海南砂仁中一种二芳基庚烷类化合物提取分离方法和应用专利检索-···无环酸的酯例如帕伐他丁专利检索查询-专利查询网

海南砂仁中一种二芳基庚烷类化合物提取分离方法和应用

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查; 撤回;
专利有效性	无效专利	当前状态	撤回
申请号	CN202411009942.6	申请日	2024-07-26
公开(公告)号	CN119241362A	公开(公告)日	2025-01-03
申请人	海南医科大学(海南省医学科学院);	申请人类型	学校
发明人	魏娜; 孔奕丹; 周小妹; 练勇; 程倩影;	第一发明人	魏娜
权利人	海南医科大学(海南省医学科学院)	权利人类型	学校
当前权利人	海南医科大学(海南省医学科学院)	当前权利人类型	学校
省份	当前专利权人所在省份：海南省	城市	当前专利权人所在城市：海南省海口市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：海南省海口市龙华区学院路3号	邮编	当前专利权人邮编：570000
主IPC国际分类	C07C67/48	所有IPC国际分类	C07C67/48 ; C07C67/56 ; C07C69/21 ; A61K31/22 ; A61P1/04 ; A61P1/00 ; A61P29/00
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	3	专利文献类型	A
专利代理机构	海南翔翔专利代理有限公司	专利代理人	郭妍;
摘要	本发明涉及一种从海南砂仁中提取分离二芳基庚烷类化合物的制备方法及应用。具体制备流程是将海南砂仁经醇提法、有机溶剂萃取法、硅胶柱色谱分离、ODS柱色谱、Sephadex LH‑20凝胶柱色谱以及半制备型高效液相色谱仪纯化等步骤，从中得到1个线性二芳基庚烷化合物，为(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷，分子式为C23H28O8。体外细胞研究表明该化合物具有胃黏膜保护、抗肠炎及抗炎活性。本发明提取分离二芳基庚烷化合物的方法明确可控，获得的化合物杂质少、纯度高，具有潜在的药用开发前景，可用于制备抗胃黏膜损伤药物及抗溃疡性结肠炎药物。
权利要求	1.一种从海南砂仁中提取分离得到的二芳基庚烷类化合物的制备方法，包括以下步骤： (1)醇提取：称取6kg海南砂仁干燥果实，粉碎，加入70％乙醇回流提取3次，料液比1:5，合并提取液，回收溶剂，减压干燥，得浸膏； (2)有机溶剂萃取：将步骤(1)得到的浸膏，加蒸馏水溶解，再用等体积的二氯甲烷进行萃取，萃取5次，合并二氯甲烷萃取液，浓缩干燥得到二氯甲烷浸膏； (3)硅胶柱色谱分离：取步骤(2)得到的二氯甲烷浸膏进行硅胶柱色谱分离，湿法装柱，采用体积比为100:0～10:1的二氯甲烷‑甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，其中将体积比为50:1的二氯甲烷‑甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂，得到分离产物； (4)ODS反相柱纯化：将步骤(3)得到的分离产物用35％～50％甲醇水溶液洗脱，其中 40％甲醇水洗脱部分减压回收溶剂，得到粗品1； (5)葡聚糖凝胶柱色谱分离：将步骤(4)得到的粗品1，进行葡聚糖凝胶柱再次纯化，以纯甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得粗品2； (6)半制备型HPLC纯化：将步骤(5)得到粗品2，经半制备型HPLC纯化，以60％甲醇水为流动相，体积流量2mL/min，检测波长210nm，分离得到二芳基庚烷类化合物纯品，该化合物为(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷。 2.根据权利要求1所述制备方法得到的二芳基庚烷类化合物在制备抗胃粘膜损伤药物中的应用。 3.根据权利要求1所述制备方法得到的二芳基庚烷类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。
说明书全文	海南砂仁中一种二芳基庚烷类化合物提取分离方法和应用技术领域 [0001] 本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种从海南砂仁中分离得到二芳基庚烷类化合物的制备方法和应用。背景技术 [0002] 砂仁性味辛，温，归脾、胃、肾经。具有化湿开胃，温脾止泻，理气安胎之功效，用于治疗湿浊中阻，脱痞不饥，脾胃虚寒，呕吐泄泻，妊娠恶阻，胎动不安。砂仁具有1300多年的药用历史，是我国“四大南药”之一，同时也被收录于药食同源类药材目录。现代药理研究，砂仁具有胃肠道保护、抑菌、保胎、调节肠道菌群和降血糖活性等作用。 [0003] 海南砂仁是海南的特有品种，所产砂仁属于地理标志产品，但是海南砂仁的研究内容较阳春砂少。