一种缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜及其制备方法 |
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| 申请号 | CN202410182763.6 | 申请日 | 2024-02-19 | 公开(公告)号 | CN117988107A | 公开(公告)日 | 2024-05-07 |
| 申请人 | 中国农业大学; | 发明人 | 胡瑶; 王淑敏; 陈娟; 陈翰; 王鹏杰; 张伟博; 陈冲; 任发政; 刘思源; 朱银华; 王然; 刘蓉; 方冰; 王晓玉; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种缓释型玉米醇溶蛋白抗菌 纤维 膜及其制备方法，包括以下步骤：将玉米醇溶蛋白与乙酸充分混合，得到玉米醇溶蛋白溶液；将丁香酚与玉米醇溶蛋白溶液充分混合，得到纺丝溶液，将纺丝溶液 静电纺丝 ，得到 纳米纤维 膜；使用戊二 醛 蒸汽 对所述纳米纤维膜进行交联处理，得到缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜。本发明所述的缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜通过将功能成分丁香酚封装到玉米醇溶蛋白纳米纤维膜中，赋予玉米醇溶蛋白纳米纤维膜良好的抗 氧 化、抗菌活性；再通过戊二醛蒸汽交联结合 真空 干燥后处理，提高了纤维膜的 力 学性能和 水 稳定性 ，有效地延缓了丁香酚的释放，同时最大限度的减少了戊二醛在纤维膜上的残留。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜及其制备方法技术领域背景技术[0002] 微生物污染引起的腐烂变质被认为是导致果蔬采后损失的一个重要因素。丁香酚(EU)是一种安全、有效的天然抗菌剂，具有出色的抗氧化、抗炎和抗菌活性，强大的功能特性使其成为可以取代化学杀菌剂的有前景的抗菌物质。然而，EU的风味浓烈可能会影响食品风味，这限制了其作为抗菌添加剂在食品中的直接应用。另外，由于双键的存在，EU在食品中的实际应用往往受到其稳定性差、低水溶性、高反应性(与其他食品成分的潜在相互作用)、以及不受控制的释放特性的限制，从而大大降低其生物利用度。 [0003] 由于具有简单、经济、加工过程温和、结构可调、以及可连续生产纤维等优点，静电纺丝被认为是封装不稳定性EU有前途的技术。另外，静电纺丝纤维材料允许活性成分的高负载，其较高的比表面积提高了对周围条件的响应并允许活性成分的及时释放，这意味着有可能减少用于实现货架期延长的抗菌活性成分的添加量；并且纤维之间较小的间隙也为细菌进入提供了屏障。玉米醇溶蛋白(zein)具有低吸湿性、高耐热性、优异的氧阻隔性、抗氧化活性和可电纺性，是用于静电纺丝开发食品抗菌膜的理想生物聚合物。 [0004] 迄今为止，许多不同类型的抗菌活性成分被成功地封装到zein纳米纤维膜中，并显示出比未包封活性成分更好的抗菌性能；但是现有的zein抗菌纤维膜在实际应用中仍然受到封装活性成分的不良释放动力学(突发释放或不可持续释放)的限制。 发明内容[0005] 有鉴于此，本发明旨在提出一种缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜及其制备方法，以实现对抗菌和抗氧化功能成分丁香酚的高效装载和缓释，显著提高玉米醇溶蛋白纳米纤维膜作为抗菌包装的有效性。 [0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的： [0007] 第一方面，本发明提供一种缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜的制备方法，包括以下步骤： [0008] S1、将玉米醇溶蛋白与乙酸充分混合，得到玉米醇溶蛋白溶液； [0009] S2、将丁香酚与玉米醇溶蛋白溶液充分混合，得到纺丝溶液，将纺丝溶液静电纺丝，得到纳米纤维膜； [0011] 进一步地，所述玉米醇溶蛋白溶液中玉米醇溶蛋白的质量浓度为30％～40％。 [0012] 进一步地，丁香酚的添加量为玉米醇溶蛋白质量的5％～30％。 [0014] 进一步地，使用戊二醛蒸汽对所述纳米纤维膜进行交联处理包括以下步骤： [0016] b、将纳米纤维膜放置在干燥器的顶部，并将干燥器放入恒温培养箱内进行交联反应； [0017] c、将交联反应后的纳米纤维膜置于真空干燥箱中、真空干燥得到缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜。 [0018] 进一步地，戊二醛水溶液的质量浓度为20％～30％。 [0019] 进一步地，真空干燥的条件为：40℃条件下真空干燥至少12h。 [0020] 第二方面，本发明提供一种根据上述的制备方法制得的缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜。 [0021] 第三方面，本发明提供根据上述的制备方法制得的缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜或根据上述的缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜在产品包装中的应用。 [0022] 进一步地，所述产品为水果或蔬菜。 [0023] 第四方面，本发明提供丁香酚在改善玉米醇溶蛋白纳米纤维膜性能方面的应用，所述应用包括以下至少一种： [0024] (1)在提高玉米醇溶蛋白纳米纤维膜的抗氧化性中的应用； [0025] (2)在提高玉米醇溶蛋白纳米纤维膜的抗菌活性中的应用。 [0026] 相对于现有技术，本发明所述的缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜及其制备方法具有以下优势： [0027] (1)本发明所述的缓释型玉米醇溶蛋白抗菌纤维膜通过将功能成分丁香酚封装到玉米醇溶蛋白纳米纤维膜中，赋予玉米醇溶蛋白纳米纤维膜良好的抗氧化、抗菌活性；再通过戊二醛蒸汽交联结合真空干燥后处理，提高了纤维膜的力学性能和水稳定性，有效地延缓了丁香酚的释放，同时最大限度的减少了戊二醛在纤维膜上的残留。 [0029] 构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： [0030] 图1是测试例1不同丁香酚添加量zein纳米纤维膜(a‑f)及戊二醛交联EU/zein纳米纤维膜(g)的扫描电镜示意图，其中a‑f丁香酚添加量分别为0％、5％、10％、20％、30％、40％； [0031] 图2是测试例3不同纳米纤维膜的抗氧化活性对比示意图； [0032] 图3是测试例4未负载及负载丁香酚zein纳米纤维膜对大肠杆菌(A)和金黄色葡萄球菌(B)的抗菌活性对比示意图； [0033] 图4是测试例4微生物渗透试验的宏观图像； [0034] 图5是测试例4微生物渗透试验的培养基光密度值结果示意图； [0035] 图6是测试例6不同丁香酚浓度(A)和戊二醛交联载丁香酚zein纳米纤维膜(B)在磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的释放曲线示意图； [0036] 图7是实施例2未负载及负载丁香酚zein纤维膜对草莓的保鲜效果图； [0037] 图8是实施例2不同组别草莓在25℃贮藏期间硬度的变化结果示意图； [0038] 图9是实施例2不同组别草莓在25℃贮藏期间可滴定酸度(A)和浆液pH值(B)的变化结果示意图； [0039] 图10是实施例2不同组别草莓在25℃贮藏期间总可溶性固形物含量的变化结果示意图。 具体实施方式[0040] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。 [0041] 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。 [0042] 以下实施例中所用的主要试剂和试验仪器如表1、表2所示。 [0043] 表1主要试验试剂 [0044] [0045] 表2主要仪器设备 [0046] [0047] [0048] 以下实施例中涉及到的检测方法包括： [0049] 1、包封率和载药量测定 [0050] 将15mg zein抗菌纤维膜样品溶解在4mL 90％乙醇水溶液中来测定抗菌纤维中丁香酚的包封率和载药量。随后，将其转移至透析袋中置于含有60mL 90％乙醇水溶液的烧杯中，经封口膜密封后，于25℃、80rpm的恒温摇床中透析12h，随后采用分光光度法对照丁香酚标准曲线在280nm波长下测定丁香酚的含量。