约950个、至少约1,000个或更多的单独的收缩部。在一些方面，所述多个收缩部中的每个收缩部都是相同的。在一些方面，所述多个收缩部中的一个或多个收缩部是不同的。在一些方面，所述一个或多个收缩部的长度、深度、宽度或它们的组合有所不同。 [0041] 本公开还提供了一种诱导有需要的受试者的多特异性免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的任何多核苷酸、载体、细胞或药物组合物。在一些方面，所述多特异性免疫反应包含CD8+T细胞反应。 [0042] 本文还提供了一种诱导有需要的受试者的增强的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的任何多核苷酸、载体、细胞或药物组合物。在一些方面，所述增强的免疫反应包含：(i)如与参考免疫反应相比，诱导的免疫反应的幅度增加，(ii)如与参考免疫反应相比，诱导的免疫反应的广度增加，(iii)如与参考免疫反应相比，诱导的免疫反应的持续时间增加，或(iv)(i)至(iii)的任何组合；其中参考免疫包含在未接受所述多核 苷酸或修饰的细胞的施用的相应受试者中观察到的免疫反应。 [0043] 本文提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的任何多核苷酸、载体、细胞或药物组合物。在一些方面，所述疾病或疾患包含癌症。在一些方面，所述癌症与异常KRAS表达相关。在一些方面，所述疾病或疾患与非自身抗原相关。在一些方面，所述非自身抗原来源于病毒。在一些方面，所述病毒包含HPV、HIV或HBV。 附图说明 [0044] 图1A示出了三种连接抗原mRNA构建体，其中每种编码以不同顺序排列的5种抗原(HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASG12V和KRASG12D)中的每一种的约25个氨基酸长的片段。 [0045] 图1B示出了在与用图1A中所示的三种不同的连接抗原mRNA构建体中的每一种挤压的PMBC共培养后，E6 TCR Jurkat细胞(左图)、E7 TCR Jurkat细胞(中间图)和pp65特异 性Cellero应答T细胞(右图)的激活。所示的对照包括用以下一种处理的应答细胞：(i)未修饰的PBMC(即，无挤压并且无多核苷酸)(“NC”)，(ii)未用任何mRNA挤压的PBMC(“空”)，以及(iii)掺有各自的最小表位的NC PBMC(对于每种不同的细胞系，右侧第2个条形)。未处理的应答细胞也被用作对照(右侧最后一个条形)。 [0046] 图2A示出了三种连接抗原mRNA构建体，其中两种编码以不同顺序排列的10种抗原(HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASGl2V、KRASG12D、Flu M1、NY‑ESO‑1、HSV gD、SARS‑CoV2 S和MAGE‑A10)中的每一种的约25个氨基酸长的片段，并且第三种mRNA构建体编码5种抗原 (HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASG12V和KRASG12D)中的每一种的约25个氨基酸长的片段。 [0047] 图2B示出了在与用图2A中所示的三种不同的连接抗原mRNA构建体中的每一种挤压的PMBC共培养后，E6 TCR Jurkat细胞(左图)和E7 TCR Jurkat细胞(右图)的激活。对照 与图1B中所述的那些相同。 [0048] 图2C示出了在与用图2A中所示的三种不同的连接抗原mRNA构建体中的每一种挤压的PMBC共培养后，pp65特异性Cellero应答T细胞(左图)、M1特异性Flu Cellero应答T细 胞(中间图)和NY‑ESO‑1特异性Cellero应答T细胞(右图)的激活。对照与图1B中所述的那些相同。 [0049] 图3A示出了五种连接抗原mRNA构建体，其中三种编码以不同顺序排列的5种抗原(HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASG12V和KRASG12D)中的每一种的约25个氨基酸长的片段，并且其中两种编码以不同顺序排列的10种抗原(HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASG12V、KRASG12D、Flu M1、NY‑ESO‑1、HSV gD、SARS‑CoV2 S和MAGE‑A10)中的每一种的约25个氨基酸长的片段。 [0050] 图3B示出了两块SDS‑PAGE凝胶的蛋白质印迹，所述凝胶上是小麦胚芽提取物的运行样品，所述样品翻译了图3A中所示的五种连接抗原mRNA构建体中的每一种。用抗HPV E629‑38 SLP(克隆5G10)的第一抗体和山羊抗兔第二抗体对凝胶进行印迹分析。 [0051] 图4示出了在与用图1A中所示的三种不同的连接抗原mRNA构建体中的每一种挤压的PMBC共培养后，KRASG12V TCR Jurkat细胞的激活。对照与图1B中所述的那些相同。 [0052] 图5A示出了CD8 T细胞用表达E629‑38特异性TCR或E711‑19特异性TCR的慢病毒转导的示意图，并且通过与用连接抗原mRNA、连接抗原mRNA和信号2/3mRNA或单独的信号2/3mRNA挤压的PMBC共培养而激活。将细胞培养6天，接着用相应的E629‑38或E711‑19肽再刺激，并通过细胞内细胞因子染色(ICS)来测量细胞因子产生。 [0053] 图5B示出了与单独的连接抗原mRNA或信号2/3mRNA相比，在与用连接抗原mRNA和信号2/3mRNA一起挤压的PMBC共培养后，E6 TCR转导和E7 TCR转导的CD8+T细胞的激活。 [0054] 图6A和图6B分别示出了A*11限制性G12V和G12D TCR Jurkat应答细胞中的G12V和G12D特异性反应，所述细胞与用以下mRNA构建体中的一种挤压的PBMC一起培养：(1)编码以下的连接mRNA构建体：(a)KRASG12D和KRASG12V抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑ 25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)，(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“连接抗原+2/3”)；(2)仅编码KRASG12D和KRASG12V抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突 变)的连接mRNA构建体(“G12D‑G12V连接抗原”)；(3)仅编码CD86(即，信号2)、(c)膜结合IL‑ 2(即，信号3)和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)的连接mRNA构建体(“信号2/3”)；(4)编码以下的连接mRNA构建体：(a)包含G12V突变的单个约25aa的片段，(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“G12V+2/3”)；(5)编码以下的连接mRNA构建体：(a)包含G12D突变的单个约25aa的片段，(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“G12D+2/3”)；(6)编码以下的连接mRNA构建体：(a)与原生野生型KRAS的前1‑25aa重叠的约25aa的片段；(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“WT+2/3”)；(7)仅编码包含G12V突变的单个约 25aa的片段的非连接mRNA构建体(即，无信号2和3)(“G12V”)；(8)仅编码包含G12D突变的单个约25aa的片段的非连接mRNA构建体(即，无信号2和3)(“G12D”)；以及(9)仅编码与原生野生型KRAS的前1‑25aa重叠的约25aa的片段的非连接mRNA构建体(即，无信号2和3)(“野生 型”)。示出了G12V和G12D特异性反应，如通过发光表达所证实。在一些条形上方示出的特定值表示在与未用mRNA挤压的PBMC(“空”)一起培养的应答细胞中观察到的发光表达的倍数 变化。 [0055] 图7A和图7B分别示出了A*11限制性G12V和G12D TCR Jurkat应答细胞中的G12V和G12D特异性反应，所述细胞与用编码七种连接KRAS突变抗原的mRNA构建体挤压的PBMC一起 培养。所述mRNA构建体以两种剂量(250μg/mL和500μg/mL)之一使用并且包括以下：(1)仅编码KRASG12D、KRASG12V、KRASG12C、KRASG13D、KRASG12A、KRASG12R和KRASG12S抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)的连接mRNA构建体 (“7mut_v1”)；和(2)仅编码KRASG12S、KRASG12R、KRASG12A、KRASG13D、KRASG12C、KRASG12V和KRASG12D抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突 变)的连接mRNA构建体(“7mut_v2”)。示出了G12V和G12D特异性反应，如通过发光表达所证实。在一些条形上方示出的特定值表示在与未用mRNA挤压的PBMC(“空”)一起培养的应答细胞中观察到的发光表达的倍数变化。 [0056] 图8A和图8B分别示出了A*11限制性G12V和G12D TCR Jurkat应答细胞中的G12V和G12D特异性反应，所述细胞与用编码七种连接KRAS突变抗原的mRNA构建体和编码信号2 (即，CD86)和3(即，膜结合IL‑2和IL‑12)的其他mRNA构建体挤压的PBMC一起培养。具体mRNA构建体如下：(1)编码以下的连接mRNA构建体：(a)KRASG12D、KRASG12V、KRASG12C、KRASG13D、KRASG12A、KRASG12R和KRASG12S抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)(称为“KRAS 7mut_v1”)，(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“7mut_v1+信号2/3”)；(2)仅编码 KRASG12D、KRASGl2V、KRASG12C、KRASG13D、KRASG12A、KRASG12R和KRASG12S抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)的连接mRNA构建体 (“7mut_v1”)；(3)编码以下的连接mRNA构建体：(a)KRASG12S、KRASG12R、KRASG12A、KRASG13D、KRASG12C、KRASG12V和KRASG12D抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)(此处称为KRAS 7mut_v2)，(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“7mut_v2+信号2/3”)；(4)仅编码 KRASG12S、KRASG12R、KRASG12A、KRASG13D、KRASG12C、KRASG12V和KRASG12D抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)的连接mRNA构建体 (“mut_v2”)；以及(5)仅编码CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑ 12(即，信号3)的连接mRNA构建体(“单独的信号2/3”)。示出了G12V和G12D特异性反应，如通过发光表达所证实。在一些条形上方示出的特定值表示在与未用mRNA挤压的PBMC(“空”)一起培养的应答细胞中观察到的发光表达的倍数变化。 具体实施方式[0057] 本公开一般针对可用于诱导多种抗原在细胞中表达的分离的多核苷酸。更特别地，本文提供了至少包含编码第一抗原的第一编码区和编码第二抗原的第二编码区的多核 苷酸，其中第一抗原和第二抗原并不相同，并且其中第一编码区和第二编码区是连接的(例如，通过接头)。如本文所述和所证实，此类多核苷酸可在细胞内递送至细胞，其中细胞随后表达第一抗原和第二抗原两者。 [0058] 如本文进一步所述，本文所提供的示例性递送方法(即，挤压递送)具有本领域已知的其他非收缩介导的递送方法所不具备的某些独特的特性。例如，除了改进将各种类型 的有效载荷递送至细胞中的能力以外，本文所述的挤压处理方法对细胞产生的持久影响也 最小。与诸如电穿孔的传统递送方法相比，本公开的挤压处理方法保留了挤压细胞的结构 和功能完整性两者。与本文所提供的递送方法相反，电穿孔可以诱导基因表达的广泛并且 持久的改变，这可能导致细胞(例如，人类T细胞)的非特异性激活以及抗原刺激后的延迟增殖。使用本发明方法，对细胞的任何改变(例如，细胞膜中的扰动)都是暂时的，并且一旦将细胞从收缩部中移出，扰动就会被再密封。本公开示出了各个方面的非限制性实例。 [0059] I.一般技术 [0060] 本文所述或所引用的一些技术和程序一般是本领域技术人员充分理解的并且通常使用常规方法加以使用，例如以下所述的广泛使用的方法：Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook等人，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编，2003)；the series Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor编，1995)；Antibodies，A Laboratory Manual(Harlow和Lane编.，1988)；Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney，第6版，J.Wiley and Sons，2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编，Academic Press，1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，Plenum Press，1998)；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle、 J.B.Griffiths和D.G.Newell编，J.Wiley and Sons，1993‑8)；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，J.Wiley and Sons， 2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等人，2004)；Antibodies(P.Finch，1997)； Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.编，IRL Press，1988‑1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编，Oxford University Press， 2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编，Harwood Academic Publishers，1995)；以及Cancer：Principles and Practice of Oncology (V.T.DeVita等人编，J.B.Lippincott Company，2011)。 [0061] II.定义 [0062] 为了解释本说明书，以下定义将适用并且在适当的情况下，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。如果下文所阐述的任何定义与以引用的方式并入本文中的任 何文件相冲突，则应以本文所阐述的定义为准。在整个具体实施方式中阐述了额外定义。 [0063] 如本文所用，单数形式术语“一(a/an)”和“所述(the)”实体是指一个或多个所述实体，除非另有说明。因而，术语“一”(或“所述”)、“一个或多个(one or more)”和“至少一个(at least one)”在本文中可互换使用。 [0064] 应理解，本文所述的公开的方面和方面包括“包含”方面和方面、“由方面和方面组成”和“基本上由方面和方面组成”。还应理解，每当在本文中用语言“包含”描述方面和方面时，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似方面或方面。 [0065] 此外，当在本文中使用时，“和/或(and/or)”应被视为特定公开两种指定特征或组分中的每一者，无论有无其他特征或组分。因此，如本文中诸如“A和/或B”的短语中所用，术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所用，术语“和/或”意图涵盖以下方面中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。 [0066] 对于本文所述的所有组合物以及使用本文所述的组合物的所有方法，所述组合物可包含所列出的组分或步骤，或者可“基本上由所列出的组分或步骤组成”。当一种组合物被描述为“基本上由所列出的组分组成”时，所述组合物含有所列出的组分，并且还可以含有不会大体上影响所公开的方法的其他组分，但是不含除了明确列出的那些组分之外大体 上会影响所公开的方法的任何其他组分；或者，如果组合物确实含有除了所列出的那些之 外大体上会影响所公开的方法的额外组分，则所述组合物不含足以大体上影响所公开的方 法的浓度或量的所述额外组分。当一种方法被描述为“基本上由所列出的步骤组成”时，所述方法含有所列出的步骤，并且还可以含有大体上不会影响所公开的方法的其他步骤，但 是所述方法不含除了明确列出的那些步骤之外大体上会影响所公开的方法的任何其他步 骤。作为非限制性具体实例，当一种组合物被描述为“基本上由一种组分组成”时，所述组合物可以另外含有任何量的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂以及大体上不会影响所公 开的方法的其他此类组分。 [0067] 单位、前缀和符号是以它们的国际单位制(Système International de Unites，SI)接受的形式表示。数字范围包括限定范围的数字。本文所提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，所述方面可以通过参考本说明书通篇而获得。因此，通过参考本说明书通 篇，更详细地定义了下文紧接着定义的术语。 [0068] 术语“约”在本文中用于意指大概、约略地、大约或在区域中。当术语“约”与数字范围结合使用时，它通过延伸所阐述的数值上方和下方的边界来修改所述范围。通常，术语“约”可修改所陈述的值上方和下方的数值达例如10％的方差，向上或向下(更高或更低)。 [0069] 如本文所用，术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质(即，可在体外和/或体内诱导免疫反应)，例如蛋白质、肽或半抗原。本公开别处提供了抗原的非限制性实例。 [0070] 如本文所用，术语“与......相关(associated with)”是指两个或更多个实体或特性之间的密切关系。例如，当用于描述疾病或疾患时，术语“与......相关”是指当受试者表现出蛋白质和/或基因的异常表达(例如，KRAS突变体)时，受试者患上所述疾病或疾患的可能性增加。在一些方面，蛋白质和/或基因的异常表达导致疾病或疾患。在一些方面，异常表达未必引起疾病或疾患，但与疾病或疾患相关。 [0071] 如本文所用，术语“表位”是指蛋白质中可以被免疫系统(例如，抗体、B细胞和/或T细胞)识别并从而诱导免疫反应的部分。 [0072] 如本文所用，术语“连接(linked)”是指第一部分与第二部分(例如，第一编码区与第二编码区)之间形成的共价或非共价键。如本文进一步所述，在一些方面，第一部分和第二部分可以用接头连接。 [0073] 如本文所用，术语“收缩部”是指狭窄的通道。在一些方面，收缩部是微流体通道，例如含于微流体装置内的通道。在一些方面，收缩部是孔或者含于孔内。当收缩部是孔时，在一些方面，所述孔含于表面中。除非另有说明，否则术语收缩部是指微流体通道和孔两者，以及本领域中可用的其他合适的收缩部。因此，在适用的情况下，与微流体通道相关的公开内容也可以适用于孔和/或本领域中可用的其他合适的收缩部。同样，在适用的情况 下，与孔相关的公开内容同样可以适用于微流体通道和/或本领域中可用的其他合适的收 缩部。 [0074] 如本文所用，术语“孔”是指开口，包括但不限于材料内的洞、裂口、空腔、孔隙、断裂、间隙或穿孔。在一些方面，(如有说明)所述术语是指在微流体装置(例如本公开中所述的那些)的表面内的孔。在一些方面，(如有说明)孔可以指细胞壁和/或细胞膜中的孔。 [0075] 如本文所用，术语“膜”是指含有孔的选择性屏障或薄片。所述术语包括但不限于充当边界或衬里的柔韧片状结构。在一些方面，所述术语是指含有孔的表面或过滤器。这一术语不同于“细胞膜”，后者是指围绕细胞的细胞质的半透膜。 [0076] 如本文所用，术语“过滤器”是指允许选择性穿过孔的多孔物品。在一些方面，所述术语是指含有孔的表面或膜。 [0077] 如本文所用，术语“变形”和“畸形”(包括其衍生词)是指细胞中的物理变化。如本文所述，当细胞穿过收缩部(例如本公开的那些)时，由于约束性物理环境，它会受到各种力，包括但不限于引起细胞膜中的扰动的机械变形力和/或剪切力。如本文所用，细胞膜内的“扰动”是指细胞膜中的任何开口，它在正常稳态条件下(例如，未对细胞施加变形力)不存在。扰动可以包含洞、裂口、空腔、孔隙、孔、断裂、间隙、穿孔或它们的组合。 [0078] 如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，这一术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA‑RNA杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸酯基团(通常可在RNA或DNA中发现)，或修饰或取代的糖或磷酸酯基团。或者，多核苷酸的骨架可以包含合成亚基的聚合物(例如氨基磷酸酯)，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P‑NH2)或混合的氨基磷酸酯‑磷酸二酯寡聚物。此外，可以通过合成互补链并在适当条件下使链退 火，或者通过使用DNA聚合酶用适当引物从头合成互补链，从化学合成的单链多核苷酸产物获得双链多核苷酸。如本文所述，可使用本文所提供的挤压处理方法递送至细胞的核酸包 含RNA(例如，mRNA)。如本文所用，“RNA”包含自我扩增RNA(例如，自我扩增mRNA)和非自我扩增RNA(例如，非自我扩增mRNA)。如本文所用，术语“自我扩增RNA”是指可在宿主中复制的RNA分子，从而导致RNA和由所述RNA编码的蛋白质(例如，抗原)的量增加。如本文所用，术语“mRNA”是指编码至少一种多肽的任何多核苷酸(自我扩增或非自我扩增)。 [0079] 术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖全长蛋白和其片段。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，就本公开的目的来说，“多肽”是指一种蛋白质，所述蛋白质包括对原生序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(在性质上一般是保守的)，只要所述蛋白质维持所需的活性。这些修饰可能是有意的，如通过定点诱变，或可能是意外的，例如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增所致的错误。 [0080] 如本文所用，“免疫反应”是指脊椎动物体内针对外来剂或异常(例如癌细胞)的生物反应，所述反应保护生物体抵抗这些剂和由它们引起的疾病。