用于药敏试验的菌液制备方法
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410557155.9 | 申请日 | 2024-05-07 |
| 公开(公告)号 | CN118441014A | 公开(公告)日 | 2024-08-06 |
| 申请人 | 北京威妙生物科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 唐明忠; | 第一发明人 | 唐明忠 |
| 权利人 | 北京威妙生物科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 北京威妙生物科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：北京市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：北京市大兴区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：北京市大兴区礼贤镇乾平路1号自贸试验区大兴机场片区A号楼0313号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：102600 |
| 主IPC国际分类 | C12Q1/24 | 所有IPC国际分类 | C12Q1/24 ; C12Q1/18 ; G01N27/04 ; C12R1/185 ; C12R1/385 ; C12R1/445 ; C12R1/46 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京博浩百睿知识产权代理有限责任公司 | 专利代理人 | 宋子良; |
| 摘要 | 本 发明 提供了用于药敏试验的菌液制备方法，上述方法包括：挑取制备上述菌液的样本的菌落；将上述菌落制备为第一菌液，对上述第一菌液的细菌个数进行计数，得到上述第一菌液的第一细菌个数；根据上述第一细菌个数推断得到上述第一菌液的第一浓度，根据上述第一浓度稀释上述第一菌液，得到第二菌液，上述第二菌液的第二浓度为105至106个/毫升(cfu/mL)；上述第二菌液为上述用于药敏试验的菌液。将计数法巧妙的运用到制备用于药敏试验的菌液中，大大缩短了制备菌液的时间，本发明方案中采用的样本的浓度几乎低于0.5MCF(1.5*108cfu/mL)的菌液量100倍，即在低浓度下就能开启药敏实验的菌液制备，实现了应用创新。 | ||
| 权利要求 | 1.用于药敏试验的菌液制备方法，其特征在于，所述方法包括： |
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| 说明书全文 | 用于药敏试验的菌液制备方法技术领域背景技术[0002] 微生物药敏试验(AST)常规操作中菌液准备工作是较为重要的一环，其要求菌液5 6 接种量目标浓度为10 ‑10 cfu/mL,常规的操作是，采用麦氏比浊仪测量达到0.5MCF(1.5* 8 10cfu/mL)的菌液量，之后手动稀释到目标浓度。但是临床上获得0.5麦氏的纯菌落，是需要等待较长时间的，一方面是由于培养菌生长比较缓慢，另一方面是因为在实际临床工作中得到足够量的单一纯菌落比较困难，由于定植菌的存在，致病菌的纯菌落很难得到较大浓度，因此需要对其进行进一步的转种培养，时间往往达到24小时甚至更久。 [0003] 麦氏比浊法测量是通过检测悬浮液中的微生物散射光来反映微生物含量的常用手段之一，悬浮液中微生物的含量越大，透过悬浮液的光越少，被散射的光就越多，即细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，它主要应用于微生物检测领域的细菌浊度检测、药敏试验等。 [0004] 浊度是指水中悬浮物对光线透过时所发生的阻碍程度，水中的悬浮物一般是泥土、砂粒、微细的有机物和无机物、浮游生物、微生物和胶体物质等，水的浊度不仅与水中悬浮物质的含量有关，而且与它们的大小、形状及折射系数等有关，浊度也可以浊度仪来测定，浊度仪发出光线，使之穿过一段样品，并从与入射光呈90度的方向上检测有多少光被水中的颗粒物所散射，这种散射光测量方法称作散射法。任何真正的浊度都必须按这种方式测量，浊度仪既适用于野外和实验室内的测量，也适用于全天候的连续监测。 [0005] 该原理下测试菌液浓度的比浊法使用光电比浊检测方法，通过对待测液的透射率和反射率测试，给出待测液的浊度值，可输出透射麦氏单位结果，但是利用光学浓度检测菌液浓度的此种方法并不准确，手工操作繁琐，所测得麦氏结果偏高则需要稀释后重新测量，若所测得麦氏结果偏低，则需要再次挑菌重新测量。 [0006] 故有待提出一种新的用于药敏试验的菌液准备的方法，以便至少解决现有技术中对菌液进行进一步的转种培养时间过久，且菌液浓度不准确及手工操作繁琐的技术问题。 发明内容[0007] 本发明提供了用于药敏试验的菌液制备方法，至少解决了现有技术中对菌液进行进一步的转种培养时间过久，且菌液浓度不准确及手工操作繁琐的技术问题。 [0008] 本发明提供了用于药敏试验的菌液制备方法，上述方法包括： [0009] 挑取制备上述菌液的样本的菌落； [0010] 将上述菌落制备为第一菌液，对上述第一菌液的细菌个数进行计数，得到上述第一菌液的第一细菌个数； [0011] 根据上述第一细菌个数推断得到上述第一菌液的第一浓度，根据上述第一浓度稀5 6 释上述第一菌液，得到第二菌液，上述第二菌液的第二浓度为10至10个/毫升(cfu/mL)； [0012] 上述第二菌液为上述用于药敏试验的菌液。 [0013] 可选的，上述菌落为苛养菌菌落或混合菌菌落或纯菌落。 [0014] 可选的，上述苛养菌菌落为生长未达到0.5麦氏的苛养菌菌落，或上述混合菌菌落包括生长未达到0.5麦氏的菌落，或上述纯菌落为生长未达到0.5麦氏的纯菌落。 [0015] 可选的，挑取制备上述菌液的样本的菌落至生理盐水中混匀成上述第一菌液；根据上述第一浓度，用培养液稀释上述第一菌液，得到第二菌液。 [0016] 可选的，采用电阻计数法对上述第一菌液的细菌个数进行计数，得到上述第一菌液的第一细菌个数。 [0017] 可选的，用接种装置挑取制备上述菌液的样本的菌落。 [0018] 可选的，上述接种装置为接种针。 [0019] 可选的，上述的方法包括如下步骤： [0020] A.挑取上述菌落到2至10毫升生理盐水中，充分混匀成上述第一菌液； [0021] B.对上述第一菌液的细菌个数进行计数，得到上述第一菌液的第一细菌个数； [0022] C.根据上述第一细菌个数及上述第一菌液的体积推断得到上述第一菌液的第一浓度(C初)，根据上述第一浓度(C初)对上述第一菌液进行稀释并混匀，得到第二菌液，上述第5 6 二菌液的第二浓度为10至10个/毫升(cfu/mL)，上述第二菌液为上述用于药敏试验的菌液。 [0023] 可选的，上述的方法包括如下步骤： [0024] A.挑取上述菌落到3至5毫升生理盐水中，充分混匀成上述第一菌液； [0025] B.对上述第一菌液的细菌个数进行计数，得到上述第一菌液的第一细菌个数； [0026] C.根据上述第一细菌个数及上述第一菌液的体积推断得到上述第一菌液的第一浓度(C初)，根据上述第一浓度(C初)对上述第一菌液进行稀释并混匀，得到第二菌液，上述第5 6 二菌液的第二浓度为10至10个/毫升(cfu/mL)，上述第二菌液为上述用于药敏试验的菌液。 [0027] 可选的，上述的方法包括如下步骤： [0028] A.