丁香酚的包封率和载药量采用如下公式计算： [0051] [0052] [0053] 2、形态及直径分布 [0054] 扫描电子显微镜用于观察不同丁香酚浓度及戊二醛交联载丁香酚zein纳米纤维膜的形态。然后在代表性的显微照片上随机选取200根纤维应用图像分析软件(Image J)来测量纤维直径，计算得到纤维平均直径和直径分布。 [0055] 3、分子结构 [0056] 通过ATR模式下的傅里叶变换红外光谱研究了缓释型zein抗菌纤维膜中各组分之间的分子间相互作用。待测样品放置在ATR配件上，将配件小心地压下，以确保样品与ATR晶‑1 ‑1体良好的接触。波长扫描范围为400‑4000cm ，分辨率为4cm ，每个样本的光谱是在平均32次扫描后收集的，空ATR晶体作为参照。 [0057] 4、抗氧化活性测定 [0058] 载丁香酚zein抗菌纤维膜对DPPH自由基的清除能力可以表征其抗氧化性能。具体地，将15mg抗菌纤维膜样品溶解于10mL80％乙醇水溶液中，取2mL样液与2mL DPPH甲醇溶液(0.1mM)混匀，避光孵育30min后，使用分光光度计记录在517nm处的吸光度值。空白对照为80％乙醇水溶液替代DPPH甲醇溶液，进行相同处理；阴性对照为80％乙醇水溶液替代样液，进行相同处理。抗氧化活性采用如下公式计算： [0059] [0060] 其中，A表示待测样本在517nm处的吸光度值；B表示空白对照在在517nm处的吸光度值；C表示阴性对照在517nm处的吸光度值。 [0061] 5、抗菌活性 [0062] 使用浊度法评估未交联及戊二醛交联缓释型zein抗菌纤维膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能。首先，将大肠杆菌菌株和金黄色葡萄球菌菌株从‑80℃取出并解冻，分别使用LB培养基于37℃培养12h进行活化，之后以2％的接种量接种于新鲜的LB培养基中继续培养12h，将得到的细菌悬浮液使用生理盐水进行稀释，取适量加入到新鲜的LB培5 养基中使细菌的最终浓度为10CFU/mL。然后，将20mg待测的zein纳米纤维膜样品浸入细菌悬浮液(10mL)中，在37℃恒温培养箱孵育24h，分别在6h、12h和24h测定细菌生长情况。 [0063] 6、微生物渗透性 [0064] 为了评价zein纳米纤维膜样品对微生物的屏障功能，进行微生物渗透性试验，具体方法为：首先，向每个无菌玻璃瓶中加入5mL无菌营养肉汤，之后用纳米纤维膜样品将玻璃瓶密封，使用没有任何密封处理的玻璃瓶作为空白对照。室温(25±2℃)下静置15d后，使用酶标仪测定营养肉汤在620nm处的吸光度，以分析微生物在每个玻璃瓶中的生长情况。对每个样品进行三个平行实验，并计算平均值。 [0065] 7、细胞毒性测定 [0066] CCK‑8法测定zein纳米纤维膜、未交联及戊二醛交联EU/zein抗菌纤维膜的细胞毒3 性。取对数期的L929细胞按照8×10/孔的细胞浓度接种到96孔板中，在含有5％ CO2的37℃恒温培养箱中培养24h；培养基为含有10％胎牛血清的MEM培养基。取20mg待测样品，样品的两侧分别经过紫外线照射30min进行灭菌。然后将待测样本在37℃下浸入4mL完全培养基中浸提24h，得到的浸提液经过0.22μm无菌Millipore过滤器过滤除菌。使用完全培养基将滤液梯度稀释，得到浓度为2500、1250、625、和312.5μg/mL的样品工作液。然后，使用100μL样品工作液置换细胞培养基，继续孵育24h后移除培养基，用PBS清洗3次。之后加入100μL含 10％CCK‑8的培养基，在含有5％CO2的37℃恒温培养箱中孵育2h。最后，用酶标仪测定在 450nm处的吸光度。细胞活力通过如下公式计算： [0067] [0068] 其中OD样本和OD空白分别是在有和没有纳米纤维膜提取液的情况下孵育溶液的光密度值。 [0069] 采用活/死细胞染色验证MTT法的检测结果。在细胞与纳米纤维膜提取液(1250μg/mL)共培养后，活细胞和死细胞分别用Calcein AM和PI染料染色。染色15min后，用激光共聚焦显微镜观察细胞的存活情况。其中，活细胞产生绿色荧光，死细胞产生红色荧光。 [0070] 8、体外释放 [0071] 研究了不同丁香酚浓度及戊二醛交联载丁香酚zein纳米纤维膜中丁香酚的释放性能。丁香酚的体外释放是在pH 7.2的PBS缓冲液中进行的。