近年来，人们对海南砂仁化学成分研究大多集中在挥发油的分析，对海南砂仁非挥发性成分与药效研究较少，无法揭示海南砂仁的真正的品质。另外，由于海南省拥有得天独厚的种植条件，海南砂仁等药材的林下经济种植模式在海南有独特发展优势，近年该模式在不断发展中，可为海南经济带来增益，此外对海南砂仁进行成分和活性研究，利于发现和优化其种植条件，优良的种植条件亦有助于提高其药用价值，为热带药用资源的开发利用提供理论依据，有利于中医药产业的发展。发明内容 [0004] 鉴以此，本发明目的是提供一种从海南砂仁中提取分离得到的二芳基庚烷类化合物的制备方法，包括以下步骤： [0005] (1)醇提取：称取6kg海南砂仁干燥果实，粉碎，加入70％乙醇回流提取3次，料液比1:5，合并提取液，回收溶剂，减压干燥，得浸膏； [0006] (2)有机溶剂萃取：将步骤(1)得到的浸膏，加蒸馏水溶解，再用等体积的二氯甲烷进行萃取，萃取5次，合并二氯甲烷萃取液，浓缩干燥得到二氯甲烷浸膏； [0007] (3)硅胶柱色谱分离：取步骤(2)得到的二氯甲烷浸膏进行硅胶柱色谱分离，湿法装柱，采用体积比为100:0～10:1的二氯甲烷‑甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，其中将体积比为50:1的二氯甲烷‑甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂，得到分离产物； [0008] (4)ODS反相柱纯化：将步骤(3)得到的分离产物用35％～50％甲醇水溶液洗脱，其中40％甲醇水洗脱部分减压回收溶剂，得到粗品1； [0009] (5)葡聚糖凝胶柱色谱分离：将步骤(4)得到的粗品1，进行葡聚糖凝胶柱再次纯化，以纯甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得粗品2； [0010] (6)半制备型HPLC纯化：将步骤(5)得到粗品2，经半制备型HPLC纯化，以60％甲醇水为流动相，体积流量2mL/min，检测波长210nm，分离得到二芳基庚烷类化合物纯品，该化合物为(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷，其化学结构式如下： [0011] [0012] 分子式为C23H28O8。 [0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明海南砂仁中(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷的提取分离方法明确可控，获得的化合物杂质少、纯度高；且该化合物具有胃粘膜保护活性、抗肠炎活性和抗炎活性，为进一步开发海南砂仁中胃粘膜保护及抗肠炎药效物质提供来源和依据。附图说明 [0014] 图1(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷氢谱 [0015] 图2(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷碳谱 [0016] 图3效果实施例1中该化合物的胃粘膜保护活性。 [0017] 图4效果实施例2中该化合物的抗肠炎活性。 [0018] 图5效果实施例3中该化合物的抗炎活性。具体实施方式 [0019] 为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。 [0020] 实施例1：(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷的制备方法： [0021] (1)醇提取：称取6kg海南砂仁干燥果实，粉碎，加入70％乙醇回流提取3次，料液比1:5，1h/次，合并提取液，回收溶剂，旋转蒸发减压干燥，得浸膏1461.5g； [0022] (2)有机溶剂萃取：将步骤(1)得到的浸膏，加蒸馏水溶解，再用等体积的二氯甲烷进行萃取，萃取5次，合并二氯甲烷萃取液，浓缩干燥得到二氯甲烷浸膏233.4g； [0023] (3)硅胶柱色谱分离：取步骤(2)得到的二氯甲烷浸膏进行硅胶柱色谱分离，湿法装柱，用二氯甲烷：甲醇(100:0、50:1、20:1、10:1)进行洗脱，得到FrA、Fr B、Fr C、Fr D 4个馏分。不同馏分利用硅胶薄层板(TCL)检测，主成分相同后合并，FrA得到9个馏分(FrA1‑9)，Fr B得到18个馏分(Fr B1‑18)，Fr C得到10个馏分(Fr C1‑10)，Fr D得到8个馏分(Fr D1‑8)。Fr B13中该化合物纯度为70.62％； [0024] (4)ODS反相柱纯化：将Fr B13进行ODS反相柱纯化，用甲醇水(35％、40％、45％、50％)洗脱，不同馏分利用硅胶薄层板(TCL)检测，主成分相同后合并，得到Fr B13‑40％组分，纯度达82.05％； [0025] (5)葡聚糖凝胶柱色谱分离：将Fr B13‑40％进行Sephadex LH‑20葡聚糖凝胶柱再次纯化，以纯甲醇洗脱，得到Fr B13‑40％‑N12组分，纯度达90.78％； [0026] (6)半制备型HPLC纯化：FrB13‑40％‑N12经半制备型HPLC纯化，60％甲醇水，体积流量2mL/min，检测波长210nm，分离得到纯度为94.24％的(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷。 [0027] 实施例2：(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷的结构确定，其氢谱、碳谱如附图1和2，其质谱、波谱数据如下： [0028] 1H‑NMR(CD3OD，400MHz)δ:6.57(2H，d，J＝2.1Hz，H‑2'，2”)，6.64(2H，d，J＝8.0Hz，H‑5'，5”)，6.46(2H，dd，J＝8.0Hz、2.1Hz，H‑6'，6”)，2.42(4H，t，J＝7.9Hz，H‑1，7)，1.75(4H，m，H‑2，6)，4.89(2H，m，H‑3，5)，1.81(2H，m，H‑4)，1.94(6H，m，CH3)；13C‑NMR(CD3OD，100MHz)δ:30.52(C‑1)，36.24(C‑2)，70.09(C‑3)，38.06(C‑4)，70.09(C‑5)，36.24(C‑6)， 30.52(C‑7)，132.89(C‑1')，114.90(C‑2')，144.65(C‑3')，142.86(C‑4')，115.06(C‑5')， 119.20(C‑6')，132.89(C‑1”)，114.90(C‑2”)，144.65(C‑3”)，142.86(C‑4”)，119.20(C‑ 5”)，119.20(C‑6”)，20.16(‑CH3)，171.47(C＝O)鉴定为(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷。 [0029] 效果实施例1(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷胃黏膜保护活性研究 [0030] 1.细胞培养与传代 [0031] 将复苏的人胃黏膜上皮细胞(GES‑1细胞)于完全培养基(含10％FBS+1％P/S双抗+89％RPMI‑1640培养基)中培养。24h后更换新培养液，使GES‑1细胞贴壁生长，待GES‑1细胞长满合适密度后(80％左右)进行传代。弃去旧培养基，PBS缓慢冲洗GES‑1细胞，将细胞表面残留血清冲洗干净。每个T25培养瓶中加入约1mL 0.25％胰酶消化细胞，2min后加入3mL完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入适量完全培养基重新悬浮细胞，以适量细胞浓度进行传代培养。 [0032] 2.该化合物对GES‑1细胞损伤的毒性结果 [0033] 将GES‑1细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，贴壁生长24h后，弃旧培养基，正常组(NC)加入100μL完全培养基，用DMSO溶解单体，配置成浓度100mM的母液，药物处理组分别加入以完全培养基稀释成浓度为500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625、7.812μM的药液，每孔100μL，设4个复孔。37℃、5％CO2的培养箱中培养24h后，吸弃上清液，加入10％CCK‑8溶液，每孔100μL。孵育1h后在酶标仪(450nm)上检测每孔的OD值，并计算细胞TC50值。 [0034] 3.该体化合物对乙醇诱导GES‑1细胞损伤的保护作用研究 [0035] 将GES‑1细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，贴壁生长24h后，弃旧培养基，正常组(NC)及模型组(EC)每孔加100μL完全培养基，以细胞毒性结果为依据，设立药物处理组的给药浓度，药物处理组加入200.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125μM的含药培养基，每孔100μL。药物干预24h后，弃旧培养基，除正常组外，其余组均加入9％的乙醇造模，培养3h，采用CCK‑8法，以细胞存活率为指标，进行胃黏膜保护活性评价。 [0036] 该化合物对GES‑1细胞的半数毒性浓度(TC50)为220.412±23.430μM。如附图1所示，该化合物在25.000μM～100.000μM时，表现出显著地抗乙醇诱导GES‑1细胞损伤的保护活性(P<0.05)，表明该化合物具有胃黏膜保护活性。 [0037] 效果实施例2：(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷抗肠炎活性研究 [0038] 1.细胞培养与传代 [0039] 将复苏的人克隆结肠腺癌细胞株(Caco‑2细胞)于完全培养基(含10％FBS+1％P/S双抗+89％DMEM培养基)中培养。24h后更换新培养液，使Caco‑2细胞贴壁生长，待Caco‑2长满合适密度后(80％左右)进行传代。