| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 实质审查; 驳回; |
| 专利有效性 | 无效专利 | 当前状态 | 驳回 |
| 申请号 | CN201810784491.1 | 申请日 | 2018-07-17 |
| 公开(公告)号 | CN109010813A | 公开(公告)日 | 2018-12-18 |
| 申请人 | 成都安特金生物技术有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 王倩; 罗丽娜; 苏玉婷; 钟正丹; 王超; 李银波; 敬小兵; 刘思利; 张建军; 凌燕; 杨冬妮; 黄放; 王岩; 薛平; | 第一发明人 | 王倩 |
| 权利人 | 成都安特金生物技术有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 成都安特金生物技术有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：四川省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：四川省成都市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：四川省成都市高新区科园南路88号C1栋415 | 邮编 | 当前专利权人邮编：610000 |
| 主IPC国际分类 | A61K39/095 | 所有IPC国际分类 | A61K39/095 ; A61K39/102 ; A61K39/02 ; A61K39/085 ; A61K39/00 ; A61K39/09 ; A61K39/106 ; A61K39/08 ; A61P31/04 ; A61P31/10 ; G01N33/557 ; G01N33/558 ; G01N21/82 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京驰纳智财知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 陈常美; |
| 摘要 | 本 发明 涉及一种免疫原性多糖及其 鉴别 方法以及根据上述免疫原性多糖制备的多糖 疫苗 及其鉴别方法。免疫速率散射比浊至少包括将多糖 抗原 与相应 抗体 接触 形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。本发明的速率散射比浊法是一种基于免疫化学方法建立的技术手段，速率散射比浊法可测量悬浮于小杯中的颗粒所造成的散射光强度变化，可在几十秒内得出反应速率值。抗原抗体反应形成抗原抗体复合物聚集体颗粒，抗原或抗体浓度的不同形成颗粒的速率不同。该法特异性强，灵敏度高，节约检测时间，且抗原抗体直接接触，有利于低浓度样品检测，可用于疫苗生产过程中原液和/或半成品和/或成品的鉴别。 | ||
| 权利要求 | 1.一种免疫原性多糖，所述多糖是采用免疫速率散射比浊进行鉴别，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖抗原与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。 |
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| 说明书全文 | 一种免疫原性多糖疫苗及其鉴别方法技术领域[0001] 本发明涉及医疗领域，具体的涉及疫苗及疫苗的鉴别，尤其是一种免疫原性多糖及其鉴别方法以及一种免疫原性多糖疫苗及其鉴别方法。 背景技术[0002] 细菌中存在的多糖物质，在细菌的识别、信号传递、黏附、感染及防御等方面发挥着重要作用，通过提取纯化细菌中引起特异性保护作用的多糖抗原，可生产具有特异性的多糖疫苗。接种多糖疫苗可预防多种疾病感染，控制好多糖疫苗质量尤其重要，只有疫苗被鉴别无误、组分正确后，才有必要进行检查和含量测定等分析工作。尤其在疫苗中存在多种抗原时，鉴别试验在检测疫苗的质量稳定性，疫苗组分的正确性过程中起到了至关重要的作用。除此之外，利用特异性免疫反应对疫苗进行鉴别试验，还可以间接证明疫苗中各有效成分是否具有相应的抗原性，疫苗制备的工艺过程是否会破坏各成分的抗原性。 [0003] 鉴别试验作为判断疫苗真伪，明确疫苗组分等的有效手段，在疫苗的质量检验工作中当属首项。欧洲药典《European Pharmacopoeia 8.0》、WHO规程《WHO Technical Report Series》、《中华人民共和国药典》(2015年版三部)均要求对疫苗原液和成品进行鉴别。《European Pharmacopoeia 8.0》中推荐多糖疫苗如：脑膜炎球菌多糖疫苗、伤寒多糖疫苗、肺炎球菌多糖疫苗用免疫学方法和核磁共振技术进行鉴别试验，《WHO Technical Report Series》推荐多糖疫苗如：脑膜炎球菌多糖疫苗用免疫学方法和核磁共振技术进行鉴别试验，《中华人民共和国药典》(2015版三部)中收载的多糖疫苗制品如：伤寒Vi多糖疫苗、A群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗推荐鉴别方法为免疫双扩散法。该法是在琼脂板上打孔，抗原抗体加入相应孔中，待其自由扩散后，抗原抗体形成可见的沉淀线。其中抗原抗体自由扩散的速度受分子量影响，分子量小者，扩散快，反之较慢。