一种辣椒SNP分子标记组合、SNP芯片及其应用 |
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| 申请号 | CN202311662361.8 | 申请日 | 2023-12-06 | 公开(公告)号 | CN117587159A | 公开(公告)日 | 2024-02-23 |
| 申请人 | 华智生物技术有限公司; | 发明人 | 雷雨婷; 刘峰; 熊程; 李为国; 唐顺学; 何轮; 邹学校; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种辣椒SNP分子标记组合、SNP芯片及其应用，所述SNP分子标记组合由高多态性和高检出率的51172个SNP分子标记组成，所述SNP分子标记由 染色 体分布均匀的的47589个SNP位点、3194个MNP标记位点和389个与辣椒抗病、辣椒果实 颜色 、辣椒辣味及辣椒雄性不育等重要农艺性状/基因相关的位点共同构成。结合分子标记本发明还研制出一种辣椒50K液相育种芯片。该芯片检测通量高、目标位点检出率高、分型结果准确可靠，可应用于辣椒新品种鉴定、分子标记辅助选择育种、基因 定位 、全基因组选择、群体遗传学、群体进化的分析。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种辣椒SNP分子标记组合，其特征在于，所述SNP分子标记组合由51172个SNP分子标记组成，所述51172个SNP分子标记如表1所示，所述SNP位点的位置及变异信息采用染色体：物理位置：参考基因型/变异等位基因型的形式进行表示，所述SNP分子标记组合的物理位置是基于樟树港辣椒参考基因组进行定位分析。 |
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| 说明书全文 | 一种辣椒SNP分子标记组合、SNP芯片及其应用技术领域背景技术[0002] 辣椒（Capsicum annuum L.）属于茄科，是一种重要的调味品和着色剂。辣椒栽培历史悠久，其品种资源丰富且复杂，近年来辣椒常规育种取得了很大的成就，但随着消费需求的升级，对辣椒品种口感、颜色、健康优质等多样性的需求加深，品质优良的品种的提供是目前辣椒育种的发展方向。 [0003] 辣椒常规育种以田间植株形态学鉴定为主，但该方式受准确性低、鉴定时间长、投入成本高和易受环境影响等因素制约，而且随着辣椒品种数量的增多，品种间表现型差异越来越小，形态鉴定更加困难。我国在扩大创新品种的同时，还需引进优质种质资源，尤其是针对野生资源和特异性资源还较缺乏，因此结合现代化的分子育种技术选育优质辣椒品种需求增加。 [0004] 目前常用的分子标记鉴定方法有RFLP、RAPD和SSR技术，具有如下缺点：RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)技术操作复杂，对DNA质量要求高，费用较高，放射性同位素对人体有害；RAPD技术（随机扩增多态性DNA）结果不稳定，重复性较差；SSR引物开发费用高，不适合大规模的商业鉴定；均未达到理想的检测方法的要求。 [0005] 相比其他检测方式，基于SNP标记的液相育种芯片具备标记密度高、自动化强、检测通量高等特征，可建立现代育种体系，促进辣椒育种发展。 发明内容[0007] 为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案如下：本发明第一方面提供一种辣椒SNP分子标记组合，所述SNP分子标记组合由51172个SNP分子标记组成，所述51172个SNP分子标记如表1所示，所述SNP位点的位置及变异信息采用染色体：物理位置：参考基因型/变异等位基因型的形式进行表示，所述SNP分子标记组合的物理位置是基于樟树港辣椒参考基因组进行定位分析。 [0008] 樟树港辣椒参考基因组来源见文献《Genomes of cultivated and wild Capsicum species provide insights into pepper domestication and population differentiation》。 [0009] 51172个SNP分子标记具体信息如下表1所示。 [0010] 表1：SNP分子标记信息 [0011] 基于相同的技术构思，本发明第二方面还提供一种辣椒SNP芯片，所述辣椒SNP芯片包括用于检测上述的辣椒SNP分子标记组合的探针或引物。 [0012] 本发明还提供上述辣椒SNP分子标记组合或辣椒SNP芯片在辣椒遗传多样性分析中的应用。 [0013] 发明还提供上述辣椒SNP分子标记组合或辣椒SNP芯片在辣椒群体结构分析中的应用。 [0014] 发明还提供上述辣椒SNP分子标记组合或辣椒SNP芯片在辣椒遗传背景选育分析中的应用。 [0015] 发明还提供上述辣椒SNP分子标记组合或辣椒SNP芯片在辣椒亲缘关系鉴定中的应用。 [0016] 发明还提供上述辣椒SNP分子标记组合或辣椒SNP芯片在辣椒全基因组关联分析中的应用。 [0017] 发明还提供上述辣椒SNP分子标记组合或辣椒SNP芯片在辣椒品种鉴定中的应用。 [0018] 发明还提供上述辣椒SNP分子标记组合或辣椒SNP芯片在分子标记辅助选择育种中的应用。 [0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明利用国内外辣椒主要栽培种、湖南地方改良品种等辣椒种质资源的重测序数据筛选了在全基因组中高多态性（PIC均值0.30）、高检出率（均值99.5%）、均匀分布的全基因组SNP位点；用于植物品种鉴定的MNP标记位点；还添加了与26个辣椒重要农艺性状基因：辣味基因、抗病基因、果色果实发育基因等位点，开发了一套共51172个SNP分子标记，组成辣椒高密度液相育种芯片。该芯片检测通量高、目标位点检出率高、分型结果准确可靠，可应用于辣椒新品种鉴定、分子标记辅助选择育种、基因定位、全基因组选择、群体遗传学、群体进化等。 附图说明 [0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0021] 图1为本发明实施例1中的位点筛选流程图；图2为本发明实施例1中51172个SNP位点的PIC值分布图； 图3为本发明实施例1中51172个SNP位点在染色体上的分布图； 图4为本发明实施例2中139个辣椒材料的群体结构分析图； 图5为本发明实施例2中139个辣椒材料的PCA散点图。 具体实施方式[0023] 除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。 [0025] 本实施例提供一种辣椒SNP分子标记组合，由51172个SNP分子标记组成，51172个SNP分子标记如发明内容部分表1中所示，筛选过程如图1所示，具体如下：1.辣椒种质资源收集 为了保证辣椒材料的代表性，及液相芯片的普适性，我们收集到湖南农业大学提供的176份辣椒种质资源数据，并进行重测序。 [0026] 同时收集来自亚洲、美洲、非洲和欧洲基因库的辣椒栽培种、野生种、不同起源、果形多样的育种品种等300余份辣椒种的重测序数据。 [0028] （2）采用MGI标准建库方法，将质检合格的用于DNA‑seq测序文库构建。 [0029] （3）质检合格的文库采用华大测序平台(MGI)测序，测序策略为PE150，测序深度为10×，每个品系测30Gb。 [0030] 对176份重测序数据进行比对和变异检测，分析流程如下：（1）使用Sentieon将Reads比对到对应到辣椒参考基因组（樟树港辣椒）上、位置排序和标记重复reads。 [0031] （2）对每个样本进行变异位点检测，获得每个样本的变异信息。 [0032] （3）对所有样本的gVCF进行联合分析，得到群体中每个个体的变异结果。 [0033] 3.辣椒液相育种芯片开发（1）全基因组位点 a.重测序变异位点获得：湖南农业大学提供的176份辣椒种质资源数据，并进行重测序，提取约1.3亿个SNP变异位点。从国内外收集到的300余份辣椒种的重测序数据，提取约7600万个SNP变异位点。筛选共有的SNP变异位点6600万个。 [0034] b.候选位点筛选：计算位点的质量指标，筛选杂合率＜0.2，位点缺失频率＜0.1，最小等位基因频率＞0.1，位点多态性＞0.15，测序深度＞5x的SNP多态性位点作为候选位点，共获得约200万个SNP位点。 [0035] c.位点探针设计及筛选：提取SNP位点上下游50bp序列，对其进行特异性、GC含量等分析，判断是否合适设计探针，筛选获得能够用于芯片开发的约86万个SNP位点。 [0036] d.位点密度筛选：根据位点均匀分布原则，筛选在辣椒染色体上均匀分布的SNP位点，共包含47589个SNP位点，平均间距为60Kb。 [0037] （2）辣椒MNP位点根据《植物品种鉴定—MNP标记法》（GB/T 38551‑2020）中已公布的辣椒MNP标记引物序列，比对至辣椒参考基因组，共获得831个目标区间，提取区间内高质量的SNP位点作为候选位点，共包含3194个SNP位点。 [0038] （3）重要基因/功能位点的确定挖掘文献中已报道的与辣椒抗病、辣椒果实颜色、辣椒辣味及辣椒雄性不育等重要农艺性状相关的基因，筛选在基因区及其上下游1K区间内的高质量SNP位点，共包含389个SNP位点，所选择的基因类型与标记数如下表2所示： 表2：基因类型及标记数 [0039] 4.开发辣椒50K SNP液相芯片将基于不同类型（国际主要栽培种、湖南地方品种、不同起源、果形多样的育种品种）辣椒材料收集结合湖南农业大学提供的辣椒种质资源，进行重测序分析，获得了SNP位点。再根据这些SNP位点的质量指标，挑选出代表性强、多态性好、并在染色体上分布均匀的 47589个SNP位点、3194个MNP标记位点和389个与辣椒抗病、辣椒果实颜色、辣椒辣味及辣椒雄性不育等重要农艺性状/基因相关的位点共同构成辣椒的50K液相芯片。 [0040] 辣椒50K芯片SNP位点的多态性分析：统计已筛选的辣椒的50K SNP位点的多态性，平均多态信息含量（PIC）为0.30，PIC值分布图如图2所示.辣椒50K芯片SNP位点的染色体分布：对筛选到的50K芯片在12条染色体上的分布进行了统计，发现50K的SNP位点均匀分布在辣椒12条染色体上，SNP位点在染色体上的平均间距为60Kb，位点分布图如图3所示。 [0041] 将挑选出的51172个SNP位点，运用华智自主研发的液相探针精准定位测序分型技术(Genotyping by Pinpoint Sequencing of liquid captured targets,cGPS)开发成辣椒50K液相芯片。液相芯片技术，是基于优化的热力学稳定性算法模型对目标区间（3K‑150K目标区间）序列进行特异性探针设计，利用合成的特异性探针对位于不同基因组位置的多个不同目标序列进行液相杂交捕获富集，然后对捕获富集的目标区间进行文库构建和二代测序，从而获得目标SNP位点的基因型。 [0042] 该技术涉及以下步骤：（1）样品DNA提取与质控：采用磁珠法进行样品DNA提取。用Qubit荧光定量仪检测DNA样品的浓度；用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的完整性，质控合格的样品用于文库制备。 [0043] （2）文库构建与质控：a.利用片段化酶对DNA样品进行酶切，修复酶切末端，并在3’端加上A碱基，用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。b.使用T4连接酶连接测序接头与DNA片段，利用磁珠对连接产物进行纯化。纯化后的产物用Qubit荧光定量仪检测浓度，琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。c.对纯化后的连接产物进行PCR扩增，利用磁珠对扩增产物进行片段筛选。片段筛选后的产物用Qubit荧光定量仪检测浓度，琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。d.取200ng完成构建的文库，加入探针与杂交试剂后，50℃孵育16‑24小时完成杂交反应。利用链霉亲和素磁珠进行目标区段捕获，使用清洗液清洗捕获产物，去除非特异性结合片段，再进行一轮PCR扩增。利用Qubit荧光定量仪检测文库浓度，琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，浓度及片段大小测定合格后，即完成测序文库构建。将已制备好的文库使用华大测序仪进行高通量测序，测序策略为PE150。 [0044] （3）生物信息分析：①.原始数据过滤：测序得到的原始测序序列（Raw Reads）进行过滤，得到高质量的Clean Reads，使用FASTP软件对下机数据进行质控。②.污染检测：利用BLAST软件将序列比对到NCBI NT数据库，进行污染评估。③.参考基因组比对：使用BWA软件将测序Reads比对到参考基因组，并进行位置排序得到样本排序后的bam文件。④.变异检测：a.使用GATK软件对每个样本进行变异位点检测，获得每个样本及群体的变异结果文件。⑤.目标位点基因型分型：根据该位点不同Alles的支持Reads数目比例进行判断，当突变Reads支持比例≥0.8或者≤0.2时，则该位点判断为纯合基因型，当突变Reads支持比例在 0.2‑0.8之间，判定为杂合基因型。最终得到28转换后的变异结果文件，可高通量地获取到每个目标SNP在特定个体中的基因分型结果，实现高通量的SNP基因分型。 实施例2 [0045] 辣椒SNP分子标记组合在在辣椒育种材料的多态性和群体结构分析中的应用。 [0046] 利用开发完成的辣椒50K液相育种芯片，对辣椒139份材料进行检测，提取目标位点基因型分型，样本平均检出率为99.63%，同批次材料重复一致率为99.99%，说明本方案的液相芯片目标位点检出率高，分型结果准确可靠。 [0047] 利用Plink软件计算遗传距离矩阵并对辣椒育种材料进行聚类分析，构建系统进化树图可判断不同材料的亲缘关系、进化关系及组成结构。使用本发明对来自不同群体139个辣椒材料进行聚类分析，发现辣椒育种材料分成3个亚群，效果与实际分群一致，分析结果如图4所示，表明筛选出的51172个SNP位点具有较高的代表性。 [0048] 利用Plink软件分析检测材料的PCA（主成分分析）组成成分，构建PCA散点图。散点图中每一个位点代表一个样本，图中两个样本距离越远，则说明两个样本遗传背景差异越大，遗传背景相似的个体则会在图中聚为一类。发现辣椒育种材料分成3个明显的群体，结果见图5。 [0049] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。 |
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