挑取上述菌落到6至8毫升生理盐水中，充分混匀成上述第一菌液； [0029] B.对上述第一菌液的细菌个数进行计数，得到上述第一菌液的第一细菌个数； [0030] C.根据上述第一细菌个数及上述第一菌液的体积推断得到上述第一菌液的第一浓度(C初)，根据上述第一浓度(C初)对上述第一菌液进行稀释并混匀，得到第二菌液，上述第5 6 二菌液的第二浓度为10至10个/毫升(cfu/mL)，上述第二菌液为上述用于药敏试验的菌液。 [0031] 可选的，上述用于药敏试验的菌液制备方法所得到的上述第二菌液在上述药敏试验中的应用。 [0032] 本发明技术方案可获得临床所需的菌液浓度，进行细菌含量的测定，可稀释到目标菌液浓度，其优点在于： [0033] 1.相比于比浊法，菌液使用生理盐水进行稀释后需要手动频繁的操作，使菌液最终达到0.5麦氏浓度后才能上机实验的缺陷，本发明方法可使菌液使用生理盐水稀释后直接上机，因为仪器首先测得初始菌值，再根据软件自动分析稀释倍数，仪器根据稀释倍数稀释菌液后再上机培养检测，与比浊法相比，则避免了手动频繁操作，节省了大量的时间与人工的操作，更加自动化。 [0034] 2.当细菌生长量少，不足以满足0.5麦氏浓度时，就需要等待一个相当长的时间，本发明技术方案可以完全避免这种情况的发生，即极大程度缩短时间。 [0035] 3.在临床操作过程中，标本不是单一菌落存在的，有很多定植菌存在，致病菌的单菌落很难达到0.5麦氏浓度，一般需要转种培养24小时后，达到纯菌落后再进行试验，如果采用本发明技术方案就可以节省时间，不需要转种培养也可以直接进行试验。 [0036] 具体而言，细菌鉴定药敏要求有一个初始浓度标准，配置出来的标本的初始浓度必须围绕着这个标准，不能太高，也不能太低，现有技术通常采用的方法是比浊法，如图1所示，挑菌落至5毫升生理盐水中，混匀，放入比浊仪，观察麦氏结果，如果麦氏结果偏高，则生理盐水稀释后比浊仪继续测量，直到结果正常为止，如果麦氏结果偏低，则继续挑菌落至生理盐水中，混匀后比浊仪继续测量，使菌液最终达到0.5麦氏浓度后上机，整个过程需要手动频繁操作。而本发明技术方案实现了全自动，首先把样本当中的浓度进行阻抗法测定，然后根据测定的结果判断是否需要稀释，以及稀释多少倍，然后自动对菌液样本进行稀释，稀释完成之后，它的浓度就应该非常接近标准浓度了，因为是仪器根据阻抗法的细菌数量来自动测算与标准浓度的差距。 [0037] 现有技术中的比浊法得到纯菌落非常困难，是因为在临床操作过程中，标本有很多定植菌存在，使得致病菌的单一菌落也就是纯菌落很难达到0.5麦氏浓度，所以需要转种培养，需要一个相当长的时间，而本发明方法不需要转钟培养，可以直接挑取标本平板中的纯菌落，通过计数法进行稀释，从而达到用于药敏试验的菌液浓度，属于计数法在制备用于药敏试验的菌液中的应用创新。 [0038] 临床分离出来的样本是混合菌感染的时候，单菌落浓度无法达到0.5麦氏的时候，现有技术的比浊法是需要耗费大量时间去培养，才能稀释的，而本发明技术方案中，接种针5 6 不需要挑到0.5麦氏浓度的纯菌落，而只需要达到10‑10cfu/mL以上的浓度，就可以开始进 5 6 行药敏实验前的菌液制备了，因为最终药敏实验的菌液浓度要求就是10 ‑10cfu/mL即可，而现有技术之所以必须达到0.5麦氏的浓度，是因为比浊法本身的要求，否则无法采用比浊法进行稀释，故将计数法巧妙的运用到制备用于药敏试验的菌液中，大大缩短了制备菌液 8 的时间，本发明方案中采用的样本的浓度几乎低于0.5MCF(1.5*10 cfu/mL)的菌液量100倍，即在低浓度下就能开启药敏实验的菌液制备，实现了应用创新。 