自由扩散这一性质使得该法耗时长，且对于分子量较大的样品沉淀线不明显。 [0004] 《中华人民共和国药典》(2015年版3部)中收载的多糖疫苗采用免疫学鉴别方法(免疫双扩散法)，该法具体操作是：取琼脂糖加生理盐水煮沸溶胀成1.5％溶液，趁热倾倒于水平玻板上(每平方厘米加0.19ml琼脂糖)，凝固后，在玻板上打方阵型孔(直径3mm，孔距3mm)。根据需要确定方阵型图数量。中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液，并留1孔加入相应阳性对照血清，每孔加样20μl，然后置水平湿盒中，37℃水平扩散24h。用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5％氨基黑溶液中染色。用脱色液脱至背景无色，沉淀线呈清晰蓝色为止。用适当方法保存或复制图谱。该法中抗原抗体浓度不宜过小，自由扩散过程的稀释，导致浓度太小无法产生沉淀线，样品分子量过大也不利于扩散，影响试验效果。 [0005] 具体操作时，免疫双扩散法需预先制备凝胶板，将抗原抗体稀释至合适浓度，分别加入相应孔中，37℃水平扩散24h，再浸泡30min，染色30min，再经脱色液脱至背景无色，观察，整个过程耗时2天左右甚至更长，且采用自由扩散的方式使抗原抗体接触，样品分子量不宜过大，浓度不宜过低，否则均较难形成清晰的沉淀线，尤其对于在制备过程中因一系列反应使抗原性降低的样品，更难以达到免疫双扩散法中需求的适宜的抗原浓度，从而导致鉴别试验实施困难。 发明内容[0006] 为了克服现有疫苗鉴别技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种免疫原性多糖及其鉴别方法，以及根据上述免疫原性多糖制备的多糖疫苗及其鉴别方法。本发明的速率散射比浊法是一种基于免疫化学方法建立的技术手段，速率散射比浊法可测量悬浮于小杯中的颗粒所造成的散射光强度变化，可在几十秒内得出反应速率值。抗原抗体反应形成抗原抗体复合物聚集体颗粒，抗原或抗体浓度的不同形成颗粒的速率不同。该法特异性强，灵敏度高，节约检测时间，且抗原抗体直接接触，有利于低浓度样品检测，可用于疫苗生产过程中原液和/或半成品和/或成品的鉴别。 [0007] 本发明提供了一种免疫原性多糖，所述多糖是采用免疫速率散射比浊进行鉴别，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖抗原与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。 [0008] 优选的是，所述多糖包括脑膜炎奈瑟球菌任一血清群荚膜多糖、流感嗜血杆菌任一血清型荚膜多糖、伤寒沙门菌Vi多糖、金黄色葡萄球菌任一血清型荚膜多糖、隐球菌任一血清型荚膜多糖、链球菌任一血清群荚膜多糖、艰难梭菌任一血清群荚膜多糖、霍乱弧菌任一血清群荚膜多糖、肺炎克雷伯杆菌任一血清型荚膜多糖中的至少一种。 [0009] 本发明还公开一种鉴别免疫原性多糖的方法，免疫速率散射比浊法，包括下列步骤： [0010] (1)检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值； [0011] (2)改变反应时间检测抗原抗体反应速率值； [0012] (3)标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值； [0013] (4)测试多糖供试样品。 [0014] 优选的是，所述步骤(1)中检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值包括以下步骤： [0015] a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值。 [0016] b)选择a)中抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值。其中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。 [0017] 上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中通过选择多糖抗原标准品浓度和抗体稀释倍数，改变反应时间检测抗原抗体反应速率值。具体的通过选择步骤b)中的抗原标准品浓度和步骤a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值，其中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。 [0018] 上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中通过选择确定的抗体稀释倍数和反应时间，用不同浓度的多糖抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。具体的通过选择确定的抗体稀释倍数和步骤(2)中的反应时间，用不同浓度的抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。 [0019] 上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中应用标定曲线的方法测试多糖供试样品，其速率值大于抗原抗体反应浓度-速率曲线最低点速率值判定多糖供试样品原液鉴别试验合格。