免疫反应是由免疫系统的一种或多种细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞或中性粒细胞)和由这些细胞中的任一者或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，所述作用导致选择性靶向、结合于、损害、破坏和/或从脊椎动物体内消除侵入性病原体、受病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞，或(在自身免疫或病理性炎症的情况下)正常人类细胞或组织。免疫反应包括例如 激活或抑制T细胞，例如效应T细胞、Th细胞、CD4+细胞、CD8+T细胞或Treg细胞，或者激活或抑制免疫系统的任何其他细胞，例如NK细胞。因此，免疫反应可以包含体液免疫反应(例如，由B细胞介导)、细胞免疫反应(例如，由T细胞介导)或体液和细胞免疫反应两者。在一些方面，由本文所述的多核苷酸诱导的免疫反应包含T细胞反应。在一些方面，T细胞反应是由 CD8+T细胞介导的。在一些方面，T细胞反应是由CD4+T细胞介导的。在一些方面，T细胞反应是由CD8+和CD4+T细胞两者介导的。 [0081] III.多核苷酸 [0082] 本公开针对包含多个核苷酸序列(例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个)的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)，其中所述多个核苷酸序列中的每一个均编码抗原。编码抗原的核苷酸序列在本文中也称为“编码区”。如本文所证实和进一步所述，如与自然界中天然存在的相应的多核苷酸相比，本公开的多核苷酸有所不同(在结构和/或功能上)。 [0083] 编码区： [0084] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含单个开放阅读框(ORF)中来自多种蛋白质的编码区，其中所述编码区在自然界中并未天然地一起存在(例如，在单个多核苷酸内)。例如，在一些方面，本公开的多核苷酸包含具有第一编码区和第二编码区的单个ORF，其中第一编码区可以编码癌症抗原并且第二编码区可以编码不同的癌症抗原。例如，在一些方面，本公开的多核苷酸包含第一编码区和第二编码区，其中第一编码区可以编码病毒抗原并且 第二编码区可以编码不同的病毒抗原。例如，在一些方面，本公开的多核苷酸包含具有第一编码区和第二编码区的单个ORF，其中第一编码区可以编码癌症抗原(例如，KRAS抗原)并且第二编码区可以编码病毒抗原(例如，HPV、HIV或HBV)。本公开别处提供了可用于本公开的抗原的非限制性实例。对于本领域技术人员来说显而易见的是，此类多核苷酸可特别地用 于同时对抗多种不同的病原体和/或疾病。 [0085] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含编码区，其中编码区可以天然地一起存在于单个多核苷酸内(例如，同一ORF内)。例如，在一些方面，编码区包含第一编码区和第二编码区，其中第一编码区可以编码蛋白质(例如，病毒蛋白)的第一表位并且第二编码区可以 编码同一蛋白质的第二表位，其中所述蛋白质在自然界中由多核苷酸的单个ORF编码。当可用于本公开的多核苷酸包含此类编码区时，在一些方面，所述编码区在多核苷酸的ORF内以特定顺序排列，其中所述特定顺序在自然界中并未天然地存在。 [0086] 为了帮助说明，自然界中存在的示例性多核苷酸包含具有第一编码区、第二编码区和第三编码区的单个ORF，其中第一、第二和第三编码区排列如下(从5′至3′)：(第一编码区)、(第二编码区)和(第三编码区)。当本文所述的多核苷酸包含此类编码区时，在一些方面，第一编码区、第二编码区和第三编码区在多核苷酸的单个ORF内以任何下列顺序排列 (从5′至3′)： [0087] (a)(第一编码区)、(第三编码区)和(第二编码区)； [0088] (b)(第二编码区)、(第一编码区)和(第三编码区)； [0089] (c)(第二编码区)、(第三编码区)和(第一编码区)； [0090] (d)(第三编码区)、(第一编码区)和(第二编码区)；或 [0091] (e)(第三编码区)、(第二编码区)和(第一编码区)。 [0092] 本公开通篇提供了所述多核苷酸的额外结构特征。例如，在一些方面，所描述的多核苷酸包含具有多个编码区(例如，第一编码区和第二编码区)的单个ORF，其中一个或多个编码区编码全长蛋白。为了说明，在一些方面，多核苷酸包含具有第一编码区和第二编码区的单个ORF，其中第一编码区编码HPV E6蛋白(例如，HPV‑16或HPV‑18)的全长蛋白，并且第二编码区编码HPV E7蛋白(例如，HPV‑16或HPV‑18)的全长蛋白。然而，如本文所证实，编码区没有必要编码全长蛋白(或其大片段)来发挥治疗效果(例如，诱导针对所述蛋白质的免疫反应)。因此，本文所述的多核苷酸包含含有多个编码区的单个ORF，其中由所述多个编码区编码的一个或多个抗原包含较大蛋白质的肽片段。在一些方面，如与相应的全长片段相 比，肽片段的长度小于约99％、小于约98％、小于约97％、小于约96％、小于约95％、小于约 90％、小于约85％、小于约80％、小于约75％、小于约70％、小于约65％、小于约60％、小于约 55％、小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约 20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％。在一些方面，由所述多个编码区中的一个或多个编码的抗原是小于约200个氨基酸长。在一些方面，抗原是小于约150个氨基酸长。在一些方面，抗原是小于约100个氨基酸长。在一些方面，抗原是小于约50个氨基酸长。在一些方面，由本文所述的多核苷酸的单个ORF中存在的多个编码区中的一个或多个编码的抗原是 约5个氨基酸至约200个氨基酸长。在一些方面，抗原是约5个氨基酸至约150个氨基酸长。在一些方面，抗原是约5个氨基酸至约100个氨基酸长。在一些方面，抗原是约5个氨基酸至约 50个氨基酸长。在一些方面，抗原是约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸、约20个氨基酸、约21个氨基酸、约22个氨基酸、约23个氨基酸、约24个氨基酸、约25个氨基酸、约26个氨基酸、约27个氨基酸、约28个氨基酸、约29个氨基酸、约30个氨基酸、约31个氨基酸、约32个氨基酸、约33个氨基酸、约34个氨基酸、约35个氨基酸、约36个氨基酸、约37个氨基酸、约 38个氨基酸、约39个氨基酸、约40个氨基酸、约41个氨基酸、约42个氨基酸、约43个氨基酸、约44个氨基酸、约45个氨基酸、约46个氨基酸、约47个氨基酸、约48个氨基酸、约49个氨基酸或约50个氨基酸长。在一些方面，抗原是约10个至约50个氨基酸长。在一些方面，抗原是约 10个至约40个氨基酸长。在一些方面，抗原是约10个至约30个氨基酸长。在一些方面，抗原是约10个至约20个氨基酸长。在一些方面，抗原是约20个至约50个氨基酸长。在一些方面，抗原是约20个至约40个氨基酸长。在一些方面，抗原是约20个至约30个氨基酸长。在一些方面，抗原是约30个至约50个氨基酸长。在一些方面，抗原是约30个至40个氨基酸长。在一些方面，抗原是约40个至约50个氨基酸长。在一些方面，抗原是约8个至约11个氨基酸长。在一些方面，抗原是约10个至约17个氨基酸长。在一些方面，抗原是约10个氨基酸长。在一些方面，抗原是约15个氨基酸长。在一些方面，抗原是约20个氨基酸长。在一些方面，抗原是约25个氨基酸长。在一些方面，抗原是约30个氨基酸长。在一些方面，抗原是约35个氨基酸长。在一些方面，抗原是约40个氨基酸长。在一些方面，抗原是约45个氨基酸长。在一些方面，抗原是约50个氨基酸长。在一些方面，抗原是约8个氨基酸长。 [0093] 不受任何一种理论的束缚，由于抗原的大小，本文所述的多核苷酸可以被设计成包含许多编码区。在一些方面，所描述的多核苷酸包含单个ORF，所述单个ORF具有约两个编码区、约三个编码区、约四个编码区、约五个编码区、约六个编码区、约七个编码区、约八个编码区、约九个编码区、约10个编码区、约11个编码区、约12个编码区、约13个编码区、约14个编码区、约15个编码区、约16个编码区、约17个编码区、约18个编码区、约19个编码区、约 20个编码区、约21个编码区、约22个编码区、约23个编码区、约24个编码区、约25个编码区、约26个编码区、约27个编码区、约28个编码区、约29个编码区或约30个编码区。如本文所述，在一些方面，两个或更多个编码区是连接的。在一些方面，每个编码区都是连接的。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有两个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有三个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有四个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有五个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有六个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有七个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有八个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有九个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有十个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有11个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有12个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有13个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有14个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有15个连接的编码区的单个ORF。 在一些方面，多核苷酸包含具有16个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有17个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有18个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有19个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有20个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有21个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有22个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有23个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有24个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有25个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有26个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有27个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有28个连接的编码区的单个ORF。 在一些方面，多核苷酸包含具有29个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，多核苷酸包含具有30个连接的编码区的单个ORF。在一些方面，本文所述的多核苷酸的单个ORF中存在的 每个编码区编码不同的抗原。在一些方面，至少两个编码区编码不同的抗原。 [0094] 在一些方面，本文所述的任何多核苷酸均可以组合使用。例如，在一些方面，组合物可以包括第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第一多核苷酸包含具有多个(例如，约10个)连接的编码区的单个ORF，并且第二多核苷酸包含具有多个(例如，约10个)连接的编码 区的单个ORF。在一些方面，第一多核苷酸的多个连接的编码区和第二多核苷酸的多个连接的编码区编码不同的抗原。为了说明，在一些方面，第一多核苷酸的多个编码区可以编码肿瘤抗原(例如，新抗原)，并且第二多核苷酸的多个编码区可以编码非自身抗原(例如，来源于病毒)。此类第一和第二多核苷酸可以作为单一组合物组合施用于受试者。在一些方面，第一和第二多核苷酸可以组合但作为单独的组合物使用。 [0095] 因此，本公开的一些方面涉及包含单个ORF的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)，所述ORF具有编码第一抗原的第一编码区、编码第二抗原的第二编码区和编码第三抗原的 第三编码区，并且其中第一编码区、第二编码区和第三编码区是连接的。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个并不相同。在一些方面，所述编码的连接抗原中的每一个都 是不同的。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个是相同的。在一些方面，第一编码区、第二编码区以及第三编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序 相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。在一些方面，多核苷酸的单个ORF内的编码区的特定顺序可能帮助改进多核苷酸的一种或多种特性(例 如，当递送至细胞时改进翻译)。例如，为了帮助说明，在一些方面，第一多核苷酸包含单个ORF，所述ORF包含编码抗原的第一编码区、编码抗原的第二编码区和编码抗原的第三编码 区，其中第一、第二和第三编码区在ORF内排列如下(从5′至3′)：(第一编码区)‑(第二编码区)‑(第三编码区)。在一些方面，第二多核苷酸包含单个ORF，所述ORF具有与第一多核苷酸相同的第一、第二和第三编码区，但是其中第一、第二和第三编码区在ORF内排列如下(从5′至3′)：(第一编码区)‑(第三编码区)‑(第二编码区)。在一些方面，第三多核苷酸包含单个ORF，所述ORF具有相同的第一、第二和第三编码区，但是其中所述编码区排列如下(从5′至 3′)：(第二编码区)‑(第三编码区)‑(第一编码区)。对于第一、第二和第三多核苷酸中的每一个，三个编码区可以用接头和/或不用接头连接(例如，通过天然肽键直接缀合)。不受任何一种理论的束缚，在一些方面，第一、第二和第三多核苷酸中的每一个可能产生不同的治疗效果。例如，在一些方面，当将第一、第二和/或多核苷酸递送至细胞中(例如，使用本文所述的挤压处理)时，它们可以导致不同的翻译效率(例如，与被修饰成包含第一或第二多核 苷酸的细胞相比，被修饰成包含第二多核苷酸的细胞可能具有更高的编码蛋白质表达)。因此，在一些方面，如与具有相同编码区但以不同顺序排列的相应的多核苷酸相比，本文所述的多核苷酸可以具有改进的效果(例如，更好的翻译)。 [0096] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含单个ORF，所述单个ORF具有编码第一抗原的第一编码区、编码第二抗原的第二编码区、编码第三抗原的第三编码区以及编码第四抗 原的第四编码区，并且其中第一编码区、第二编码区、第三编码区以及第四编码区是连接 的。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区以及第四编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然 存在的相应多核苷酸。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个并不相同。在一些方面，所述编码的连接抗原中的每一个都是不同的。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个是相同的。 [0097] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含单个ORF，所述单个ORF具有编码第一抗原的第一编码区、编码第二抗原的第二编码区、编码第三抗原的第三编码区、编码第四抗原的第四编码区以及编码第五抗原的第五编码区，并且其中第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区以及第五编码区是连接的。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区以及第五编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相 比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个并不相同。在一些方面，所述编码的连接抗原中的每一个 都是不同的。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个是相同的。 [0098] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含单个ORF，所述单个ORF具有编码第一抗原的第一编码区、编码第二抗原的第二编码区、编码第三抗原的第三编码区、编码第四抗原的第四编码区、编码第五抗原的第五编码区以及编码第六抗原的第六编码区，并且其中第一 编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区以及第六编码区是连接的。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区以及第六编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个并 不相同。在一些方面，所述编码的连接抗原中的每一个都是不同的。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个是相同的。 [0099] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含单个ORF，所述单个ORF具有编码第一抗原的第一编码区、编码第二抗原的第二编码区、编码第三抗原的第三编码区、编码第四抗原的第四编码区、编码第五抗原的第五编码区、编码第六抗原的第六编码区以及编码第七抗原 的第七编码区，并且其中第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区、第六编码区以及第七编码区是连接的。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区、第六编码区以及第七编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核 苷酸。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个并不相同。在一些方面，所述编码的连接抗原中的每一个都是不同的。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个是相同 的。 [0100] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含单个ORF，所述单个ORF具有编码第一抗原的第一编码区、编码第二抗原的第二编码区、编码第三抗原的第三编码区、编码第四抗原的第四编码区、编码第五抗原的第五编码区、编码第六抗原的第六编码区、编码第七抗原的第七编码区以及编码第八抗原的第八编码区，并且其中第一编码区、第二编码区、第三编码 区、第四编码区、第五编码区、第六编码区、第七编码区以及第八编码区是连接的。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区、第六编码区、第七编码区以及第八编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序 是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个并不相同。在一些方面，所述编码的连接抗原中的每一个都是不同的。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个是相同的。 [0101] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含单个ORF，所述单个ORF具有编码第一抗原的第一编码区、编码第二抗原的第二编码区、编码第三抗原的第三编码区、编码第四抗原的第四编码区、编码第五抗原的第五编码区、编码第六抗原的第六编码区、编码第七抗原的第七编码区、编码第八抗原的第八编码区以及编码第九抗原的第九编码区，并且其中第一编 码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区、第六编码区、第七编码区、第八编码区以及第九编码区是连接的。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区、第六编码区、第七编码区、第八编码区以及第九编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天 然存在的相应多核苷酸。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个并不相同。在一些方面，所述编码的连接抗原中的每一个都是不同的。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个是相同的。 [0102] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含单个ORF，所述单个ORF具有编码第一抗原的第一编码区、编码第二抗原的第二编码区、编码第三抗原的第三编码区、编码第四抗原的第四编码区、编码第五抗原的第五编码区、编码第六抗原的第六编码区、编码第七抗原的第七编码区、编码第八抗原的第八编码区、编码第九抗原的第九编码区以及编码第十抗原的 第十编码区，并且其中第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区、第六编码区、第七编码区、第八编码区、第九编码区以及第十编码区是连接的。在一些方面，第一编码区、第二编码区、第三编码区、第四编码区、第五编码区、第六编码区、第七编码区、第八编码区、第九编码区以及第十编码区按顺序排列，其中如与参考多核苷酸中存在的相应 顺序相比，所述顺序是不同的，其中参考多核苷酸包含天然存在的相应多核苷酸。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个并不相同。在一些方面，所述编码的连接抗原中的每一个都是不同的。在一些方面，所述编码的连接抗原中的至少两个是相同的。 [0103] 抗原： [0104] 如本文所述，本文所述的多核苷酸包含具有来自多种蛋白质的编码区的单个ORF，其中所述编码区编码抗原。在一些方面，所述抗原可以包含表位。在一些方面，所述抗原可以包含免疫原性表位。因此，在一些方面，所述多个编码区中的一个或多个可以编码单个较大蛋白质的独特的(即，不同的)表位，其中所述单个较大蛋白质包含多个独特的表位。例 如，在一些方面，本文所述的多核苷酸包含至少具有第一编码区和第二编码区的单个ORF，并且其中第一编码区和第二编码区编码同一蛋白质的独特的表位。