一种基于4-异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202310472680.6 | 申请日 | 2023-04-27 |
| 公开(公告)号 | CN116334105A | 公开(公告)日 | 2023-06-27 |
| 申请人 | 江南大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 刘春立; 底心怡; 白仲虎; 刘秀霞; 杨艳坤; | 第一发明人 | 刘春立 |
| 权利人 | 江南大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 江南大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：江苏省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：江苏省无锡市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：江苏省无锡市梁溪区通沙路898号南楼七层 | 邮编 | 当前专利权人邮编：214000 |
| 主IPC国际分类 | C12N15/52 | 所有IPC国际分类 | C12N15/52 ; C12N15/70 ; C12N15/78 ; C12N15/67 ; C12R1/19 ; C12R1/40 |
| 专利引用数量 | 2 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 南京禹为知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 刘峰; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种一种基于4‑异丙基苯 甲酸 诱导的cmt操纵子的改造方法，以恶臭假单胞菌F1(PseudomonasPutidaF1)代谢途径中存在的4‑异丙基 苯甲酸 (cumate)诱导的cmt操纵子为 基础 ，构建得到可在大肠杆菌BL21(DE3)和恶臭假单胞菌KT2440中应用的4‑异丙基苯甲酸诱导表达系统，确定构建得到诱导系统的诱导剂在恶臭假单胞菌KT2440中的有效响应范围，根据确定的有效响应范围分别筛选出在大肠杆菌BL21(DE3)和恶臭假单胞菌KT2440中响应较好的多阻遏位点诱导系统。 | ||
| 权利要求 | 1.一种基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法，其特征在于：包括， |
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| 说明书全文 | 一种基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法技术领域背景技术[0002] 恶臭假单胞菌F1(Pseudomonas Putida F1)是一种革兰氏阴性菌，其酶系丰富，能降解甲苯、乙苯、对异丙基甲苯等多种芳香族化合物。其中，降解对异丙基甲苯类物质的能力来源于恶臭假单胞菌F1基因组上的cym及cmt操纵子，并以阻遏蛋白cymR与中间代谢物4‑异丙基苯甲酸及阻遏位点的结合为所述酶系表达与否的调控机制。 [0003] 根据其作用原理，阻遏蛋白cymR及cmt操纵子已被改造用于多种宿主中构建诱导表达载体。Chaudhary等人使用pNB1紧密型载体在大肠杆菌中构建了诱导表达体系，将组成型pGapA启动子与阻遏蛋白cymR组合，成功抑制插入cmt操纵子阻遏序列的T7启动子下基因的表达；Gruber等人使用j5启动子与cmt操纵子阻遏序列结合并构建出能在兼性化学固定自养菌Ralstonia eutropha H16中使用的诱导系统；Horbal等人以P21表达启动子和cmt阻遏序列结合构建的诱导体系经验证可在链霉菌及其他放线菌中使用。 [0004] 但目前该诱导系统未应用于恶臭假单胞菌中，且其来源恶臭假单胞菌F1中存在分解代谢4‑异丙基苯甲酸的内源代谢途径，无法在其来源菌株中使用。 发明内容[0005] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。 [0006] 鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。 [0007] 因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法。 [0008] 为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括， [0009] 对4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子原有表达用启动子以及表达目的基因进行替换，再组合阻遏位点，即得到改造后的cmt操纵子； [0010] 其中，所述4‑异丙基苯甲酸存在于恶臭假单胞菌F1(Pseudomonas Putida F1)代谢途径中，其诱导的cmt操纵子的序列如SEQ ID NO:15所示。 [0011] 作为本发明所述的基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法的一种优选方案，其中：所述改造后的cmt操纵子包括编码阻遏蛋白基因cymR、阻遏位点CuO2、外源引入的启动子tac、绿色荧光蛋白eGFP。 [0012] 作为本发明所述的基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法的一种优选方案，其中：所述对4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子原有表达用启动子以及表达目的基因进行替换，包括， [0013] 以质粒pBBR1‑pTrc为模板，设计引物pBBR1vector‑F、pBBR1vector‑R通过PCR扩增抗性基因Kan、复制子pBBR1 oriV、pBBR1 Rep得到片段1； [0014] 以恶臭假单胞菌F1纯化基因组为模板，设计引物cymR‑F、cymR‑R通过PCR扩增阻遏蛋白基因cymR得到片段2； [0015] 设计引物CuO2‑F、CuO2‑R扩增cmt操纵子阻遏位点CuO2和启动子得到片段3； [0016] 以pBBR1‑CuO2‑eGFP和pBBR1‑cymR‑CuO2‑eGFP质粒为模板，设计引物tac‑F、tac‑R通过PCR扩增两个质粒载体，得到片段4和片段5； [0017] 