弃去旧培养基，PBS缓慢冲洗Caco‑2细胞，将细胞表面残留血清冲洗干净。每个T25培养瓶中加入约1mL 0.25％胰酶消化细胞，2min后加入3mL完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入适量完全培养基重新悬浮细胞，以适量细胞浓度进行传代培养。 [0040] 2.该化合物对Caco‑2细胞损伤的毒性结果 [0041] 将Caco‑2细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，贴壁生长24h后，弃旧培养基，正常组(NC)加入100μL完全培养基，用DMSO溶解单体，配置成浓度100mM的母液，药物处理组分别加入以完全培养基稀释成浓度为500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625、7.812μM的药液，每孔100μL，设4个复孔。37℃、5％CO2的培养箱中培养24h后，吸弃上清液，加入10％CCK‑8溶液，每孔100μL。孵育1h后在酶标仪(450nm)上检测每孔的OD值，并计算细胞TC50值。 [0042] 3.该化合物对LPS诱导Caco‑2细胞损伤的保护作用研究 [0043] 将Caco‑2细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，贴壁生长24h后，弃旧培养基，正常组(NC)及模型组(EC)每孔加100μL完全培养基，以细胞毒性结果为依据，设立药物处理组的给药浓度，药物处理组加入125.000、62.500、31.250、15.625、7.815μM的含药培养基，每孔100μL。药物干预24h后，弃旧培养基，除正常组外，其余组均加入2.5μg/mL的LPS造模，培养 12h，采用CCK‑8法，以细胞存活率为指标，进行抗肠炎活性评价。 [0044] 该化合物对Caco‑2细胞的半数毒性浓度(TC50)为235.065±15.322μM。如附图2所示，该化合物在62.500μM～125.000μM时，表现出显著地抗LPS诱导Caco‑2细胞损伤的保护活性(P<0.01)，表明单体化合物具有抗肠炎活性。 [0045] 效果实施例3：(3R,5R)‑3,5‑二乙酰氧基‑1,7‑双(3,4‑二羟基苯基)庚烷抗炎活性研究 [0046] 1.细胞培养与传代 [0047] 将复苏的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW 264.7细胞)于完全培养基(含10％FBS+1％P/S双抗+89％DMEM培养基)中培养。24h后更换新培养液，使RAW 264.7细胞贴壁生长，待RAW 264.7长满合适密度后(80％左右)进行传代。弃去旧培养基，PBS缓慢冲洗RAW 264.7细胞，将细胞表面残留血清冲洗干净。每个T25培养瓶中加入约1mL 0.25％胰酶消化细胞，2min后加入3mL完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入适量完全培养基重新悬浮细胞，以适量细胞浓度进行传代培养。 [0048] 2.该化合物对RAW 264.7细胞损伤的毒性结果 [0049] 将RAW 264.7细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，贴壁生长24h后，弃旧培养基，正常组(NC)加入100μL完全培养基，用DMSO溶解单体，配置成浓度100mM的母液，药物处理组分别加入以完全培养基稀释成浓度为400.000、200.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250μM的药液，每孔100μL，设4个复孔。37℃、5％CO2的培养箱中培养24h后，吸弃上清液，加入10％CCK‑8溶液，每孔100μL。孵育1h后在酶标仪(450nm)上检测每孔的OD值，并计算细胞TC50值。 [0050] 3.该化合物对LPS诱导RAW 264.7细胞损伤的保护作用研究 [0051] 将RAW 264.7细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，贴壁生长24h后，弃旧培养基，正常组(NC)及模型组(EC)每孔加100μL完全培养基，以细胞毒性结果为依据，设立药物处理组的给药浓度，药物处理组加入50.000、25.000、12.500、6.250、3.125μM的含药培养基，每孔100μL。药物干预24h后，弃旧培养基，除正常组外，其余组均加入0.5μg/mL的LPS造模，培养12h，采用CCK‑8法，以细胞存活率为指标，进行抗炎活性评价。 [0052] 该化合物对RAW 264.7细胞的半数毒性浓度(TC50)为120.215±13.320μM。如附图3所示，该化合物在12.500μM～50.000μM时，表现出显著地抗LPS诱导RAW 264.7细胞损伤的保护活性(P<0.01)，表明单体化合物具有抗炎活性。

意见反馈