具体地，将20mg待测纳米纤维膜样品浸入含有4mL PBS缓冲液(pH＝7.2)的透析袋(10000Da，直径34mm)中，之后将透析袋置于盛有60mL PBS缓冲液(pH＝7.2)的烧杯中，然后将密封的烧杯在25℃恒温控制的摇床中以80rpm摇动30h。在预定的时间间隔(0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、20、24、和30h)，取出5mL的释放介质，并补充等量的新鲜PBS缓冲液(pH＝7.2)。采用分光光度计对照丁香酚标准曲线在280nm波长下测定样液中丁香酚的含量。 [0072] 使用数学模型零阶、一阶、Higuchi、Rigter‑Peppas、Peppas‑Sahlin和Kopcha对zein纳米纤维膜释放丁香酚的相关数据进行拟合，探究纳米纤维膜中丁香酚的释放机制。 [0073] 9、数据统计及分析 [0074] 使用SPSS20软件对所有数据进行统计分析，所获得的数据表示为平均值±标准差。平均值之间的比较是在置信水平为0.05的情况下通过单因素方差分析(ANOVA)和邓肯多范围检验(DMRT)进行的。 [0075] 对比例1 [0076] 本对比例提供了一种zein纳米纤维膜，制备方法为： [0077] (1)通过在室温下(25±2℃)磁力搅拌过夜，将30％(w/v)玉米醇溶蛋白充分溶解在乙酸中，得到玉米醇溶蛋白溶液。 [0078] (2)将上述溶液用于静电纺丝，得到zein纳米纤维膜，标记为zein NFF。 [0079] 静电纺丝参数为：流速0.5～3mL/h，电压20kv，接收距离10cm，滚筒转速1000rpm。 [0080] 对比例2 [0081] 本对比例提供了不同丁香酚添加量zein纳米纤维膜，制备方法为： [0082] 参照对比例1步骤(1)制备得到玉米醇溶蛋白溶液。 [0083] (2)为了封装，将丁香酚以zein含量的5％、10％、20％、30％和40％(w/w)的水平添加到上述玉米醇溶蛋白溶液中，在室温下混合1h后，将溶液用于静电纺丝，得到不同丁香酚添加量的载丁香酚zein纳米纤维膜，分别标记为EU5/zein NFF、EU10/zein NFF、EU/zein NFF、EU30/zein NFF、EU40/zein NFF。 [0084] 静电纺丝参数为：流速0.5～3mL/h，电压20kv，接收距离10cm，滚筒转速1000rpm。 [0085] 本对比例测定了步骤(3)添加丁香酚的zein纺丝溶液的特性，结果如表3所示。 [0086] 表3不同丁香酚添加量zein溶液的物理特性及zein纳米纤维的平均直径 [0087] [0088] 注：每列不同的小写字母表示差异显著。 [0089] 表3显示了不同丁香酚添加水平下zein溶液的物理和流变特性。纯的zein溶液的粘度为0.32Pa·s，随着丁香酚浓度增加到40％，溶液的粘度逐渐降低至0.19Pa·s。此外，zein溶液的表面张力随着丁香酚添加量的增加从32.13mN/m逐渐增大至35.06mN/m。然而，随着丁香酚浓度增加至40％，zein溶液的电导率显示出先增大后减小的变化趋势，当浓度为20％时，溶液的电导率达到最大，为120.67uS/cm。 [0090] 进一步的，本对比例测定了不同丁香酚添加量的载丁香酚zein纳米纤维膜中丁香酚的包封率和载药量。 [0091] 表4不同丁香酚添加量zein纳米纤维膜的包封率和载药量 [0092]丁香酚添加量 包封率％ 载药量％ a e 5％ 99.97±0.02 4.95±0.04 a d 10％ 99.89±0.02 8.38±0.11 b c 20％ 95.61±0.08 13.54±0.01 c b 30％ 72.20±1.28 17.08±0.52 d a 40％ 63.93±1.56 19.51±0.33 [0093] 如表4所示，在添加5％‑20％(w/w，基于zein)的丁香酚时，载丁香酚zein纳米纤维膜的包封率均大于95％(95.61％‑99.97％)，表明丁香酚可以被有效地封装到zein纳米纤维膜中。然而，随着丁香酚浓度继续增加，zein纳米纤维膜对丁香酚的包封率明显降低，添加30％和40％丁香酚时的包封率只有72.20％和63.93％。此外，随着丁香酚浓度从5％增加到40％，zein纳米纤维膜中丁香酚的载药量从4.95％增加至19.51％。表明静电纺丝是一种有效的封装方式，zein纳米纤维膜被认为是一种潜在的丁香酚的封装和递送载体。