一种复合刺参胶原蛋白静电纺丝膜及其制备方法 |
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| 申请号 | CN202311862335.X | 申请日 | 2023-12-29 | 公开(公告)号 | CN117926595A | 公开(公告)日 | 2024-04-26 |
| 申请人 | 烟台蓝创生物技术有限公司; | 发明人 | 谢则平; 秦松; 李容恺; 李诚博; 曲承蕾; 宫世周; 李文军; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种复合刺参 胶原蛋白 静电纺丝 膜及其制备方法。本 申请 的制备方法包括刺参预处理、制备刺参胶原蛋白液、制备 醛 基化海藻酸钠，静电纺丝制备致密层、致密层的交联、制备疏松层、干燥灭菌等步骤。该复合刺参胶原蛋白静电纺丝膜致密层机械强度好，搭载纳米 银 具备了抗菌效果，疏松层孔隙致密，可以吸收伤口渗液和杂质，质地柔软，能与伤口紧密贴合，能够促进血管新生和肉芽组织生长， 加速 胶原沉积，可明显提高 伤口愈合 率，并且减少伤口色素沉积和疤痕的产生。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种复合刺参皮胶原蛋白静电纺丝膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种复合刺参胶原蛋白静电纺丝膜及其制备方法技术领域背景技术[0002] 胶原蛋白(collagen)是一种在动物体中含量最高、分布最为广泛的具有纤维状结构的蛋白质，在动物体中，约占体内所有蛋白质的25％至40％，每个胶原分子是由三条α－肽链以平行、右手螺旋形式缠绕成草绳状的三股螺旋结构，分子质量约为300ku。在胶原蛋白中甘氨酸、赖氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸的含量非常丰富，其中羟脯氨酸是胶原蛋白的特有氨基酸。对于海参类而言，海参属于棘皮动物，棘皮动物是无脊椎动物的一种。水产无脊椎动物的胶原蛋白主要可分为类I型和类V型两种(类Ⅰ型胶原富含有丙氨酸和糖结合型的羟赖氨酸，类Ⅴ型胶原富含糖结合型羟赖氨酸、丙氨酸含量比较少)，均相当于脊椎动物的Ⅰ型胶原。因而，海参富含有I型胶原蛋白。胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使骨、腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度。因其弱的抗原性和良好的生物相容性可作为生物医药材料的基础材料。 发明内容[0003] 本发明的目的是提供一种复合刺参胶原蛋白静电纺丝膜及其制备方法，该方法制备的静电纺丝膜具有优异的生物相容性和机械性能。 [0004] 技术方案：一种复合刺参胶原蛋白静电纺丝膜及其制备方法，具体包括以下步骤： [0005] (S1)刺参预处理：脱黑皮、脱脂、脱色； [0006] (S2)制备刺参胶原蛋白液：超声、酶法处理、过滤； [0008] (S4)制备致密层：将步骤(S2)中胶原蛋白液移至静电纺丝注射泵中，静电纺丝形成致密层； [0009] (S5)致密层的交联：将致密层用戊二醛溶液交联； [0010] (S6)制备疏松层：步骤(S2)中胶原蛋白液与醛基化海藻酸钠溶液均匀的涂覆在交联后的致密层上，冷冻干燥、灭菌，制备得到疏松层。 [0011] 本发明以刺参为基础材料提取刺参胶原蛋白液，制备一种复合刺参胶原蛋白静电纺丝膜，防止细菌感染，提高伤口愈合率，减少伤口色素沉积和疤痕的产生。 [0012] 进一步地，步骤(S1)中，所述去黑皮是用3％‑8％乙酸溶液浸泡刺参2‑8min，再将黑色刺参皮刮去。 [0013] 进一步地，步骤(S1)中，所述脱脂是刺参与异丙醇按照料液比1：20的比例搅拌处理。 [0014] 进一步地，步骤(S1)中，所述脱色是用2％‑10％的双氧水溶液搅拌处理。 [0015] 进一步地，步骤(S2)中，所述超声是按照1：20的液料比，将刺参置于乙酸溶液中超声，超声功率为200‑600W，超声时间为10‑30min。 [0016] 进一步地，步骤(S2)中，所述酶法处理是用质量为刺参干重的质量百分比4％‑8％的胃蛋白酶搅拌处理。 [0017] 进一步地，步骤(S2)中，所述过滤是用滤袋‑筒式过滤系统。 [0018] 进一步地，步骤(S3)中，所述醛基化海藻酸钠通过以下方法制备：向80‑120mL质量百分浓度为2‑6％海藻酸钠溶液加入2‑4g高碘酸钠，避光搅拌8‑16h，透析，冻干，得到醛基化海藻酸钠。 [0019] 进一步地，透析的方法为：反应后的溶液用分子截留量800‑1000Da的透析袋闭光透析2‑4天。 [0020] 进一步地，步骤(S4)中，纳米银溶液的质量浓度为0.5‑2％；推进器的推进速度为7‑12mL/h，纺丝电压为10‑20kV，滚轴的接收距离为10‑20cm，滚轴的转动速度为500‑ 1000rmp，纺丝时间为4‑10h。 [0021] 进一步地，步骤(S4)中，所述致密层厚度为0.02‑0.05mm。 [0022] 进一步地，步骤(S5)中，所述戊二醛溶液的质量百分浓度为4％‑15％。 [0023] 进一步地，步骤(S6)中，所述醛基化海藻酸钠的质量百分浓度为5‑15％。 [0024] 进一步地，步骤(S6)中，所述醛基化海藻酸钠溶液与胶原蛋白液的质量比例为1：1。 [0025] 进一步地，步骤(S6)中，所述疏松层厚度为1‑3mm。 [0027] 进一步地，步骤(S6)中，所述灭菌是通过Co‑60γ射线辐照灭菌。 [0028] 本申请进一步制备了一种复合刺参皮胶原蛋白静电纺丝膜，所述静电纺丝膜由上述的制备方法所制备。 [0029] 有益效果：与现有技术相比，本申请制备的该复合刺参胶原蛋白静电纺丝膜包括两部分，致密层是通过将胶原蛋白液通过静电纺丝形成的膜，疏松层是将从刺参中提取的胶原蛋白液涂覆在致密层上，通过其自组装形成一层胶原海绵，机械强度好，质地柔软，能与伤口紧密贴合，能够促进血管新生和肉芽组织生长，加速胶原沉积，可明显提高伤口愈合率，并且减少伤口色素沉积和疤痕的产生。附图说明 [0030] 图1为复合静电纺丝膜致密层的扫描电镜图； [0031] 图2为复合静电纺丝膜疏松层的扫描电镜图； [0032] 图3为复合静电纺丝膜的体外降解曲线。 具体实施方式[0033] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述： [0034] 实施例1：复合刺参胶原蛋白静电纺丝膜的制备 [0035] 步骤(1)：刺参预处理 [0036] 取冷冻储存的刺参，化冻后用5℃的纯化水冲洗3遍至表面无明显杂质；用质量百分浓度为3％的乙酸溶液浸泡刺参4min，用5℃纯化水冲洗掉残留乙酸，用刀将黑色外皮刮去；将刺参依次置于4L 10％异丙醇溶液和5％的双氧水溶液搅拌处理后切成5mm×5mm的形状、洗净，粗砂布沥干，称重为176.35g。 [0037] 步骤(2)：制备胶原蛋白液 [0038] 将预处理后的刺参置于在4L醋酸溶液中超声，超声功率为200W，超声时间为10min；超声结束后将液体倒出，称取8g胃蛋白酶加入到溶液中搅拌，搅拌结束后，将胶液分别通过5微米的滤袋过滤、0.45微米的筒式过滤系统进行过滤，获得胶原蛋白液。 [0039] 步骤(3)：制备致密层 [0040] 将9mL胶原蛋白液与1mL质量百分浓度为1％纳米银溶液混合均匀，少量分次装入10mL静电纺丝注射器，注射泵控制溶液流速为2mL/h左右，电压设定在20kV，针头与收集板的距离为15cm，不锈钢滚轴的转动速度为800rmp，纺丝4h，形成致密层，致密层厚度为 0.03mm，致密层的结构如图1所示。 [0041] 步骤(4)：致密层的交联 [0042] 将致密层置于质量百分浓度为8％的戊二醛溶液中交联。 [0043] 步骤(5)：制备疏松层 [0044] 醛基化海藻酸钠的制备：100mL质量百分浓度为4％海藻酸钠溶液加入4g高碘酸钠，避光搅拌16h，溶液用分子截留量800‑1000Da的透析袋闭光透析2天，然后将溶液冻干，得到醛基化海藻酸钠；将步骤(2)制备的胶原蛋白液与浓度为10％的醛基化海藻酸钠按照质量比为1:1均匀混合后，快速涂覆在交联后的致密层上，通过胶原与醛基化海藻酸钠自组装形成凝胶结构，获得刺参胶原蛋白静电纺丝膜，置于真空冷冻干燥机内进行真空冷冻干燥，形成多孔的疏松层，疏松层厚度为2mm，通过Co‑60γ射线辐照灭菌，封装保存，疏松层的结构如图2所示。 [0045] 实施例2：复合静电纺丝膜的扫描电镜观察 [0046] 1、样品制备，样品必须干燥(无水)。将导电胶一面粘于钉型样品台上，将样品固定在样品台上导电胶的另一面，确保样品粘贴牢固。样品固定好后，使用压缩空气(压力确保在8‑10psi之间)吹扫除尘。 [0047] 2、将制备好的样品放进离子溅射仪中，真空度为8Pa时，开始喷金，喷金时电流为5mA，喷金时长200s。 [0048] 3、将样品放在样品杯中，放入电镜中进行观察。点击软件，电镜由光学模式转换成电子模式，进入二次电子观察模式，调节电压为5KV，电流为中等电流。调节放大旋钮、聚焦旋钮、对比度和亮度按钮等操作，调节好需要观察的图片区域，然后点击存储图片，扫描电镜照片形成。 [0049] 实施例3：复合静电纺丝膜的体外降解研究 [0050] 取5U胶原酶，20mM PBS，pH7.4，0.36mM CaCl2，配制250mL溶液，分装到2毫升离心管中，1.8mL/管；样品剪成0.5*2cm大小并精确称重，放入PBS溶液中10min以上挤压赶出气泡，洗去残液后至于上述离心管中，编号，37℃水浴一定时间取出，根据情况离心弃上清，沉淀用纯水漂洗三次，室温下真空干燥，称取残留样品重量绘制体外降解曲线(图3)。从图3的结果可以看出，交联过后的胶原蛋白纤维膜，降解速率明显慢于未交联组，可以更好的适应伤口愈合周期，减少伤口敷料更换的频次。 [0051] 实施例4：复合静电纺丝膜的细胞毒性研究 [0053] 2、浸提液的制备：取复合静电纺丝膜，按0.1g样品：1mL浸提介质的比例，浸提介质为含血清的DMEM培养基，(37±1)℃，(24±2)h制备试验液。 [0054] 3、将样品试验液，阴性对照(聚苯乙烯)、阳性对照(10％DMSO)的浸提液及介质对照分别放于6个培养着L929小鼠成纤维细胞的细胞培养板孔内，在5％CO2，37℃细胞培养箱中培养，24h后显微镜下观察各组细胞形态学改变，并用CCK‑8法测定个组相对于介质组的细胞存活率。 [0055] 4、显微镜下观察，24h试验组绝大部分细胞形态正常，少量细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变；偶见细胞溶解。CCK‑8法显示该复合静电纺丝膜试验液的的细胞存活率为84.0％，无潜在细胞毒性(见表1)。 [0056] 表1复合静电纺丝膜的细胞毒性的测试结果 [0057] 组别 吸光度均值 存活率/％介质对照组 1.752 / 试验组 1.471 84.0 阴性对照组 1.706 97.3 阳性对照组 0.146 8.3 [0058] 从以上结果可以看出，本申请制备的复合刺参胶原蛋白静电纺丝膜致密层机械强度好，搭载纳米银具备了抗菌效果，疏松层孔隙致密，可以吸收伤口渗液和杂质，质地柔软，能与伤口紧密贴合，能够促进血管新生和肉芽组织生长，加速胶原沉积，可明显提高伤口愈合率，并且减少伤口色素沉积和疤痕的产生。 |
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