抗原抗体反应浓度-速率曲线为步骤(3)中标定的抗原抗体反应浓度-速率曲线。 [0020] 上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中选择确定的抗体稀释倍数和反应时间，测试多糖供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于阴性对照速率值判定多糖供试样品原液鉴别试验合格。 [0021] 上述任一方案优选的是，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水。即通过选择确定的抗体稀释倍数和步骤(3)中的反应时间，测试免疫原性多糖供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于cutoff值(阴性对照速率值)判定多糖鉴别试验合格，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水，其中cutoff值为阴性对照平均速率值，优选为2.1倍阴性对照平均速率值，更优选为阴性对照平均速率值加上2个标准差，最优选为阴性对照平均速率值加3个标准差。 [0022] 上述任一方案优选的是，所述免疫原性多糖包括脑膜炎奈瑟球菌任一血清群荚膜多糖、流感嗜血杆菌任一血清型荚膜多糖、伤寒沙门菌Vi多糖、金黄色葡萄球菌任一血清型荚膜多糖、隐球菌任一血清型荚膜多糖、链球菌任一血清群荚膜多糖、艰难梭菌任一血清群荚膜多糖、霍乱弧菌任一血清群荚膜多糖、肺炎克雷伯杆菌任一血清型荚膜多糖中的至少一种。 [0023] 上述任一方案优选的是，所述多糖疫苗是经过免疫速率比浊进行鉴别的，所述免疫速率散射比浊包括将多糖疫苗供试样品与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。即利用抗原与抗体特异结合形成抗原抗体复合物所测得的速率单位值对多糖疫苗进行鉴别。 [0024] 上述任一方案优选的是，所述多糖疫苗中多糖包括脑膜炎奈瑟球菌任一血清群荚膜多糖、流感嗜血杆菌任一血清型荚膜多糖、伤寒沙门菌Vi多糖、金黄色葡萄球菌任一血清型荚膜多糖、隐球菌任一血清型荚膜多糖、链球菌任一血清群荚膜多糖、艰难梭菌任一血清群荚膜多糖、霍乱弧菌任一血清群荚膜多糖、肺炎克雷伯杆菌任一血清型荚膜多糖中的至少一种。 [0025] 本发明还公开一种鉴别免疫原性多糖疫苗的方法，采用免疫速率散射比浊方法，包括下列步骤： [0026] (1)检测抗原标准品与抗体反应速率值； [0027] (2)改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值； [0028] (3)标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值； [0029] (4)测试多糖疫苗供试样品。 [0030] 优选的是，所述步骤(1)中检测抗原标准品与抗体反应速率值包括以下步骤： [0031] a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测抗原标准品与抗体反应速率值； [0032] b)选择a)抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测抗原标准品与抗体反应速率值。其中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。 [0033] 上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中通过选择抗原标准品浓度和抗体稀释倍数，改变反应时间检测抗原抗体反应速率值。具体的通过选择步骤b)的抗原标准品浓度和步骤a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值，其中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。 [0034] 上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中通过选择确定的抗体稀释倍数和反应时间，用不同浓度的抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应速率-浓度曲线，记录最低点反应速率值。具体的通过选择确定的抗体稀释倍数和步骤(2)的反应时间，用不同浓度的抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。 [0035] 上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中应用标定曲线的方法测试多疫苗供试样品，其速率值大于抗原抗体反应浓度-速率曲线最低点速率值判定疫苗鉴别试验合格。抗原抗体反应浓度-速率曲线为步骤(3)中标定的抗原抗体反应浓度-速率曲线。 [0036] 上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中选择确定的抗体稀释倍数和反应时间，测试多糖疫苗供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于阴性对照速率值判定疫苗鉴别试验合格。在该方法中步骤(3)不是必须步骤。 [0037] 上述任一方案优选的是，所述阴性对照包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水。即通过选择确定的抗体稀释倍数和步骤c)的反应时间，测试多糖疫苗供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于cutoff值(阴性对照速率值)判定多糖疫苗鉴别试验合格，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水，其中cutoff值为阴性对照平均速率值，优选为2.1倍阴性对照平均速率值，更优选为阴性对照平均速率值加上2个标准差，最优选为阴性对照平均速率值加3个标准差。 [0038] 上述任一方案优选的是，所述多糖疫苗中多糖包括脑膜炎奈瑟球菌任一血清群荚膜多糖、流感嗜血杆菌任一血清型荚膜多糖、伤寒沙门菌Vi多糖、金黄色葡萄球菌任一血清型荚膜多糖、隐球菌任一血清型荚膜多糖、链球菌任一血清群荚膜多糖、艰难梭菌任一血清群荚膜多糖、霍乱弧菌任一血清群荚膜多糖、肺炎克雷伯杆菌任一血清型荚膜多糖中的至少一种。 [0039] 有益效果： [0040] (1)本发明的一种免疫原性多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法与现有技术及文献不同。在现有文献报道和上述典籍的方案中，多糖的鉴别方法为免疫学方法或核磁共振技术。其中免疫学方法涉及样品在体系中的扩散，因此样品需较高的浓度；核磁共振技术样品需求量大，且对样品纯度要求高。本发明的免疫速率散射比浊法，抗原抗体直接接触，不会因扩散稀释样品，形成的抗原抗体复合物由仪器通过散射光强的改变直接检测，所需样品浓度小，通常只需几十微克，几微克，甚至可鉴别浓度小于1μg/ml的样品，灵敏度高。 [0041] (2)本发明的一种免疫原性多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，是基于免疫学原理建立的，抗原仅与其对应的抗体发生特异性反应，形成抗原抗体复合物聚集体，对于含多组分的样品尤其适用，鉴别样品中某一组分时可排除其他组分的干扰，特异性好。 [0042] (3)本发明的一种免疫原性多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，整个鉴别过程在免疫化学系统(Immunochemistry System)中进行，从取样、反应到检测均由仪器完成，速率比浊检测器通过检测经过抗原抗体复合物聚集颗粒的光散射强度变化，将其转换成速率单位值，将结果数字化直接读取，更加直观。而上述典籍中推荐的免疫沉淀和免疫电泳法，采用肉眼观察，这就要求形成的沉淀线足够清晰，核磁共振技术则需要解析图谱，寻找特征峰，对于结构复杂的多糖图谱解析困难。 [0043] (4)本发明的一种免疫原性多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，抗原抗体直接接触反应，省去扩散的时间，在反应开始后的10分钟内便可得出结果，且可同时检测72个样品。而常用的免疫沉淀法通过自由扩散使抗原抗体接触，耗时长达十几个小时，免疫电泳法使抗原抗体接触，也需几十分钟甚至更长，而后还需染色脱色至少几小时甚至几天，方可观察结果，步骤繁琐耗时长。 [0044] (5)本发明的一种免疫原性多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，因其较高的灵敏度高，所需抗原抗体浓度低，无需染色剂脱色液，不必制备凝胶板，大大节约鉴别试验成本。 [0045] (6)本发明所述的一种免疫原性多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法-免疫速率散射比浊法，是经过免疫速率散射比浊检测免疫原性多糖及多糖疫苗中抗原与相应抗体的反应速率值，可大大提高疫苗生产过程中鉴别的效率，缩短时间。 [0046] (7)本发明所述的一种免疫原性多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，该方法基于抗原抗体特异性反应的免疫学原理，抗原抗体在37℃直接接触，在反应开始后10min内由检测器直接读取速率值，直观表达速率值，无需染色脱色，可对低浓度样品进行鉴别，灵敏度高，结果可靠；且将自由扩散后的接触改为直接接触，缩短试验时间，大大提高了鉴别效率，可应用于疫苗生产中原液、半成品和成品鉴别，在生产中具有很大的应用价值。 [0047] (8)建立了一种免疫原性多糖的鉴别方法-免疫速率散射比浊鉴别法，确定了抗原抗体反应的适宜浓度，合适的反应时间，并对方法进行精密度、准确度和专属性验证，应用建立的方法鉴别脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群荚膜多糖，伤寒沙门菌Vi多糖。 [0048] (9)建立了一种多糖疫苗的鉴别方法-免疫速率散射比浊鉴别法，确定了抗原抗体反应的适宜浓度，合适的反应时间，并对方法进行精密度、准确度和专属性验证，应用建立的方法鉴别A群脑膜炎球菌多糖疫苗、C群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗、伤寒Vi多糖疫苗。 [0049] (10)本发明中建立的免疫速率散射比浊鉴别法，是将抗原抗体稀释至合适浓度，37℃直接接触反应，在10min内读取反应速率值。相较于免疫双扩散法，免疫速率散射比浊法操作简单，耗时短，无需凝胶板，无需染色脱色，直接接触也使抗原抗体可在较小的浓度范围进行反应，结果直观，对于抗原性降低的大分子样品尤为适合。 [0050] 以上公开的内容对本发明进行了一般性描述，可以通过如下实施例，但非限制，举例进一步理解本发明的核心内容或精神。所述实施例仅用于阐述本发明的概念和几个优选的实施方案，不应理解为以任何方式限制本发明的范围。应当理解本发明并不限于如下具体实施方案，并且对如下实施例进行的多种变化、调整、修饰、修改、改变、改良、改进、减少、简化、增加、增添等可以由本领域技术人员实施，而不背离本发明的范围或精神。本发明的其它实施例在不背离本发明的核心的前提下为本领域技术人员所预见。附图说明 [0051] 图1为脑膜炎球菌抗体稀释倍数确定图。 [0052] 图2为脑膜炎球菌多糖抗原浓度范围确定图。 [0053] 图3为伤寒沙门菌Vi多糖抗体稀释倍数确定图。 [0054] 图4为伤寒沙门菌Vi多糖抗原浓度范围确定图。 [0055] 图5为伤寒沙门菌Vi多糖反应时间确定图。 [0056] 图6为伤寒沙门菌Vi多糖抗原浓度-速率值线性图。 [0057] 图7为伤寒Vi多糖鉴别结果图。 [0058] 图8为伤寒Vi多糖鉴别结果图。 [0059] 图9为A群脑膜炎球菌多糖免疫双扩散鉴别试验结果图；图中1、2、3、4、为A群脑膜炎球菌多糖，5为阳性对照，6为阴性对照，7为A群脑膜炎球菌多糖抗血清。 [0060] 图10为A群脑膜炎球菌多糖疫苗1免疫双扩散鉴别试验结果图；图中1、2、3、4、为A群脑膜炎球菌多糖，5为阳性对照，6为阴性对照，7为A群脑膜炎球菌多糖抗血清。 具体实施方式[0061] [0062] 本发明可通过结合如下实施例进一步论述，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商建议的条件，除非另行定义，文中使用的所有专业与科学用语及缩写与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 [0063] 以下实施例中使用的免疫化学系统(Immunochemistry System)(购自Beckman Coulter公司，型号：IMMAGE 800)、所用配套稀释液I、缓冲液I、清洗液(均购自Beckman Coulter公司)。 [0064] 实施例1 [0065] 本发明提供一种免疫原性多糖，所述多糖是经过免疫速率散射比浊进行鉴别的，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖溶液与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。 [0066] 本发明进一步优化的技术方案，所述免疫原性多糖包括脑膜炎奈瑟球菌任一血清群荚膜多糖、流感嗜血杆菌任一血清型荚膜多糖、伤寒沙门菌Vi多糖、金黄色葡萄球菌任一血清型荚膜多糖、隐球菌任一血清型荚膜多糖、链球菌任一血清群荚膜多糖、艰难梭菌任一血清群荚膜多糖、霍乱弧菌任一血清群荚膜多糖、肺炎克雷伯杆菌任一血清型荚膜多糖等中的至少一种。 [0067] 本发明还提供了一种鉴别免疫原性多糖的免疫速率散射比浊方法，所述方法至少包括下列步骤： [0068] a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测抗原标准品与抗体反应速率值。 [0069] b)选择a)抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。 [0070] c)选择b)的抗原标准品浓度和a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值，其中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。 [0071] d)选择确定的抗体稀释倍数和c)的反应时间，用不同浓度的抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。 [0072] e)应用标定曲线的方法测试免疫原性多糖供试样品，其速率值大于d)曲线最低点速率值判定多糖鉴别试验合格。 [0073] 本发明还提供了另外一种鉴别免疫原性多糖的免疫速率散射比浊方法，所述方法至少包括下列步骤： [0074] a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测抗原标准品与抗体反应速率值。 [0075] b)选择a)抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。 [0076] c)选择b)的抗原标准品浓度和a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值，其中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。 [0077] d)选择确定的抗体稀释倍数和c)的反应时间，测试免疫原性多糖供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于cutoff值(阴性对照速率值)判定多糖鉴别试验合格，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水，其中cutoff值为阴性对照平均速率值，优选为2.1倍阴性对照平均速率值，更优选为阴性对照平均速率值加上2个标准差，最优选为阴性对照平均速率值加3个标准差。 [0078] 本发明进一步优化的技术方案，所述免疫原性多糖包括脑膜炎奈瑟球菌任一血清群荚膜多糖、流感嗜血杆菌任一血清型荚膜多糖、伤寒沙门菌Vi多糖、金黄色葡萄球菌任一血清型荚膜多糖、隐球菌任一血清型荚膜多糖、链球菌任一血清群荚膜多糖、艰难梭菌任一血清群荚膜多糖、霍乱弧菌任一血清群荚膜多糖、肺炎克雷伯杆菌任一血清型荚膜多糖等中的至少一种。 [0079] 在该实施例中，建立了一种免疫原性多糖的鉴别方法-免疫速率散射比浊鉴别法，确定了抗原抗体反应的适宜浓度，合适的反应时间，并对方法进行精密度、准确度和专属性验证，应用建立的方法鉴别脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群荚膜多糖。 [0080] 实施例2 [0081] 本发明提供一种免疫原性多糖制备的多糖疫苗，所述多糖疫苗是经过免疫速率散射比浊进行鉴别的，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖疫苗与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。换言之，利用抗原与抗体特异结合形成抗原抗体复合物所测得的速率单位值对多糖疫苗进行鉴别。 [0082] 本发明进一步优化的技术方案，所述多糖疫苗中多糖包括脑膜炎奈瑟球菌任一血清群荚膜多糖、流感嗜血杆菌任一血清型荚膜多糖、伤寒沙门菌Vi多糖、金黄色葡萄球菌任一血清型荚膜多糖、隐球菌任一血清型荚膜多糖、链球菌任一血清群荚膜多糖、艰难梭菌任一血清群荚膜多糖、霍乱弧菌任一血清群荚膜多糖、肺炎克雷伯杆菌任一血清型荚膜多糖等中的至少一种。 [0083] 本发明还提供了一种鉴别多糖疫苗的免疫速率散射比浊方法，所述方法至少包括下列步骤： [0084] a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测抗原标准品与抗体反应速率值。 [0085] b)选择a)抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。 [0086] c)选择b)的抗原标准品浓度和a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值，其中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。 [0087] d)选择确定的抗体稀释倍数和c)的反应时间，用不同浓度的抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。 [0088] e)应用标定曲线的方法测试多糖疫苗供试样品，其速率值大于d)曲线最低点速率值判定多糖疫苗鉴别试验合格。 [0089] 本发明还提供了一种鉴别多糖疫苗的免疫速率散射比浊方法，所述方法至少包括下列步骤： [0090] a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测抗原标准品与抗体反应速率值。 [0091] b)选择a)抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。 [0092] c)选择b)的抗原标准品浓度和a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值，其中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。 [0093] d)选择确定的抗体稀释倍数和c)的反应时间，测试多糖疫苗供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于cutoff值(阴性对照速率值)判定多糖疫苗鉴别试验合格，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水，其中cutoff值为阴性对照平均速率值，优选为2.1倍阴性对照平均速率值，更优选为阴性对照平均速率值加上2个标准差，最优选为阴性对照平均速率值加3个标准差。 [0094] 本发明进一步优化的技术方案是，所述多糖疫苗中的多糖包括脑膜炎奈瑟球菌任一血清群荚膜多糖、流感嗜血杆菌任一血清型荚膜多糖、伤寒沙门菌Vi多糖、金黄色葡萄球菌任一血清型荚膜多糖、隐球菌任一血清型荚膜多糖、链球菌任一血清群荚膜多糖、艰难梭菌任一血清群荚膜多糖、霍乱弧菌任一血清群荚膜多糖、肺炎克雷伯杆菌任一血清型荚膜多糖等中的至少一种。 [0095] 在该实施例中，建立了一种多糖疫苗的鉴别方法-免疫速率散射比浊鉴别法，确定了抗原抗体反应的适宜浓度，合适的反应时间，并对方法进行精密度、准确度和专属性验证，应用建立的方法鉴别A群脑膜炎球菌多糖疫苗、C群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗、伤寒沙门菌Vi多糖疫苗。 [0096] 实施例3 [0097] (1)样品来源脑膜炎球菌血清群A、C、Y、W135荚膜多糖、流感嗜血杆菌血清型b荚膜多糖、破伤风类毒素参考品均购于NIBSC(英国国家生物制品检定所)，脑膜炎球菌血清群A、C、Y、W135抗血清均购于BD生物公司，伤寒Vi多糖抗血清购于中国食品药品检定研究院。 [0098] (2)按照本公司另一发明专利CN201010129404.2公布方法制备脑膜炎球菌血清群A、C、Y、W135荚膜多糖、A群脑膜炎球菌多糖疫苗、C群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗，根据中国专利CN201110171746.5公布方法制备伤寒Vi多糖及其疫苗。 [0099] (3)按《中华人民共和国药典》(2015版三部)规定项目和方法检定。 [0100] 以下实施例中抗体稀释倍数、多糖标准品浓度范围及反应时间仅限于本次试验，但非限制，因标准抗体无准确抗体含量或滴度，由其瓶号、批次、titer的不同，多糖标准品批次不同，各血清型抗原抗体反应特性的差异，可根据实际情况调整反应参数。 [0101] 实施例4脑膜炎球菌多糖的鉴别 [0102] (1)根据发明内容实施例1所述方法，建立脑膜炎球菌多糖鉴别方法。取脑膜炎球菌荚膜多糖标准品，溶解成含多糖6μg/ml溶液，取一定量脑膜炎球菌多糖抗血清，按1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8稀释成不同梯度，将抗原抗体放入仪器对应位置，运行反应 1.5min，记录各稀释倍数下速率单位值，图1、表1，得出脑膜炎各血清群多糖抗体稀释范围，脑膜炎球菌血清群A、C、Y、W135对应抗血清稀释范围分别为1～5、1～6、1～4、1～5。 [0103] 表1.脑膜炎球菌抗体不同稀释倍数对应速率值 [0104] [0105] (2)取上述项确定的抗体稀释倍数，脑膜炎球菌血清群A、C、Y、W135分别选择1:5、1:6、1:3、1:4倍稀释，将多糖标准品溶解成不同的浓度梯度(具体为2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml)，将抗原抗体放入仪器对应位置，运行反应1.5min，记录各浓度下速率单位值，当抗原浓度在2μg/ml～10μg/ml范围内，速率值随浓度增加而变大，绘制速率-浓度曲线，发现当抗原浓度增大到8μg/ml后，增幅稍减小，图2、表2，为保证曲线具有良好线性，确定抗原的浓度范围为2μg/ml～8μg/ml。根据上述两项确定的抗体稀释倍数和抗原浓度(6μg/ml)，改变反应时间(具体为1.5min、2.5min、5min、7.5min、10min)，将抗原抗体放入仪器对应位置，运行，记录各时间下反应速率值，表3，1.5min～2.5min达到最大反应速率值，选择2.5min为最佳反应时间。根据确定的反应参数(脑膜炎球菌血清群A、C、Y、W135分别稀释 5、6、3、4倍，反应时间2.5min)，将抗原抗体放入仪器对应位置，运行，记录各浓度下反应速率值，及线性最低点速率值，表4。并对方法进行精密度、准确度、专属性验证。 [0106] 表2.脑膜炎球菌多糖抗原浓度范围确定 [0107] [0108] [0109] 表3.脑膜炎球菌不同反应时间对应速率值 [0110] [0111] 表4.脑膜炎球菌浓度-速率值表 [0112] [0113] (3)取脑膜炎球菌血清群A、C、Y、W135多糖稀释至多糖2.5μg/ml～7.5μg/ml，同时取多糖溶剂系统(生理氯化钠溶液)为阴性对照，将对应抗体稀释对应倍数(脑膜炎球菌血清群A、C、Y、W135分别稀释5、6、3、4倍)，将抗原抗体放入仪器对应位置，抗原抗体取样量各20μl反应2.5min，应用建立曲线的参数测试多糖速率值。 [0114] (4)脑膜炎球菌多糖鉴别结果见表5。脑膜炎球菌多糖速率值均大于其对应曲线最低点速率值，且大于阴性对照平均值，脑膜炎球菌多糖鉴别试验合格。 [0115] 表5.脑膜炎球菌多糖鉴别试验结果 [0116] [0117] [0118] 实施例5脑膜炎球菌多糖疫苗的鉴别 [0119] (1)根据实施例4建立的脑膜炎球菌多糖鉴别方法测试样品。取A群脑膜炎球菌多糖疫苗、C群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗稀释至含各群多糖2.5μg/ml～7.5μg/ml，同时取脑膜炎球菌多糖疫苗溶剂系统(生理氯化钠溶液)为阴性对照，脑膜炎球菌血清群A、C、Y、W135抗血清分别稀释5、6、3、4倍，将抗原抗体放入仪器对应位置，抗原抗体取样量各20μl反应2.5min，应用建立曲线的参数测试多糖速率值。 [0120] (2)脑膜炎球菌多糖疫苗鉴别结果见表6。由结果可以看出，脑膜炎球菌多糖疫苗速率值均大于曲线最低点速率值，大于阴性对照速率值，脑膜炎球菌多糖疫苗鉴别试验合格。 [0121] 表6.脑膜炎球菌多糖疫苗鉴别试验结果 [0122] [0123] 实施例6伤寒沙门菌Vi多糖鉴别 [0124] (1)根据发明内容实施例1所述方法，建立伤寒沙门菌Vi多糖鉴别方法。取伤寒沙门菌Vi多糖参考品，溶解成含多糖4μg/ml溶液，取一定量多糖抗血清，按1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8稀释成不同梯度，将抗原抗体放入仪器对应位置，运行反应1.5min，记录各稀释倍数下速率单位值，图3，得出伤寒沙门菌Vi多糖抗体稀释范围为1～6。 [0125] (2)取上述项确定的抗体稀释倍数1：4，将多糖参考品溶解成不同的浓度梯度(具体为1μg/ml、3μg/ml、5μg/ml、8μg/ml、10μg/ml)，将抗原抗体放入仪器对应位置，运行反应1.5min，记录各浓度下速率单位值，当抗原浓度在2μg/ml～10μg/ml范围内，速率值随浓度增加而变大，绘制速率-浓度曲线，为保证曲线具有良好线性，节约参考品，确定抗原的浓度范围为1μg/ml～6μg/ml，图4。