在一些方面，所述多个 编码区中的一个或多个可以编码来自不同蛋白质的表位。例如，在一些方面，本公开的多核苷酸包含至少具有第一编码区和第二编码区的单个ORF，其中第一编码区编码第一蛋白质 的表位，其中第二编码区编码第二蛋白质的表位，并且其中第一蛋白质和第二蛋白质并不 相同(例如，分别为KRAS蛋白和HPV蛋白)。在一些方面，抗原包含野生型蛋白质。在一些方面，抗原包含来源于野生型蛋白质的肽片段。在一些方面，抗原包含如与相应野生型蛋白质(本文中也称为“突变蛋白质”)(例如，KRAS突变体)相比具有至少一个或多个氨基酸修饰 (例如，取代、缺失、添加或插入缺失)的蛋白质。在一些方面，抗原包含来源于此类突变蛋白质的肽片段。 [0105] 可用于本公开的抗原的非限制性实例包括癌症抗原、非自身抗原、与肿瘤相关的自身抗原、疾病相关抗原或它们的组合。 [0106] 在一些方面，抗原包含癌症抗原。如本文所用，术语“癌症抗原”和“肿瘤抗原”(以及其衍生词)可以互换使用，并且是指特定的过度增殖性病症(例如癌症)所共有的任何抗原。癌症抗原的非限制性实例包括：鸟苷酸环化酶C(GC‑C)、表皮生长因子受体(EGFR或 erbB‑1)、人表皮生长因子受体2(HER2或erbB2)、erbB‑3、erbB‑4、MUC‑1、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、间皮素(MSLN)、叶酸受体1(FOLR1)、CD4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CXCR5、c‑Met、HERV包膜蛋白、eriostin、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFRvIII、EGP2、EGP40、IGFr、L1CAM、AXL、组织因子(TF)、CD74、EpCAM、EphA2、MRP3钙粘蛋白19(CDH19)、表皮生长因子2(HER2)、5T4、8H9、αvβ6整合素、BCMA、B7‑H3、B7‑H6、CAIX、CA9、FAP、FBP、胎儿AchR、FRcc、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑1(GPC1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑2(GPC2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑ 3(GPC3)、MAGE1、MAGEA10、NY‑ESO‑1、IL‑13Rcc2、Lewis‑Y、KDR、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、PRAME、PSC1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR2、SP17、生存素、TAG72、TEM、癌胚抗原、HMW‑MAA、VEGF、CLDN18.2、新抗原、KRAS或它们的组合。在一些方面，癌症抗原包含KRAS。 [0107] Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)是鸟苷‑5‑三磷酸酶(GTPase)蛋白超家族的成员，所述超家族还包括NRAS和HRAS。这一超家族的成员的主要作用是将信号从 上游细胞表面受体(例如，EGFR、FGFR和ERBB2‑4)传输至下游增殖和存活途径(例如RAF‑ MEK‑ERK、PI3K‑AKT‑mTOR和RALGDS‑RA)。Adderley，H.等人，EBioMedicine 41：711‑716(2019)。KRAS突变与多种类型的癌症有关，包括超过90％的胰腺癌、35‑45％的结直肠癌和大约25％的肺癌。Zeitouni，D.等人，Cancers 8(4)：45(2016)；Tan，C.等人，World J Gastroenterol 18(37)：5171‑5180(2012)；和Roman，M.等人，Molecular Cancer 17：33(2018)。KRAS突变也与非常差的预后有关(例如，胰腺癌的5年生存率为约9％)，并且许多具有KRAS突变的患者对各种癌症疗法具有抗性。Del Re，M.等人，Oncotarget 9(5)：6630‑ 6643(2017)。因此，对于与KRAS突变相关的癌症，需要新的并且改进的治疗选项。 [0108] KRAS在本领域中被称为多种名称。此类名称包括：KRAS原癌基因GTPase；V‑Ki‑Ras2 Kirsten大鼠肉瘤2病毒致癌基因同源物；GTPase KRas；C‑Ki‑Ras；K‑Ras 2；KRAS2； RASK2；V‑Ki‑Ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物；Kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因；细胞转化原癌基因；细胞C‑Ki‑Ras2原癌基因；转化蛋白P21；PR310C‑K‑Ras致癌基因；C‑Kirsten‑Ras蛋白；K‑Ras P21蛋白；和致癌基因KRAS2。 [0109] 人类野生型KRAS蛋白(P01116)有两种同种型，是由可变剪接产生的。同种型2A(登录号：P01116‑1；SEQ ID NO：16)是规范序列。它也被称为K‑Ras4A。同种型2B(登录号： P01116‑2；也称为K‑Ras4B；SEQ ID NO：17)与所述规范序列的不同之处如下：(i)151‑153： RVE→GVD；和(ii)165‑189：QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM→KHKEKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM。 [0110] 人类KRAS基因产物的天然变体是已知的。例如，人类KRAS蛋白的天然变体可以含有一个或多个选自以下的氨基酸取代：K5E、K5N、G10GG、G10V、G12A、G12C、G12D、G12F、G12I、G12L、G12R、G12S、G12V、G13C、G13D、G13E、G13R、G13V、V14I、L19F、T20M、Q22E、Q22H、Q22K、Q22R、Q25H、N26Y、F28L、E31K、D33E、P34L、P34Q、P34R、I36M、R41K、D57N、T58I、A59T、G60D、G60R、G60S、G60V、Q61A、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P、Q61R、E63K、S65N、R68S、Y71H、T74A、L79I、R97I、Q99E、M111L、K117N、K117R、D119G、S122F、T144P、A146P、A146T、A146V、K147E、K147T、R149K、L159S、I163S、R164Q、I183N、I84M或它们的组合。KRAS蛋白同种型2B所特有的天然变体含有一个或多个选自以下的氨基酸取代：V152G、D153V、F156I、F156L或它们的组合。 [0111] 从以上公开内容明显可见，在一些方面，本文所述的多核苷酸的一个或多个编码区编码KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含如与相应野生型KRAS抗原的氨基酸序列相比在序 列上不同的氨基酸序列。此类KRAS抗原在本文中也被称为“KRAS突变体”或“KRAS变体”。在一些方面，如与相应野生型KRAS抗原的氨基酸序列相比，KRAS突变体的氨基酸序列具有小 于约99％、小于约98％、小于约97％、小于约96％、小于约95％、小于约94％、小于约93％、小于约92％、小于约91％、小于约90％、小于约85％或小于约90％的序列同一性。在一些方面，KRAS突变体的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸取代，其中所述一个或多个氨基酸取代与 癌症相关。在一些方面，KRAS突变体的氨基酸序列包含本文所述的任何氨基酸取代。例如，在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的，其中所述多个编码区中的至少一个编码KRAS抗原，其中所述KRAS抗原的氨基酸序 列包含G12V氨基酸取代。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个 ORF，其中所述多个编码区是连接的，其中所述多个编码区中的至少一个编码KRAS抗原，其中所述KRAS抗原的氨基酸序列包含G12D氨基酸取代。在一些方面，本文所述的多核苷酸包 含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的，其中所述多个编码区中的至少一个编码KRAS抗原，并且其中所述KRAS抗原的氨基酸序列包含G12C氨基酸取代。在一些 方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接 的，其中所述多个编码区中的至少一个编码KRAS抗原，并且其中所述KRAS抗原的氨基酸序 列包含G13D氨基酸取代。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个 ORF，其中所述多个编码区是连接的，其中所述多个编码区中的至少一个编码KRAS抗原，并且其中所述KRAS抗原的氨基酸序列包含G12A氨基酸取代。在一些方面，本文所述的多核苷 酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的，其中所述多个编码区中的至少一个编码KRAS抗原，并且其中所述KRAS抗原的氨基酸序列包含G12R氨基酸取代。在 一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的，其中所述多个编码区中的至少一个编码KRAS抗原，并且其中所述KRAS抗原的氨基酸 序列包含G12S氨基酸取代。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个 ORF，其中所述多个编码区是连接的，其中所述多个编码区中的至少一个编码KRAS抗原，并 1‑16 2‑19 2‑22 2 且其中所述KRAS抗原的氨基酸序列包含以下一者或多者：G12D 、G12D 、G12D 、G12D ‑29 1‑16 2‑19 3‑17 3‑42 、G12V 、G12V 、G12V 或G12V 抗原。 [0112] 在一些方面，所述多个编码区中的至少一个编码KRAS抗原，其中如与SEQ ID NO：1‑15中任一者所示的氨基酸序列相比，所述KRAS抗原的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约99％的序列同一性。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS 抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区 的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：3中所示 的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编 码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS 抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区 的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编 码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个 ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含 SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码 至少一种KRAS抗原，其中所述KRAS抗原包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。 [0113] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含单个ORF，所述单个ORF至少具有编码第一KRAS抗原的第一编码区和编码第二KRAS抗原的第二编码区，其中第一编码区和第二编码区 是连接的，其中第一KRAS抗原的氨基酸序列包含G12V氨基酸取代，并且第二KRAS抗原的氨 基酸序列包含G12D氨基酸取代。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的 单个ORF，其中所述多个编码区是连接的，其中所述多个编码区中的一个或多个编码KRAS突变抗原(例如，包含G12D和/或G12V取代)，并且其中所述多个编码区中的一个或多个编码额外肿瘤抗原(例如，NY‑ESO‑1和/或MAGEA10)。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含具有多个编码区的单个ORF，其中所述多个编码区是连接的并且编码多种KRAS抗原。在一些方面，所述多种KRAS抗原包含以下氨基酸取代中的一种或多种：G12A、G12C、G12D、G12R、G12S G12V和G13D。如本文所述，在一些方面，所述多个编码区在本文所述的多核苷酸内以特定顺序排列。 [0114] 因此，在一些方面，本文所述的多核苷酸包含以下编码区，所述编码区是连接的并且按以下顺序排列(从5′至3′)：(1)编码KRAS G12D突变体(即，具有G12D氨基酸取代)的第一编码区，(2)编码KRAS G12V突变体的第二编码区，(3)编码KRAS G12C突变体的第三编码区，(4)编码KRAS G13D突变体的第四编码区，(5)编码KRAS G12A突变体的第五编码区，(6)编码KRAS G12R突变体的第六编码区，以及(7)编码KRAS G12S突变体的第七编码区。在一些方面，此类多核苷酸包含额外连接的编码区(例如，编码共刺激分子和/或细胞因子)。例如，在一些方面，本公开的多核苷酸包含多个编码区，所述编码区编码：(1)多种KRAS突变抗原，(2)共刺激分子(例如，CD86)，和(3)一种或多种细胞因子(例如，膜结合IL‑2和膜结合IL‑ 12)，其中包含以下突变的多种KRAS突变抗原排列如下(从5′至3′)：G12D、G12V、G12C、G13D、G12A、G12R和G12S。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含以下编码区，所述编码区是连接的并且按以下顺序排列(从5′至3′)：(1)编码KRAS G12S突变体的第一编码区，(2)编码KRAS G12R突变体的第二编码区，(3)编码KRAS G12A突变体的第三编码区，(4)编码KRAS G13D突 变体的第四编码区，(5)编码KRAS G12C突变体的第五编码区，(6)编码KRAS G12V突变体的 第六编码区，以及(7)编码KRAS G12D突变体的第七编码区。在一些方面，此类多核苷酸包含额外连接的编码区(例如，编码共刺激分子和/或细胞因子)。例如，在一些方面，本公开的多核苷酸包含多个编码区，所述编码区编码：(1)多种KRAS突变抗原，(2)共刺激分子(例如，CD86)，和(3)一种或多种细胞因子(例如，膜结合IL‑2和膜结合IL‑12)，其中包含以下突变的多种KRAS突变抗原排列如下(从5′至3′)：G12S、G12R、G21A、G13D、G12C、G12V和G12D。如本文所证实(参见例如实施例6‑8)，当使用此类多核苷酸挤压细胞(例如，PBMC)时，每种编码抗原均可在PBMC中表达，使得PBMC能够诱导识别编码抗原的T细胞的激活。 [0115] 在一些方面，抗原包含自身抗原。例如，在一些方面，抗原包含在某些肿瘤中过表达的自身抗原。在一些方面，抗原包含非自身抗原。如本文所用，术语“非自身抗原”是指来源于病原体的任何抗原物质(即，当存在于体内时能够诱导免疫反应)，所述病原体包括但不限于病毒、真菌、原生动物或它们的组合。非自身抗原的非限制性实例包括来源于以下一种或多种的抗原：人类γ疱疹病毒4(即，EB病毒(Epstein Barr virus，EBV))、甲型流感病毒、乙型流感病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、HIV(例如，HIV‑2)、冠状病毒(例如，COVID‑19、MERS‑CoV和SARS CoV)、丝状病毒(例如，马尔堡和埃博拉)、化脓性链球菌、肺炎链球菌、疟原虫种(例如，间日疟原虫和恶性疟原虫)、基孔肯雅病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV1)、人类疱疹病毒8(HHV8)、梅克尔细胞多瘤病毒(MCV)、布尼亚病毒(例如，汉坦病 毒)、沙粒病毒(例如，LCMV和拉沙病毒)、黄病毒(例如，登革热、寨卡、日本脑炎、西尼罗和黄热病)、肠道病毒(例如，脊髓灰质炎)、星状病毒(例如，胃肠炎)、弹状病毒科(例如，狂犬病)、伯氏疏螺旋体和马约氏疏螺旋体(例如，莱姆病)、单纯疱疹病毒2(HSV‑2)、克雷伯氏菌属、铜绿假单胞菌、肠球菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、放线菌属、凝固酶阴性葡萄球菌 (CoNS)、支原体属、腺病毒、腺相关病毒(AAV)或它们的组合。 [0116] 因此，在一些方面，本文所述的多核苷酸的一个或多个编码区编码非自身抗原。例如，在一些方面，本文所述的多核苷酸包含多个编码区，其中所述多个编码区是连接的，并且其中所述多个编码区中的一个或多个编码非自身抗原。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含多个编码区，其中所述多个编码区是连接的，并且其中所述多个编码区中的一个或 多个编码HPV抗原(例如，E7和/或E6蛋白)。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含多个编码区，其中所述多个编码区是连接的，并且其中所述多个编码区中的一个或多个编码HIV抗 原。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含多个编码区，其中所述多个编码区是连接的，并且其中所述多个编码区中的一个或多个编码HBV抗原。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含多个编码区，其中所述多个编码区是连接的，并且其中所述多个编码区中的一个或多个 编码HSV抗原(例如，HSV gD)。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含多个编码区，其中所述多个编码区是连接的，并且其中所述多个编码区中的一个或多个编码流感抗原(例如，M1蛋白)。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含多个编码区，其中所述多个编码区是连接的，并且其中所述多个编码区中的一个或多个编码冠状病毒抗原(例如，S蛋白)。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含多个编码区，其中所述多个编码区是连接的，并且其中所述多个编 码区编码多种非自身抗原(例如，HPV抗原、EBV抗原、HSV抗原、流感抗原、冠状病毒抗原和它们的组合)。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含多个编码区，其中所述多个编码区是连接的，并且其中所述多个编码区中的一个或多个编码至少一种癌症抗原(例如，KRAS突变 体、NY‑ESO‑1、MAGE A10或它们的组合)并且所述多个编码区中的一个或多个编码至少一种非自身抗原(例如，HPV抗原、EBV抗原、HSV抗原、流感抗原、冠状病毒抗原和它们的组合)。 [0117] 接头 [0118] 如本文所述，本文所述的多核苷酸包含多个编码区，其中所述多个编码区是连接的。任何连接两个部分(例如，第一编码区和第二编码区)的有用方法均可用于本公开。在一些方面，所述多个编码区用接头连接。在一些方面，所述多个编码区不用接头即可连接。例如，在一些方面，第一编码区和第二编码区可以在ORF内排列，使得它们彼此紧邻，使得在翻译时，由第一编码区编码的蛋白质和由第二编码区编码的蛋白质将通过传统的肽酰胺键连 接。如本文所用，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或非多肽(例如，烷基链)。在一些方面，两个或更多个接头可以串联连接。当存在多个接头时，所述接头中的每一个可以是相同或不同的。一般来说，接头提供灵活性或防止/改善空间位阻。接头通常不会裂解；然而，在某些方面，此类裂解可以是所需的。因此，在一些方面，接头可以包含一个或多个蛋白酶可裂解位点，所述位点可位于接头序列内或接头序列的任一端的接头侧 翼。因此，在一些方面，可用于本公开的接头包含可裂解接头。 [0119] 如本文所用，术语“可裂解接头”是指包含裂解位点的接头，使得在表达时可以选择性地裂解，产生两种或更多种产物。在一些方面，接头选自P2A接头、T2A接头、F2A接头、E2A接头、弗林蛋白酶裂解位点或它们的任何组合(参见下表1)。在一些方面，接头还包含GSG接头序列。在一些方面，可用于本公开的接头包含内部核糖体进入位点(IRES)，使得在翻译过程中产生由第一和第二基因编码的单独的多肽。例如，WO 2020/223625A1和US2019/ 0276801A1提供了对可用于本公开的接头的额外描述，所述文献中的每一者均以引用的方 式整体并入本文中。 [0120] 表1：接头序列 [0121]P2A ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：18) T2A EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：19) F2A VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：20) E2A QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：21) 弗林蛋白酶裂解位点 RAKR(SEQ ID NO：22) [0122] 在一些方面，接头是肽接头。在一些方面，肽接头包含甘氨酸/丝氨酸接头。在一些方面，肽接头是根据式[(Gly)n‑Ser]m(SEQ ID NO：23)的甘氨酸/丝氨酸接头，其中n是1至100的任何整数并且m是1至100的任何整数。在一些方面，所述甘氨酸/丝氨酸接头是根据式[(Gly)x‑(Ser)y]z(SEQ ID NO：24)，其中x是1至4的整数，y是0或1，并且z是1至50的整数。 在一些方面，肽接头包含序列Gn(SEQ ID NO：25)，其中n可以是1至100的整数。在一些方面，肽接头可以包含序列(GlyAla)n(SEQ ID NO：26)，其中n是1与100之间的整数。在一些方面，肽接头可以包含序列(GlyGlySer)n(SEQ ID NO：27)，其中n是1与100之间的整数。在一些方面，肽接头包含序列GGGG(SEQ ID NO：28)。 [0123] 在一些方面，肽接头包含序列(GGGS)n(SEQ ID NO：29)。在某些方面，肽接头包含序列(GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO：30)。在此类方面，n可以是1至100的整数。在一些方面，n可以是1至20的整数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些方面，n是1至100的整数。在一些方面，肽接头是(G4S)3(SEQ ID NO：31)。 [0124] 在一些方面，肽接头包含EAAAK接头。在一些方面，EAAAK接头包含序列(EAAAK)n，其中n是1至10之间的整数(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些方面，肽接头是(EAAAK)3(SEQ ID NO：32)。 [0125] 在一些方面，肽接头是合成的，即，非天然存在的。一方面，肽接头包括肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，其包含将第一线性氨基酸序列连接或基因融合至它在自然界中并未天然连接或基因融合的第二线性氨基酸序列的氨基酸序列。例如，一方面，肽接头可以包含非天然存在的多肽，其为天然存在的多肽的修饰形式(例如包含突变，诸如添 加、取代或缺失)。 [0126] 在一些方面，肽接头可以包含非天然存在的氨基酸。在其他方面，肽接头可以包含存在于在自然界中不存在的线性序列中的天然存在的氨基酸。在其他方面，肽接头可以包含天然存在的多肽序列。 [0127] 在一些方面，接头包含非肽接头。在其他方面，接头由非肽接头组成。在一些方面，非肽接头可以是例如马来酰亚胺基己酰基(MC)、马来酰亚胺基丙酰基(MP)、甲氧基聚乙二醇(MPEG)、4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)‑环己烷‑1‑甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4‑(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯 (SMPB)、(4‑碘乙酰基)氨基苯甲酸N‑琥珀酰亚胺酯(SIAB)、6‑[3‑(2‑吡啶基二硫代)‑丙酰胺]己酸琥珀酰亚胺酯(LC‑SPDP)、4‑琥珀酰亚胺基氧基羰基‑α‑甲基‑α‑(2‑吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)等(参见例如美国专利号7,375,078，其以引用的方式整体并入本文中)。 [0128] 其他组分： [0129] 除了上述任何特征以外，可用于本公开的多核苷酸还可以包含一种或多种额外组分。在一些方面，这些额外组分可以帮助多核苷酸发挥其治疗效果(例如，允许改进翻译和/或增加多核苷酸的稳定性)。可以包括在本文所述的多核苷酸中的额外组分的非限制性实 例包括：内部核糖体进入位点(IRES)、内含子序列、同源臂启动子、增强子、UTR、编码信号肽的序列、翻译起始序列、连接核苷的3′加尾区、5′帽、编码2A核糖体跳跃肽的序列或它们的任何组合。 [0130] 非翻译区(UTR) [0131] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包含一个或多个UTR序列(例如，5′‑UTR和/或3′‑UTR)。如本文所用，术语“非翻译区”或“UTR”是指基因中被转录但未被翻译的区域。“5'‑UTR”从转录起始位点开始并且延续至起始密码子，但不包括起始密码子；而“3′‑UTR”则紧接在终止密码子之后开始并且延续至转录终止信号。越来越多的证据表明，UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥着调节作用。UTR的调节特征可以并入本文所述的多核苷酸中，以增强分子的稳定性。也可以并入特定特征，以确保转录本在被错误引导至不需要的器官部 位时实现受控下调。 [0132] 在一些方面，可用于本公开的UTR包含存在于特定细胞、组织和/或器官中大量表达的基因中的那些。通过包括此类额外UTR，在一些方面，本公开的多核苷酸可以优先在特定细胞、组织和/或器官中表达，例如，当施用于受试者时。例如，另外引入在肝脏中表达的mRNA(例如，白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的UTR(例如，5‑UTR)可以增强本文所述的多核苷酸在肝和/或肝细胞系中的表达。此类组织特异性UTR的非限制性实例包括来自以下的那些：(a)肌肉：myoD、肌球蛋白、肌红蛋白、肌细胞生成素和herculin；(b)内皮细胞：Tie‑1和CD36；(c)髓系细胞：C/EBP、AML1、G‑CSF、GM‑CSF、CD11b、MSR、Fr‑1和i‑NOS；(d)白细胞：CD45和CD18；(e)脂肪组织： CD36、GLUT4、ACRP30和脂联素；以及(f)肺上皮细胞：SP‑A/B/C/D。 [0133] 可用于本公开的UTR的额外实例包括来源于以下核酸序列的一个或多个5′‑UTR和/或3′‑UTR：球蛋白，例如α‑球蛋白或β‑球蛋白(例如，Xenopus、小鼠、兔或人球蛋白)；强Kozak翻译起始信号；CYBA(例如，人细胞色素b‑245α多肽)；白蛋白(例如，人白蛋白7)； HSD17B4(羟基类固醇(17‑β)脱氢酶)；病毒(例如，烟草蚀纹病毒(TEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、登革热病毒、巨细胞病毒(CMV)(例如，CMV立即早期1(IE1))、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒)、辛德毕斯病毒或PAV大麦黄矮病毒)；热休克蛋白(例如，hsp70)；翻译起始因子(例如，elF4G)；葡萄糖转运蛋白(例如hGLUT1(人类葡萄糖转运蛋白1))；肌动蛋白(例如人类α或β肌动蛋白)；GAPDH；微管蛋白；组蛋白；柠檬酸循环酶；拓扑异构酶(例如，缺乏5′TOP基序(寡嘧啶束)的TOP基因的5′‑UTR)；核糖体蛋白Large 32(L32)；核糖体蛋白(例如人+ 类或小鼠核糖体蛋白，例如rps9)；ATP合酶(例如，ATP5A1或线粒体H‑ATP合酶的β亚基)；生长激素e(例如牛(bGH)或人类(hGH))；延伸因子(例如，延伸因子1α1(EEF1A1))；锰超氧化物歧化酶(MnSOD)；肌细胞增强因子2A(MEF2A)；β‑F1‑ATPase、肌酸激酶、肌红蛋白、粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)；胶原蛋白(例如，I型胶原蛋白α2(Col1A2)、I型胶原蛋白α1(Col1A1)、VI型胶原蛋白α2(Col6A2)、VI型胶原蛋白α1(Col6A1))；核糖体结合糖蛋白(例如，核糖体结合糖蛋白I(RPNI))；低密度脂蛋白受体相关蛋白(例如，LRP1)；心肌营养素样细胞因子(例如，Nnt1)；钙网蛋白(Calr)；前胶原蛋白‑赖氨酸2‑氧代戊二酸5‑双加氧酶1(Plod1)；核连蛋白(例如，Nucb1)；和它们的组合。 [0134] 帽结构 [0135] 在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)包含5′‑帽。 [0136] 如本文所用，术语“5′‑帽”是指可以添加至多核苷酸(例如，mRNA)的5′端的修饰的核苷酸(例如，鸟嘌呤)。5′‑帽结构可以在所述多核苷酸的核输出(例如，输出至可以发生翻译的细胞质)中发挥作用和/或促进所述多核苷酸的稳定性。在一些方面，5′‑帽可以通过5′‑5′‑三磷酸键联与本文所述的多核苷酸的5′末端连接。在某些方面，5′‑帽可以被甲基化(例如m7GpppN，其中N是所述多核苷酸的末端5′核苷酸)。本领域已知的任何合适的5′‑帽均 7，2′‑O 7 可用于本公开。可用于本公开的5′‑帽的非限制性实例包括：m2 GppspGRNA、m GpppG、 7 7 (7，3′‑O) (7，2′‑O) (7，2′‑O) 7，3’‑O 2’‑O mGppppmG、m2 GpppG、m2 GppspG(D1)、m2 GppspG(D2)、m2 Gppp(m1 ) 7 ApG、(mG‑3’mppp‑G；其可以等效地被指定为3′O‑Me‑m7G(5′)ppp(5′)G)、N7，2′‑O‑二甲基‑ 7 鸟苷‑5′‑三磷酸‑5′‑鸟苷、mGm‑ppp‑G、N7‑(4‑氯苯氧基乙基)‑G(5′)ppp(5′)G、N7‑(4‑氯 3′‑O 苯氧基乙基)‑m G(5′)ppp(5′)G、7mG(5′)ppp(5′)N，pN2p、7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp、7mG(5′)‑ppp(5′)NlmpN2 mp、m(7)Gpppm(3)(6，6，2′)Apm(2′)Apm(2′)Cpm(2)(3，2′)Up、肌苷、N1‑甲基‑鸟苷、2′氟‑鸟苷、7‑脱氮杂‑鸟苷、8‑氧代‑鸟苷、2‑氨基‑鸟苷、LNA‑鸟苷、2‑叠氮基‑鸟苷、N1‑甲基假尿苷、m7G(5′)ppp(5′)(2'OMeA)pG或它们的组合。 [0137] 在一些方面，可用于本公开的多核苷酸的5′‑帽包含帽类似物(也称为“合成帽类似物”、“化学帽”、“化学帽类似物”或“结构或功能帽类似物”)。“帽类似物”在化学结构上不同于天然(即，内源性、野生型或生理性)5′‑帽，同时保留了帽功能。帽类似物的非限制性实例在US 8,519,110和Kore等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry21：4570‑4574(2013)中有所描述，所述文献中的每一者均以引用的方式整体并入本文中。 [0138] 在一些方面，5′‑帽是修饰的。5′‑帽上的修饰可以进一步增加所述多核苷酸的稳定性、半衰期和/或翻译效率。在一些方面，修饰的5′帽包含以下修饰中的一种或多种：在加帽的鸟苷三磷酸(GTP)的2′和/或3′位置处的修饰，用亚甲基部分(CH2)置换糖环氧(产生碳环)，在帽结构的三磷酸桥部分处的修饰，或者在核碱基(G)部分处的修饰。参见例如US 2014/0147454和WO 2018/160540，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。 [0139] Poly(A)尾 [0140] 在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)在所述多核苷酸的3′端包含长链腺嘌呤核苷酸(本文中称为“poly(A)尾”)。在一些方面，poly(A)尾单独存在或者与本文所述的其他组分(例如，5′‑帽)组合存在。 [0141] 在一些方面，poly(A)尾的长度是大于约30个核苷酸长。在某些方面，poly(A)尾的长度是至少约35个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约45个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约90个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约110个核苷酸、至少约120个核苷酸、至少约130个核苷酸、至少约140个核苷酸、至少约150个核苷酸、至少约160个核苷酸、至少约170个核苷酸、至少约180个核苷酸、至少约190个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约250个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约350个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约450个核苷酸或至少约500个核苷酸或更多。 [0142] 本领域已知的任何合适的poly(A)尾均可用于本公开。可用于本公开的poly(A)尾的非限制性实例包括：SV40 poly(A)、bGH poly(A)、肌动蛋白poly(A)、血红蛋白poly(A)、poly(A)‑G四联体或它们的组合。 [0143] 增强子 [0144] 在一些方面，可以使用一个或多个增强子序列(本文中也称为“翻译增强子元件”或“TEE”)进一步增加由本文所述的多核苷酸的一个或多个编码区编码的抗原的表达。因 此，在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)包含一个或多个增强子序列。在一些方面，本文所述的多核苷酸包含至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个或至少约50个或更多增强子序列。当多核苷酸包含多个增强子时，在一些方面，所述增强子中的每一个都是相同的。在一些方面，所述增强子中的一个或多个是不同的。在一些方面，所述增强子中的一个或多个被间隔子隔开。 [0145] 本领域已知的任何增强子均可用于本公开的多核苷酸。参见例如，WO1999024595、WO2012009644、WO2009075886和WO2007025008、欧洲专利公布号EP2610341A1和EP2610340A1、美国专利号6,310,197、美国专利号6,849,405、美国专利号7,456,273、美国专利号7,183,395，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。在一些方面，可用于本公开的增强子是组织特异性增强子。在某些方面，可用于本公开的增强子选自人类骨骼肌动 蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子MEF(例如，MEF2)、MyoD增强子元件、心脏增强子因子(CEF)位点、鼠科动物肌酸激酶增强子元件、骨骼快肌肌钙蛋白C基因元件、慢肌心脏肌钙蛋白C基因元件、慢肌肌钙蛋白I基因元件、低氧诱导核因子、类固醇诱导元件、糖皮质激素反应元件(GRE)或它们的任何组合。 [0146] IRES序列 [0147] 在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)还可以包含编码内部核糖体进入位点(IRES)的核苷酸序列。在不存在5′‑帽结构的情况下，IRES在启动蛋白质合成中发挥重要作用。IRES可以用作唯一的核糖体结合位点，或可以用作多核苷酸的 多个核糖体结合位点之一。含有一个以上功能性核糖体结合位点的多核苷酸可以编码由核 糖体独立翻译的数种肽或多肽(“多顺反子多核苷酸”)。因此，当本文所述的多核苷酸包含编码IRES的序列时，在某些方面，所述多核苷酸可以包含多个(例如，至少两个)可翻译区‑例如，编码冠状病毒刺突蛋白的核苷酸序列；和编码不同得冠状病毒蛋白(例如，核衣壳蛋白)的核苷酸序列。 [0148] 本领域已知的任何IRES序列均可用于本公开。可用于本公开的IRES序列的非限制性实例包括来自以下的那些：小核糖核酸病毒(例如，FMDV)、瘟病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒 (CSFV)、鼠科动物白血病病毒(MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、蟋蟀麻痹病毒(CrPV)或它们的组合。 [0149] 转录后调节元件 [0150] 在一些方面，可用于本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)的额外组分包含转录后调节元件。在一些方面，转录后调节元件可以与本文所述的一种或多种其 他组分(例如，5′‑帽、3′‑poly(A)尾、增强子序列、IRES序列或它们的组合)组合存在于本文所述的多核苷酸中。在一些方面，翻译后调节元件位于本文所述的多核苷酸的多个编码区 的3′‑处。可用于本公开的转录后调节元件的非限制性实例包括突变型土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、微小RNA结合位点、DNA核靶向序列或它们的组合。 [0151] 在一些方面，可存在于本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)中的一种或多种额外组分包含启动子。在某些方面，多核苷酸可以包括单个启动子。在一些方 面，多核苷酸可以包括多个启动子(例如，两个、三个、四个或五个或更多个)，所述启动子可操作地连接至本文所述的多核苷酸的多个编码区。当多核苷酸包含多个启动子时，在一些 方面，所述多个启动子中的每一个都是相同的。在某些方面，所述多个启动子中的一个或多个是不同的。 [0153] 组成型哺乳动物启动子包括但不限于用于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β‑肌动蛋白启动子和其他组成型启动子。在真核细胞中发挥组成性作用的示例性病毒启动子包括例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒 (例如，SV40)、乳头瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、劳斯肉瘤病毒、巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒的长末端重复序列(LTR)和其他逆转录病毒的启动子，以及单纯疱疹病毒 的胸苷激酶启动子。如本文所述，在一些方面，可用于本公开的启动子是诱导型启动子。诱导型启动子在诱导剂存在下表达。例如，在某些金属离子存在下，金属硫蛋白启动子被诱 导，从而促进转录和翻译。在一些方面，可以使用的启动子包含T7启动子。 [0154] 修饰的核苷/核苷酸 [0155] 在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)包含至少一种化学修饰的核苷和/或核苷酸。 [0156] “核苷”是指含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称为“核碱基”)的组合物的化合物。“核苷酸”是指包括磷酸酯基团的核苷。修饰的核苷酸可以通过任何有用的方法合成，例如化学、酶法或重组，以包括一个或多个修饰的或非天然核苷。 [0157] 多核苷酸可以包含一个或多个由核苷连接而成的区域。此类区域可以具有可变的骨架键联。键联可以是标准的磷酸二酯键联，在所述情况下，所述多核苷酸将包含核苷酸区域。 [0158] 本公开的多核苷酸可以包含各种独特的修饰。在一些方面，多核苷酸可以含有一个、两个或更多个(任选不同的)核苷或核苷酸修饰。在一些方面，如与未修饰的多核苷酸相比，多核苷酸可以表现出一种或多种所需特性，例如，改进的热或化学稳定性、降低的免疫原性、减少的降解、与靶标微小RNA的结合增加、与其他微小RNA或其他分子的非特异性结合减少。 [0159] 在一些方面，本公开的多核苷酸是化学修饰的。如本文所用，关于多核苷酸，术语“化学修饰(chemical modification)”或适当时“化学修饰的(chemically modified)”是指对腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或脱氧核糖核苷的位置、模式、百分比或群体中的一个或多个(包括但不限于其核碱基、糖、骨架或它们的任何组合)的修饰。 [0160] 在一些方面，本公开的多核苷酸可以具有所有或任何相同核苷类型的均一化学修饰，或通过在所有或任何相同核苷类型中向下滴定相同起始修饰而产生的修饰群体，或者 所有或任何相同核苷类型但随机并入的化学修饰的测量百分比。在其他方面，本公开的多 核苷酸可以在整个多核苷酸中具有两个、三个或四个相同核苷类型的均一化学修饰(例如 所有尿苷和/或所有胞苷等以相同方式进行修饰)。 [0161] 修饰的核苷酸碱基配对不仅包括标准的腺嘌呤‑胸腺嘧啶、腺嘌呤‑尿嘧啶或鸟嘌呤‑胞嘧啶碱基对，而且包括在包含非标准或修饰的碱基的核苷酸和/或修饰的核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许非标准碱基与标准碱基之间或两个互补的非标准碱基结构之间的氢键合。此类非标准碱基配对的一个实例是修饰的核碱基肌苷 与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合均可并入本公开的多核苷酸中。 [0162] 熟练技术人员应理解，除非另有说明，否则本申请中所阐述的多核苷酸序列将在代表性DNA序列中列出“T”，但是当所述序列代表RNA时，“T”将被替换为“U”。例如，本公开的TD可以作为RNA、DNA或包含RNA和DNA单元两者的杂合分子来施用。 [0163] 在一些方面，本文所述的多核苷酸包括至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、20个或更多)修饰的核碱基的组合。 [0164] 在一些方面，多核苷酸中的核碱基、糖、骨架键联或它们的任何组合被修饰至少约5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。 [0165] 碱基修饰 [0166] 在一些方面，化学修饰是在本公开的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)中的核碱基处。在一些方面，至少一个化学修饰的核苷是修饰的尿苷(例如，假尿苷(ψ)、2‑硫代尿苷(s2U)、1‑甲基‑假尿苷(m1ψ)、1‑乙基‑假尿苷(e1ψ)或5‑甲氧基‑尿苷(mo5U))、修饰的胞嘧啶(例如，5‑甲基‑胞苷(m5C))、修饰的腺苷(例如，1‑甲基‑腺苷(miA)、N6‑甲基‑腺苷(m6A)或2‑甲基‑腺嘌呤(m2A))、修饰的鸟苷(例如，7‑甲基‑鸟苷(m7G)或1‑甲基‑鸟苷(m1G))或它们的组合。 [0167] 在一些方面，本文所述的多核苷酸针对特定修饰是均一修饰的(例如，完全修饰、在整个序列中修饰)。例如，多核苷酸可以用同一类型的碱基修饰进行均一修饰，例如5‑甲基‑胞苷(m5C)，这意味着多核苷酸序列中的所有胞嘧啶残基均被5‑甲基‑胞苷(m5C)置换。 同样，可以通过用修饰的核苷(例如上述那些中的任一个)置换序列中存在的任何类型的核 苷残基来对多核苷酸进行均一修饰。 [0168] 在一些方面，多核苷酸包括至少两个(例如，2、3、4个或更多)修饰的核碱基的组合。在一些方面，本公开的多核苷酸中的至少约5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少 25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约 60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的一种类型的核碱基是修饰的核碱基。 [0169] 骨架修饰 [0170] 在一些方面，本文所述的多核苷酸可以包括核苷之间的任何有用的键联。可用于本公开的组合物的此类键联(包括骨架修饰)包括但不限于以下：3′‑亚烷基膦酸酯、3′‑氨基氨基磷酸酯、含烯烃的骨架、氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯、硼烷磷酸酯、‑CH2‑O‑N(CH3)‑CH2‑、‑CH2‑N(CH3)‑N(CH3)‑CH2‑、‑CH2‑NH‑CH2‑、手性膦酸酯、手性硫代磷酸酯、甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架、亚甲基(甲基亚氨基)、亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架、吗啉代键联、‑N(CH3)‑CH2‑CH2‑、具有杂原子核苷间键联的寡核苷、次膦酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯核苷间键联、硫代磷酸酯、磷酸三酯、PNA、硅氧烷骨架、氨基磺酸酯骨架、硫化物亚砜和砜骨架、磺酸酯和磺酰胺骨架、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和硫羰基氨基磷酸酯。 [0171] 在一些方面，上文所公开的骨架键联的存在增加了本公开的多核苷酸的稳定性和抗降解性。在一些方面，本公开的多核苷酸中的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的骨架键联是修饰的(例如，全部为硫代磷酸酯)。 [0172] 在一些方面，本公开的多核苷酸中可包括的骨架修饰包含二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)和/或硫代磷酸酯(PS)修饰。 [0173] 糖修饰 [0174] 可并入本公开的多核苷酸中的修饰的核苷和核苷酸可以在核酸的糖上进行修饰。并入增强亲和力的核苷酸类似物(例如LNA或2′‑取代的糖)可以修饰(例如，减少)多核苷酸的长度和/或大小。 [0175] 在一些方面，本公开的多核苷酸中的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约 55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸含有糖修饰(例如，LNA)。 [0176] 如本文所述，在一些方面，本文所述的多核苷酸可以是RNA(例如，mRNA)。一般来说，RNA包括糖基核糖，它是一个含有氧的五元环。示例性、非限制性的修饰的核苷酸包括置换核糖中的氧(例如用S、Se或亚烷基，诸如亚甲基或亚乙基)；添加双键(例如，用环戊烯基或环己烯基置换核糖)；核糖的环收缩(例如，形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的环扩展(例如形成具有额外碳或杂原子的6元或7元环，诸如还具有氨基磷酸酯骨架的脱水己 糖醇、阿卓糖醇、甘露醇、环己基、环己烯基和吗啉代)；多环形式(例如三环；和“未锁定”形式，诸如乙二醇核酸(GNA)(例如R‑GNA或S‑GNA，其中核糖被连接至磷酸二酯键的乙二醇单元置换)、苏阿糖核酸(TNA，其中核糖被α‑L‑苏呋喃糖基‑(3′→2′)置换)和肽核酸(PNA，其中2‑氨基‑乙基‑甘氨酸键联置换了核糖和磷酸二酯骨架)。糖基团还可以含有一个或多个与核糖中的相应碳原子具有相反立体化学构型的碳原子。因此，多核苷酸分子可以包括含 有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。 [0177] 核糖的2′羟基(OH)可以被多种不同的取代基修饰或置换。2′‑位置处的示例性取代包括但不限于H、卤基、任选取代的C1‑6烷基；任选取代的C1‑6烷氧基；任选取代的C6‑10芳氧基；任选取代的C3‑8环烷基；任选取代的C3‑8环烷氧基；任选取代的C6‑10芳氧基；任选取代的C6‑10芳基‑C1‑6烷氧基、任选取代的C1‑12(杂环基)氧基；糖(例如，核糖、戊糖或本文所述的任何糖)；聚乙二醇(PEG)，即‑O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R是H或任选取代的烷基，并且n是0至20的整数(例如，0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至 10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16以及4至20)；“锁”核酸(LNA)，其中2′‑羟基通过C1‑6亚烷基或C1‑6亚杂烷基桥连接至同一核糖的4′‑碳，其中示例性的桥包括亚甲基、亚丙基、醚、氨基桥、氨基烷基、氨基烷氧基、氨基和氨基酸。 [0178] 在一些方面，本公开的多核苷酸中存在的核苷酸类似物包含例如2′‑O‑烷基‑RNA单元、2′‑OMe‑RNA单元、2′‑O‑烷基‑SNA、2′‑氨基‑DNA单元、2′‑氟‑DNA单元、LNA单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元、2′‑氟‑ANA单元、HNA单元、INA(嵌入核酸)单元、2′MOE单元或它们的任何组合。在一些方面，LNA是例如氧基‑LNA(例如β‑D‑氧基‑LNA或α‑L‑氧基‑LNA)、氨基‑LNA(例如β‑D‑氨基‑LNA或α‑L‑氨基‑LNA)、硫代‑LNA(例如β‑D‑硫代‑LNA或α‑L‑硫代‑LNA)、ENA(例如β‑D‑ENA或α‑L‑ENA)或它们的任何组合。在其他方面，本公开的多核苷酸中可以包括的核苷酸类似物包含锁核酸(LNA)、解锁核酸(UNA)、阿拉伯核酸(ABA)、桥接核酸(BNA)和/或肽核酸(PNA)。 [0179] 在一些方面，本公开的多核苷酸可以包含修饰的RNA核苷酸类似物(例如，LNA)和DNA单元两者。在一些方面，本文所述的多核苷酸是间隙聚体(gapmer)。参见例如美国专利号8,404,649；8,580,756；8,163,708；9,034,837；其均以引用的方式整体并入本文中。 [0180] 在一些方面，本公开的多核苷酸可以包括修饰以防止被核酸内切酶和核酸外切酶快速降解。修饰包括但不限于例如(a)末端修饰，例如5′端修饰(磷酸化、去磷酸化、缀合、反向键联等)、3′端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向键联等)，(b)碱基修饰，例如用修饰的碱基、稳定化碱基、去稳定化碱基或与扩展的配对物库进行碱基配对的碱基或缀合的碱基置换，(c)糖修饰(例如，在2′位置或4′位置处)或糖的置换，以及(d)核苷酸间键联修饰，包括磷酸二酯键联的修饰或置换。 [0181] IV.载体 [0182] 在一些方面，本文提供了包含本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)的载体(例如，表达载体)。用于本公开的合适载体包括但不限于表达载体、病毒载体和质粒载体。 [0183] 如本文所用，“表达载体”是指当被引入适当的宿主细胞中时，含有插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件或在RNA病毒载体的情况下复制和翻译所必需的元件的任何核酸构建体。表达载体可以包括质粒、噬菌粒、病毒和其衍生物。 [0184] 如本文所用，“病毒载体”包括但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，例如莫洛尼鼠科动物白血病病毒、哈维鼠科动物肉瘤病毒、鼠科动物乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；慢病毒；腺病毒；腺相关病毒；SV40类型病毒；多瘤病毒；EB病毒；乳头瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；以及RNA病毒，例如逆转录病毒。某些病毒载体是基于非细胞病变真核病毒，其中非必需基因已被所关注的基因置换。非细胞病变病毒包括逆转录 病毒，其生命周期涉及将基因组病毒RNA逆转录为DNA，随后将前病毒整合至宿主细胞DNA 中。 [0185] 在一些方面，载体来源于腺相关病毒。在一些方面，载体来源于慢病毒。慢病毒载体的实例公开于WO9931251、W09712622、W09817815、W09817816和WO9818934中，所述文献各自以引用的方式整体并入本文中。 [0186] 其他载体包括质粒载体。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。在过去的几年中，已经发现质粒载体由于其无法在宿主基因组内复制和整合至宿主基因组中而特别有利 于体内递送基因至细胞。然而，这些具有与宿主细胞可相容的启动子的质粒可以表达来自 在所述质粒内可操作性编码的基因的肽。一些可获自商业供应商的常用的质粒包括 pBR322、pUC18、pUC19、各种pcDNA质粒、pRC/CMV、各种pCMV质粒、pSV40和pBlueScript。特定质粒的额外实例包括pcDNA3.1，目录号V79020；pcDNA3.1/hygro，目录号V87020；pcDNA4/myc‑His，目录号V86320；和pBudCE4.1，目录号V53220，均来自Invitrogen(Carlsbad，CA.)。 另外，质粒可以使用标准分子生物学技术进行定制设计以去除和/或添加DNA的特定片段。 [0187] V.细胞 [0188] 在一些方面，本文提供了包含本文所述的任何多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)的细胞。在一些方面，本文所述的细胞已被修饰成包含本文所述的多核苷酸，使得细胞表达由所述多个编码区编码的抗原。如本文所证实，此类抗原在细胞中同时表达。例如，在一些方面，本文所述的细胞已用至少包含第一编码区和第二编码区的多核苷酸进行了修 饰，其中第一编码区和第二编码区是连接的。此类修饰的细胞表达了第一编码区的抗原和 第二编码区的抗原两者。在一些方面，所述细胞并未天然地表达多种抗原，使得仅在本文所述的多核苷酸被引入细胞中之后，所述细胞才表达多种抗原。在一些方面，所述细胞天然地表达所述多种抗原中的一种或多种，但在细胞被修饰成包含本文所述的多核苷酸之后，所 述多种抗原中的一种或多种的表达有所增加。 [0189] 除非另有说明，否则可以使用本领域已知的任何合适方法将本文所述的任何多核苷酸引入细胞中。用于将一个或多个外源核苷酸序列递送至细胞的合适方法的非限制性实 例包括：转染(也称为转化和转导)、电穿孔、非病毒递送、病毒转导、脂质纳米颗粒递送和它们的组合。如本文所证实，在一些方面，可以使用本文所述的收缩部介导的递送将本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)引入细胞中。如本公开别处进一步所述，当细胞穿过收缩部时，它们会暂时变形，使得细胞的细胞膜受到扰动。细胞膜内的扰动可以允许各种有效载荷(例如，包含多个连接的编码区的多核苷酸)通过扰动(例如，通过扩散)进入细 胞。细胞穿过收缩部并暂时变形的特定过程在本文中被称为“挤压处理”、“挤压递送”或“挤压”。 [0190] 因此，在一些方面，本公开提供了已被修饰成同时表达细胞并未天然表达的多种抗原(例如本文所述，例如癌症抗原和/或非自身抗原)的细胞，其中所述细胞已在一组参数下穿过收缩部，从而引起细胞内的扰动，使得多核苷酸在与细胞接触时通过扰动进入细胞，并且其中多核苷酸包含多个编码区，所述编码区是连接的并且编码多种抗原。例如，在一些方面，本文所提供的细胞至少同时表达第一抗原、第二抗原和第三抗原，其中第一、第二和第三抗原不是由细胞天然表达的，其中所述细胞已在一组参数下穿过收缩部，从而引起细 胞内的扰动，使得多核苷酸在与细胞接触时通过扰动进入细胞，并且其中多核苷酸包含编 码第一抗原的第一编码区、编码第二抗原的第二编码区和编码第三抗原的第三编码区，并 且其中第一编码区、第二编码区和第三编码区是连接的。 [0191] 本领域已知的任何合适细胞均可如本文所述进行修饰。 [0192] 在一些方面，所述细胞是干细胞。如本文所用，术语“干细胞”是指不仅具有自我复制能力，而且具有分化成其他类型的细胞(例如，神经元)的能力的细胞。在一些方面，可用于本公开的干细胞包含诱导性多潜能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、组织特异性干细胞(例如，肝干细胞、心脏干细胞或神经干细胞)、间充质干细胞、造血干细胞(HSC)或它们的组合。在一些方面，所述干细胞是iPSC。 [0193] 在一些方面，所述细胞是体细胞。如本文所用，术语“体细胞”是指体内并非配子(精子或卵子)、生殖细胞(继续成为配子的细胞)或干细胞的任何细胞。体细胞的非限制性实例包括血细胞、骨细胞、肌肉细胞、神经细胞或它们的组合。在一些方面，可用于本公开的体细胞包含血细胞。在一些方面，血细胞是外周血单核细胞(PBMC)。如本文所用，“PBMC”是指任何具有圆形细胞核的外周血细胞。在一些方面，PBMC包含免疫细胞。如本文所用，术语“免疫细胞”是指在免疫功能中发挥作用的任何细胞。在一些方面，免疫细胞包含T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)、NKT细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、DC2.4树突状细胞或它们的组合。在一些方面，血细胞是红细胞。在一些方面，所述细胞是癌细胞。在一些方面，癌细胞是癌细胞系细胞，例如HeLa细胞。在一些方面，癌细胞是肿瘤细胞。在一些方面，癌细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。在一些方面，所述细胞是成纤维细胞，例如原代成纤维细胞或新生儿包皮成纤维细胞(Nuff细胞)。 在一些方面，所述细胞是永生化细胞系细胞，例如HEK293细胞或CHO细胞。在一些方面，所述细胞是皮肤细胞。在一些方面，所述细胞是生殖细胞，例如卵母细胞、卵子或受精卵。在一些方面，所述细胞是细胞簇，例如胚胎，前提是所述细胞簇在穿过孔时不会被破坏。 [0194] VL组合物 [0195] 在一些方面，本公开还包括一种组合物，所述组合物包含本文所述的任何多核苷酸、载体或细胞。在一些方面，所述组合物是药物组合物。因此，本文公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)本文所述的多核苷酸(例如，至少包含第一编码区和第二编码 区，其中第一编码区和第二编码区并不相同，并且其中第一编码区和第二编码区是连接 的)，和(ii)药学上可接受的载体。在一些方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)已被修饰成包含本文所述的任何多核苷酸的细胞，和(ii)药学上可接受的载体。 在一些方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)包含本文所述的任何多核苷酸的载体(vector)，和(ii)药学上可接受的载体。 [0196] 术语“赋形剂”和“载体”可互换使用并且是指添加至药物组合物中以进一步促进化合物(例如，本文所述的任何多核苷酸、载体或细胞)的施用的惰性物质。术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”以及其语法变化形式涵盖由美国联邦政府管理机构批准或美国药典中列出的用于动物(包括人类)的任何剂，以及不会导致产生达到禁止向受试者施用组合物的程度的不良生理效应并且不会消除所施用的化合物的生物活性和特 性的任何载体或稀释剂。包括可用于制备药物组合物并且通常安全、无毒并且合乎需要的 赋形剂和载体。 [0197] 可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚； 环己醇；3‑戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螫合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如，Zn‑蛋白质配合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如 或聚乙二醇(PEG)。 [0198] 药物组合物可以配制用于对受试者的任何施用途径。施用途径的特定实例包括肌肉内、皮下、眼部、静脉内、腹膜内、皮内、眶内、脑内、颅内、脊柱内、脑室内、鞘内、脑池内、囊内或肿瘤内。本文还考虑了肠胃外施用，其特征在于皮下、肌肉内或静脉内注射。可注射剂可以常规形式制备，如液体溶液或悬浮液，适合在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或者乳液。所述可注射剂、溶液和乳液还含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、生理盐水、右旋糖或甘油。此外，必要时，待施用的药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，如pH缓冲剂、稳定剂和其他此类剂，例如乙酸钠、山梨醇酐单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。 [0199] VII.试剂盒 [0200] 本文还公开了试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的任何多核苷酸、载体、组合物或细胞。在一些方面，所述试剂盒用于针对疾病或病症(例如，癌症)的免疫疗法和/或治疗所述疾病或病症(例如，癌症)或降低其风险。在一些方面，所述试剂盒包括一个或多个容器，所述容器包括本文所述的任何多核苷酸、载体、组合物或细胞。 [0201] 在一些方面，所述试剂盒包括根据本文所述的任何方法进行使用的说明书。例如，所包括的说明书可以包括关于施用本文所述的药物组合物来治疗、延迟发作或缓解目标疾病的描述。在一些方面，说明书包括关于向有目标疾病/病症(例如，癌症)风险的受试者施用本文所述的组合物的描述。 [0202] 在一些方面，说明书包括剂量信息、给药时间表和施用途径。在一些方面，所述容器是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在一些方面，说明书是标签或包装插页(例如，试剂盒中所包括的纸张)上的书面说明。在一些方面，说明书是机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)。 [0203] 在一些方面，标签或包装插页指出，本文所公开的组合物用于治疗、延迟发作和/或缓解与癌症相关的疾病或病症，例如本文所述的那些。可以提供用于实践本文所述的任 何方法的说明书。 [0204] 在一些方面，本文所述的试剂盒采用合适的包装。在一些方面，合适的包装包括小瓶、瓶子、罐子、柔性包装(例如，密封的迈拉或塑料袋)或它们的组合。在一些方面，包装包括与特定装置(例如吸入器、鼻施用装置(例如雾化器)或输注装置(例如微型泵))组合使用的包装。在一些方面，所述试剂盒包括无菌存取口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些方面，所述容器也可以具有无菌存取口 (例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。 [0205] 在一些方面，所述试剂盒还包括额外组件，例如缓冲液和解释信息。在一些方面，所述试剂盒包括容器和在所述容器上或与所述容器缔合的标签或包装插页。在一些方面，本公开提供了制品，所述制品包括本文所述的试剂盒的内容物。 [0206] VIII.用途和方法 [0207] 多种抗原的表达 [0208] 从本公开明显可见，本文所述的多核苷酸、载体、细胞和/或药物组合物具有多种体外和体内效用。例如，本文所述的多核苷酸可以在体外或离体施用于培养的细胞，或例如在体内施用于人类受试者，以诱导多种抗原在细胞中表达，这在一些方面可以帮助治疗多 种疾病或病症。 [0209] 因此，本公开的一些方面涉及一种诱导多种抗原在细胞中表达的方法，所述方法包括在细胞内将本文所述的多核苷酸递送至细胞。如本文所述和所证实，所述多种抗原同 时在细胞中表达。例如，在一些方面，本文提供了一种诱导第一抗原和第二抗原在细胞中表达的方法，所述方法包括在细胞内将多核苷酸递送至细胞，其中所述多核苷酸包含编码第 一抗原的第一编码区和编码第二抗原的第二编码区，其中第一编码区和第二编码区并不相 同，并且其中第一编码区和第二编码区是连接的。在一些方面，第一抗原和第二抗原同时在细胞中表达。 [0210] 如本文所述，在一些方面，在将所述多核苷酸引入细胞中之前，细胞并未表达所述多种抗原(例如，第一抗原和第二抗原)。在一些方面，细胞在引入所述多核苷酸之前表达所述多种抗原中的一种或多种，但在引入所述多核苷酸之后，表达进一步增加。在任一情况下，在引入本文所述的多核苷酸后，如与参考表达相比，所述多种抗原的表达均增加。在一些方面，参考表达包含在引入所述多核苷酸之前细胞中的表达。在一些方面，参考表达包含未被修饰成包含本文所述的多核苷酸的相应细胞中的表达。在一些方面，参考表达包含被 修饰成包含多种多核苷酸的相应细胞中的表达，其中所述多种多核苷酸中的每一种编码单 独的抗原。在一些方面，在引入本文所述的多核苷酸后，如与参考表达相比，所述多种抗原的表达增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约 60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，在引入本文所述的多核苷酸后，如与参考表达相比，所述多种抗原的表达增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约 50倍或更多。 [0211] 在一些方面，在细胞内将所述多核苷酸递送至细胞包括使包含细胞的细胞悬浮液在一组参数下穿过收缩部，从而引起细胞内的扰动，使得所述多核苷酸在与细胞接触时通 过扰动进入细胞。在一些方面，所述方法还包括使细胞与所述多核苷酸接触。如本文所用，细胞与本文所述的多核苷酸之间的“接触”并不需要细胞与多核苷酸进行物理接触。从本公开明显可见，只要多核苷酸在细胞的细胞膜内出现扰动时能够进入细胞，就会发生细胞与 多核苷酸之间的接触。为了帮助说明，在一些方面，如果细胞和多核苷酸都存在于同一细胞悬浮液内，则无论细胞与多核苷酸是否进行物理接触，细胞与多核苷酸都是接触的。因此，在一些方面，使细胞与多核苷酸接触包括将包含细胞的细胞悬浮液与多核苷酸一起孵育。 [0212] 在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)可以单独地或者与一种或多种额外货物(本文中也称为“有效载荷”)组合在细胞内递送至细胞。例如，在一些方面，所述额外货物可以包含单独的多核苷酸。在一些方面，所述单独的多核苷酸可以编码改进和/或增强本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)的治疗效果的化 合物。如本领域的一般理解，为了最佳的T细胞激活，需要多个信号：(1)“信号1”：通过使TCR结合至与MHC复合的抗原肽提供的抗原特异性信号；(2)“信号2”：由抗原呈递细胞(APC)上的共刺激分子(例如CD80和CD86)的衔接介导；和(3)“信号3”：由细胞因子(例如，IL‑2和/或IL‑12)介导。因此，在一些方面，本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)与一种或多种单独的多核苷酸组合在细胞内递送至细胞，其中所述一种或多种单独的多核苷酸 编码共刺激分子(即，信号2)和/或细胞因子(即，信号3)。 [0213] 在一些方面，当递送多种多核苷酸时，可以使用单次挤压处理将它们递送至细胞(例如，细胞悬浮液包含所述多种多核苷酸，它们被组合递送至细胞；“同时递送”)。在一些方面，可以依序将所述多种多核苷酸(例如，本文所述的多核苷酸和编码共刺激分子和/或 细胞因子的单独的多核苷酸)递送至细胞。如本文所用，术语“依序递送”是指将多种多核苷酸递送至细胞，其中将第一多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)递送至细胞并且接着 将第二(或后续)多核苷酸(例如，编码共刺激分子和/或细胞因子的单独的多核苷酸)递送 至细胞。在一些方面，可以使用挤压处理将第一多核苷酸、第二多核苷酸或第一和第二多核苷酸两者递送至细胞。例如，在一些方面，可以使用挤压处理将第一多核苷酸递送至细胞，并且可以使用非挤压处理(例如，转染)将第二多核苷酸递送至细胞。在一些方面，可以使用非挤压处理(例如，转染)将第一多核苷酸递送至细胞，并且可以使用挤压处理将第二多核 苷酸递送至细胞。在一些方面，可以使用第一次挤压将第一多核苷酸递送至细胞，并且接着可以使用第二次挤压将第二多核苷酸递送至细胞(本文中也称为“依序挤压”或“依序挤压处理”)。因此，可用于本公开的依序递送可以包括多次挤压处理。在一些方面，所述多次挤压处理中的每一次都会将单独的多核苷酸递送至细胞。在一些方面，所述多次挤压处理中 的一次或多次不涉及多核苷酸的递送。例如，在一些方面，本文所述的依序递送方法包括第一次挤压、第二次挤压和第三次挤压，其中第一次挤压包括使不带有任何有效载荷的细胞 穿过第一个收缩部，第二次挤压包括使第一次挤压后的细胞穿过第二个收缩部以将第一多 核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)递送至细胞，并且第三次挤压包括使第二次挤压后 的细胞穿过第三个收缩部以将第二多核苷酸(例如，编码共刺激分子和/或细胞因子)递送 至细胞。不受任何一种理论的束缚，在一些方面，使细胞在没有任何有效载荷的情况下穿过第一个收缩部(即，第一次挤压)可以帮助为后续的递送准备细胞，例如，可以改进第一多核苷酸和/或第二多核苷酸的递送效率。 [0214] 在一些方面，可以重复将有效载荷(例如，多核苷酸)的组合递送至细胞(例如，干细胞或PBMC)。例如，在一些方面，通过第一次挤压处理将多核苷酸的组合(例如，包含多个连接的编码区的第一多核苷酸和编码共刺激分子和/或细胞因子的第二多核苷酸)递送至 细胞；接着，通过第二次挤压处理将所述多核苷酸的组合再次递送至细胞。在一些方面，第一次挤压处理包括具有多排收缩部的微流体装置(例如，芯片)，使得挤压过程发生在单个 微流体装置(例如，芯片)上。如本文进一步所述，在一些方面，第二次挤压处理可以在细胞经过第一次挤压处理之后立即(例如，在细胞穿过第一次挤压处理的收缩部之后立即)发 生。