适用于mNGS检测的样本前处理方法 |
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申请号 | CN202211074699.7 | 申请日 | 2022-09-01 | 公开(公告)号 | CN117660598A | 公开(公告)日 | 2024-03-08 |
申请人 | 广州达安基因股份有限公司; | 发明人 | 蒋析文; 梁志坤; 梁焱; 吴轶兰; 袁亚丽; | ||||
摘要 | 本 申请 实施例 属于分子 生物 学技术领域,涉及一种适用于mNGS检测的样本前处理方法,包括对待处理的样本进行 研磨 预处理操作,获得匀质样本;对所述匀质样本进行核酸提取操作,获得目标核酸;根据所述目标核酸进行二代测序文库构建,获得目标DNA测序文库;将所述目标DNA测序文库依次进行 磁珠 纯化及PCR处理,获得适用于mNGS检测的样本。本申请提升测序检出结果。 | ||||||
权利要求 | 1.一种适用于mNGS检测的样本前处理方法,其特征在于,包括下述步骤: |
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说明书全文 | 适用于mNGS检测的样本前处理方法技术领域背景技术[0002] 宏基因组新一代测序技术(mNGS),不依赖于传统的微生物培养,直接对临床样本中的核酸进行高通量测序,然后与数据库进行比对分析,根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类,能够快速、客观地检测临床样本中的较多病原微生物(包括细菌、真菌、寄生虫及病毒),尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。mNGS湿实验包括样本前处理、核酸提取、文库构建及上机测序。mNGS的临床样本主要有肺泡灌洗液、痰液、脑脊液等,而不同的临床样本比较复杂,差异较大,需要在核酸提取前进行样本的差异化前处理,针对性的提升病原体检出。 [0003] 由于细菌、真菌、病毒和寄生虫等各种微生物特性不同,样本前处理和核酸提取的方法需要兼容不同微生物的特征。对于提取比较难破壁的细菌和真菌核酸时,常规的方法对此类微生物的提取效果较差,其测序检出结果也较差。发明内容 [0004] 本申请实施例的目的在于提出一种适用于mNGS检测的样本前处理方法,提升测序检出结果。 [0005] 为了解决上述技术问题,本申请实施例提供一种适用于mNGS检测的样本前处理方法,采用了如下所述的技术方案: [0006] 一种适用于mNGS检测的样本前处理方法,包括下述步骤: [0008] 对所述匀质样本进行核酸提取操作,获得目标核酸; [0009] 根据所述目标核酸进行二代测序文库构建,获得目标DNA测序文库; [0010] 将所述目标DNA测序文库依次进行磁珠纯化及PCR处理,获得适用于mNGS检测的样本。 [0011] 进一步的,所述对待处理的样本进行研磨预处理操作,获得匀质样本的步骤包括: [0012] 向装有研磨珠的研磨管中加入所述待处理的样本和裂解液; [0013] 将所述研磨管置于专用的匀质仪器中进行研磨操作,获得所述匀质样本。 [0014] 进一步的,所述研磨珠为锆珠。 [0015] 进一步的,所述锆珠的粒径为0.2mm。 [0016] 进一步的,所述匀质仪器为漩涡振荡器Vortex‑Genie2。 [0017] 进一步的,所述匀质仪器的研磨条件为:以最大速度研磨15min~20min。 [0018] 进一步的,所述向装有研磨珠的研磨管中加入所述待处理的样本和裂解液的步骤包括: [0019] 向装有研磨珠的研磨管中加入400μL所述待处理的样本和1mL裂解液。 [0020] 进一步的,所述对所述匀质样本进行核酸提取操作,获得目标核酸的步骤包括: [0021] 根据所述待处理的样本的数量,在96深孔板的第3列和第9列中加入600μL的第一洗涤液; [0022] 根据所述待处理的样本的数量,在96深孔板的第4列、第5列、第10列和第11列中加入600μL的第二洗涤液; [0023] 根据所述待处理的样本的数量,在96深孔板的第6列和第12列中加入60μL的洗脱液; [0024] 根据所述待处理的样本的数量,在96深孔板的第1列、第2列、第7列和第8列中均按顺序加入20μL磁珠、20μL蛋白酶K和所述匀质样本; [0025] 将所述96深孔板放入Smart32型全自动核酸提取仪中,运行核酸提取程序,获得所述目标核酸。 [0026] 进一步的,所述Smart32型全自动核酸提取仪的核酸提取程序为: [0027] 所述96深孔板的第一孔位和第二孔位进行裂解操作; [0028] 所述96深孔板的第三孔位、第四孔位和第五孔位进行洗涤操作; [0029] 所述96深孔板的第六孔位进行洗脱操作; [0030] 所述96孔板饿第四孔位进行弃磁操作。 [0031] 进一步的,所述对所述匀质样本进行核酸提取操作,获得目标核酸的步骤包括: [0032] 步骤1:在灭菌的2mL离心管中加入40uL磁珠、40μL蛋白酶K及匀质后的样本,充分涡旋混匀; [0033] 步骤2:将离心管置于恒温震荡金属浴中,70℃孵育12min,瞬时离心; [0035] 步骤4:往离心管中加入600μL第一洗涤液,涡旋混匀1min,瞬时离心; [0036] 步骤5:将离心管置于磁力架上,待磁珠完全吸附后,用移液器去除液体; [0037] 步骤6:往离心管中加入600μL第二洗涤液,涡旋混匀1min,瞬时离心; [0038] 步骤7:将离心管置于磁力架上,待磁珠完全吸附后,用移液器去除液体; [0039] 步骤8:重复步骤5和步骤6; [0040] 步骤9:将离心管置于磁力架上,待磁珠完全吸附后,用移液器去除液体,开盖晾干; [0041] 步骤10:往离心管中加入60μL~120μL洗脱液,涡旋混匀,室温孵育5min后,置于磁力架上,待磁珠完全吸附后,获得所述目标核酸。 [0042] 与现有技术相比,本申请实施例主要有以下有益效果: [0044] 为了更清楚地说明本申请中的方案,下面将对本申请实施例描述中所需要使用的附图作一个简单介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0045] 图1是根据本申请的适用于mNGS检测的样本前处理方法的一个实施例的流程图。 具体实施方式[0046] 除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同;本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请;本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含。本申请的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象,而不是用于描述特定顺序。 [0047] 在本文中提及“实施例”意味着,结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例,也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是,本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。 [0048] 以下的实施例便于更好地理解本申请,但并不限定本申请。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。 [0049] 为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案,下面将结合附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。 [0050] 一种适用于mNGS检测的样本前处理方法,包括下述步骤: [0051] S1:对待处理的样本进行研磨预处理操作,获得匀质样本; [0052] S2:对所述匀质样本进行核酸提取操作,获得目标核酸; [0053] S3:根据所述目标核酸进行二代测序文库构建,获得目标DNA测序文库; [0054] S4:将所述目标DNA测序文库依次进行磁珠纯化及PCR处理,获得适用于mNGS检测的样本。 [0055] 本申请采用物理研磨、化学破碎及生物酶消化相结合的方法,解决核酸提取过程中微生物破壁等的关键步骤。 [0056] 其中,在步骤S1中,即所述对待处理的样本进行研磨预处理操作,获得匀质样本的步骤包括: [0057] 将所述待处理的样本和裂解液混合,加入装有研磨珠的研磨管中; [0058] 将所述研磨管置于专用的匀质仪器中进行研磨操作,获得所述匀质样本。 [0059] 其中,研磨管中的研磨珠为锆珠,粒径为0.2mm,分装的重量为0.4g,灭菌,烘干,分装,灭菌,烘干。 [0060] 匀质仪器为漩涡振荡器Vortex‑Genie2(生产厂家:scientificindustrie),配套。所述匀质仪器的研磨时间(即匀质条件)为15min~20min。 [0061] 在步骤S2中,即对所述匀质样本进行核酸提取操作,获得目标核酸的步骤包括: [0062] 具体的,包括如下步骤: [0063] 1、Smart32型全自动核酸提取仪操作: [0064] (1)根据提取样本的数量,在96深孔板的第3、9列中加入600μL的洗涤液1; [0065] (2)根据提取样本的数量,在96深孔板的第4、5、10、11列中加入600μL的洗涤液2; [0066] (3)根据提取样本的数量,在96深孔板的第6、12列中加入60μL的洗脱液; [0067] (4)根据提取样本的数量,在96深孔板的第1、2、7、8列中按顺序加入20μL磁珠、20μL蛋白酶K、匀质后的样本; [0068] 注:添加磁珠前需充分混匀磁珠,如果提取的样本数量较多,则每添加完8个样品孔重悬一次磁珠。 [0069] [0070] (5)运行程序前,确保插入新的磁棒套; [0071] (6)运行仪器; [0072] (7)仪器运行结束后,第6列和第12列即为提取的核酸,转移至1.5mLEP管; [0073] (8)丢弃磁棒套,仪器清洁,紫外照射20min。 [0074] 在本实施例中,匀质样本与蛋白酶K再次破壁,核酸与磁珠结合,再经过三步洗涤,最后被洗脱液洗脱下来。 [0075] 2、手工提取: [0076] 步骤1:在灭菌的2mL离心管中加入40uL磁珠、40μL蛋白酶K及匀质后的样本,充分涡旋混匀; [0077] 步骤2:将离心管置于恒温震荡金属浴中,70℃孵育12min(转速为1000rpm/min),瞬时离心; [0078] 步骤3:将离心管置于磁力架上,待磁珠完全吸附后,用移液器小心去除液体,注意不要吸取磁珠; [0079] 步骤4:往离心管中加入600μL洗涤液1,涡旋混匀1min,瞬时离心; [0080] 步骤5:将离心管置于磁力架上,待磁珠完全吸附后,用移液器小心去除液体,注意不要吸取磁珠; [0081] 步骤6:往离心管中加入600μL洗涤液2,涡旋混匀1min,瞬时离心; [0082] 步骤7:将离心管置于磁力架上,待磁珠完全吸附后,用移液器小心去除液体,注意不要吸取磁珠; [0083] 步骤8:重复步骤5和步骤6; [0084] 步骤9:将离心管瞬时离心10s后,将离心管置于磁力架上,待磁珠完全吸附后,用移液器小心去除液体,注意不要吸取磁珠,开盖晾干3min~5min; [0085] 步骤10:往离心管中加入60~120μL洗脱液,涡旋混匀,室温孵育5min后,置于磁力架上,待磁珠完全吸附后,将核酸溶液转移至新的灭菌离心管,核酸建议立即使用,如需保存,置于‑20℃±5℃。 [0086] 在步骤S3中,根据所述目标核酸进行二代测序文库构建,获得目标DNA测序文库的步骤包括: [0088] 所述高通量测序为二代测序。 [0089] 最后对目标DNA测序文库依次进行磁珠纯化及PCR处理,获得适用于mNGS检测的样本。 [0090] 本申请对比了两种研磨珠类型(锆珠及玻璃珠)及不同的研磨珠大小,和两种研磨方式匀质仪(TGrinder H24,6M/S的速度振荡30s,间隔30s,共6个循环)及涡旋仪的前处理,处理完之后进行常规的提取建库及测序,经数据库比对后看烟曲霉的检出情况对比。 [0091] [0092] 结果显示,不同的研磨珠及研磨方式对真菌的检出有差异,锆珠对真菌的检出比玻璃珠的检出好,且0.2mm的锆珠真菌检出最优;涡旋振荡器的研磨方式对真菌的检出效果比匀质仪的好。综上,在mNGS的检测中,为了提高真菌的检出率,本申请在核酸提取前进行研磨处理,研磨珠使用0.2mm的锆珠,搭配漩涡振荡器振荡15min~20min。 [0093] 应该理解的是,虽然附图的流程图中的各个步骤按照箭头的指示依次显示,但是这些步骤并不是必然按照箭头指示的顺序依次执行。除非本文中有明确的说明,这些步骤的执行并没有严格的顺序限制,其可以以其他的顺序执行。而且,附图的流程图中的至少一部分步骤可以包括多个子步骤或者多个阶段,这些子步骤或者阶段并不必然是在同一时刻执行完成,而是可以在不同的时刻执行,其执行顺序也不必然是依次进行,而是可以与其他步骤或者其他步骤的子步骤或者阶段的至少一部分轮流或者交替地执行。 |