一种构建RNA文库的方法和试剂盒 |
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| 申请号 | CN202311638841.0 | 申请日 | 2023-11-30 | 公开(公告)号 | CN117661124A | 公开(公告)日 | 2024-03-08 |
| 申请人 | 武汉大学; | 发明人 | 殷雷; 孙再桥; 雷骏; 何柏晓; 陈鹏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种构建RNA文库的方法，所述方法包括：从RNA样品中富集获得mRNA，所述富集过程中将所述mRNA打断成mRNA小 片段 ；采用第一引物对所述mRNA小片段进行逆转录并纯化，获得第一链cDNA；采用第二引物扩增所述第一链cDNA并纯化，获得第二链cDNA；采用第三引物扩增所述二链cDNA，获得RNA文库；该方法能够简化建库的过程并有效降低建库成本，通过两轮带有接头序列的cDNA的合成，同步完成模板的逆转录和双端接头序列的引入，并完成模板的富集，实现了低成本且快速高效的建库。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种构建RNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括： |
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| 说明书全文 | 一种构建RNA文库的方法和试剂盒技术领域背景技术[0002] RNA二代测序技术(RNANext‑generation sequencing,RNA‑seq)一般是高通量大规模的转录组测序技术，可以同时对几十万乃至几百万个转录RNA分子进行序列测定，用于未知病原的鉴定、生物遗传进化分析、基因表达差异分析和RNA合成及加工分析等。因此，RNA‑seq广泛用于科学研究和疾病诊断等领域，并取得了许多突破性的结果。RNA文库构建是指通过逆转录和接头连接等过程将RNA转化为二代测序仪可识别的双链DNA的过程，是RNA‑seq的关键步骤。近年来出现的RNA‑seq建库试剂盒主要侧重于RNA链特异性研究，其具体的建库过程如下：(1)片段化RNA，添加dUTP合成双链cDNA，通过尿嘧啶U碱基区分链特异性；(2)对cDNA进行末端补平修复及对cDNA的3’端加腺嘌呤A碱基，保证cDNA双链的3’端含有A碱基悬挂进而配合接头的3’端胸腺嘧啶T碱基实现TA连接完成建库；(3)需要设计两条单链接头并退火形成双链，且含有硫代硫酸酯键修饰，保证接头T碱基不会脱落，才能进行有效接头连接；(4)最后，在进行PCR之前还需对含有尿嘧啶U碱基的cDNA第二链进行消化才能实现链特异性建库。 [0003] 由于现有的流程需要先进行RNA打断至小片段，再生成双链cDNA后，最后进行双链的补平，加A，连接接头、扩增建库等步骤，所以流程较长，通常需要7～9个小时才能完成试验，建库效率低。 [0004] 因此，有必要开发一种流程短、建库效率高的文库构建的方法和试剂盒。 发明内容[0005] 本发明目的是提供一种构建RNA文库的方法，该方法能够简化建库的过程并有效降低建库成本，通过两轮带有接头序列的cDNA的合成，同步完成模板的逆转录和双端接头序列的引入，并完成模板的富集，实现了低成本且快速高效的建库。 [0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： [0007] 在本发明的第一方面，提供了一种构建RNA文库的方法，所述方法包括： [0008] 从RNA样品中富集获得mRNA，所述富集过程中将所述mRNA打断成mRNA小片段； [0009] 采用第一引物对所述mRNA小片段进行逆转录并纯化，获得第一链cDNA； [0010] 采用第二引物扩增所述第一链cDNA并纯化，获得第二链cDNA； [0011] 采用第三引物扩增所述二链cDNA，获得RNA文库； [0012] 其中，所述第一引物从5’端至3’端依次包括第一接头序列和随机序列；所述第二引物从5’端至3’端依次包括第二接头序列和随机序列； [0013] 所述第三引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物从5’端至3’端依次包括：上游测序平台序列、文库index序列以及上游测序引物序列，所述下游引物从5’端至3’端依次包括：下游测序平台序列、文库index序列以及下游测序引物序列，其中，所述上游测序引物序列与所述第二引物的5’端的至少部分序列相同，所述下游测序引物序列与所述第一引物的5’端的至少部分序列相同。 [0014] 进一步地，所述第一接头序列和所述第二接头序列均选自P5和P7接头，且所述第一接头序列和第二接头序列不同。 [0015] 进一步地，所述第一引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三引物中的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。 [0016] 进一步地，所述RNA样品包括总RNA、mRNA、lncRNA、去除核糖体的RNA中的至少一种。 [0017] 进一步地，所述采用第二引物扩增所述第一链cDNA时，采用具有链置换功能的DNA聚合酶，同时添加RNase H。 [0018] 在本发明的第二方面，提供了构建RNA文库的引物组合，所述引物组合包括第一引物、第二引物和第三引物，所述第一引物从5’端至3’端依次包括第一接头序列和随机序列；所述第二引物从5’端至3’端依次包括第二接头序列和随机序列；所述第三引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物从5’端至3’端依次包括：上游测序平台序列、文库index序列以及上游测序引物序列，所述下游引物从5’端至3’端依次包括：下游测序平台序列、文库index序列以及下游测序引物序列，其中，所述上游测序引物序列与所述第二引物的5’端的至少部分序列相同，所述下游测序引物序列与所述第一引物的5’端的至少部分序列相同。 [0019] 进一步地，所述第一引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三引物包括序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物。 [0020] 在本发明的第二方面，提供了一种构建RNA文库的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合。 [0021] 本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点： [0022] 本发明提供一种构建RNA文库的方法，通过对打断富集的mRNA进行逆转录，由于mRNA打断之后，第一链引物和第二链引物中的随机序列可以和模板进行多点的结合，两个引物结合位点相隔不远，便于后续PCR扩增富集，获得了高于原始模板产量的cDNA，且由于两次反应分别用不同的酶和接头，两次随机引物分别结合在DNA的不同链，因此获得的RNA文库具有链特异性，在PCR之前产物分选使得产物长度也在测序合理范围内。，由于引物上直接连接有接头序列，无需后期再进行双端接头连接，因此无论是扩增效率还是建库速度都大幅提升。附图说明 [0023] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。 [0024] 图1为本申请实施例中提供的构建RNA文库的流程示意图。 [0025] 图2为DADCSeq与其他RNA‑seq的检测基因数比较。 [0026] 图3为DADCSeq与其他RNA‑seq的基因区域覆盖均一性比较。 [0027] 图4为DADCSeq与其他RNA‑seq的基因组比对区域比较。 [0028] 图5为DADCSeq与其他RNA‑seq的文库GC含量比较。 [0029] 图6为DADCSeq与其他RNA‑seq的链特异性比较。 具体实施方式[0030] 下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。 [0031] 在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。 [0032] 除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。 [0033] 本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下： [0034] 本发明实施例提供一种构建RNA文库的方法，如图1所示，所述方法包括： [0035] 步骤S1、从RNA样品中富集获得mRNA，所述富集过程中将所述mRNA打断成mRNA小片段； [0036] 所述步骤S1中，所述RNA样品包括总RNA、mRNA、lncRNA、去除核糖体的RNA中的至少一种。 [0037] 所述RNA样品可以采用常规方法对样品进行提取。 [0038] 作为一种具体的实施方式，所述富集方法包括mRNA磁性分离法。 [0039] 真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构(m7G)和3’端Poly(A)尾结构。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20‑30个腺苷酸组成的Poly(A)尾，通常用Poly(A+)表示。该结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志。NEBNext Poly(A)mRNA磁性分离模块可从总RNA中分离完整的Poly(A+)RNA。具体的分离流程如下：首先使用带有Oligo d(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，Oligo d(T)探针将和带Poly(A)尾的mRNA结合，接下来回收磁珠，将这些带Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来即可。 [0040] 作为一种具体的实施方式，所述富集过程中将所述mRNA打断成mRNA小片段可采用的方式包括：用浓度为2.5mM镁离子的1×Reverse transcriptionbuffer将洗脱下来的mRNA打成片段(片段大小为250‑350bp左右) [0041] 步骤S2、采用第一引物对所述mRNA小片段进行逆转录并纯化，获得第一链cDNA； [0042] 所述步骤S2中，所述第一引物从5’端至3’端依次包括第一接头序列和随机序列； [0043] 作为一种具体的实施方式，所述第一接头序列选自P5和P7接头，所述第一引物的序列如SEQ ID NO.1所示：5’‑GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNN‑3’(N代表ATGC中的任意一个)。 [0044] 所述逆转录中还加入逆转录酶和缓冲液，添加体系具体如表3所示。 [0045] 步骤S3、采用第二引物扩增所述第一链cDNA并纯化，获得第二链cDNA； [0046] 所述步骤S3中，所述第二引物从5’端至3’端依次包括第二接头序列和随机序列； [0047] 作为一种具体的实施方式，所述第二接头序列选自P5和P7接头，所述第二引物的序列如SEQ ID NO.2所示： [0048] 5’‑ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNN‑3’(N代表ATGC中的任意一个)。 [0049] 扩增所述第一链cDNA时，采用具有链置换功能的DNA聚合酶，同时添加RNase H。 [0050] 所述添加RNase H是为了去除cDNA链中的RNA。便于随机引物更好结合在cDNA链，第二链随机引物有多个结合位点，产物带有双端接头序列，无需再进行接头连接。 [0051] RNA片段化所用的Reverse transcription buffer主要成分包括：25mM Tris pH 8.3，30mM NaCl，2.5mM MgCl2，8mM DTT。合成第二链cDNA时，由于DNA聚合酶具有高效的链置换活性，在本申请的一个具体实施方式中，所述DNA聚合酶为Bsu酶。添加体系具体如表5所示。 [0052] 所述步骤S2和步骤S3中，通过纯化第一链和第二链产物去掉残留的接头序列，以减少后续非特异性扩增，减少二聚体的产生。 [0054] 步骤S4、采用第三引物扩增所述二链cDNA，获得RNA文库； [0055] 所述步骤S4中， [0056] 所述第三引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物从5’端至3’端依次包括：上游测序平台序列、文库index序列以及上游测序引物序列，所述下游引物从5’端至3’端依次包括：下游测序平台序列、文库index序列以及下游测序引物序列，其中，所述上游测序引物序列与所述第二引物的5’端的至少部分序列相同，所述下游测序引物序列与所述第一引物的5’端的至少部分序列相同。 [0057] 作为一种具体的实施方式，所述第三引物中的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。 [0058] 上游引物： [0059] 5’‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACA CGACGC‑3’[0060] 下游引物： [0061] 5’‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTT‑3’[0062] 其中XXXXXXXX为index序列。 [0063] 作为一种具体的实施方式，所述index序列可参照诺维赞公司的试剂说明书https://www.vazyme.com/product/694.html，比如TATAGCCT、ATAGAGGC、CGAGTAAT、TCTCCGGA均可。 [0064] 所述扩增中还加入高保真PCR酶，添加体系具体如表7所示。 [0065] 下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种构建RNA文库的方法进行详细说明。 [0066] 实施例1、RNA文库的构建 [0067] RNA文库的构建示意图见图1所示。RNA文库构建的步骤如下：如图1所示，通过带有第一接头序列的随机引物进行逆转录合成第一链cDNA，然后加入带有第二接头序列的随机引物合成二链，再经过PCR扩增富集得到RNA文库。具体过程如下： [0068] 一、mRNA富集 [0069] a、提前将mRNACapture Beads，Beads Wash Buffer，Tris Buffer，Beads Binding Buffer从2～8℃取出，静置使其平衡至室温。 [0070] b、准备RNA样品：将0.01‑4μg总RNA溶解于Nuclease‑free ddH2O至总体积50μl，冰上放置备用。 [0071] c、缓慢颠倒使mRNA Capture Beads充分混匀，吸取50μl加入到准备好的RNA样品中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。 [0072] d、在PCR仪中运行如下程序，使mRNA与磁珠进行第一次结合： [0073] 表1 [0075] e、将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。 [0076] f、将样品从磁力架上取出，加入200μl Beads Wash Buffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀并置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。 [0077] g、将样品从磁力架上取下，加入50μl Tris Buffer用移液器轻轻吸打10次将磁珠充分混匀。 [0078] h、在PCR仪中运行如下程序，洗脱mRNA： [0079] 表2 [0080] 温度 时间80℃ 2min 25℃ Hold [0081] i、加入50μl Beads Binding Buffer，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。 [0082] j、室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上。 [0083] k、将样品置于磁力架上，使mRNA与总RNA分离，待溶液变澄清后(约5min)，小心移除上清。 [0084] l、将样品从磁力架上取出，加入200μl Beads Wash Buffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀并置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。m、将样品从磁力架上取出，加入24μl 1×Reverse transcription Buffer，用移液器吹打6次充分混匀，95℃反应5min，立即置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心吸取22μl上清至一个新的Nuclease‑free PCR管中。 [0085] 二、逆转录反应 [0086] 2.1按照下表1配制逆转录mix。 [0087] 表3‑逆转录mix [0088] [0089] 2.2将逆转录mix置于PCR仪上，按照如下表2中的程序进行逆转录得到逆转录产物即第一链cDNA。 [0090] 表4‑逆转录反应程序 [0091] 温度 时间25℃ 5min 50℃ 20min 80℃ 10min 4℃ Hold [0092] 2.3.cDNA产物纯化。 [0093] a.将DNA Clean Beads提前30min从2‑8℃取出，静置使其温度平衡。 [0094] b.颠倒或旋涡振荡使DNAClean Beads充分混匀，吸取20μl(1×)加入到PCR产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。 [0095] c.室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上。 [0096] d.将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。 [0097] e.保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，在室温孵育30s [0098] f.重复步骤e一次。 [0099] g.保持样品始终处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约3‑5min。 [0100] h.将样品从磁力架上取出，加入22μl Nuclease‑free H2O，使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取20μl上清至一个新的Nuclease‑free PCR管中。 [0101] 三、二链合成 [0102] 按照表5配制二链合成mix [0103] 表5 [0104] 名称 体积(μL)一链纯化产物 19.3 CWN6(10uM) 1 dNTP 1 Bsu DNA polymarance 1 RNase H 0.2 10×Bsu DNA polymarance buffer 2.5 To ddH20 25 [0105] 将二链合成mix置于PCR仪上，按照如下表4中的程序进行二链合成得到双链DNA。 [0106] 表6‑二链合成反应温度 [0107]温度 时间 25℃ 5min 37℃ 30min 4℃ Hold [0108] 向二链DNA中加入22ul磁珠，吸打混匀后静置5min，置于磁力架上至澄清，弃去上清；再使用200ul新鲜的80％乙醇清洗磁珠，清洗两次后，使用23ul Nuclease‑free H2O水洗脱磁珠得到纯化后的二链产物，吸取23ul二链产物进入后续试验。 [0109] 四、PCR扩增 [0110] 4.1.向上一步纯化产物中加入1ul L5和L7引物，25ul高保真PCR master mix(含有DNA聚合酶)，吸打混匀，按照表5程序进行PCR扩增得到扩增产物。 [0111] 表7‑PCR反应混合物 [0112] [0113] [0114] PCR反应，按照表8进行PCR反应 [0115] 表8‑PCR扩增运行程序 [0116] [0117] 五、产物分选 [0118] a、将平衡至室温的 DNASelection Beads磁珠，振荡或上下颠倒混匀取65μL磁珠加入上述100μL(加水稀释到100μL)反应体系中，使用移液枪轻轻吹打混匀，室温孵育5min。 [0119] b、PCR管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min)，小心转移上清到新的PCR管中。 [0120] c、取20μL磁珠加入上述新的PCR管，室温孵育5min，置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。 [0121] d、保持PCR管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后小心移除上清。 [0122] e、重复步骤d，总计漂洗两次。 [0123] f、保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约3‑5min)。 [0124] g、将PCR管从磁力架中取出，加入22μLddH2O洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置孵育5min。 [0125] h、将反应管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清(约5min)后小心吸取20μL上清至干净的PCR管中。 [0126] 由上可见，本实施例中提供的RNA文库的构建方法，全流程仅需3步扩增反应即可(图1)，操作简单，整体实验时间为4～4.5小时，整个建库所需时间缩短一半，而所构建的RNA文库有利于后期的推广应用。 [0127] 实施例2、DADC‑seq与其他RNA建立方法的比较 [0128] 1、本发明的DADC‑seq建库方面同实施例1，其他方法包括传统方法Hieff NGS Ultima Dual‑mode RNALibrary Prep Kit，建库流程按照产品说明书进行。SHERRY方法参照(Di et al.,2020)，本研究RNA建库流程见图1。 [0129] 表9‑建库成本比较 [0130] [0131] 本发明的DADCSeq方法与其他RNA‑seq的成本比较结果如表9可知，本发明所需成本最低，每个样品建库费用仅需30元左右，当样品量大价格会更优惠。 [0132] 2、不同方法转录组比对率比较结果如表10。 [0133] 表10‑转录组比对率比较 [0134] 基因组比对率 外显子比对率 基因检测数 DADCseq 83.08％±0.44％ 84.03％±0.49％ 14582±42 SHERRY 83.33％±0.31％ 87.18％±0.35％ 14055±118 Hieff NGS 82.43％±0.15％ 83.60％±0.14％ 14930±50 [0135] 本发明的DADCSeq方法与其他RNA‑seq的转录组比对率比较结果如表10可知，DADCSeq转录组比对率跟其他方法对比基本一致。 [0136] 3、RNA投入量为200ng,使用Qubit对构建好的文库进行定量，Agilent 2100验证文库大小分布。构建好的文库在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序并分析。结果见图2‑图6。 [0137] 本发明的DADCSeq方法与其他RNA‑seq的检测基因数比较结果如图2可知，DADCSeq基因检测数量跟HieffNGS较为接近，比SHERRY方法明显更多。 [0138] 本发明的DADCSeq方法与其他RNA‑seq的基因区域覆盖均一性比较结果如图3可知，DADCSeq基因覆盖区域跟HieffNGS一致，比起SHERRY方法在5’端覆盖更广范。本发明的DADCSeq方法与其他RNA‑seq的基因组比对区域比较结果如图4可知，DADCSeq与其他方法基本一致。 [0139] 本发明的DADCSeq方法与其他RNA‑seq的文库GC含量比较结果如图5可知，DADCSeq跟其他方法也比较一致。 [0140] 本发明的DADCSeq方法与其他RNA‑seq的链特异性比较结果如图6可知，DADCSeq主要覆盖正义链，HieffNGS主要覆盖在反义链，而SHERRY没有链特异性。 [0141] 综上，本发明提供一种高效快速的RNA建库技术，称为(DADCSeq)。相较于传统的RNA建库方法，DADCseq具有耗时短、操作简单和成本低廉等优点，相较于已有的RNA‑seq技术，DADC‑seq具有基因检出率高、RNA信息完整和链特异性等(适用于检测lncRNA)优点，是一种高效灵敏的转录组测序技术，可以广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域，且操作简单快速，有利于大规模推广。 [0142] 最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。 [0143] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。 [0144] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。 |
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