在一些方面，第二次挤压处理可以在第一次挤压处理之后的某个时间(例如，在细胞穿过第一次挤压处理的收缩部之后至少约1分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约6小时、至少约12小时或至少约1天)发生。 [0215] 收缩部 [0216] 微流体通道 [0217] 如本文所述，使用收缩部来引起细胞的物理变形，使得在细胞的细胞膜内产生扰动，从而允许将有效载荷(例如，本文所述的包含多个连接的编码区的多核苷酸)递送至细 胞中。在一些方面，收缩部是在微流体装置内所含的通道(本文中称为“微流体通道”或“通道”)内。当涉及多个通道时，在一些方面，所述多个通道可以在微流体装置内并联和/或串联放置。在一些方面，本文所述的细胞可以穿过至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约75个、至少约100个、至少约150个、至少约200个、至少约 250个、至少约300个、至少约350个、至少约400个、至少约450个、至少约500个、至少约550个、至少约600个、至少约650个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约850个、至少约900个、至少约950个、至少约1，000个或更多的单独的收缩部。在一些方面，本文所述的细胞穿过超过约1，000个单独的收缩部。在一些方面，所述多个收缩部可以是单个微流体装置(例如，多排收缩部的芯片)的一部分。在一些方面，所述多个收缩部中的一个或多个可以是不同微流体装置的一部分。例如，在一些方面，本文所述的细胞(例如，干细胞或PBMC)经历第一次挤压处理，其中细胞穿过第一微流体装置(例如，芯片)中的第一收缩部。接着，在细胞经历了第一次挤压处理(例如，穿过第一个收缩部)之后，细胞经历第二次挤压处理，其中细胞穿过第二微流体装置(例如，芯片)中的第二收缩部。在一些方面，所述收缩部中的每一个都是相同的(例如，具有相同的长度、宽度和/或深度)。在一些方面，所述收缩部中的一个或多个是不同的。当使用多个收缩部时，所述多个收缩部可以包括与第一多核苷酸(例 如，包含多个连接的编码区)相关联的第一收缩部，以及与第二多核苷酸(例如，编码共刺激分子和/或细胞因子)相关联的第二收缩部，其中细胞悬浮液穿过第一收缩部，使得第一多 核苷酸被递送至多个细胞中的一个或多个细胞，并且接着，细胞悬浮液穿过第二收缩部，使得第二多核苷酸被递送至所述多个细胞中的一个或多个细胞。在一些方面，在细胞悬浮液 穿过第一收缩部之后至少约1分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约6小时、至少约12小时或至少约1天，细胞悬浮液穿过第二收缩部。 [0218] 在一些方面，当细胞悬浮液穿过多个收缩部(例如，多次挤压处理)时，细胞在穿过每个收缩部之后仍然是活的。从本公开明显可见，在一些方面，多个收缩部可以包括单个微流体装置(例如，多排收缩部的芯片)内存在的两个或更多个收缩部，使得细胞依序穿过所述多个收缩部。在一些方面，所述多个收缩部是单独的微流体装置的一部分，使得第一收缩部与第一微流体装置相关联，并且第二收缩部与第二微流体装置相关联。例如，在一些方 面，细胞穿过第一收缩部(即，第一次挤压处理)，所述第一收缩部与第一微流体装置(例如，芯片)相关联。在细胞已穿过第一收缩部之后，使细胞穿过第二收缩部(即，第二次挤压处 理)，所述第二收缩部与第二微流体装置(例如，芯片)相关联。在一些方面，在穿过第一收缩部之后，在培养基中培养细胞，接着使细胞穿过第二收缩部。在一些方面，在使细胞穿过第二收缩部之前，将细胞培养至少约1分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约6小时、至少约12小时或至少约1天。从本公开明显可见，在一些方面，第一和第二收缩部具有相同的长度、深度和/或宽度。在一些方面，第一和第二收缩部可以具有不同的长度、深度和/或宽度。 [0219] 在一些方面，在穿过收缩部之后，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约 100％的细胞仍是活的。当细胞穿过多个收缩部(例如，单个微流体装置的一部分或单独的 微流体装置)时，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约 75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的细胞在穿过所述多个收缩部中的每一个之后仍是活的。可以使用本领域已知的任何合适方法来测量细胞的活 力。在一些方面，可以使用Nucleocounter NC‑200、Orflo Moxi Go II细胞计数器或两者来测量细胞的活力。 [0220] 用于本文所公开的方法的含有细胞变形收缩部的示例性微流体通道描述于美国公布号2020/0277566 A1、美国公布号2020/0332243 A1、美国公布号2020/0316604 A1、美国临时申请号63/131,423和美国临时申请号63/131,430中，所述文献中的每一者均以引用 的方式整体并入本文中。 [0221] 在一些方面，本文所述的微流体通道(即，包括收缩部)包括管腔并且被配置，使得悬浮在缓冲液(例如，细胞悬浮液)中的细胞可以穿过所述通道。可用于本公开的微流体通道可以使用本领域中可用的任何合适材料来制得，所述材料包括但不限于硅、金属(例如，不锈钢)、塑料(例如，聚苯乙烯)、陶瓷、玻璃、结晶基底、非晶态基底、聚合物(例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PDMS、环状烯烃共聚物(COC))或它们的组合。在一些方面，所述材料是硅。微流体通道的制造可以通过本领域中已知的任何方法来进行，所述方法包括但不限于 干法蚀刻(例如，深反应离子蚀刻)、湿法蚀刻、光刻、注塑成型、激光烧蚀、SU‑8掩模或它们的组合。在一些方面，所述制造是使用干法蚀刻进行的。 [0222] 在一些方面，可用于本公开的微流体通道包括入口部分、中心点和出口部分。在一些方面，入口部分、中心点和/或出口部分中的一个或多个的横截面可以变化。例如，横截面的形状可以是圆形、椭圆形、细长狭缝、正方形、六边形或三角形。 [0223] 入口部分限定了一个收缩角。在一些方面，通过调节(例如，增加或减少)所述收缩角，可以减少或防止收缩部的任何堵塞。在一些方面，出口部分的角度也可以进行调节。例如，在一些方面，出口部分的角度可以被配置成降低可以导致非层流的湍流的可能性。在一些方面，入口部分和/或出口部分的壁是线性的。在一些方面，入口部分和/或出口部分的壁是弯曲的。 [0224] 在一些方面，收缩部的长度、深度和/或宽度可以变化。在一些方面，通过调节(例如，增加或减少)收缩部的长度、深度和/或宽度，可以调节有效载荷的递送效率。如本文所用，术语“递送效率”是指递送至细胞中的有效载荷的量。例如，当递送的有效载荷的总量增加时，可能发生递送效率的增加。 [0225] 在一些方面，收缩部具有小于约1μm的长度。在一些方面，收缩部具有约0μm至约100μm的长度。在一些方面，收缩部的长度小于约0.1μm、小于约0.2μm、小于约0.3μm、小于约 0.4μm、小于约0.5μm、小于约0.6μm、小于约0.7μm、小于约0.8μm、小于约0.9μm、小于约1μm、小于约2.5μm、小于约5μm、小于约7.5μm、小于约10μm、小于约12.5μm、小于约15μm、小于约20μm、小于约30μm、小于约40μm、小于约50μm、小于约60μm、小于约70μm、小于约80μm、小于约90μm或小于约100μm。在一些方面，收缩部的长度是约0.1μm、约0.2μm、约0.3μm、约0.4μm、约 0.5μm、约0.6μm、约0.7μm、约0.8μm、约0.9μm、约1μm、约2.5μm、约5μm、约7.5μm、约10μm、约 12.5μm、约15μm、约20μm、约30μm、约40μm、约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm或约100μm。在一些方面，收缩部的长度是约10μm。在一些方面，收缩部具有约0μm的长度。例如，在一些方面，可用于本公开的微流体装置(例如，芯片)包括收缩部，其类似于钻石的两个点汇聚在一起，使得收缩部的长度是约0μm。 [0226] 在一些方面，收缩部的宽度在约0μm至约10μm之间。在一些方面，收缩部的宽度小于约0.1μm、小于约0.2μm、小于约0.3μm、小于约0.4μm、小于约0.5μm、小于约0.6μm、小于约0.7μm、小于约0.8μm、小于约0.9μm、小于约1μm、小于约2μm、小于约3μm、小于约4μm、小于约5μm、小于约6μm、小于约7μm、小于约8μm、小于约9μm或小于约10μm。在一些方面，收缩部的宽度是约0.1μm、约0.2μm、约0.3μm、约0.4μm、约0.5μm、约0.6μm、约0.7μm、约0.8μm、约0.9μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm或约10μm。在一些方面，收缩部的宽度在约3μm至约10μm之间。在一些方面，收缩部的宽度是约6μm。 [0227] 在一些方面，收缩部的深度是至少约1μm。在一些方面，收缩部的深度是至少约2μm、至少约3μm、至少约4μm、至少约5μm、至少约10μm、至少约20μm、至少约30μm、至少约40μm、至少约50μm、至少约60μm、至少约70μm、至少约80μm、至少约90μm、至少约100μm、至少约110μm或至少约120μm。在一些方面，收缩部的深度是约5μm至约90μm。在一些方面，收缩部的深度是约5μm、约10μm、约20μm、约30μm、约40μm、约50μm、约60μm、约70μm、约80μm或约90μm。在一些方面，收缩部的深度是约70μm。 [0228] 在一些方面，收缩部的长度是约10μm，收缩部的宽度是约6μm，并且收缩部的深度是约70μm。在一些方面，收缩部的长度是10μm，收缩部的宽度是6μm，并且收缩部的深度是70μm。 [0229] 在一些方面，收缩部(例如，微流体通道内所含)的直径是穿过所述收缩部的一个或多个细胞的直径的函数。不受任何一种理论的束缚，在一些方面，收缩部的直径小于细胞的直径，使得当细胞穿过收缩部时对细胞施加变形力，导致细胞发生暂时的物理变形。 [0230] 因此，在一些方面，收缩部的直径(本文中也称为“收缩部大小”)是细胞直径的约20％至约99％。在一些方面，收缩部大小是细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约 60％、约70％、约80％、约90％或约99％。从本公开明显可知，通过调节(例如，增加或减少)收缩部的直径，也可以调节将有效载荷递送至细胞中的效率。 [0231] 表面有孔 [0232] 在一些方面，本文所述的收缩部包括孔，所述孔含于表面中。可用于本公开的表面中所含的孔的非限制性实例描述于例如美国公布号2019/0382796 A1中，所述文献以引用的方式整体并入本文中。 [0233] 在一些方面，可用于本公开的表面(即，包括一个或多个孔，当细胞穿过孔时，所述孔可导致细胞发生物理变形)可以使用本领域中可用的任何合适材料来制得和/或采用多种形式中的任一种。此类材料的非限制性实例包括合成或天然聚合物、聚碳酸酯、硅、玻璃、金属、合金、硝酸纤维素、银、乙酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚丙烯腈(PAN)、聚丙烯、PVDF、聚四氟乙烯、混合纤维素酯、瓷器、陶瓷或它们的组合。 [0234] 在一些方面，表面包括过滤器。在一些方面，所述过滤器是切向流过滤器。在一些方面，表面包括膜。在一些方面，表面包括海绵或海绵状基质。在一些方面，表面包括基质。在一些方面，表面包括曲折路径表面。在一些方面，所述曲折路径表面包括乙酸纤维素。 [0235] 本文所公开的表面(即，包括一个或多个孔)可以具有本领域中已知的任何合适形状。当表面具有2维形状时，表面可以是但不限于圆形(circular)、椭圆形、圆形(round)、正方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形或八边形。在一些方面，表面的形状是圆形。当表面具有3维形状时，在一些方面，表面可以是但不限于圆柱形、圆锥形或立方形。 [0236] 从本公开明显可知，可用于本公开的表面(例如，包括一个或多个孔)可以具有各种横截面宽度和厚度。在一些方面，表面的横截面宽度在约1mm与约1m之间。在一些方面，表面具有确定的厚度。在一些方面，表面厚度是均一的。在一些方面，表面厚度是可变的。例如，在一些方面，表面的某些部分比表面的其他部分更厚或更薄。在此类方面，表面的不同部分的厚度可以变化约1％至约90％。在一些方面，表面的厚度在约0.01μm至约5mm之间。 [0237] 孔的横截面宽度可能取决于有效载荷所靶向的细胞的类型。在一些方面，孔径是待靶向的细胞簇中的细胞的直径的函数。在一些方面，孔径使得细胞在穿过孔时受到扰动 (即，物理变形)。在一些方面，孔径小于细胞直径。在一些方面，孔径是细胞直径的约20％至约99％。在一些方面，孔径是细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些方面，孔径是约0.4μm、约0.5μm、约0.6μm、约0.7μm、约0.8μm、约0.9μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm或约15μm或更大。 [0238] 孔的入口和出口可以具有多种角度。在一些方面，通过调节(例如，增加或减少)孔角度，可以减少或防止孔的任何堵塞。在一些方面，流动速度(即，细胞或包含细胞的悬浮液穿过孔的速率)在约0.001mL/cm/sec至约100L/cm/sec之间。例如，入口或出口部分的角度可以在约0与约90度之间。在一些方面，孔具有相同的入口角和出口角。在一些方面，孔具有不同的入口角和出口角。在一些方面，孔边缘是光滑的，例如圆形或弯曲的。如本文所用，“光滑”孔边缘具有连续、平坦并且均匀的表面，而无凸起、脊或不均匀部分。在一些方面，孔边缘是尖锐的。如本文所用，“尖锐”孔边缘具有呈尖角或呈锐角的薄边缘。在一些方面，孔通道是平直的。如本文所用，“平直”孔通道不含曲线、弯曲、角度或其他不规则形状。在一些方面，孔通道是弯曲的。如本文所用，“弯曲”孔通道是弯曲的或者偏离直线。在一些方面，孔通道具有多个曲线，例如约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个或更多曲线。 [0239] 孔可以具有本领域中已知的任何形状，包括2维或3维形状。孔形状(例如，横截面形状)可以是但不限于圆形、椭圆形、圆形、正方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。在一些方面，孔的横截面形状是圆形。在一些方面，孔的3维形状是圆柱形或圆锥形。在一些方面，孔具有凹槽入口和出口形状。在一些方面，在给定表面内的孔之中，孔形状是均质的(即，一致或规则的)。在一些方面，在给定表面内的孔之中，孔形状是异质的(即，混合或变化的)。 [0240] 可用于本公开的表面可以具有单个孔。在一些方面，可用于本公开的表面包括多个孔。在一些方面，所述孔占表面的总表面积的约10％至约80％。在一些方面，表面含有总 5 30 15 2 计约1.0x10至约1.0x10 个孔。在一些方面，表面包括约10个与约1.0x10 个之间的孔/mm 表面积。 [0241] 所述孔可以多种方式分布在给定表面内。在一些方面，所述孔平行分布在给定表面内。在一些方面，所述孔在同一方向上并排分布，并且在给定表面内相隔相同的距离。在一些方面，所述孔的分布是有序或均质的。在此类方面，所述孔可以规则、系统的模式分布，或者可以在给定表面内相隔相同的距离。在一些方面，所述孔的分布是随机或异质的。例 如，在一些方面，所述孔以不规则、无序的模式分布，或者在给定表面内相隔不同的距离。 [0242] 在一些方面，使用多个表面，使得细胞穿过多个孔，其中所述孔是在不同的表面上。在一些方面，多个表面是串联分布的。所述多个表面在表面大小、形状和/或粗糙度上可以是均质的或异质的。所述多个表面还可以含有具有均质或异质孔径、形状和/或数量的 孔，由此使得能够将多种有效载荷同时递送至不同的细胞类型中。 [0243] 在一些方面，单个孔(例如，可用于本公开的表面的孔)具有均一的宽度尺寸(即，沿着孔通道的长度具有恒定宽度)。在一些方面，单个孔具有可变的宽度(即，沿着孔通道的长度具有增加或减少的宽度)。在一些方面，给定表面内的孔具有相同的单个孔深度。在一些方面，给定表面内的孔具有不同的单个孔深度。在一些方面，所述孔彼此紧邻。在一些方面，所述孔彼此相隔一定距离。在一些方面，所述孔彼此相隔约0.001μm至约30mm的距离。 [0244] 在一些方面，表面涂布有材料。所述材料可以选自本领域中已知的任何材料，包括但不限于特氟隆(Teflon)、粘合剂涂料、表面活性剂、蛋白质、粘附分子、抗体、抗凝剂、调节细胞功能的因子、核酸、脂质、碳水化合物、跨膜蛋白或它们的组合。在一些方面，表面涂布有聚乙烯吡咯烷酮。在一些方面，所述材料共价附着至表面。在一些方面，所述材料非共价附着至表面。在一些方面，表面分子在细胞穿过孔时被释放。 [0245] 在一些方面，表面具有改变的化学特性。在一些方面，表面是亲水性的。在一些方面，表面是疏水性的。在一些方面，表面是带电的。在一些方面，表面是带正电和/或带负电的。在一些方面，表面可以在一些区域中带正电并且在其他区域中带负电。在一些方面，表面具有总体正电荷或总体负电荷。在一些方面，表面可以是以下任一种：光滑的、电抛光的、粗糙的或等离子体处理过的。在一些方面，表面包含两性离子或偶极化合物。在一些方面，表面是等离子体处理过的。 [0247] 细胞扰动 [0248] 如本文所述，当细胞穿过收缩部时，它会发生物理变形，使得细胞的细胞膜中出现扰动(例如，洞、裂口、空腔、孔隙、孔、断裂、间隙、穿孔)。细胞膜中的此类扰动是暂时的，并且足以将本文所述的任何有效载荷(例如，包含多个连接的编码区的多核苷酸)递送至细胞中。细胞具有自我修复机制，所述机制允许细胞修复它们的细胞膜上的任何破坏。参见 Blazek等人，Physiology(Bethesda)30(6)：438‑48(2015年11月)，所述文献以引用的方式整体并入本文中。因此，在一些方面，一旦细胞已穿过收缩部(例如，微流体通道或孔)，就可以减少或消除细胞膜中的扰动，使得递送至细胞中的有效载荷不会离开细胞。 [0249] 在一些方面，在压力被去除(例如，细胞已穿过收缩部)之后，细胞膜中的扰动持续‑9 ‑9约1.0x10 秒至约2小时。在一些方面，细胞扰动持续约1.0x10 秒至约1秒，约1秒至约1分 ‑9 ‑1 钟，或约1分钟至约1小时。在一些方面，细胞扰动持续约1.0x10 秒至约1.0x10 秒之间、约‑9 ‑2 ‑9 ‑3 ‑9 1.0x10 秒至约1.0x10 秒之间、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒之间、约1.0x10 秒至约 ‑4 ‑9 ‑5 ‑9 ‑6 1.0x10 秒之间、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒之间、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒之间、约 ‑9 ‑7 ‑9 ‑8 1.0x10 秒至约1.0x10 秒或约1.0x10 秒至约1.0x10 秒之间。在一些方面，细胞扰动持续 ‑8 ‑1 ‑7 ‑1 ‑6 ‑1 约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、 ‑5 ‑1 ‑4 ‑1 ‑3 ‑1 约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒 ‑2 ‑1 或约1.0x10 秒至约1.0x10 秒。通过本文所述的方法产生的细胞扰动(例如，孔或洞)不是 由于多肽亚基组装形成多聚体孔结构(例如由补体或细菌溶血素产生的多聚体孔结构)而 形成的。 [0250] 在一些方面，当细胞穿过收缩部时，施加至细胞上的压力会暂时对细胞膜造成损伤，从而导致材料通过扰动被动扩散。在一些方面，细胞变形或受到扰动仅持续一段短时 间，例如大约100μs或更短，以最小化通过细胞信号传导机制激活凋亡途径的可能性，不过其他持续时间也是可能的(例如，介于纳秒至小时范围内)。在一些方面，细胞变形持续不足‑9 ‑9 约1.0x10 秒至不足约2小时。在一些方面，细胞变形持续不足约1.0x10 秒至不足约1秒， 不足约1秒至不足约1分钟，或不足约1分钟至不足约1小时。在一些方面，细胞变形持续约 ‑9 ‑9 1.0x10 秒至约2小时。在一些方面，细胞变形持续约1.0x10 秒至约1秒，约1秒至约1分钟，‑9 或约1分钟至约1小时。在一些方面，细胞变形持续以下任一者之间：约1.0x10 秒至约 ‑1 ‑9 ‑2 ‑9 ‑3 ‑9 1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约 ‑4 ‑9 ‑5 ‑9 ‑6 ‑9 1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约 ‑7 ‑9 ‑8 1.0x10 秒或约1.0x10 秒至约1.0x10 秒。在一些方面，细胞变形或受到扰动持续约 ‑8 ‑1 ‑7 ‑1 ‑6 ‑1 1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约 ‑5 ‑1 ‑4 ‑1 ‑3 ‑1 1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒、约1.0x10 秒至约1.0x10 秒或 ‑2 ‑1 约1.0x10 秒至约1.0x10 秒。在一些方面，使细胞变形包括使细胞变形持续一段时间，所 述时间介于但不限于约1μs至至少约750μs范围内，例如至少约1μs、至少约10μs、至少约50μs、至少约100μs、至少约500μs或至少约750μs。 [0251] 在一些方面，将本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)递送至细胞与细胞穿过收缩部同时发生。在一些方面，将多核苷酸递送至细胞中可以在细胞穿过收缩 部之后(即，当细胞膜的扰动仍然存在时并且在细胞的细胞膜恢复之前)发生。在一些方面，将多核苷酸递送至细胞中发生在细胞穿过收缩部之后大约几分钟内。在一些方面，细胞穿 过收缩部之后的扰动在细胞穿过收缩部之后大约五分钟内得到纠正。 [0252] 在一些方面，细胞(例如，干细胞或PBMC)穿过收缩部之后的活力是约5％至约100％。在一些方面，穿过收缩部之后的细胞活力是至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些方面，在细胞穿过收缩部之后约‑2 ‑2 1.0x10 秒至至少约10天内测量细胞活力。例如，可以在细胞穿过收缩部之后约1.0x10 秒 至约1秒、约1秒至约1分钟、约1分钟至约30分钟或约30分钟至约2小时内测量细胞活力。在‑2 ‑2 一些方面，在细胞穿过收缩部之后约1.0x10 秒至约2小时、约1.0x10 秒至约1小时、约 ‑2 ‑2 ‑2 ‑2 1.0x10 秒至约30分钟、约11.0x10 秒至约1分钟、约1.0x10 秒至约30秒、约1.0x10 秒至 ‑2 约1秒或约1.0x10 秒至约0.1秒内测量细胞活力。在一些方面，在细胞穿过收缩部之后约 1.5小时至约2小时、约1小时至约2小时、约30分钟至约2小时、约15分钟至约2小时、约1分钟至约2小时、约30秒至约2小时或约1秒至约2小时内测量细胞活力。在一些方面，在细胞穿过收缩部之后约2小时至约5小时、约5小时至约12小时、约12小时至约24小时或约24小时至约 10天内测量细胞活力。 [0253] 递送参数 [0254] 从本公开明显可见，许多参数可以影响使用本文所提供的挤压处理方法将本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)递送至细胞中的效率。因此，通过调节(例如，增加或减少)一个或多个递送参数，可以改进有效载荷向细胞中的递送。