基于以上结果，选择20％(w/w)的丁香酚浓度制备载丁香酚zein纳米纤维膜用于后续试验。 [0094] 对比例3 [0095] 本对比例提供了一种GTA_zein纳米纤维膜，制备方法为： [0096] 参照对比例1步骤(1)～(2)制备得到zein纳米纤维膜。使用戊二醛蒸汽对zein纳米纤维膜进行交联处理，具体方法为：将25％戊二醛水溶液(20mL)倒入直径为90mm的培养皿中，并放置在干燥器的底部；将zein纳米纤维膜放置在干燥器的顶部，并将干燥器放入20℃恒温培养箱内；将zein纳米纤维膜暴露于戊二醛蒸汽中6h后，取出置于40℃条件下真空干燥箱中、真空干燥处理12h，以去除未反应的戊二醛，最终得到的GTA_zein纳米纤维膜，标记为GTA_zein NFF。 [0097] 实施例1 [0098] 本实施例提供了一种缓释型zein抗菌纤维膜，其制备方法包括以下步骤： [0099] 首先，参照对比例2步骤(1)～(2)制备得到EU/zein纳米纤维膜。其中，步骤(2)中丁香酚以zein含量的20％(w/w)的水平添加到上述混合溶液中，用于静电纺丝。 [0100] 进一步的，使用戊二醛蒸汽对所述EU/zein纳米纤维膜进行交联处理，具体方法为：将25％戊二醛水溶液(20mL)倒入直径为90mm的培养皿中，并放置在干燥器的底部；将EU/zein纳米纤维膜放置在干燥器的顶部，并将干燥器放入20℃恒温培养箱内；将EU/zein纳米纤维膜暴露于戊二醛蒸汽中6h后，取出置于40℃条件下真空干燥箱中、真空干燥处理12h，以去除未反应的戊二醛，最终得到的缓释型zein抗菌纤维膜，标记为GTA_EU/zein NFF。 [0101] 测试例1——zein抗菌纤维膜的形态及直径 [0102] 本测试例利用扫描电子显微镜分别观察对上述对比例1‑2不同丁香酚添加量zein纳米纤维膜和实施例1所述缓释型zein抗菌纤维膜的形态。丁香酚浓度对zein纳米纤维形态结构的影响如图1所示。可以看出，丁香酚的添加会显著影响zein纳米纤维的形态结构。随着丁香酚浓度的增加，载丁香酚zein纳米纤维膜从均匀光滑的棒状纤维变为不均匀且逐渐粘附化的纤维结构。 [0103] 根据图1中(g)所示，经过戊二醛蒸汽交联6h后，实施例1缓释型zein抗菌纤维膜仍然保持其纤维结构，但是纤维发生溶胀及粘连，且均匀性降低，纤维结构变得紧密。交联6h后EU/zein抗菌纤维膜的纤维直径为246.24±71.15nm，与未交联的EU/zein纳米纤维膜(123.11±34.76nm)相比，交联后纳米纤维膜的平均纤维直径和直径分布范围均增加。 [0104] 测试例2——zein抗菌纤维膜的分子结构 [0105] 首先，本测试例通过ATR模式下的傅里叶变换红外光谱研究丁香酚、zein粉末、对比例1zein纳米纤维膜、对比例2EU/zein纳米纤维膜和实施例1缓释型zein抗菌纤维膜的分子结构，从而探究载丁香酚zein纳米纤维膜中各组分之间的分子间相互作用。 [0106] 结果显示，EU/zein纳米纤维的光谱在1542cm‑1和1066cm‑1处呈现zein的特征峰，‑1 ‑1在1253cm 和886cm 区域呈现丁香酚的特征峰，表明丁香酚成功地封装和负载到zein纳米纤维膜中。此外，与zein纳米纤维膜相比，在EU/zein纳米纤维膜的光谱中观察到丁香酚的‑1 ‑1 ‑1 ‑1 几个特征性尖峰消失(1366cm 、1233cm 、1148cm 和816cm )。这些结果证实了丁香酚‑玉米醇溶蛋白复合物的合成，这两种成分的结构都发生了变化。丁香酚和zein在分子水平具有良好的相容性，这有利于纳米纤维膜的稳定性，以避免固相分离。 [0107] 负载丁香酚后，EU/zein纳米纤维膜在886cm‑1处显示出丁香酚的特征峰，表明丁香酚被成功地包封在zein纳米纤维膜中。然而，EU/zein纳米纤维膜对应于C‑H伸缩振动的指‑1 ‑1示峰从2960cm 移动到2958cm ，表明丁香酚和zein之间存在疏水相互作用。此外，负载丁‑1 香酚后，EU/zein纳米纤维膜在3305cm 处对应于N‑H伸缩振动和O‑H伸缩振动的特征峰移动‑1 到3293cm 处，这种条带向较低波数区域的移动与在N‑H基团上发生的氢键相互作用增加直接相关，同时较低的波数也表明更大的结构稳定性。 [0108] 所有纤维膜样品在～3300cm‑1处都有一个宽吸收峰，对应于氢键O‑H和N‑H。然而，‑1 ‑1戊二醛蒸汽交联后，该峰的强度明显降低。