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生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202411551959.4	申请日	2024-11-01
公开(公告)号	CN119614468A	公开(公告)日	2025-03-14
申请人	厦门大学;	申请人类型	学校
发明人	袁吉锋; 吴培玲;	第一发明人	袁吉锋
权利人	厦门大学	权利人类型	学校
当前权利人	厦门大学	当前权利人类型	学校
省份	当前专利权人所在省份：福建省	城市	当前专利权人所在城市：福建省厦门市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：福建省厦门市思明南路422号	邮编	当前专利权人邮编：361000
主IPC国际分类	C12N1/21	所有IPC国际分类	C12N1/21 ; C12N15/54 ; C12N15/60 ; C12N15/70 ; C12P7/18 ; C12R1/19
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	10	专利文献类型	A
专利代理机构	厦门创象知识产权代理有限公司	专利代理人	尤怀成; 王凤玲;
摘要	本发明涉及一种生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用，该方法通过构建表达苯丙酮酸脱羧酶的基因ARO10的重组质粒pET‑ARO10；构建表达乙酰羟酸合酶的基因ScIlv2的重组质粒pRSF‑ScIlv2c；将所述重组质粒pET‑ARO10和所述重组质粒pRSF‑ScIlv2c导入大肠杆菌中，以获得生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株。该大肠杆菌工程菌株能够生产β,γ型二元醇4‑甲基戊烷‑2,3‑二醇、5‑甲基己烷‑2,3‑二醇、4‑甲基己烷‑2,3‑二醇，实现了β,γ型二元醇在大肠杆菌中的高效合成，可应用于药物、生物燃料、新型聚合物材料等行业。
权利要求	1.一种生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株构建方法，其特征在于，包括以下步骤：构建表达苯丙酮酸脱羧酶的基因ARO10的重组质粒pET‑ARO10；构建表达乙酰羟酸合酶的基因ScIlv2的重组质粒pRSF‑ScIlv2c；将所述重组质粒pET‑ARO10和所述重组质粒pRSF‑ScIlv2c导入大肠杆菌中，以获得生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株。 2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，编码所述苯丙酮酸脱羧酶的基因ARO10的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码所述乙酰羟酸合酶的基因ScIlv2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。 3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coli K‑ 12MG1655 RARE。 4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pET‑ARO10的构建是以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C的基因组为模板，以SEQ ID NO：3、SEQ ID NO： 4所示序列为引物，PCR扩增得到ARO10基因片段，将其连接入载体pETDuet‑1，获得具有氨苄青霉素抗性的重组质粒pET‑ARO10。 5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pRSF‑ScIlv2c的构建是以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C的基因组为模板，以SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的序列为引物，经PCR扩增得到ScIlv2基因片段，将其连接入pRSFDuet‑1，获得具有卡那霉素抗性的重组质粒pRSF‑ScIlv2c。 6.一种生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，由权利要求1‑5中任一项所述的构建方法构建得到。 7.一种生产β,γ型二元醇的方法，其特征在于，以权利要求6所述的大肠杆菌工程菌株进行发酵生产β,γ型二元醇。 8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，以甘油或葡萄糖为碳源的改良M9培养基发酵所述大肠杆菌工程菌株生产β,γ型二元醇。 9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述β,γ型二元醇包括4‑甲基戊烷‑2,3‑二醇，5‑甲基己烷‑2,3‑二醇和4‑甲基己烷‑2,3‑二醇。 10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述甘油或葡萄糖的浓度为40g/L。