因此，在一些方面，本公开涉及一种增加有效载荷(例如，本文所述的多核苷酸)向细胞中的递送的方法，其中 所述方法包括调节细胞悬浮液穿过收缩部时的一个或多个参数，其中细胞悬浮液包含细胞 群体，并且其中与参考参数相比，所述一个或多个参数增加有效载荷向细胞群体中的一个 或多个细胞中的递送。如本公开别处所述，有效载荷可以在挤压步骤之前、期间或之后与细胞群体接触。 [0255] 在一些方面，与使用参考参数将有效载荷剂递送至相应细胞中相比，通过调节一个或多个递送参数，将有效载荷(例如，本文所述的多核苷酸)递送至一个或多个细胞中增 加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。 [0256] 在一些方面，所述一个或多个可以被调节成增加参数的递送效率的递送参数包含细胞密度(即，例如细胞悬浮液中存在的细胞的浓度)、压力或两者。本公开别处提供了可以调节的递送参数的额外实例。 [0257] 在一些方面，细胞密度是约1x107个细胞/mL、约2x107个细胞/mL、约3x107个细胞/7 7 7 7 7 mL、约4x10个细胞/mL、约5x10个细胞/mL、约6x10个细胞/mL、约7x10个细胞/mL、约8x10 7 8 8 8 个细胞/mL、约9x10 个细胞/mL、约1x10个细胞/mL、约1.1x10 个细胞/mL、约1.2x10个细 8 8 8 8 胞/mL、约1.3x10个细胞/mL、约1.4x10 个细胞/mL、约1.5x10 个细胞/mL、约2.0x10个细 8 8 8 8 胞/mL、约3.0x10个细胞/mL、约4.0x10 个细胞/mL、约5.0x10 个细胞/mL、约6.0x10个细 8 8 8 9 胞/mL、约7.0x10个细胞/mL、约8.0x10个细胞/mL、约9.0x10 个细胞/mL或约1.0x10个细 7 8 胞/mL或更高。在一些方面，细胞密度在约6x10个细胞/mL与约1.2x10个细胞/mL之间。 [0258] 在一些方面，压力是约20psi、约25psi、约30psi、约35psi、约40psi、约50psi、约55psi、约60psi、约65psi、约70psi、约75psi、约80psi、约85psi、约90psi、约95psi、约 100psi、约110psi、约120psi、约130psi、约140psi、约150psi、约160psi、约170psi、约 180psi、约190psi或约200psi或更高。在一些方面，压力在约30psi与约90psi之间。 [0259] 在一些方面，特定类型的装置(例如，微流体芯片)也可能对本文所述的有效载荷(例如，本文所述的多核苷酸)的递送效率产生影响。对于微流控芯片来说，不同的芯片可能具有不同的收缩部参数，例如收缩部的长度、深度和宽度；入口角、出口角、接近区域的长度、深度和宽度等。如本文所述，此类变量可能影响使用本公开的挤压处理方法将有效载荷递送至细胞中。在一些方面，收缩部的长度高达100μm。例如，在一些方面，长度是约1μm、约5μm，10μm、约20μm、约30μm、约40μm、约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm或约100μm。在一些方面，收缩部的长度小于1μm。在一些方面，收缩部的长度小于约1μm、小于约5μm、小于约 10μm、小于约20μm、小于约30μm、小于约40μm、小于约50μm、小于约60μm、小于约70μm、小于约 80μm、小于约90μm或小于约100μm。在一些方面，收缩部具有约10μm的长度。 [0260] 在一些方面，收缩部的宽度高达约10μm。在一些方面，收缩部的宽度小于约1μm、小于约2μm、小于约3μm、小于约4μm、小于约5μm、小于约6μm、小于约7μm、小于约8μm、小于约9μm或小于约10μm。在一些方面，宽度在约3μm至约10μm之间。在一些方面，宽度是约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm或约10μm。在一些方面，收缩部的宽度是约6μm。 [0261] 在一些方面，收缩部的深度是至少约1μm。在一些方面，收缩部的深度是至少约1μm、至少约2μm、至少约3μm、至少约4μm、至少约5μm、至少约10μm、至少约20μm、至少约30μm、至少约40μm、至少约50μm、至少约60μm、至少约70μm、至少约80μm、至少约90μm、至少约100μm、至少约110μm或至少约120μm。在一些方面，深度在约5μm至约90μm之间。在一些方面，深度是约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约30μm、约40μm、约50μm、约60μm、约70μm、约80μm或约90μm。在一些方面，收缩部的深度是约70μm。 [0262] 在一些方面，长度是约10μm，宽度是约6μm，并且深度是约70μm。 [0263] 可能影响有效载荷向细胞中的递送的参数的额外实例包括但不限于收缩部的尺寸(例如，长度、宽度和/或深度)、收缩部的入口角、收缩部的表面特性(例如，粗糙度、化学改性、亲水性、疏水性)、操作流动速度、有效载荷浓度、细胞恢复的时间量或它们的组合。可能影响有效载荷(例如，本文所述的多核苷酸)的递送效率的其他参数可以包括细胞在收缩 部中的速度、在收缩部中的剪切速率、细胞悬浮液的粘度、垂直于流动速度的速度分量以及在收缩部中的时间。此类参数可以被设计成控制有效载荷的递送。 [0264] 在一些方面，本公开的方法中使用的温度也可能对将有效载荷递送至细胞中的效率以及细胞的活力产生影响。在一些方面，所述挤压处理方法在约‑5℃与约45℃之间进行。 例如，所述方法可以在室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至45℃或更高)或低温(例如，约‑5℃至约4℃)或这些示例性温度之间的温度下进行。 [0265] 可以使用各种方法来驱动细胞通过收缩部。例如，可以通过入口侧的泵(例如，气瓶或压缩机)施加压力，可以通过出口侧的真空泵施加真空，可以通过管施加毛细作用，和/或系统可以是重力进料的。也可以使用基于位移的流动系统(例如，注射泵、蠕动泵、手动注射器或移液管、活塞等)。在一些方面，细胞通过正压穿过收缩部。在一些方面，细胞通过恒定压力或可变压力穿过收缩部。在一些方面，使用注射器来施加压力。在一些方面，使用泵来施加压力。在一些方面，泵是蠕动泵或隔膜泵。在一些方面，使用真空来施加压力。在一些方面，细胞通过重力穿过收缩部。在一些方面，细胞通过毛细管压力穿过收缩部。 [0266] 在一些方面，液体流动引导细胞通过收缩部。在一些方面，在细胞穿过收缩部之前，流体流动是湍流。湍流是一种流体流动，其中给定点的速度在幅度和方向上不规律变 化。在一些方面，通过收缩部的流体流动是层流。层流涉及固体边界附近的流体的不间断流动，其中每个点的流动方向保持不变。在一些方面，在细胞穿过收缩部之后，流体流动是湍流。细胞穿过收缩部时的速度可以是变化的。在一些方面，细胞以均一的细胞速度穿过收缩部。在一些方面，细胞以波动的细胞速度穿过收缩部。 [0267] 在一些方面，使用组合治疗来递送有效载荷，例如，使用本文所述的方法，随后暴露于收缩部下游的电场。在一些方面，细胞在穿过收缩部之后会穿过由至少一个电极生成的电场。在一些方面，电场有助于将有效载荷递送至细胞内的第二个位置，例如细胞核。在一些方面，一个或多个电极靠近细胞变形收缩部以生成电场。在一些方面，电场在约0.1kV/m至约100MV/m之间。在一些方面，使用集成电路来提供电信号，从而驱动电极。在一些方面，细胞暴露于电场，脉冲宽度在约1ns至约1s之间并且周期在约100ns至约10s之间。 [0268] 诱导免疫反应 [0269] 从本公开明显可知，本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)可用于诱导有需要的受试者的免疫反应。例如，如本文所证实，因为本文所述的多核苷酸包含多个连接的编码区，所以向受试者施用本公开的多核苷酸可导致诱导对由所述多个编码区编码 的一种或多种抗原的免疫反应。因此，在一些方面，本文提供了一种用于诱导有需要的受试者的多抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用多核苷酸，所述多核 苷酸包含多个连接的编码区，并且其中所述多个编码区编码多抗原。在一些方面，所述方法包括施用本公开的任何多核苷酸。在一些方面，所述方法包括向所述受试者施用多核苷酸，所述多核苷酸至少包含编码第一抗原的第一编码区和编码第二抗原的第二编码区，其中第 一编码区和第二编码区是连接的，并且其中在施用之后，在受试者中诱导了针对第一抗原 和第二抗原两者的免疫反应。在一些方面，所述方法可以包括向所述受试者施用已被修饰 成包含所述多核苷酸的细胞，使得所述细胞表达所述多种抗原。 [0270] 在一些方面，在施用之后，如与参考受试者的免疫反应相比，针对第一抗原的免疫反应有所增加。在一些方面，参考受试者包含施用之前的受试者。在一些方面，参考受试者包含未接受所述多核苷酸(即，至少包含编码第一抗原的第一编码区和编码第二抗原的第二编码区，其中第一编码区和第二编码区是连接的)的施用的相应受试者。在一些方面，参考受试者包含接受了至少两种单独的多核苷酸的施用的相应受试者，其中第一抗原和第二 抗原在单独的多核苷酸上编码。在一些方面，如与参考受试者相比，所述受试者在施用之后针对第一抗原的免疫反应增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，如与参考受试者相比，所述受试者在施用之后针对第一抗原的免疫反应增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍或更多。 [0271] 在一些方面，在施用之后，如与参考受试者的免疫反应相比，针对第二抗原的免疫反应有所增加。在一些方面，如与参考受试者相比，所述受试者在施用之后针对第二抗原的免疫反应增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，如与参考受试者相比，所述受试者在施用之后针对第二抗原的免疫反应增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约 50倍或更多。 [0272] 在一些方面，在施用之后，如与参考受试者的免疫反应相比，针对第一抗原和第二抗原两者的免疫反应有所增加。在一些方面，如与参考受试者相比，所述受试者在施用之后针对第一抗原和第二抗原两者的免疫反应增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，如与参考受试者相比，所述受试者在施用之后针对第一抗原和第二抗原两者 的免疫反应增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍或更多。 [0273] 因此，在一些方面，本文提供了一种诱导有需要的受试者的增强的免疫反应的方法。在一些方面，此类方法包括向所述受试者施用包含多个编码区的多核苷酸，其中所述多个编码区是连接的，并且其中所述多个编码区编码多种抗原。在一些方面，所述方法可以包括向所述受试者施用已被修饰成包含所述多核苷酸的细胞，使得所述细胞表达所述多种抗 原。 [0274] 在一些方面，增强的免疫反应包含：(i)如与参考免疫反应相比，诱导的免疫反应的幅度增加，(ii)如与参考免疫反应相比，诱导的免疫反应的广度增加，(iii)如与参考免疫反应相比，诱导的免疫反应的持续时间增加，或(iv)(i)至(iii)的任何组合。如本文所 述，在一些方面，参考受试者包含施用之前的受试者。在一些方面，参考受试者包含未接受所述多核苷酸(即，包含多个编码区，所述编码区是连接的并且编码多种抗原)的施用的相 应受试者。在一些方面，参考受试者包含接受了多种多核苷酸的施用的相应受试者，其中所述多种抗原中的每一种均在单独的多核苷酸上编码。 [0275] 在一些方面，如与参考受试者相比，诱导的免疫反应的幅度增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，如与参考受试者相比，诱导的免疫反应的幅度增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍或更多。 [0276] 在一些方面，如与参考受试者相比，诱导的免疫反应的广度增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，如与参考受试者相比，诱导的免疫反应的广度增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍或更多。 [0277] 在一些方面，如与参考受试者相比，诱导的免疫反应的持续时间增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约 80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，如与参考受试者相比，诱导的免疫反应的持续时间增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约 35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍或更多。 [0278] 在一些方面，如与参考受试者相比，受试者中诱导的免疫反应的幅度和广度均有所增加。在一些方面，如与参考受试者相比，受试者中诱导的免疫反应的幅度和持续时间均有所增加。在一些方面，如与参考受试者相比，受试者中诱导的免疫反应的广度和持续时间均有所增加。在一些方面，如与参考受试者相比，受试者中诱导的免疫反应的幅度、广度和持续时间均有所增加。 [0279] 从本公开明显可知，由本文所述的多核苷酸或被修饰成包含所述多核苷酸的细胞诱导的增强的免疫反应可用于治疗多种疾病或疾患。在一些方面，本文提供了一种治疗有 需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的任何多核苷 酸。本公开的一些方面涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括 向所述受试者施用多核苷酸，所述多核苷酸至少包含编码第一抗原的第一编码区和编码第 二抗原的第二编码区，其中第一编码区和第二编码区是连接的，其中第一抗原和第二抗原 与所述疾病或疾患相关。因此，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本文所述的多核苷酸(或被修饰成包含所述多核苷酸的细胞)可以用于治疗与特定抗原相关的任何疾病或疾 患。不受任何一种理论的束缚，通过在本文所述的多核苷酸的多个编码区内编码与疾病或 疾患相关的多种抗原，可以诱导针对所述多种抗原的免疫反应。在一些方面，此类免疫反应可用于治疗所述疾病或疾患。例如，在一些方面，本文所述的多核苷酸包含多个连接的编码区，其中所述多个编码区编码多种KRAS突变抗原(例如，包含G12D和/或G12V氨基酸取代)。 此类多核苷酸可以用于治疗与KRAS突变体表达相关的癌症。 [0280] 以下实施例作为说明而非作为限制来提供。 [0281] 实施例 [0282] 实施例1：用5个连接抗原分析抗原表达 [0283] 为了确定用编码5个连接在一起的抗原片段的单个mRNA挤压的免疫细胞是否可以同时引发多种抗原特异性免疫反应，用三种不同的连接抗原mRNA构建体挤压人类PBMC，每 种构建体编码HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASG12V和KRASG12D抗原的约25个氨基酸长的片段。参见图1A。每种mRNA构建体中的5个抗原片段均以与其他两种mRNA构建体不同的顺序连接。使用抗原特异性应答细胞来评估这些编码抗原的免疫原性表位在MHC I类细胞上的 呈递。 [0284] 通过将表达KRASG12V特异性TCR、E629‑38特异性TCR或E711‑19特异性TCR的慢病毒转导至已敲除了内源性TCRα/β的Jurkat‑Lucia NFAT细胞(InvivoGen)中，生成了E6 T细胞受体(TCR)、E7 TCR和KRASG12V TCR Jurkat‑Lucia NFAT报告细胞。这三种TCR与相应的肽‑MHC(pMHC)复合物的衔接会导致NFAT信号传导途径的激活和Lucia荧光素酶的分泌。 [0285] 以5×107个细胞/mL的密度制备来自人类HLA‑A*02+HLA‑A*11+供体的PBMC，并在室温下在RPMI 1640培养基中，用250μg/mL的编码5个连接在一起的抗原片段(5xL1、5xL2或 5xL3)的mRN A构建体或不用货物(空挤压)在60psi下挤压通过3.5μm宽度、10μm长度和70μm深度的收缩部。将挤压负载的PMBC转移至RPMI+10％胎牛血清+1x Pen/Strep(R10)中，在室温下淬灭。将挤压负载的PBMC在共培养基(R10)中洗涤两次，接着再悬浮于新鲜共培养基 中。 [0286] 接着将2.5×105个挤压负载的PBMC与1.25×105个E6 TCR Jurkat细胞或5×104个5 5 E7 TCR Jurkat细胞放入96孔板中进行共培养。接着将5×10个挤压负载的PBMC与2.5×10 个KRASG12V TCR Jurkat细胞放入96孔板中进行共培养。作为阳性对照，将1μM E629‑38、E711‑19或KRASG12V(7‑16)最小表位直接添加至未处理的PBMC和相关Jurkat应答细胞的共培养物 中。在37℃下孵育共培养物持续16至18小时之后，收获共培养物上清液。在添加腔肠素底物之后，通过发光测量培养物上清液中分泌的Lucia荧光素酶的水平。 [0287] 为了测量对连接抗原mRNA中的pp65片段的反应，接着将2.5×105个挤压负载的4 PBMC与6.25×10个CMV pp65特异性T细胞(Cellero)放入96孔板中进行共培养。作为阳性 对照，将1μM pp65495‑503最小表位直接添加至未处理的PBMC和CMV pp65特异性T细胞的共培养物中。在37℃下孵育共培养物持续16至18小时之后，收获共培养物上清液。为了评估pp65特异性T细胞的激活，根据制造商的方案，使用Ella免疫分析仪器(Bio‑Techne)来测量共培养物上清液中的IFNγ浓度。 [0288] 如图1B所示，与空挤压对照相比，挤压装载连接抗原mRNA并且与CMV pp65特异性T细胞、KRASG12V TCR Jurkat细胞、E6 TCR Jurkat细胞或E7 TCR Jurkat细胞共培养的人类PBMC会导致相关应答细胞的激活增加。这些结果表明，挤压装载连接抗原mRNA的人类PBMC 可以同时引发对多个抗原片段的免疫反应。 [0289] 实施例2：用10个连接抗原分析抗原表达 [0290] 为了确定用编码多达10个连接在一起的抗原片段的单个mRNA挤压的免疫细胞是否可以同时引发多种抗原特异性免疫反应，用两种不同的连接抗原mRNA构建体挤压人类 PBMC，每种构建体编码HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASG12V、KRASG12D、Flu M1、NY‑ESO‑1、HSV gD、SARS‑CoV2 S和MAGE‑A10抗原的约25个氨基酸长的片段。每种mRNA构建体中的10个抗原片段均以与另一构建体不同的顺序连接。参见图2A。使用抗原特异性应答细胞来评估 这些编码抗原的免疫原性表位在MHC I类细胞上的呈递。 [0291] 通过将表达E629‑38特异性TCR或E711‑19特异性TCR的慢病毒转导至已敲除了内源性TCRα/β的Jurkat‑Lucia NFAT细胞(InvivoGen)中，生成了E6 TCR和E7 TCR Jurkat‑LuciaNFAT报告细胞。这些TCR与相应的肽‑MHC(pMHC)复合物的衔接会导致NFAT信号传导途径的激活和Lucia荧光素酶的分泌。 [0292] 以5×107个细胞/mL的密度制备来自人类HLA‑A*02+HLA‑A*11+供体的PBMC，并在室温下在RPMI 1640培养基中，用250μg/mL的编码10个连接在一起的抗原片段(10xL1或10xL2)的mRNA构建体、用250μg/mL的编码5个连接在一起的抗原片段(5xL3)的mRNA构建体 或不用货物(空挤压)在60psi下挤压通过3.5μm宽度、10μm长度和70μm深度的收缩部。将挤压负载的PMBC转移至RPMI+10％胎牛血清+1x Pen/Strep(R10)中并且在室温下淬灭。将挤 压负载的PBMC在共培养基(R10)中洗涤两次，接着再悬浮于新鲜共培养基中。 [0293] 接着将2.5×105个挤压负载的PBMC与1.25×105个E6 TCR Jurkat细胞或5×104个E7 TCR Jurkat细胞放入96孔板中进行共培养。作为阳性对照，将1μM E629‑38或E711‑19最小表位直接添加至未处理的PBMC和相关Jurkat应答细胞的共培养物中。在37℃下孵育共培养 物持续16至18小时之后，收获共培养物上清液。在添加腔肠素底物之后，通过发光测量培养物上清液中分泌的Lucia荧光素酶的水平。 [0294] 将2.5×105个挤压负载的PBMC与6.25×104个CMV pp65、M1 Flu、NY‑ESO‑1或MAGE‑A10特异性T细胞(Cellero)放入96孔板中进行共培养。作为阳性对照，将1μM M158‑66或pp65495‑503最小表位直接添加至未处理的PBMC和相关抗原特异性T细胞的共培养物中。在37℃下孵育共培养物持续16至18小时之后，收获共培养物上清液。为了评估抗原特异性T细胞的激活，根据制造商的方案，使用Ella免疫分析仪器(Bio‑Techne)来测量共培养物上清液中的IFNγ浓度。 [0295] 如图2B和图2C所示，与空挤压对照相比，挤压装载编码10个连接在一起的抗原片段的mRNA构建体并且与CMV pp65特异性T细胞、Flu M1特异性T细胞、NY‑ESO‑1特异性T细胞、E6 TCR Jurkat细胞或E7 TCR Jurkat细胞共培养的人类PBMC会导致相关应答细胞的激 活增加。这些结果表明，挤压装载连接抗原mRNA的人类PBMC可以同时引发对多个抗原片段 的免疫反应。 [0296] 实施例3：包含连接抗原的mRNA的体外翻译效率 [0297] 为了评估编码5个连接在一起的抗原片段(HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASG12V和KRASG12D)或编码10个连接在一起的抗原片段(HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASG12V、KRASG12D、Flu M1、NY‑ESO‑1、HSV gD、SARS‑CoV2 S和MAGE‑A10)的mRNA构建体的体外翻译效率，使每种连接抗原mRNA构建体单独与小麦胚芽提取物(一种无细胞表达系统)混 合。参见图3A。 [0298] 将 SP6高产小麦胚芽蛋白预混液(Promega)解冻并立即放置在冰上。用diH2O将每种连接抗原mRNA构建体稀释至1μg/μL的最终浓度。对于每种连接抗原mRNA构建体，将2μg mRNA添加至30μL小麦胚芽提取物中，并用diH2O使其达到50μL的总体积，并且将反应物在25℃下孵育2小时。2小时孵育后，将样品放置在冰上来终止反应，并使50μL翻译的样品与 25μL样品缓冲液混合。 [0299] 对于SDS‑PAGE凝胶，将样品在95℃下加热2分钟，接着装载至至4至12％的蛋白质凝胶(Invitrogen)上。使样品在100‑130V下在凝胶上跑胶约90分钟，直至染料到达凝胶底部。将凝胶转移至硝酸纤维素膜上，并使用针对HPV E629‑38 SLP(克隆5G10)生成的第一抗体和山羊抗兔第二抗体对连接抗原进行印迹分析。通过编码5个连接抗原片段的mRNA构建体 中约26kDa蛋白质色带的存在，以及编码10个连接抗原片段的mRNA构建体中约35kDa蛋白质 色带的存在来评估翻译。 [0300] 如图3B所示，在各种幅度下检测到了每种连接抗原mRNA构建体的翻译。在各自编码5个连接在一起的模型抗原片段的三种mRNA构建体中，构建体5xL3的翻译程度最高，其次是5xL2并且最后是5xL1。在各自编码10个连接在一起的模型抗原片段的两种mRNA构建体 中，10xL2的翻译程度比10xL1更高。 [0301] 实施例4：诱导KRAS突变体特异性免疫反应 [0302] 为了确定用编码5个连接在一起的抗原片段的单个mRNA挤压的免疫细胞是否可以同时引发KRASG12V和KRASG12D抗原特异性免疫反应，用三种不同的连接抗原mRNA构建体挤压人类PBMC，每种构建体编码HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASG12V和KRASG12D抗原的约25个氨基酸长的片段。每种mRNA构建体中的5个抗原片段均以与其他两种mRNA构建体不同的顺 序连接。使用抗原特异性应答细胞来评估这些编码抗原的免疫原性表位在MHC I类细胞上 的呈递。 [0303] 通过将表达KRASG12V特异性TCR或KRASG12D特异性TCR的慢病毒转导至已敲除了内源性TCRα/β的Jurkat‑Lucia NFAT细胞(InvivoGen)中，生成了KRASG12D TCR和KRASG12V TCR Jurkat‑Lucia NFAT报告细胞。这些TCR与相应的肽‑MHC(pMHC)复合物的衔接会导致NFAT信号传导途径的激活和Lucia荧光素酶的分泌。 [0304] 以5×107个细胞/mL的密度制备来自人类HLA‑A*02+HLA‑A*11+供体的PBMC，并在室温下在RPMI 1640培养基中，用250μg/mL的编码5个连接在一起的抗原片段(5xLl、5xL2或 5xL3)的mRN A构建体或不用货物(空挤压)在60psi下挤压通过3.5μm宽度、10μm长度和70μm深度的收缩部。将挤压负载的PMBC转移至RPMI+10％胎牛血清+1x Pen/Strep(R10)中，在室温下淬灭。将挤压负载的PBMC在共培养基(R10)中洗涤两次，接着再悬浮于新鲜共培养基 中。 [0305] 接着将5×105个挤压负载的PBMC与2.5×105个KRASG12V TCR Jurkat细胞或KRASG12D TCR Jurkat细胞放入96孔板中进行共培养。作为阳性对照，将1μM KRASG12V(7‑16)或KRASG12D(7‑16)最小表位直接添加至未处理的PBMC和相关Jurkat应答细胞的共培养物 中。在37℃下孵育共培养物持续16至18小时之后，收获共培养物上清液。在添加腔肠素底物之后，通过发光测量共培养物上清液中分泌的Lucia荧光素酶的水平。 [0306] 如图4所示，与空挤压对照相比，挤压装载连接抗原mRNA并且与KRASG12V TCR Jurkat细胞共培养的人类PBMC会导致相关应答细胞的激活增加。这些结果表明，挤压装载 连接抗原mRNA的人类PBMC可以引发对KRAS突变抗原的免疫反应。 [0307] 实施例5：信号2/3对包含连接抗原的mRNA诱导的免疫反应的影响 [0308] 为了测量用编码5个连接在一起的抗原片段的单个mRNA加上或不加上额外信号2/3mRNA(编码CD86、mbIL‑2和mbIL‑12)挤压的免疫细胞的功能性CD8+T细胞反应，用编码 HPV16 E6、HPV16 E7、CMV pp65、KRASG12V和KRASG12D抗原的约25个氨基酸长的aa片段的mRNA构建体加上或不加上信号2/3mRNA挤压人类PBMC，或仅用信号2/3mRNA挤压。使用抗原特异 性原代细胞来评估这些抗原加上或不加上信号2/3的功能性CD8+T细胞反应。 [0309] 如图5A所示，从HLA‑A*02+供体分离CD8+T细胞，并用CD3/CD28 Dynabeads和rhIL‑2激活2天。连续2天用表达E629‑38特异性TCR或E711‑19特异性TCR的慢病毒转导CD8+T细胞。去除残留的慢病毒，并在共培养之前将细胞扩增5天。这些TCR与相应的肽‑MHC(pMHC)复合物的衔接会导致IFNγ产生。 [0310] 以5×107个细胞/mL的密度制备来自同一HLA‑A*02+供体的PBMC，并在室温下在RPMI 1640培养基中，用250μg/mL的连接抗原mRNA(L2)、连接抗原mRNA和信号2/3mRNA、单独信号2/3mRNA或不用货物(空挤压)在60psi下挤压通过3.5μm宽度、10μm长度和70μm深度的收缩部。将挤压负载的PMBC转移至RPMI+10％胎牛血清+1x Pen/Strep(R10)中，在室温下淬灭。将挤压负载的PBMC在共培养基(R10)中洗涤两次，接着再悬浮于新鲜共培养基中。 [0311] 接着将5×104个挤压负载的PBMC与0.2％E6 TCR或E7 TCR四聚体+CD8+T细胞和5 1.28×10 个未处理的PBMC放入96孔板中进行共培养。在37℃下孵育共培养物持续6天后， 用相应的E629‑38或E711‑19肽和golgiblock或作为阴性对照用单独的golgiblock再刺激共培养的细胞，并在37℃下孵育。在6小时的再刺激后，对细胞进行细胞内染色，并通过流式细胞术评估IFNγ和TNFα的表达。还通过流式细胞术评估了6天共培养后E711‑29五聚体+或E629‑38四聚体+CD8+T细胞的频率。 [0312] 如图5B所示，与仅用信号2/3mRNA挤压的人类PBMC相比，挤压装载连接抗原mRNA和信号2/3mRNA并且接着与E6 TCR转导的CD8+T细胞或E7 TCR转导的CD8+T细胞共培养的人类 PBMC会导致抗原特异性CD8+T细胞的激活增加。这些结果表明，当与信号2/3mRNA组合时，挤压装载连接抗原mRNA的人类PBMC可以引发强烈的免疫反应。 [0313] 实施例6：用编码两个KRAS突变体连接抗原的mRNA挤压处理后对KRAS G12V和G12D特异性反应的分析 [0314] 为了进一步评估本文所述的多核苷酸(例如，包含多个连接的编码区)的功能能力，用下文所述的连接mRNA之一对人类PBMC进行挤压处理。 [0315] (1)编码以下的连接mRNA构建体：(a)KRASG12D和KRASG12V抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)，(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“连接抗原+2/3”)； [0316] (2)仅编码KRASG12D和KRASG12V抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)的连接mRNA构建体(“G12D‑G12V连接抗原”)； [0317] (3)仅编码CD86(即，信号2)、(c)膜结合IL‑2(即，信号3)和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)的连接mRNA构建体(“信号2/3”)； [0318] (4)编码以下的连接mRNA构建体：(a)包含G12V突变的单个约25aa的片段，(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“G12V+2/3”)； [0319] (5)编码以下的连接mRNA构建体：(a)包含G12D突变的单个约25aa的片段，(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“G12D+2/3”)； [0320] (6)编码以下的连接mRNA构建体：(a)与原生野生型KRAS的前1‑25aa重叠的约25aa的片段；(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“WT+2/3”)； [0321] (7)仅编码包含G12V突变的单个约25aa的片段的mRNA构建体(即，无信号2和3)(“G12V”)； [0322] (8)仅编码包含G12D突变的单个约25aa的片段的mRNA构建体(即，无信号2和3)(“G12D”)；以及 [0323] (9)仅编码与原生野生型KRAS的前1‑25aa重叠的约25aa的片段的mRNA构建体(即，无信号2和3)(“野生型”)。 [0324] 方法 [0325] 应答细胞的生成： [0326] 为了生成A*11限制性G12V和G12D TCR Jurkat应答细胞，用表达A*11限制性G12V7‑16和G12D7‑16特异性TCR的慢病毒转导由Creative Biolabs定制制得的Jurkat‑Lucia NFAT TCRα/βKO细胞。去除残留的病毒，并且接着对细胞进行嘌呤霉素选择并培养数天，接+ 着进行小鼠TCR(mTCR)富集，以增加mTCR细胞的频率。mTCR富集后，将细胞培养数天，通过流式进行表征并且使其冻结以用于共培养分析。所得的A*11限制性G12V TCR Jurkat和 G12D TCR Jurkat应答细胞分别在细胞表面上表达HLA‑A*11限制性G12V7‑16特异性TCR或 HLA‑A*11限制性G12D7‑16特异性TCR。这些TCR与相应的肽‑MHC(pMHC)复合物的衔接(以用KRAS突变体mRNA挤压的PBMC形式提供，或与G12V7‑16或G12D7‑16A*11限制肽一起孵育)会导致NFAT信号传导途径的激活和Lucia荧光素酶的分泌。使用腔肠素底物来测量培养物上 清液中分泌的Lucia荧光素酶的水平。所产生的发光信号与分泌的Lucia荧光素酶的量相 关，证实了细胞已正确产生。 [0327] 挤压处理： [0328] 以200×106个细胞/mL的密度制备来自HLA‑A*11+供体的PBMC，并使其在4‑8℃下静置约15分钟。接着，用3.5μm宽度、10μm长度和70μm深度的收缩部在60psi下并在室温下在RPMI 1640培养基中用250μg/mL的上述mRNA构建体之一对进行PBMC挤压处理(将mRNA溶液在4‑8℃下冷却约15分钟，接着与细胞混合并进行挤压)。未用mRNA进行挤压处理(即，空挤压)的PBMC用作一个对照。挤压处理后，将挤压处理的PBMC转移至R10培养基(RPMI+10％胎 6 牛血清(FBS)+1x Pen/Strep)中，在室温下淬灭，随后在R10中洗涤并以5x10个细胞/mL进 行冷冻保存，并存储在液氮中以备将来使用。 [0329] 分析： [0330] 在共培养设置当天，在IMDM+10％FBS中以2.5x106个细胞/mL制备HLA‑A*11限制性G12V和G12D TCR Jurkat。使冷冻保存的挤压处理或未处理的PBMC解冻，将培养基更换为 6 IMDM+10％FBS，密度为5x10个细胞/mL。将G12V或G12D TCR Jurkat与PBMC以1∶2比率(250, 000个Jurkat细胞与500,000个PBMC)在组织培养物处理(TCT)的96孔U型底板中共培养过夜 (18‑24小时)。将HLA‑A*11限制性G12V7‑16和G12D7‑16或WT7‑16最小表位添加至与Jurkat细胞和未处理的PBMC的共培养物中，以控制抗原突变特异性Jurkat反应性。收集细胞培养物上 清液并通过Quanti LUC分析分泌的Lucia荧光素酶的水平。 [0331] 结果 [0332] 如图6A和图6B所示，挤压装载KRAS G12D‑G12V连接抗原mRNA加上或不加上信号2/3mRNA并与G12V TCR转导的Jurkat细胞或G12D TCR转导的Jurkat细胞共培养的人类PBMC会 导致相对于对照(空挤压、单独信号2/3mRNA、KRAS WT mRNA加上或不加上信号2/3mRNA)， G12V和G12D TCR转导的Jurkat细胞的激活出现KRAS突变体特异性增加。用KRAS G12D‑G12V连接抗原mRNA挤压的PBMC分别在G12V TCR转导或G12D TCR转导的Jurkat细胞中引发了与 它们相关的KRAS突变体单个mRNA相似或更强的突变特异性反应。 [0333] 这些结果表明，挤压装载KRAS突变体连接抗原mRNA的人类PBMC可以在G12V和G12D TCR转导的Jurkat细胞中引发强烈的突变特异性反应，类似于或强于它们各自的KRAS突变 体单个抗原mRNA。 [0334] 实施例7：用编码七个KRAS突变体连接抗原的mRNA挤压处理后对KRAS G12V和G12D特异性反应的分析 [0335] 为了评估编码超过两个连接抗原的mRNA的功能活性，用包含七个连接的KRAS突变抗原的mRNA构建体对免疫细胞(PBMC)进行挤压处理。下文提供了所用的特定mRNA构建体。 每种构建体均以两种剂量之一使用：250μg/mL和500μg/mL。 [0336] (1)仅编码KRASG12D、KRASG12V、KRASG12C、KRASG13D、KRASG12A、KRASG12R和KRASG12S抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)的连接mRNA构建体(“7mut_v1”)；和 [0337] (2)仅编码KRASG12S、KRASG12R、KRASG12A、KRASG13D、KRASG12C、KRASG12V和KRASG12D抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)的连接mRNA构建体(“7mut_v2”)。 [0338] 方法 [0339] 应答细胞的生成： [0340] 为了生成A*11限制性G12V和G12D TCR Jurkat应答细胞，用表达A*11限制性G12V7‑16和G12D7‑16特异性TCR的慢病毒转导由Creative Biolabs定制制得的Jurkat‑Lucia NFAT TCRα/βKO细胞(一次)。TCR转导后一天去除残留的病毒，并且接着对细胞进行嘌呤霉+ 素选择并培养数天，接着进行小鼠TCR(mTCR)富集，以增加mTCR 细胞的频率。mTCR富集后，将细胞培养数天，通过流式进行表征并且使其冻结以用于共培养分析。所得的A*11限制性 G12V TCR Jurkat和G12D TCR Jurkat应答细胞分别在细胞表面上表达HLA‑A*11限制性 G12V7‑16特异性TCR或HLA‑A*11限制性G12D7‑16特异性TCR。这些TCR与相应的肽‑MHC(pMHC)复合物的衔接(以用KRAS突变体mRNA挤压的PBMC形式提供，或与G12V7‑16或G12D7‑16A*11限制肽一起孵育)会导致NFAT信号传导途径的激活和Lucia荧光素酶的分泌。可以使用腔肠素底物 来测量培养物上清液中分泌的Lucia荧光素酶的水平。所产生的发光信号与分泌的Lucia荧 光素酶的量相关。 [0341] 挤压处理： [0342] 以200×106个细胞/mL的密度制备来自HLA‑A*11+供体的PBMC，使其在4‑8℃下静置约10‑15分钟，接着在室温下在RPMI 1640培养基中，用250或500μg/mL的KRAS 7mut_v1 mRNA或者250或500μg/mL的KRAS 7mut_v2 mRNA或不用货物(空挤压)在60psi下挤压通过 3.5μm宽度、10μm长度和70μm深度的收缩部(将mRNA溶液在4‑8℃下冷却约10‑15分钟，接着与细胞混合并进行挤压)。挤压后，将挤压处理的PBMC转移至R10培养基(RPMI+10％胎牛血 6 清(FBS)+1x Pen/Strep)中，在室温下淬灭，随后在R10中洗涤并以5‑10x10个细胞/mL进行冷冻保存，并存储在液氮中以备将来使用。 [0343] 分析： [0344] 在共培养设置当天，在IMDM+10％FBS中以2.5x106个细胞/mL制备HLA‑A*11限制性G12V和G12D TCR Jurkat。使冷冻保存的挤压或未处理的PBMC解冻，将培养基更换为IMDM+ 6 10％FBS，密度为5x10个细胞/mL。将G12V或G12D TCR Jurkat与PBMC以1∶2比率(250,000个Jurkat细胞与500,000个PBMC)在组织培养物处理(TCT)的96孔U型底板中共培养过夜(18‑ 24小时)。将HLA‑A*11限制性G12V7‑16和G12D7‑16最小表位添加至与Jurkat细胞和未处理的PBMC的共培养物中，以控制抗原突变特异性Jurkat反应性。收集细胞培养物上清液并通过 Quanti LUC分析分泌的Lucia荧光素酶的水平。所产生的发光信号与分泌的Lucia荧光素酶 的量相关。 [0345] 结果： [0346] 如7A和7B所示，挤压装载KRAS七个突变连接抗原mRNA并与G12V TCR转导或G12D TCR转导的Jurkat细胞共培养的人类PBMC会导致相对于对照(空挤压、未处理的PBMC和无关 突变最小表位刺激)，TCR转导的Jurkat细胞产生KRAS突变体特异性反应。G12V特异性反应： 用KRAS 7mut_v1 mRNA挤压的PBMC以剂量依赖性方式在G12V TCR转导的Jurkat细胞中引发 G12V特异性反应。用KRAS 7mut_v2 mRNA挤压的PBMC在两种挤压浓度(250、500μg/mL)下引发了相似的反应，并与用250μg/mL的KRAS 7mut_v1mRNA挤压的PBMC引发的反应可相当。 G12D特异性反应：用KRAS 7mut_v1 mRNA挤压的PBMC以剂量依赖性方式在G12D TCR转导的 Jurkat细胞中引发G12D特异性反应。用KRAS 7mut_v2 mRNA挤压的PBMC引发的G12D反应的 水平与对照组(未处理的PBMC和空挤压)中观察到的反应相似。 [0347] 这些结果表明，挤压装载KRAS 7个突变连接抗原mRNA(KRAS 7mut_v1构建体)的人类PBMC可以在G12V和G12D TCR转导的Jurkat细胞两者中引发强烈的突变特异性反应。 [0348] 实施例8：用编码七个KRAS突变体连接抗原的mRNA挤压处理后对KRAS G12V和G12D特异性反应的进一步分析 [0349] 为了评估编码七个KRAS突变抗原并且进一步编码CD86(信号2)、膜结合IL‑2(信号3)和膜结合IL‑12(信号3)的mRNA的功能活性，用以下mRNA构建体之一对免疫细胞(PBMC)进行挤压处理： [0350] (1)编码以下的连接mRNA构建体：(a)KRASG12D、KRASG12V、KRASG12C、KRASG13D、KRASG12A、KRASG12R和KRASG12S抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)(称为“KRAS 7mut_v1”)，(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“7mut_v1+信号2/3”)； [0351] (2)仅编码KRASG12D、KRASG12V、KRASG12C、KRASG13D、KRASG12A、KRASG12R和KRASG12S抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)的连接mRNA构建体(“7mut_v1”)； [0352] (3)编码以下的连接mRNA构建体：(a)KRASG12s、KRASG12R、KRASG12A、KRASG13D、KRASG12C、KRASG12V和KRASG12D抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)(此处称为KRAS 7mut_v2)，(b)CD86(即，信号2)，(c)膜结合IL‑2(即，信号3)，和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)(“7mut_v2+信号2/3”)； [0353] (4)仅编码KRASG12S、KRASG12R、KRASG12A、KRASG13D、KRASG12C、KRASG12V和KRASG12D抗原的约25aa的片段(与整个KRAS蛋白中的1‑25aa序列重叠并且在第12个密码子上存在突变)的连接mRNA构建体(“mut_v2”)；以及 [0354] (5)仅编码CD86(即，信号2)、(c)膜结合IL‑2(即，信号3)和(d)膜结合IL‑12(即，信号3)的连接mRNA构建体(“单独信号2/3”)。 [0355] 方法 [0356] 应答细胞的生成： [0357] 为了生成A*11限制性G12V和G12D TCR Jurkat应答细胞，用表达A*11限制性G12V7‑16和G12D7‑16特异性TCR的慢病毒转导由Creative Biolabs定制制得的Jurkat‑Lucia NFAT TCRα/βKO细胞(一次)。TCR转导后一天去除残留的病毒，并且接着对细胞进行嘌呤霉+ 素选择并培养数天，接着进行小鼠TCR(mTCR)富集，以增加mTCR 细胞的频率。mTCR富集后，将细胞培养数天，通过流式进行表征并且使其冻结以用于共培养分析。所得的A*11限制性 G12V TCR Jurkat和G12D TCR Jurkat应答细胞分别在细胞表面上表达HLA‑A*11限制性 G12V7‑16特异性TCR或HLA‑A*11限制性G12D7‑16特异性TCR。这些TCR与相应的肽‑MHC(pMHC)复合物的衔接(以用KRAS突变体mRNA挤压的PBMC形式提供，或与G12V7‑16或G12D7‑16A*11限制肽一起孵育)会导致NFAT信号传导途径的激活和Lucia荧光素酶的分泌。可以使用腔肠素底物 来测量培养物上清液中分泌的Lucia荧光素酶的水平。所产生的发光信号与分泌的Lucia荧 光素酶的量相关。 [0358] 挤压处理： [0359] 以200×106个细胞/mL的密度(细胞挤压浓度100×106个细胞/mL)制备来自HLA‑A*+ 11供体的PBMC，并使其在4‑8℃下静置约10‑15分钟。接着，用3.5μm宽度、10μm长度和70μm深度的收缩部在60psi下并在室温下在RPMI 1640培养基中用500μg/mL的上述mRNA构建体 之一对进行PBMC挤压处理(将mRNA溶液在4‑8℃下冷却约15分钟，接着与细胞混合并进行挤压)。挤压后，将挤压处理的PBMC转移至R10培养基(RPMI+10％胎牛血清(FBS)+1xPen/ 6 Strep)中，在室温下淬灭，随后在R10中洗涤并以5x10 个细胞/mL进行冷冻保存，并存储在液氮中以备将来使用。 [0360] 分析： [0361] 在共培养设置当天，在IMDM+10％FBS中以2.5x106个细胞/mL制备HLA‑A*11限制性G12V和G12D TCR Jurkat。使冷冻保存的挤压或未处理的PBMC解冻，将培养基更换为IMDM+ 6 10％FBS，密度为5x10个细胞/mL。将G12V或G12D TCR Jurkat与PBMC以1∶2比率(250,000个Jurkat细胞与500,000个PBMC)在组织培养物处理(TCT)的96孔U型底板中共培养过夜(18‑ 24小时)。将HLA‑A*11限制性G12V7‑16和G12D7‑16最小表位添加至与Jurkat细胞和未处理的PBMC的共培养物中，以控制抗原突变特异性Jurkat反应性。收集细胞培养物上清液并通过 Quanti LUC分析分泌的Lucia荧光素酶的水平。所产生的发光信号与分泌的Lucia荧光素酶 的量相关。 [0362] 结果 [0363] 如图8A和图8B所示，挤压装载KRAS七个突变连接抗原mRNA加上或不加上信号2/3mRNA并与G12V TCR转导或G12D TCR转导的Jurkat细胞共培养的人类PBMC会导致相对于对 照(空挤压、未处理的PBMC、单独信号2/3mRNA和无关突变最小表位刺激)，TCR转导的Jurkat细胞产生KRAS突变体特异性反应。G12V特异性反应：用500μg/mL的KRAS 7mut_v1 mRNA或 KRAS 7mut_v2 mRNA(加上或不加上信号2/3mRNA)挤压的PBMC会在G12V TCR转导的Jurkat 细胞中引发G12V特异性反应。G12D特异性反应：用500μg/mL的KRAS 7mut_v1 mRNA(加上或不加上信号2/3mRNA)挤压的PBMC会在G12D TCR转导的Jurkat细胞中引发G12D特异性反应。 [0364] 这些结果还表明，挤压装载KRAS 7个突变连接抗原mRNA (KRAS 7mut_v1构建体)的人类PBMC可以在G12V和G12D TCR转导的Jurkat细胞两者中引发强烈的突变特异性反应。 [0365] 表2.示例性序列 [0366] [0367] 以引用的方式并入 [0368] 本申请中引用的所有公布、专利、专利申请和其他文件由此以引用的方式整体并入来达成所有目的，其并入程度就如同每篇单独的公布、专利、专利申请或其他文件被单独指出以引用的方式并入来达成所有目的一般。 [0369] 等效方案 [0370] 虽然已经说明和描述了各种具体方面，但上述说明书并非限制性的。应理解，可以进行各种改变而不脱离本公开的精神和范围。在阅读本说明书后，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。 |
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