此外，所有光谱在1700‑1600cm 、1580‑1480cm‑1 和1480‑1420cm 处均显示出三个特征吸收峰，分别对应于酰胺Ⅰ带(C＝O拉伸振动)、酰胺Ⅱ带(N‑H弯曲和C‑N拉伸振动)和酰胺Ⅲ带(C＝O弯曲和C‑N伸缩振动)。与未交联的EU/zein纳‑1 米纤维膜相比，戊二醛交联后这些特征峰强度变低，并且1654cm 处的峰发生红移。 [0109] 测试例3——zein抗菌纤维膜的抗氧化活性 [0110] 本测试例使用DPPH自由基清除法评估了对比例1zein纳米纤维膜、对比例2EU/zein纳米纤维膜和实施例1缓释型zein抗菌纤维膜的抗氧化活性，结果如图2所示。zein纳米纤维膜显示出49.85％的DPPH清除活性，这是由于zein中存在带有苯基的氨基酸，从而表现出抗氧化活性。添加20％(w/w，基于zein)丁香酚后，EU/zein纳米纤维膜对DPPH的清除能力显著提高(P<0.05)，为83.63％。此外，戊二醛蒸汽交联过程并未影响EU/zein纳米纤维膜的抗氧化活性，在交联处理6h后，缓释型zein抗菌纤维膜显示出82.73％的DPPH清除活性。 [0111] 测试例4——zein抗菌纤维膜的抗菌性能/微生物渗透性 [0112] 本测试例通过浊度法评估了对比例3GTA_zein纳米纤维膜和实施例1缓释型zein抗菌纤维膜(2mg/mL)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能。纯的丁香酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为4.95μL/mL，这意味着24.75μg/mL的载丁香酚zein纳米纤维膜理论上具有抑菌活性。图3中(A)显示了大肠杆菌与zein纳米纤维膜样品共孵育24h的光密度值。可以看出，与对比例3GTA_zein纳米纤维膜相比，大肠杆菌与缓释型zein抗菌纤维膜共孵育后的光密度值明显降低，这表明负载丁香酚后赋予了zein纳米纤维膜抗菌活性。类似地，图3中(B)的结果显示了实施例1所述缓释型zein抗菌纤维膜对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。 [0113] 防止微生物渗透被认为是食品活性包装的一个重要指标。如图4所示，空白对照组在空气中暴露5天后，培养基表面已经出现大量菌落。随着暴露时间延长，玻璃瓶中的细菌菌落越来越多。而在暴露15天后，覆盖有zein纳米纤维膜样品的玻璃瓶内的培养基仍然保持澄清透明，显示出良好的防止细菌渗透的能力。培养基的光密度值测定结果如图5所示，新鲜LB肉汤的光密度值为0.040；暴露15天后，空白对照组培养基的光密度值显著增大至1.433，而GTA交联zein纳米纤维膜和GTA交联EU/zein纳米纤维膜保护的培养基仅稍有增加，光密度值分别为0.051和0.044。 [0114] 测试例5——zein抗菌纤维膜的细胞毒性 [0115] 由于食品包装可能与食品直接接触，因此食品包装的生物相容性至关重要。根据ISO标准10993‑5，当细胞活力高于70％时，认为不具有细胞毒性。本实施例通过CCK‑8法评价了zein纳米纤维膜、对比例2EU/zein纳米纤维膜以及实施例1缓释型zein抗菌纤维膜的细胞毒性。结果显示，L929细胞暴露于浓度为312.5、625、1250和2500μg/mL的zein纳米纤维膜提取物后，活细胞的百分比没有受到显著影响。而对于EU/zein纳米纤维膜以及缓释型zein抗菌纤维膜，当以1250μg/mL和2500μg/mL的浓度暴露于L929细胞时，细胞存活率降低，但仍高于85％。此外，根据细胞活/死试验的结果显示，zein纳米纤维膜、EU/zein纳米纤维膜以及缓释型zein抗菌纤维膜膜均具有较高的活细胞密度。这些结果表明实施例1缓释型zein抗菌纤维膜具有良好的生物相容性，证明了其在食品保鲜和生物医学领域中应用的可行性。 [0116] 测试例6——zein抗菌纤维膜的体外释放动力学及机制 [0117] 为了深入了解zein纳米纤维膜向周围环境的递送性能，本测试例以亲水介质(PBS溶液)作为模拟食品的模型溶剂，对未负载及负载丁香酚zein纳米纤维膜中丁香酚的释放速率进行了研究。 [0118] 图6中(A)显示了不同丁香酚添加浓度zein纳米纤维膜中丁香酚的累积释放曲线。可以看出，随着丁香酚添加浓度的增加，丁香酚的释放量和释放速率逐渐增加。