说明书全文	生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用技术领域 [0001] 本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用。背景技术 [0002] 二元醇是一类重要化工原料，广泛用于燃料、溶剂、聚合物单体和药物前体等日用品和精细化工行业。传统的二元醇合成工艺依赖石油原料加工而成，对环境及资源造成影响。近年来生物合成二元醇取得了许多进展，随着细胞工厂的建立以及各种生物合成途径的提出，结构多样化的二元醇得以通过如甘油，葡萄糖、木糖、蔗糖和纤维水解液等可再生原料在大肠杆菌，谷氨酸棒状杆菌，肺炎克雷伯菌、地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌等各种微生物底盘发酵下得到。目前，一些短链二元醇的生物合成已经取得了重要的发展，并实现了商业化，如美国杜邦公司成功利用工程菌将玉米水解的葡萄糖转化为1,3‑丙二醇(α,γ‑型二元醇)。 [0003] β,γ型二元醇，相较于同分子结构的二元醇，其具有更高的熔点，更低的沸点，更高的闪点，其物理性质方面的优势使其可以用作火箭推进器燃料、合成橡胶、聚合物的成分。然而，目前除了2，3‑丁二醇外，生物合成技术在合成β,γ型二元醇方面仍然存在瓶颈。发明内容 [0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用；在大肠杆菌底盘实现多种可再生原料甘油或葡萄糖转化为C6‑C7结构的β,γ型二元醇。 [0005] 为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株构建方法，其包括以下步骤： [0006] 构建表达苯丙酮酸脱羧酶的基因ARO10的重组质粒pET‑ARO10； [0007] 构建表达乙酰羟酸合酶的基因ScIlv2的重组质粒pRSF‑ScIlv2c； [0008] 将所述重组质粒pET‑ARO10和所述重组质粒pRSF‑ScIlv2c导入大肠杆菌中，以获得生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株。 [0009] 根据本发明的一种生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株构建方法，该方法通过向大肠杆菌中导入苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10和乙酰羟基酸合酶基因ScIlv2，使得构建的大肠杆菌工程菌株能够生产β,γ型二元醇4‑甲基戊烷‑2,3‑二醇、5‑甲基己烷‑2,3‑二醇、4‑甲基己烷‑2,3‑二醇，实现了β,γ型二元醇在大肠杆菌中的高效合成，可应用于药物、生物燃料、新型聚合物材料等行业。 [0010] 可选地，编码所述苯丙酮酸脱羧酶的基因ARO10的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码所述乙酰羟酸合酶的基因ScIlv2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。 [0011] 可选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coli K‑12MG1655 RARE。 [0012] 可选地，所述重组质粒pET‑ARO10的构建是以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C的基因组为模板，以SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示序列为引物，PCR扩增得到ARO10基因片段，将其连接入载体pETDuet‑1，获得具有氨苄青霉素抗性的重组质粒pET‑ARO10。 [0013] 可选地，所述重组质粒pRSF‑ScIlv2c的构建是以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C的基因组为模板，以SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的序列为引物，经PCR扩增得到ScIlv2基因片段，将其连接入pRSFDuet‑1，获得具有卡那霉素抗性的重组质粒pRSF‑ScIlv2c。 [0014] 在本发明的第二个方面，本发明提出了由上述构建方法得到的生产β,γ型二元醇的大肠杆菌工程菌株。 [0015] 在本发明的第三个方面，本发明提出一种生产β,γ型二元醇的方法，其以上述的大肠杆菌工程菌株进行发酵生产β,γ型二元醇。 [0016] 可选地，是以甘油或葡萄糖为碳源的改良M9培养基发酵所述大肠杆菌工程菌株生产β,γ型二元醇。 [0017] 可选地，所述β,γ型二元醇包括4‑甲基戊烷‑2,3‑二醇，5‑甲基己烷‑2,3‑二醇和4‑甲基己烷‑2,3‑二醇。 [0018] 可选地，所述甘油或葡萄糖的浓度为40g/L。 [0019] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明 [0020] 图1为根据本发明实施例的PCR扩增目的基因的凝胶电泳图； [0021] 图2为根据本发明实施例的重组质粒pET‑ARO10的图谱； [0022] 图3为根据本发明实施例的重组质粒pRSF‑ScIlv2c的图谱； [0023] 图4为根据本发明实施例的重组菌株生产二元醇的气相色谱检测图； [0024] 图5为根据本发明实施例的重组菌株生产的二元醇的气相质谱结果图； [0025] 图6为根据本发明实施例的重组菌株利用不同碳源发酵生产二元醇的产量图； [0026] 图7为根据本发明实施例的重组菌株物利用不同碳源的生物量(OD600)比较； [0027] 图8为根据本发明实施例的二元醇合成的路径图。具体实施方式 [0028] 以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。 [0029] 为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。 [0030] 本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得；涉及的实验如无特别说明，均为常规实验方法。 [0031] 大肠杆菌E.coli K‑12MG1655 RARE可从商业渠道购买(Addgene:E.coli K‑12MG1655RARE)。 [0032] 表1：PCR扩增所用引物 [0033]引物名称引物5'‑3 序列编号 ARO10‑F ACGGGATCCGATGGCACCTGTTACAATTG SEQ ID NO：3 ARO10‑R TTGGTCTCCTCGAGCTATTTTTTATTTCTTTTAAGTG SEQ ID NO：4 ScIlv2‑F TTGGTCTCGGATCCGATGCCAGAGCCTGCTCCAAG SEQ ID NO：5 ScIlv2‑R TTGGTCTCCTCGAGTCAGTGCTTACCGCCTGTAC SEQ ID NO：6 [0034] 下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。 [0035] 实施例1目的基因扩增及重组质粒构建 [0036] (1)根据NCBI上来自Saccharomyces cerevisiae S288C的编码苯丙酮酸脱羧酶的基因ARO10(Gene ID:851987)，设计得到ARO10‑F和ARO10‑R引物序列(表1)。根据来自Saccharomyces cerevisiae S288C的编码乙酰羟酸合酶的基因ScIlv2(Gene ID:855135)，设计得到ScIlv2‑F和ScIlv2‑R引物序列(表1)。 [0037] (2)以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列为上、下游引物(表1)，以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C的基因组(Gene ID:851987)为模板PCR扩增ARO10基因片段，ARO10基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列为上、下游引物(表1)，以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C的基因组(Gene ID:855135)为模板PCR扩增ScIlv2基因片段，ScIlv2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。扩增所使用的PCR酶为New England Biolabs公司的 High‑Fidelity DNA Polymerases，反应体系如表2；PCR反应条件如表3所示。 [0038] 表2PCR反应体系 [0039] [0040] 表3PCR扩增程序 [0041] 步骤温度时间1 98℃ 30s 2 98℃ 15s 3 57‑63℃ 15s 4 72℃ 60s 5 步骤2‑4循环30次 6 72℃ 2min 7 4℃ ∞ [0042] 对PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，ARO10基因的PCR结果如图1A所示，扩增片段大小在1kb‑2kb之间，基本符合ARO10基因大小。ScIlv2的PCR结果如图1B所示，扩增片段大小在3kb左右，基本符合ScIlv2c基因大小。切割目的条带，使用BioFlux公司的DNA纯化试剂盒纯化回收目的片段ARO10，ScIlv2。 [0043] (3)使用New England Biolabs公司的限制性内切酶和XhoI对目的片段ARO10，ScIlv2以及载体pRSFDuet‑1，pETDuet‑1进行酶切，反应体系如表4。 [0044] 表4酶切体系 [0045]体系 50μL 纯化回收片段/载体 1μg 10x Cutsmart buffer 5μL BamHI‑HF 1μL XhoI 1μL 双蒸水补齐至50μL [0046] 使用BioFlux公司的DNA纯化试剂盒纯化限制性内切酶切割后的片段和载体。 [0047] (4)使用New England Biolabs公司的T4连接酶对限制性内切酶切割后的片段和载体进行连接，苯丙酮酸脱羧酶ARO10的基因插入pETDuet‑1的BamHI和XhoI位点；乙酰羟酸合酶ScIlv2c的基因插入pRSFDuet‑1的BamHI和XhoI位点。连接体系如表5。 [0048] 表5连接体系 [0049] 体系 10μL酶切载体 100ng 酶切片段 300ng T4 ligase 0.5μL 10x T4 ligase buffer 1μL 双蒸水补齐至10μL [0050] 室温连接3‑4小时后，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别通过氨苄青霉素、卡那霉素筛选阳性克隆，菌落PCR验证阳性单克隆并测序。正确后提取质粒，得到重组质粒pET‑ARO10，如图2所示；以及重组质粒pRSF‑ScIlv2c，如图3所示。 [0051] 实施例2重组菌株构建 [0052] 原始菌株E.coli K‑12MG1655 RARE在2mL无抗LB培养基中培养过夜后，制备电转感受态细胞；电转感受态制备方法：1)按1：100的比例将菌液接种到100mL LB培养基中。摇约2‑3h至OD600达到0.6‑0.8之间。2)菌液冰浴10分钟，4℃，7000rpm离心10分钟，去除上清。加入双蒸水重悬菌体沉淀。3)4℃，7000rpm离心10分钟，去除上清，加入10％甘油重悬菌体沉淀。4)重复步骤3)一次。5)加入5mL 10％甘油重悬菌体沉淀，分装到EP，液氮冻存后保存于‑80℃冰箱。 [0053] 通过电转化仪将重组质粒pET‑ARO10和重组质粒pRSF‑ScIlv2c转入E.coli K‑12MG1655RARE感受态细胞，加入1mL LB培养基复苏一小时。 [0054] 采用添加了氨苄青霉素和卡那霉素的LB平台进行筛选。过夜培养后获得阳性单克隆，命名为MR‑ScIlv2‑ARO10。阳性菌液添加20％甘油后保存于‑80℃冰箱。 [0055] 实施例3重组菌株在生产β，γ型二元醇中的应用 [0056] (1)工程菌株培养：将实施例2获得重组菌株MR‑ScIlv2‑ARO10取出，划线到含有卡那霉素和氨苄青霉素的固体LB平板上，37℃培养过夜。第二天挑取重组菌株MR‑ScIlv2‑ARO10单克隆到添加了卡那霉素和氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，250rpm摇8‑10小时作为发酵种子液。将种子液以1％的接种量接种于10mL添加了卡那霉素和氨苄青霉素的M9培养基中；37℃，250rpm培养4小时至OD600至0.8‑10之间。加入IPTG至终浓度100μM。培养物在30℃，250rpm继续培养108小时，每24小时取样检测。 [0057] 其中，M9培养基的其他组成包括：11.1μg/L CaCl2、240.7mg/L MgSO4、17.08 g/LNa2HPO4·12H2O、3 g/L KH2PO4、1 g/L NH4Cl、0.5 g/L NaCl，微量元素：50mg/L EDTA、8.3mg/L FeCl3·6H2O、0.84mg/L ZnCl2、0.13mg/L CuCl2·2H2O、0.1mg/L CoCl2·6H2O、 0.1mg/LH3BO3、16mg/L MnCl2·6H2O、0.3mg/L Na2MoO4·4H2O，5mg/L盐酸硫胺素、10mg/L烟酸、0.1mg/L生物素(pH 7.2)、7g/L酵母提取物、4％(w/v)葡萄糖或4％(w/v)甘油。 [0058] (2)二元醇萃取 [0059] 取混匀的发酵液300μL于1mL EP管，与300μL乙酸乙酯混合。涡旋仪振荡2分钟，使发酵液层的二元醇萃取到乙酸乙酯层。14000rpm离心5分钟，取200μL乙酸乙酯用于分析。 [0060] (3)二元醇检测 [0061] 使用气相色谱检测二元醇，使用配备火焰离子化检测器(FID)的Nexis GC‑2030仪器，在SH‑Rtx‑5毛细管柱(25m×0.32mm×0.5μm)上进行GC分析。使用在250℃下运行的分流进样器，每个样品进样1μL。以氮气为载气，柱流速为1.0mL/min。使用的柱温箱温度程序为：初始温度40℃(保持2分钟)，然后以15℃/min的速度升温至250℃(保持2分钟)。FID检测器在350℃下运行。使用外部标准校准实现二元醇的定量。 [0062] 结果如图4所示，为重组菌株MR‑ScIlv2‑ARO10生产二元醇的气相色谱检测图，可知重组菌株MR‑ScIlv2‑ARO10能够生产β,γ型二元醇：4‑methylpentane‑2,3‑diol，5‑methylhexane‑2,3‑diol，4‑methylhexane‑2,3‑diol，实现了β,γ型二元醇在大肠杆菌中的高效合成。 [0063] (4)二元醇结构鉴定 [0064] 在与质谱仪联用的Agilent 7890B气相色谱仪上进行GC/MS分析，以确认目标二元醇的形成。使用的气相色谱柱为安捷伦DB‑5ms UI毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)。使用在250℃下运行的分流进样器，每个样品进样1μL。以氦气为载气，柱流速为1.0mL/min。使用的柱温箱温度程序为：初始温度40℃(保持2分钟)，然后以15℃/min的速度升温至250℃(保持 2分钟)。MS在2‑500amu的扫描模式下运行，溶剂延迟为4.5min。MS离子源和MS Quad的温度分别设置为230℃和150℃。 [0065] 结果如图5所示，通过将质谱与NIST数据库中的质谱进行比较，以确认相同的MS碎片峰，确认β,γ型二元醇：4‑甲基戊烷‑2,3‑二醇、5‑甲基己烷‑2,3‑二醇、4‑甲基己烷‑2,3‑二醇形成。 [0066] 实施例4重组菌株发酵优化 [0067] 发酵方法同上实施例3；在培养基上选择甘油、葡萄糖这两种基础碳源进行比较。40g/L甘油或40g/L葡萄糖添加到基本M9培养基中配制成改良M9培养基。30℃，250rpm发酵 108小时，每24小时取样测试样品的OD600及代谢物参数，比较不同碳源对生物量及二元醇产量的影响。 [0068] 结果如图6和图7所示，通过比较不同碳源发现，以甘油作为碳源，二元醇产量和生物量均高于以葡萄糖作为碳源。4‑甲基戊烷‑2,3‑二醇的产量达到4.4±0.3mM，5‑甲基己烷‑2,3‑二醇的产量达到4.4±0.5，4‑甲基己烷‑2,3‑二醇的产量达到0.2mM。 [0069] 综上，根据本发明的实施例，如图8所示，将来自酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶ARO10基因及乙酰羟基酸合酶ScIlv2基因导入大肠杆菌E.coli K‑12MG1655 RARE中，得到重组菌株；重组菌株菌株构建方法简单，发酵实验证明重组菌株能够生产β,γ型二元醇4‑甲基戊烷‑2,3‑二醇、5‑甲基己烷‑2,3‑二醇、4‑甲基己烷‑2,3‑二醇，实现了在大肠杆菌底盘上将多种可再生原料甘油转化为C6‑C7结构的β，γ型二元醇；并且重组菌株是以可再生碳源甘油或葡萄糖发酵，是一种绿色可持续的二元醇合成方法。 [0070] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。 [0071] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

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