附图说明 [0039] 通过参考附图阅读下文的详细描述，本发明示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本发明的若干实施方式，其中： [0040] 图1为现有技术提供的一种可选的比浊法测量的流程示意图； [0041] 图2为本发明实施例的一种可选的用于药敏试验的菌液的制备流程示意图； [0042] 图3‑1为本发明实施例的一种可选的用于药敏试验的菌液的多种菌培养16‑24h后的示意图； [0043] 图3‑2为将图3‑1圆圈中的目标菌转种24h后的示意图。 [0044] 下面具体实施方式用于进一步说明但不限于本发明，下面实施例仅为本发明一种优选地实施方式。 具体实施方式[0045] 下面将参考若干示例性实施方式来描述本发明的原理和精神。应当理解，给出这些实施方式仅仅是为了使本领域技术人员能够更好地理解进而实现本发明，而并非以任何方式限制本发明的范围。相反，提供这些实施方式是为了使本申请公开更加透彻和完整，并且能够将本申请公开的范围完整地传达给本领域的技术人员。 [0046] 临床常见污染菌分为纯菌感染和多种菌感染，其在样本处理转种过程中会有如下表现：多种菌感染(图3‑1所示大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌多种菌感染结果)，所需要的目标致病菌为肺炎链球菌，如图3‑1圆圈中所示，目标致病菌的单菌落很难达到0.5麦氏浓度，对其转种24h后，达到的纯菌落如图3‑2所示。对于多种菌感染的见实施例1、实施例2及纯菌感染见实施例3、实施例4。 [0047] 实施例1 [0048] 对于混合菌感染，由于致病菌无法满足0.5麦氏的要求，无法进行药敏试验，需要继续培养4‑8h，直到菌体浓度满足0.5麦氏的要求。相同条件下培养，培养16‑24h后，利用细6 菌计数仪将菌体浓度测出(4*10cfu/mL)，未能达到0.5麦氏的要求。将其放入设备，设定好 5 目标浓度(1.5*10 cfu/mL)，设备会根据初始浓度，自动测定需要稀释的倍数，自动吸取原 5 液，最终获得目标浓度(1.5*10cfu/mL)。 [0049] 故对于混合菌感染，其样本分离培养16‑24h之后，其培养可能会呈现如图3‑1所示5 6 的这种形态：圆圈标识为目标致病菌，如进行药敏试验，须配制其浓度为10‑10cfu/mL； [0050] 1.1常规操作方式： [0051] 由于如图3‑1所示其目标致病菌菌落较少无法满足0.5麦氏的浓度，将圆圈所示目标菌落继续进行分纯培养16‑24小时，至图3‑2所示菌落形态，之后挑取菌落，至5毫升生理盐水中充分混匀，放入比浊仪中，制成约0.5麦氏单位均匀的菌悬液，吸取100μL菌悬液至10mL稀释液中，标示为1号管备用； [0052] 1.2本发明方法操作方式为： [0053] 用接种装置接种针直接挑取如图3‑1所示的目标菌落至5毫升生理盐水中充分混匀，进行细菌计数，计算得到菌液浓度C初，然后根据目标浓度C终计算稀释倍数，得到目标浓度管，标示为2号管备用； [0054] 计算得到菌液浓度C初为3*107cfu/mL，然后根据目标浓度C目(1.5*105cfu/mL)，设备自动计算稀释倍数，自动吸取原液(V移)，将其注入目标管(目标管溶液已在设备设定，V设为5mL)；具体的稀释依据为：根据公式所得： [0055] [0056] C目为设定目标浓度，C初为原液测定浓度，V初为设定原液体积，V设为设定目标体积，V移为原液移入目标管体积。 [0057] 将数据代入公式 [0058] [0059] 得到V移为263μl。最终得到目标浓度为1.5*106cfu/mL，溶液体积为5.263mL。 [0060] 1.3对1号管及2号管按照菌落计数的方法进行菌落计数，菌落计数方法如下： [0061] (1)分别取1号管、2号管中的菌液用药敏接种培养液(普通型)进行2*105倍稀释，总体积12mL，从中吸取50μL进行琼脂平板涂布，将涂布好的平板倒置放入37℃恒温培养箱中，培养16‑24h； [0062] (2)对培养好的平板手动计数，根据稀释倍数推算得到实际菌落个数。 [0063] 两种方法的菌落计数所得到的结果如(表1)所示： [0064] [0065] 表1 [0066] 注：表1所示结果，每种方法均做了重复计数实验。 [0067] 实验结论：通过对肺炎链球菌进行常规操作方式以及本发明实施例方法的比较，得到的菌落计数结果较为一致，得出比浊仪计数以及本发明实施例的稀释方法计数，均可以达到要求。 [0068] 这里菌落计数是两种方法的对比，目的是通过对两种方法得到的稀释菌液进行菌落计数，观察本发明实施例方法是否可行，结论是本发明技术方案可行。 [0069] 实施例2药敏实验准确性对比 [0070] 实验目的：实施例1中菌液准备是药敏实验的基础，通过药敏实验，对该菌液准备方法进行验证 [0071] 实验方法： [0072] 2.1常规操作方式：由于其致病菌菌落较少无法满足0.5麦氏的浓度，将圆圈所示目标菌落继续进行分纯培养18‑24小时，至图3‑2所示菌落形态，之后挑取菌落，至5毫升生理盐水中充分混匀，放入比浊仪中，制成约0.5麦氏单位均匀的菌悬液，吸取260μL菌悬液至26mL稀释培养液中，标示为3号管备用； [0073] 2.2本发明方法操作方式为：用接种针直接挑取图3‑1所示目标菌落至5毫升生理盐水中充分混匀，进行细菌计数，计算得到菌液浓度C初，然后根据目标浓度C目计算稀释倍数，用培养液进行稀释，得到目标浓度管，标示为4号管备用，即省略了形成图3‑2所需的时间24小时； [0074] 2.3准备药敏试剂板：将试剂板放在室温条件下恢复15‑30分钟； [0076] 2.5将接种完毕的试剂盒载入恒温孵育模块中，进行定时恒温培养； [0077] 2.6恒温培养结束后，全自动快速药敏分析仪开始检测药敏板每个孔的细菌数量，软件对测试的数据进行汇总分析并确定每个抗生素的敏感性。 [0078] 实验结果如表2所示： [0079] [0080] 表2 [0081] 对表2所分析的结果与表2中的质控结果进行比对，可知，表2的药敏检测结果与表2的质控结果相符合，由此证明用比浊仪测量得到的结果以及本发明实施例的菌落计数得到的结果均可行，即在本发明实施例的菌落计数的基础上所得药敏检测结果符合质控标准。 [0082] 实施例3实验室分纯培养的纯菌株药敏实验准确性对比实验 [0083] 对于实验室已经转种备好的纯菌落，同时进行上述两种方法的菌落计数以及药敏试验，观察本发明实施例方法是否可行，是否可以用于实验室常规操作。 [0084] 3.1准备标准菌株‑大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌3种菌株。同时进行上述两种方法的菌落计数。 [0085] 3.1.1用一次性无菌接种环分别挑取3种待检纯菌株F1代，三区划线于琼脂平板上，倒置放入37℃恒温培养箱中，培养16‑24h； [0086] 3.1.2常规操作方式：用一次性无菌接种环分别挑取部分F2代单菌落，至5毫升生理盐水中充分混匀，放入比浊仪中，制成约0.5麦氏单位均匀的菌悬液，吸取100μL菌悬液至10mL稀释液中，标示为A‑C号管备用； [0087] 该方法操作方式为：用接种针挑取F2代单菌落，至5毫升生理盐水中充分混匀，进行细菌计数，计算得到菌液浓度C初，然后根据目标浓度C目计算稀释倍数，得到目标浓度管，标示为D‑F号管备用； [0088] 3.1.3对A‑F号管按照菌落计数的方法进行菌落计数，菌落计数方法如下： [0089] 【1】分别取A‑F管中的菌液用药敏接种培养液(普通型)进行2*105倍稀释，总体积12mL，从中吸取50μL进行琼脂平板涂布，将涂布好的平板倒置放入37℃恒温培养箱中，培养 16‑24h； [0090] 【2】对培养好的平板手动计数，根据稀释倍数推算得到实际菌落个数。