其中，丁香酚添加量为40％的纳米纤维膜显示出累积4.91μg的丁香酚释放。丁香酚添加量为5％、 10％、20％和30％的纳米纤维膜显示出累积1.48μg、2.42μg、3.31μg、和4.03μg的丁香酚释放。此外，还观察到添加量为5％的载丁香酚zein纳米纤维膜在PBS(pH＝7.2)中孵育8h即完全释放。 [0119] 根据图6中(B)可知，戊二醛交联后，EU/zein纤维膜中丁香酚的释放速率降低，在第30h的释放量从未交联纳米纤维膜的81.38％减小到交联6h纳米纤维膜的64.78％。这表明戊二醛交联处理可以通过降低zein纳米纤维膜的亲水性以及在水环境中的稳定性来延长丁香酚的释放时间。交联处理使得纤维结构变得更加致密，因而从交联纤维结构网络中释放丁香酚比未交联纤维膜样品的丁香酚释放更加困难；并且交联处理会降低丁香酚在纤维基质中的扩散比率。暴露于戊二醛蒸汽后，zein纳米纤维的氨基和戊二醛的醛端之间形成了酰胺键，从而降低了纤维膜的水溶性。 [0120] 为了研究丁香酚从zein纳米纤维膜中的释放机制，使用不同的动力学模型(零级、一级、Higuchi、Rigter‑Peppas、Peppas‑Sahlin和Kopcha)对初始65％的丁香酚释放数据进行拟合。从表5中可以看出，zein纳米纤维膜中丁香酚的释放与Peppas‑Sahlin模型最为吻2 合(R>0.98)。此外，由于Rigter‑Peppas模型中的n指数小于0.45，Peppas‑Sahlin模型中的k1/k2比率大于1，Kopcha模型中的a/b比率大于1，因此，菲克扩散是未交联及戊二醛交联zein纳米纤维膜中丁香酚的主要释放机制。从释放试验结果可以看出，制备的缓释型zein抗菌纤维膜具有良好的控制释放性能，可有效用于果蔬保鲜应用。 [0121] 表5载丁香酚zein纳米纤维膜的释放模型拟合参数 [0122] [0123] [0124] 实施例2——缓释型zein抗菌纤维膜在草莓保鲜中的应用 [0125] 由于草莓货架期较短且非常容易受到微生物浸染而腐烂，本实施例将选择草莓用于评价缓释型zein抗菌纤维膜用于鲜果保鲜的可能性。从当地草莓种植基地采摘一批新鲜“红颜”草莓，分别选用尺寸、成熟度、外观一致且没有物理损伤和真菌腐败的草莓。首先将草莓浸于0.02％(w/v)次氯酸钠溶液中5min，然后用蒸馏水洗去残留物。随后，将所有草莓风干，平均分成3组：空白对照组、对比例3GTA_zein纳米纤维膜组和实施例1缓释型zein抗菌纤维膜组，分别标记为Control、GTA_zein NFF和GTA_EU/zein NFF。草莓被置于壁厚为1mm的聚丙烯材质的盒子中，纳米纤维膜被放置在盒子内的顶部。3组草莓在室温(25±1℃， 50％ RH)下贮藏6天。选择的盒子具有一定的透气性，可以维持水果的正常生理活动，但不会导致大量空气进入盒子。 [0126] 分别在第0天、第2天、第4天和第6天测定相关品质指标的变化。具体包括： [0127] 一、草莓保鲜效果评价 [0128] 如图7所示，Control组的草莓在贮藏2天后开始出现腐烂，在第4和第6天腐烂加剧，整体外观下降到了消费者无法接受的水平。然而，GTA_EU/ZNF组的草莓在贮藏6天后仍没有腐烂的迹象，这表明载丁香酚zein纤维膜可以有效地延长草莓在25℃贮藏过程中的货架期。此外，GTA_ZNF组的草莓在贮藏4天后开始出现少量腐烂；与Control组相比，GTA_ZNF对草莓货架期的延长可能与其对微生物的屏障作用有关。 [0129] 二、草莓采后品质测定 [0130] (1)硬度 [0131] 使用质构仪测量草莓的硬度。将单个草莓放在浮动平台上置于探针的正下方，以使探针穿透其赤道区。通过测量2mm的圆柱形探针以1mm/s的速率穿透8mm水果所需的力来进行草莓的硬度分析。根据5个草莓赤道带测量结果取平均值。 [0132] 图8显示了在6天贮藏试验期间草莓硬度的变化，可以看出，在贮藏期间，所有组别草莓的硬度均有所下降，其中空白对照组草莓的硬度降低速度最快，这可能与纳米纤维膜对水果内部气体成分的影响有关，从而降低呼吸速率和淀粉酶活性，最终延缓组织软化。此外，与对比例3未负载丁香酚的zein纳米纤维膜(GTA_zein NFF)相比，实施例1缓释型zein抗菌纤维膜(GTA_EU/zein NFF)组草莓的硬度损失明显更小，表明丁香酚可以延缓草莓的软化速率。