其中，所述引物pBBR1vector‑F、pBBR1vector‑R序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示； [0018] 所述引物cymR‑F、cymR‑R序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示； [0019] 所述引物CuO2‑F、CuO2‑R序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示； [0020] 所述引物为tac‑F、tac‑R序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示 [0021] 片段1和片段3进行Gibson组装，片段1、片段2和片段3进行Gibson组装，连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布培养，获得转化子； [0022] 挑取转化子单菌落，再次培养后提取质粒，即得到pBBR1‑CuO2‑eGFP和pBBR1‑cymR‑CuO2‑eGFP质粒； [0023] 片段4、片段5分别进行Gibson组装，得到pBBR1‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP质粒，序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示。 [0024] 作为本发明所述的基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法的一种优选方案，其中：所述组合阻遏位点包括组合单阻遏位点和多阻遏位点。 [0025] 作为本发明所述的基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法的一种优选方案，其中：所述组合阻遏位点，包括， [0026] 以pBBR1‑Ptac‑CuO2‑eGFP和pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP质粒为模板，设计引物CuO2‑vector‑F、CuO2‑vector‑R通过PCR扩增两个质粒载体，得到片段6和片段7，其中，所述引物为CuO2‑vector‑F、CuO2‑vector‑R，序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示； [0027] 设计引物2CuO2‑F、2CuO2‑R、3CuO2‑F、3CuO2‑R分别在相应位置添加阻遏位点CuO2，得到片段8、片段9，序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示； [0028] 片段6和片段8、片段6和片段9、片段7和片段8、片段7和片段9分别进行Gibson组装，连接产物分别转化大肠杆菌JM109，涂布培养，获得转化子； [0029] 挑取转化子单菌落，再次培养后提取质粒，即得到pBBR1‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑3CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑3CuO2‑eGFP质粒。 [0030] 作为本发明所述4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法的一种优选方案，其中：所述改造后的cmt操纵子质粒包括，pBBR1‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑2Cu O2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑3CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑3CuO2‑eGFP。 [0031] 作为本发明所述的基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法的一种优选方案，其中：所述改造后的cmt操纵子具有诱导表达活性，能够应用于大肠杆菌BL21(DE3)和恶臭假单胞菌KT2440中被4‑异丙基苯甲酸诱导表达。 [0032] 作为本发明所述的基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法的一种优选方案，其中：所述4‑异丙基苯甲酸的诱导浓度为0～400mg/L。 [0033] 作为本发明所述的基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法的一种优选方案，其中：所述改造后的cmt操纵子在大肠杆菌BL21(DE3)中响应效果最好的模型为pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑2CuO2‑eG FP，在恶臭假单胞菌KT2440中响应效果最好的模型为pBBR1‑cymR‑Ptac‑2Cu O2‑eGFP。 [0034] 作为本发明所述的基于4‑异丙基苯甲酸诱导的cmt操纵子的改造方法的一种优选方案，其中：所述改造后的cmt操纵子在4‑异丙基苯甲酸诱导浓度为400mg/L时达到最高荧光蛋白表达强度L。 [0035] 本发明有益效果： [0036] (1)本发明以恶臭假单胞菌F1(Pseudomonas Putida F1)代谢途径中存在的4‑异丙基苯甲酸(cumate)诱导的cmt操纵子为基础构建得到可在大肠杆菌BL21(DE3)和恶臭假单胞菌KT2440中应用的4‑异丙基苯甲酸诱导表达系统。 [0037] (2)本发明还确定了构建得到诱导系统的诱导剂在恶臭假单胞菌KT2440中的有效响应范围，根据确定的有效响应范围分别筛选出在大肠杆菌BL21(DE3)和恶臭假单胞菌KT2440中响应较好的多阻遏位点诱导系统。附图说明 [0038] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中： [0039] 图1为本发明对操纵子的改造原理图。 [0040] 图2为本发明实施例4中含有质粒pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP的菌株8添加不同浓度诱导剂的OD600和单位荧光强度图。 [0041] 图3为本发明实施例5中菌株1～6的OD600值对比图。 [0042] 图4为本发明实施例5中菌株1～6的FLU/OD600值对比图。 [0043] 图5为本发明实施例6中菌株7～12的OD600值对比图。 [0044] 图6为本发明实施例6中菌株7～12的FLU/OD600值对比图。 