两种方法的菌落计数所得到的结果如下表(表3)所示： [0091] [0092] 表3 [0093] 实验结论：通过对标准菌株‑大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌3种菌株进行常规操作方式以及本发明实施例方法的比较，得到的菌落计数结果较为一致，得出比浊仪计数以及本发明实施例的稀释方法计数，均可以达到要求，本发明技术方案可行。 [0094] 3.2准备标准菌株‑大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌3种菌株。同时进行上述两种方法的药敏检测。 [0095] 3.2.1用一次性无菌接种环分别挑取三种待检纯菌株F1代，三区划线于琼脂平板上，倒置放入37℃恒温培养箱中，培养16‑24h； [0096] 3.2.2常规操作方式：用一次性无菌接种环分别挑取部分F2代单菌落，至5毫升生理盐水中充分混匀，放入比浊仪中，制成约0.5麦氏单位均匀的菌悬液，吸取260μL菌悬液至26mL稀释培养液中，标示为A’‑C’号管备用； [0097] 该方法操作方式为：用接种针分别挑取F2代单菌落至5毫升生理盐水中充分混匀，进行细菌计数，计算得到菌液浓度C初，然后根据目标浓度C目计算稀释倍数，用培养液进行稀释，得到目标浓度管，标示为D’‑F’号管备用； [0098] 3.2.3准备药敏试剂板：将试剂板放在室温条件下恢复15‑30分钟； [0099] 3.2.4拆开包装袋取出试剂盒；用微量移液器或自动加样器，分别取A’‑F’号管中的药敏增菌液加入药敏试剂板中，每孔加入500μL，粘好封口膜，接种完成； [0100] 3.2.5将接种完毕的试剂盒载入恒温孵育模块中，进行定时恒温培养； [0101] 3.2.6恒温培养结束后，全自动快速药敏分析仪开始检测药敏板每个孔的细菌数量，软件对测试的数据进行汇总分析并确定每个抗生素的敏感性。 [0102] 实验结果如表4所示： [0103] [0104] [0105] 表4 [0106] 表5所附为各菌株质控标准： [0107] [0108] [0109] 表5 [0110] 对表4所分析的结果与表5中的质控结果进行比对，可知，表4的药敏检测结果与表5的质控结果相符合，由此证明用比浊仪测量得到的结果以及本发明实施例的菌落计数得到的结果均可行，即在本发明实施例的菌落计数的基础上所得药敏检测结果符合质控标准。 [0111] 实例4：肺炎链球菌(苛养菌) [0112] 将肺炎链球菌接种于培养基后，培养16‑24h后，肺炎链球菌无法满足0.5麦氏的要求，无法进行药敏试验，需要继续培养4‑8h，直到菌体浓度满足0.5麦氏的要求，手动配制成0.5麦氏的准备液。相同条件下同样转种一株肺炎链球菌，培养16‑24h后，利用细菌计数仪将菌体浓度测出(3*106cfu/mL)，未能达到0.5麦氏的要求。将其放入设备，设定好目标浓度(1.5*105cfu/mL)，设备会根据初始浓度，自动测定需要稀释的倍数，自动吸取原液，最终获得目标浓度(1.5*105cfu/mL)。 [0113] 综上所述，本发明实施例方法提供了一种用于药敏试验菌液准备的方法，解决了实验室常规操作方法带来的缺陷：首先在苛养菌感染或混合菌标本难以获得0.5麦氏纯菌液的问题上，节省大量的培养时间，为快速进入药敏阶段做准备；其次在实验室已经转种培养好的纯菌株实验中，也避免了为使菌液最终达到0.5麦氏浓度后才能上机实验的缺陷，避免了繁杂的手工操作，同时解决了浓度不准确的问题。由此说明本发明实施例方法具有可行性。 |
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