根据上述两项确定的抗体稀释倍数和抗原浓度(4μg/ml)，改变反应时间(具体为1.5min、2.5min、5min、7.5min、10min)，将抗原抗体放入仪器对应位置，运行，记录各时间下反应速率值，图5，1.5min～2.5min达到最大反应速率值，选择1.5min为最佳反应时间。根据确定的反应参数(Vi多糖抗血清稀释4倍，反应时间1.5min，多糖参考品 1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml)，将抗原抗体放入仪器对应位置，运行，记录各浓度下反应速率值，及线性最低点速率值，表7、图6。并对方法进行精密度、准确度、专属性验证。 [0126] 表7.伤寒沙门菌Vi多糖抗原浓度-速率值表 [0127] [0128] (3)取伤寒Vi多糖稀释至多糖浓度1.5μg/ml～5.5μg/ml，同时取多糖溶剂系统(生理氯化钠溶液)为阴性对照，抗体稀释4倍，将抗原抗体放入仪器对应位置，抗原抗体取样量各20μl反应1.5min，应用建立曲线的参数测试多糖速率值。 [0129] (4)伤寒Vi多糖鉴别结果见图7、表8。伤寒Vi多糖速率值(31.28Rate)大于其曲线最低点速率值(15.65Rate)，且大于阴性对照平均值(0.473Rate)，伤寒Vi多糖鉴别试验合格。 [0130] 表8.伤寒Vi多糖鉴别结果 [0131] [0132] 实施例6伤寒沙门菌Vi多糖疫苗鉴别 [0133] (1)按照实施例5建立的伤寒沙门菌Vi多糖鉴别方法，取伤寒沙门菌Vi多糖疫苗稀释至多糖浓度1.5μg/ml～5.5μg/ml，同时取多糖疫苗溶剂系统(生理氯化钠溶液)为阴性对照，抗体稀释4倍，将抗原抗体放入仪器对应位置，抗原抗体取样量各20μl反应1.5min，应用建立曲线的参数测试多糖速率值。 [0134] (2)伤寒Vi多糖疫苗鉴别结果见表9。伤寒Vi多糖速率值(26.33Rate)大于其曲线最低点速率值(15.65Rate)，且大于阴性对照平均值(0.473Rate)，伤寒Vi多糖疫苗鉴别试验合格。 [0135] 表9.伤寒Vi多糖鉴别结果 [0136] [0137] 实施例7A群脑膜炎球菌多糖鉴别(免疫双扩散法，对比实施例) [0138] (1)称取琼脂糖加生理氯化钠溶液煮沸使完全溶胀，配成1％琼脂糖溶液，将溶液倾倒于水平玻板上(每平方厘米约0.19ml琼脂糖)，待其凝固后，按下图打孔，直径3mm，孔距3mm。中央孔加多糖对应血清型抗血清，抗血清稀释5倍，周边孔加A群脑膜炎球菌多糖、阳性对照(多糖标准品)和阴性对照(生理氯化钠溶液)，多糖溶液稀释至30μg/ml～100μg/ml之间，每孔加样20μl，置水平湿盒中37℃扩散24小时。再用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板20min，以除去未结合的抗原抗体。将浸泡好的琼脂糖凝胶板取出，用滤纸压干后考马斯亮蓝G250染色液染色30min，用脱色液(乙醇：冰乙酸：水＝2:9:9体积比)脱色至背景无色，期间更换脱色液4次/天，共3天，沉淀线呈清晰的蓝色为止。 [0139] (2)图9以A群脑膜炎球菌多糖为例，说明免疫双扩散法鉴别试验。在凝胶中A群脑膜炎球菌多糖与抗血清形成明显沉淀线，沉淀线之间无交叉，阴性对照不形成沉淀线，A群脑膜炎球菌多糖鉴别试验合格，多糖分子量与抗体相差不大，沉淀线清晰且位置适中。 [0140] 实施例8A群脑膜炎球菌多糖疫苗鉴别(免疫双扩散法，对比实施例) [0141] (1)称取琼脂糖加生理氯化钠溶液煮沸使完全溶胀，配成1％琼脂糖溶液，将溶液倾倒于水平玻板上(每平方厘米约0.19ml琼脂糖)，待其凝固后，按下图打孔，直径3mm，孔距3mm。中央孔加多糖对应血清型抗血清，抗血清稀释5倍，周边孔加A群脑膜炎球菌多糖疫苗、阳性对照(多糖标准品)和阴性对照(生理氯化钠溶液)，多糖标准品稀释至30μg/ml～100μg/ml之间，疫苗不稀释，每孔加样20μl，置水平湿盒中37℃扩散24小时。再用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板20min，以除去未结合的抗原抗体。将浸泡好的琼脂糖凝胶板取出，用滤纸压干后考马斯亮蓝G250染色液染色30min，用脱色液(乙醇：冰乙酸：水＝2:9:9体积比)脱色至背景无色，期间更换脱色液4次/天，共3天，沉淀线呈清晰的蓝色为止。 [0142] (2)图10以A群脑膜炎球菌多糖疫苗为例，说明免疫双扩散法鉴别试验。在凝胶中A群脑膜炎球菌多糖疫苗与抗血清形成明显沉淀线，沉淀线之间无交叉，阴性对照不形成沉淀线，A群脑膜炎球菌多糖疫苗鉴别试验合格，多糖分子量与抗体相差不大，沉淀线清晰且位置适中。 [0143] 综合以上实施例，本发明的一种24价肺炎球菌多糖疫苗鉴别方法-免疫速率散射比浊法，用于24价肺炎球菌多糖及疫苗的鉴别，操作简单均由机器完成，灵敏度高可检测10μg/ml以下样品，结果以速率值形式呈现更直观，其特征在于(1)若判定标准采用与曲线最低点速率值比较方法，曲线一经建立，在抗体效价不变情况下，曲线无需重新标定可重复使用，样品鉴别时只需测试样品速率值；(2)若判定标准采用与阴性对照比较，无需标定曲线，样品测试时只需测试样品与阴性值；(3)可同时鉴别72个同血清型和/或不同血清型样品；(4)鉴别数十个样品仅需几十分钟，比免疫双扩散法的几十小时，大大缩短了时间，具有实时性。有很强的实用价值。 |
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