具体实施方式[0045] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。 [0046] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。 [0047] 其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。 [0048] 本发明所述引物均在金唯智公司合成。 [0049] 本发明中的PCR反应条件为： [0050] 98℃预变性3min [0051] 98℃变性15s–55℃退火10s–72℃延伸56s(40循环) [0052] 72℃保温5min [0053] 反应体系如表1所示： [0054] 表1PCR反应体系 [0055] [0056] 本发明中Gibson组装体系如表2所示： [0057] 表2组装体系 [0058] [0059] 实施例1 [0060] 本实施例以cmt操纵子为基础，替换其原有表达用启动子以及表达目的基因，构建诱导系统的表达荧光蛋白的质粒，其步骤如下： [0061] 以质粒pBBR1‑pTrc为模板，设计引物pBBR1vector‑F、pBBR1vector‑R通过PCR扩增抗性基因Kan、复制子pBBR1 oriV、pBBR1 Rep，得到片段1(4722bp)，所述引物pBBR1vector‑F、pBBR1vector‑R的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示； [0062] 以恶臭假单胞菌F1纯化基因组为模板，设计引物cymR‑F、cymR‑R通过PCR扩增阻遏蛋白基因cymR，得到片段2(1195bp)，所述引物为cymR‑F、cy mR‑R序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示； [0063] 设计引物CuO2‑F、CuO2‑R扩增cmt操纵子阻遏位点CuO2和启动子，得到片段3(145bp)，所述引物为CuO2‑F、CuO2‑R序列如SEQ ID NO:5、SE Q ID NO:6所示； [0064] 将PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收分子量正确的琼脂糖凝胶条带，测定浓度后备用； [0065] 片段1和片段3在摩尔比例为1：4下进行Gibson组装；片段1、片段2和片段3在摩尔比例为1：2：2下进行Gibson组装；反应温度50℃，反应时间1h； [0066] 连接组装产物转化大肠杆菌JM109，涂布卡那霉素LB平板，37℃过夜培养，即可获得转化子，挑取转化子单菌落，在卡那霉素抗性的LB液体培养基中37℃过夜培养，提取质粒，即得到pBBR1‑CuO2‑eGFP和pBBR1‑cymR‑CuO2‑eGFP质粒。 [0067] 以pBBR1‑CuO2‑eGFP和pBBR1‑cymR‑CuO2‑eGFP质粒为模板，设计引物tac‑F、tac‑R通过PCR扩增两个质粒载体，得到片段4和片段5，所述引物tac‑F、tac‑R序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示； [0068] 片段4、片段5分别与ddH2O按照1:1体积比进行Gibson组装，得到pBB R1‑Ptac‑CuO2‑eGFP和pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP质粒，序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示。 [0069] 实施例2 [0070] 本实施例以cmt表达荧光蛋白的质粒为基础，组合阻遏位点，其步骤如下： [0071] 以pBBR1‑Ptac‑CuO2‑eGFP和pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP质粒为模板，设计引物CuO2‑vector‑F、CuO2‑vector‑R通过PCR扩增两个质粒载体，得到片段6和片段7，所述引物CuO2‑vector‑F、CuO2‑vector‑R的序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示； [0072] 设计引物在相应位置添加阻遏位点CuO2，引物为2CuO2‑F、2CuO2‑R、3CuO2‑F、3CuO2‑R，分别得到片段8、片段9，序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示； [0073] 片段6和片段8、片段6和片段9、片段7和片段8、片段7和片段9分别在摩尔比例4：1下进行Gibson组装，反应温度50℃，反应时间1h； [0074] 连接产物分别转化大肠杆菌JM109，涂布卡那霉素LB平板，37℃过夜培养，即可获得转化子； [0075] 挑取转化子单菌落，在卡那霉素抗性的LB液体培养基中37℃过夜培养，提取质粒，即得到pBBR1‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑3CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑3CuO2‑eGFP质粒。 [0076] 实施例3 [0077] 本实施例将改造后的cmt操纵子质粒模型分别转入大肠杆菌BL21感受态细胞以及恶臭假单胞菌KT2440感受态细胞中，步骤如下： [0078] 转入大肠杆菌BL21感受态细胞： [0079] 分别取2μL质粒pBBR1‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑3CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑3CuO2‑eGFP加入100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴20min； [0080] 将感受态细胞置于42℃水浴锅中，热击90s； [0081] 立即转移至冰上冰浴5min； [0082] 立即加入预热至37℃的500μL LB恢复培养基中，转入37℃摇床中恢复培养45min； [0083] 分别涂布于50μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基中，于37℃培养箱中培养12h，得到菌株1、菌株2、菌株3、菌株4、菌株5、菌株6。 [0084] 转入恶臭假单胞菌KT2440感受态细胞： [0085] 分别取2μL质粒pBBR1‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑3CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑3CuO2‑eGFP加入80μL恶臭假单胞菌KT2440感受态细胞中，冰浴5min； [0086] 将质粒与感受态细胞的混合液转移至预冷的1mm内径的电转杯中，迅速以1.2kV的电转化条件转化质粒； [0087] 立即将500μL LB液体培养基加入电转杯将电转化液体冲洗干净，并转移至1.5mL EP管中，置于30℃摇床恢复培养2h； [0088] 分别涂布于50μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基上，于30℃培养箱培养16h，即得到菌株7、菌株8、菌株9、菌株10、菌株11、菌株12。 [0089] 实施例4 [0090] 本实施例检测改造后的cmt操纵子质粒模型在恶臭假单胞菌KT2440中对4‑异丙基苯甲酸响应的浓度范围，以pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP为例，步骤如下： [0091] 将菌株8接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于30℃过夜培养； [0092] 转接，在30℃下培养3h后，当OD600达到0.6时，分别添加2mg/L、5mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L的4‑异丙基苯甲酸cumate，并在30℃下继续生长24h； [0093] 取样50μL培养基并用H2O稀释4倍，用于OD600和eGFP荧光检测，通过酶标仪Spectramax M2485 nm激发和528nm发射测量eGFP荧光，结果如图2所示。 [0094] 图2A为恶臭假单胞菌KT2440中添加不同浓度4‑异丙基苯甲酸(cumate)诱导剂的OD600值，图2B为恶臭假单胞菌KT2440中添加不同浓度cumate诱导剂的荧光/OD600值。结果显示，恶臭假单胞菌KT2440的生长随着cumate诱导剂的浓度的提高并没有受抑制趋势，且在cumate添加浓度为0‑400mg/L的范围内该体系有明显响应趋势。 [0095] 实施例5 [0096] 本实施例检测改造后的cmt操纵子质粒模型pBBR1‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pB BR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑2Cu O2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑3CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑3CuO2‑eGFP在大肠杆菌BL21(DE3)中对4‑异丙基苯甲酸响应强度，步骤如下： [0097] 菌株1、菌株2、菌株3、菌株4、菌株5、菌株6分别接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于30℃过夜培养； [0098] 转接，在30℃下培养3h后，当OD600达到0.6时，菌株1、菌株2、菌株3、菌株4、菌株5、菌株6分别添加10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L的4‑异丙基苯甲酸cumate，并在30℃下继续生长24h； [0099] 取样50μL培养基并用H2O稀释4倍，用于OD600和eGFP荧光检测。通过酶标仪Spectramax M2485 nm激发和528nm发射测量eGFP荧光，结果如图3、图4所示。 [0100] 图3为大肠杆菌BL21(DE3)中多阻遏位点添加不同浓度cumate诱导剂的OD600值对比，结果显示菌体的生长状况随着诱导剂添加浓度升高而受到更多抑制。 [0101] 图4A为大肠杆菌BL21(DE3)中多阻遏位点添加不同浓度cumate诱导剂的荧光/OD600值对比，图4B为多阻遏位点诱导系统在大肠杆菌BL21(DE3)中对不同浓度cumate诱导剂响应程度，结果显示三组诱导系统都能在0‑400mg/L诱导剂浓度区间响应，且单阻遏位点、双阻遏位点即pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP和pBBR1‑cymR‑Ptac‑2CuO2‑eGFP的响应效果较好。 [0102] 实施例6 [0103] 本实施例检测pBBR1‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑CuO2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑2CuO2‑eGFP、pBBR1‑Ptac‑3CuO2‑eGFP、pBBR1‑cymR‑Ptac‑3CuO2‑eGFP在恶臭假单胞菌KT2440中对4‑异丙基苯甲酸响应强度，步骤如下： [0104] 菌株7、菌株8、菌株9、菌株10、菌株11、菌株12分别接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于30℃过夜培养； [0105] 转接，在30℃下培养3h后，当OD600达到0.6时，菌株7、菌株8、菌株9、菌株10、菌株11、菌株12分别添加10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L的cumate，并在30℃下继续生长24h； [0106] 取样50μL培养基并用H2O稀释4倍，用于OD600和eGFP荧光检测。通过酶标仪Spectramax M2485 nm激发和528nm发射测量eGFP荧光，结果如图5、图6所示。 [0107] 图5为恶臭假单胞菌KT2440中多阻遏位点添加不同浓度cumate诱导剂的OD600值对比，结果显示菌体的生长状况并未因诱导剂添加浓度的提高而受到明显影响。 [0108] 图6A为恶臭假单胞菌KT2440中多阻遏位点添加不同浓度cumate诱导剂的荧光/OD600值对比，图6B为多阻遏位点诱导系统在恶臭假单胞菌KT2440中对不同浓度cumate诱导剂响应程度，结果显示三组诱导系统都能在0‑400mg/L诱导剂浓度区间响应，且双阻遏位点即pBBR1‑cymR‑Ptac‑2CuO2‑eGFP在400mg/L 4‑异丙基苯甲酸诱导剂浓度下达到最高荧光蛋白表达强度。 |
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