在本实施例中，用缓释型zein抗菌纤维膜可以保持草莓的硬度，这表明它可以作为一种很有前途的抑制水果软化的方法。 [0133] (2)可滴定酸度 [0134] 将10g草莓切成小块，使用手持式均化器进行2分钟的高速均化，浆液置于蒸馏水中定容至100mL，通过pH计测量浆液的pH值。静置30min后，将浆液过滤。取10mL滤液使用0.1mol/L NaOH进行滴定，结果用每升柠檬酸克数表示。使用以下公式来计算稀释的果肉浆液的总可滴定酸度： [0135] [0136] 其中，VNaOH是滴定所用的NaOH的体积，单位为mL；0.1是NaOH溶液的摩尔浓度；0.064是柠檬酸的转换系数；V0是草莓浆液定容的体积，此处为100mL；V1是滤液体积，此处为 10mL；m是草莓的质量，此处为10g。总可滴定酸度以柠檬酸百分比表示。 [0137] 图9中(A)显示了草莓在贮藏过程中可滴定酸度的变化，可以看出，随着贮藏时间的增加，各组水果的可滴定酸度值逐渐下降。其中，空白对照组草莓的可滴定酸度下降幅度显著高于纳米纤维组的草莓，这一差异在贮藏4天后尤为显著，在贮藏第4天，空白对照组(Control)和纳米纤维膜组(GTA_zein NFF、GTA_EU/zein NFF)草莓样本的可滴定酸度之间的差异开始明显增大。此外，在贮藏期间，GTA_zein NFF组草莓样本的可滴定酸度值也明显低于GTA_EU/zein NFF组。根据图9中(B)，在贮藏过程中，空白对照组(Control)和GTA_zein NFF组草莓的浆液pH逐渐升高；而GTA_EU/zein NFF组草莓的浆液pH未发生显著变化。这些结果表明，实施例1缓释型zein抗菌纤维膜能够延缓营养物质的消耗，有效地保持草莓采后品质。 [0138] (3)可溶性固形物含量 [0139] 为了分析总可溶性固形物含量(TSS)，将10g草莓切成小块，使用手持式均化器进行2分钟的高速均化，浆液置于蒸馏水中定容至100mL，静置30min，随后将匀浆液过滤，滤液使用手持式折射计进行读数。 [0140] 图10显示了贮藏期间草莓总可溶性固形物含量的变化，可以看出，随着贮藏时间的增加，所有组别草莓的总可溶性固形物含量呈现先增大后减小的变化。在贮藏第2天总可溶性固形物含量的增加是由于水分的流失；随着贮藏时间的延长，持续的呼吸作用和碳水化合物的代谢又导致草莓总可溶性固形物含量的下降。与纳米纤维膜组(GTA_zein NFF、GTA_EU/zein NFF)相比，在25℃贮藏6天后空白对照组(Control)草莓的总可溶性固形物含量显著减少，这可能是由于它们最高的呼吸强度。在贮藏2天后，GTA_EU/zein NFF组草莓的总可溶性固形物含量均低于GTA_zein NFF组，这表明实施例1缓释型zein抗菌纤维膜中的丁香酚可以减缓草莓在贮藏过程中糖的还原。 [0141] 三、感官评价 [0142] 感官分析用于进一步评估丁香酚对草莓感官品质的可能影响。小组成员由10名年龄为20‑30岁未经培训的成年人(6名女性和4名男性)进行，他们是从实验室的学生和工作人员中招募的。考虑到被招募人员的习惯、对待分析材料的熟悉程度、敏感性和再现判断的能力，在测试前，对被招募人员进行了可视化、闻草莓和尝草莓的预训练。随机选择3个组别(Control、GTA_zein NFF、和GTA_EU/zein NFF)中的草莓，并分别在第2填、第4天、和第6天对草莓样本的气味、外观和味道进行评价，评分范围从1分(绝对不喜欢)到第9分(绝对喜欢)。小组成员被要求在样本之间用室温水漱口。 [0143] 如表6所示，结果表明，3个实验组别草莓的所有感官品质均随着贮藏时间的增加而有所下降。在贮藏6天后，空白对照组(Control)草莓发生严重腐烂，感官品质变差，导致感官得分明显下降。值得注意的是，GTA_EU/zein NFF对草莓的自然味道没有负面影响，在贮藏6天后，该组草莓在所有试验组别中的感官得分最高(大于7)；这表明实施例1缓释型zein抗菌纤维膜不仅可以延长草莓的保质期，而且在储存过程中能较好的保持草莓的视觉外观、风味和口感。 [0144] 表6草莓在6天贮藏期间感官评价的属性均值 [0145] [0146] [0147] 注：不同小写字母表示特定贮藏时间不同组别草莓的感官特性存在显著差异；不同大写字母表示特定试验组别草莓在不同贮藏时间的感官特性存在显著差异。 |
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