MurJ蛋白突变体及其应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202110786103.5 | 申请日 | 2021-07-12 |
| 公开(公告)号 | CN115611968A | 公开(公告)日 | 2023-01-17 |
| 申请人 | 李岩; | 申请人类型 | 其他 |
| 发明人 | 程江红; 牛松峰; 贾贝贝; 李岩; | 第一发明人 | 程江红 |
| 权利人 | 李岩 | 权利人类型 | 其他 |
| 当前权利人 | 李岩 | 当前权利人类型 | 其他 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：天津市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：天津市滨海新区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：天津市滨海新区海景二路海滨园 | 邮编 | 当前专利权人邮编：300450 |
| 主IPC国际分类 | C07K14/34 | 所有IPC国际分类 | C07K14/34 ; C12N15/31 ; C12N1/21 ; C12P13/14 ; C12P13/24 ; C12P13/08 ; C12R1/185 ; C12R1/15 ; C12R1/07 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京路浩知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 黄爽; |
| 摘要 | 本 发明 提供一种MurJ蛋白突变体及其应用。所述突变体包含如下①～③突变中的至少一种：①MurJ蛋白第373位 氨 基酸由P到S的突变；②MurJ蛋白第422位氨基酸由A到T的突变；③MurJ蛋白第882位氨基酸由T到I的突变。本发明提供的包含P373S、A422T、T882I突变位点的MurJ蛋白变体，能够提高氨基酸的产量和转化率，同时还能够保证菌株的生长性能。利用表达上述MurJ蛋白变体的重组 微 生物 进行氨基酸 发酵 生产，氨基酸发酵生产性能得以显著提升，特别是谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸，具有较高的产量和糖酸转化率，为氨基酸的大规模工业化生产提供有 力 工具。 | ||
| 权利要求 | 1.MurJ蛋白突变体，其特征在于，所述突变体包含如下①～③突变中的至少一种： |
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| 说明书全文 | MurJ蛋白突变体及其应用技术领域背景技术[0002] L‑谷氨酸(L‑glutamate)，化学名称为α‑氨基戊二酸，分子式为C5H9NO4，分子量为147.13076Da，分子中含有两个羧基，是一种酸性氨基酸。谷氨酸是含量最丰富的氨基酸之一，其除了参与蛋白质合成之外，在营养和信号传导方面也起着重要作用。谷氨酸或其单钠盐(味精)可作为食品添加剂提升食品的鲜味，因此被广泛地工业化生产。目前谷氨酸最常用的生产方法为发酵法，相较于酶法和化学合成的工艺复杂性以及采用原料毒性，发酵法具有原料来源安全、生产成本低、产物单一等优点。 [0003] 尽管发酵法生产谷氨酸的研究已经过几十年的发展，但目前谷氨酸菌种的生产性能仍有待进一步提高，这也制约了谷氨酸的工业大规模生产，且不利于节约生产成本。 [0004] 与谷氨酸近似，其他氨基酸生产同样面临着因发酵生产指标低造成成本过高的问题，因此改进生产氨基酸菌种性能很有必要。 发明内容[0005] 本发明的目的是提供MurJ蛋白突变体及其应用。 [0006] 本发明的另一目的是提供一种产氨基酸(L‑氨基酸)的基因工程菌及其构建方法与应用。 [0007] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种MurJ蛋白突变体，所述突变体包含如下①～③突变中的至少一种： [0008] ①MurJ蛋白第373位氨基酸由P到S的突变； [0009] ②MurJ蛋白第422位氨基酸由A到T的突变； [0010] ③MurJ蛋白第882位氨基酸由T到I的突变。 [0011] 本发明中，MurJ蛋白(murein biosynthesis protein)来自谷氨酸棒杆菌，其在NCBI上的参考序列编号为WP_216312835.1。该蛋白由murj基因(即BBD29_15285基因)编码。 [0012] 优选地，所述突变体包含MurJ蛋白第373位氨基酸由P到S的突变、第422位氨基酸由A到T的突变以及第882位氨基酸由T到I的突变(SEQ ID NO:2)。 [0013] 第二方面，本发明提供编码所述MurJ蛋白突变体的核酸分子。 [0014] 第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。 [0015] 第四方面，本发明提供所述核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用： [0016] (1)用于氨基酸(L‑氨基酸)的发酵生产； [0017] (2)用于提高氨基酸(L‑氨基酸)的发酵产量； [0018] (3)用于构建产氨基酸(L‑氨基酸)的基因工程菌。 [0019] 本发明中，所述氨基酸包括但不限于谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸。 [0020] 第五方面，本发明提供产氨基酸的基因工程菌的构建方法，利用基因工程手段，在具有氨基酸生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的MurJ蛋白包含如下①～③突变中的至少一种： [0021] ①MurJ蛋白第373位氨基酸由P到S的突变； [0022] ②MurJ蛋白第422位氨基酸由A到T的突变； [0023] ③MurJ蛋白第882位氨基酸由T到I的突变。 [0024] 优选地，所述细菌为埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)菌种。 [0025] 更优选地，所述细菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。 [0026] 在本发明的一个具体实施方式中，所述谷氨酸棒状杆菌为菌株MHZ‑0112‑8(保藏编号为CGMCC No.11941)，参见ZL201610119402.2。 [0027] 在本发明的另一个具体实施方式中，所述谷氨酸棒状杆菌为菌株MHZ‑0701(保藏编号为CGMCC No.13757)，参见ZL201710385500.5。 [0028] 在本发明的又一个具体实施方式中，所述谷氨酸棒状杆菌为菌株MHZ‑0912‑6(保藏编号为CGMCC No.11942)，参见ZL201610119394.1。 [0029] 第六方面，本发明提供按照上述方法构建得到的产氨基酸的基因工程菌。 [0030] 第七方面，本发明提供按照上述方法构建得到的基因工程菌在氨基酸(包括谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸)的发酵生产或提高氨基酸的发酵产量中的应用。 [0031] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果： [0032] 本发明提供的包含P373S、A422T、T882I突变位点的MurJ蛋白变体，能够提高氨基酸的产量和转化率，同时还能够保证菌株的生长性能。利用表达上述MurJ蛋白变体的重组微生物进行氨基酸发酵生产，氨基酸发酵生产性能得以显著提升，特别是谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸，具有较高的产量和糖酸转化率。 具体实施方式[0033] 本发明提供一种提高L‑氨基酸，特别是谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸发酵生产能力的方法。 [0034] 本发明采用如下技术方案： [0035] 本发明提供突变的BBD29_15285蛋白(即MurJ蛋白突变体)，BBD29_15285基因(即murj基因)编码蛋白的第373位脯氨酸突变为丝氨酸、第422位丙氨酸突变为苏氨酸、第882位苏氨酸突变为异亮氨酸。具体地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 [0036] 本发明还提供编码上述BBD29_15285蛋白变体的DNA分子，所述DNA分子是指BBD29_15285基因的第1117位碱基由C突变为T、第1264位碱基由G突变为A、第2645位碱基由C突变为T。具体地，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 [0037] 本发明还提供一种谷氨酸棒杆菌重组菌株，所述谷氨酸棒杆菌重组菌株通过在产谷氨酸/脯氨酸/赖氨酸菌中表达上述的DNA分子获得；所述产谷氨酸菌为MHZ‑0112‑8，产脯氨酸菌为MHZ‑0701，产赖氨酸菌为MHZ‑0912‑6。 [0038] 本发明还提供上述谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，包括： [0039] (1)分别构建BBD29_15285基因编码蛋白的第373位脯氨酸突变为丝氨酸的重组质粒、BBD29_15285基因编码蛋白的第422位丙氨酸突变为苏氨酸的重组质粒、BBD29_15285基因编码蛋白的第882位苏氨酸突变为异亮氨酸的重组质粒，以及上述三个突变组合的重组质粒； [0040] (2)将重组质粒转化谷酸棒杆菌，用含卡那霉素的选择培养基筛选转化子，将筛得的转化子用液体脑心浸液培养基培养； [0041] (3)培养物稀释后涂布在含有10％蔗糖的固体脑心浸液培养基上，培养获得重组菌株。 [0042] 具体地，重组菌株的构建方法包括： [0043] (1)分别构建BBD29_15285基因编码蛋白的第373位脯氨酸突变为丝氨酸的重组质粒pK18‑BBD29_15285(P373S)、BBD29_15285基因编码蛋白的第422位丙氨酸突变为苏氨酸的重组质粒pK18‑BBD29_15285(A422T)、BBD29_15285基因编码蛋白的第882位苏氨酸突变为异亮氨酸的重组质粒pK18‑BBD29_15285(T882I)，以及上述三个突变组合的重组质粒pK18‑BBD29_15285(P373S+A422T+T882I) [0044] (2)将重组质粒转化谷酸棒杆菌，用含15mg/L卡那霉素的选择培养基筛选转化子，将筛得的转化子用液体脑心浸液培养基在31.5℃、220rpm振荡培养过夜； [0045] (3)培养物稀释后涂布在含有10％蔗糖的固体脑心浸液培养基上，31.5℃静置培养36h获得重组菌株。 [0046] 在本发明提供的具体实施方式中，所述出发菌株为保藏编号为CGMCC No.11941的谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8、保藏编号为CGMCC No.13757的谷氨酸棒杆菌MHZ‑0701、保藏编号为CGMCC No.11942的谷氨酸棒杆菌MHZ‑0912‑6。 [0047] 谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8的纯培养物已于2015年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.11941。谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8(CGMCC No.11941)已在ZL201610119402.2中公开。 [0048] 出发菌株MHZ‑0701为谷氨酸棒杆菌，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)MHZ‑0701的纯培养物已于2017年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.13757。本发明所提及的谷氨酸棒杆菌MHZ‑ 0701(CGMCC No.13757)已在ZL201710385500.5中公开。 [0049] 出发菌株MHZ‑0912‑6为谷氨酸棒杆菌，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)MHZ‑0912‑6的纯培养物已于2015年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.11942。本发明所提及的谷氨酸棒杆菌MHZ‑0912‑6(CGMCC No.11942)已在ZL201610119394.1中公开。 [0050] 本发明还提供上述谷氨酸棒杆菌重组菌株在发酵生产谷氨酸、赖氨酸或脯氨酸中的应用。 [0051] 具体地，本发明提供一种氨基酸的生产方法，包括： [0054] 所用种子培养基为：葡萄糖25g/L，尿素3.0g/L，K2HPO4·3H2O 2.2g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，玉米浆33mL/L，豆饼水解液22mL/L，pH 7.0‑7.2。 [0055] 所用发酵培养基为：葡萄糖60g/L，硫酸铵15g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，FeSO4·7H2O 1.0mg/L，MnSO4·5H2O 1.0mg/L，VB1 200μg/L，生物素300μg/L，大豆水解液0.48g/L，pH 7.2‑7.5。 [0056] 种子培养方法包括：在31.5℃，220rpm条件下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为10‑14h。 [0057] 发酵培养方法包括：在31.5℃，220rpm条件下振荡培养12‑20h。 [0058] 在本发明提供的脯氨酸发酵生产方法中，所用种子活化培养基为：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2％，pH 7.2。 [0060] 所用发酵培养基为：玉米浆0.6％，葡萄糖12.0％，硫酸铵3.7％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO3 4％，VH 70μg/L，VB1 80μg/L，pH 7.2。 [0061] 发酵培养方法包括：33℃、220r/min振荡培养72h。 [0062] 在本发明提供的赖氨酸发酵生产方法中，所用斜面培养基为：酵母粉5.0g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2.5g/L，pH 7.0‑7.2。将配制好的培养基于121℃0.1MPa灭菌30min。 [0063] 所用种子培养基为：葡萄糖25g/L，尿素3.0g/L，K2HPO4·3H2O 2.2g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，玉米浆33mL/L，豆饼水解液22mL/L，pH 7.0‑7.2。将配制好的培养基于121℃0.1MPa灭菌15min。 [0064] 所用发酵培养基为：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO4 25g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 30g/L，NaOH调pH7.0。 [0065] 发酵培养方法包括：31.5℃、220r/min振荡培养16h。 [0066] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0067] 以下实施例中使用的引物序列如表1所示。 [0068] 表1引物序列 [0069] [0070] [0071] 实施例1构建携带P373S、A422T、T882I的单点突变及组合突变的重组质粒[0072] A、构建pK18‑BBD29_15285(P373S)重组质粒 [0073] 根据NCBI数据库中BBD29_15285基因的序列设计引物，引物序列如表1所示。利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，P373S‑UP‑1F/P373S‑UP‑1R，P373S‑DN‑2F/P373S‑DN‑2R作为引物对，以谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8的基因组为模板，制备重组片段，PCR程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸15s，循环30次，72℃彻底延伸10min。所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后以P373S‑UP‑1F/P373S‑DN‑2R为引物对，以上下游同源臂为模板，制备重组片段，PCR程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸30s，循环30次，72℃彻底延伸10min。所得重组片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，然后利用XbaI/PstI进行消化，同时将pK18‑mobsacB利用XbaI/PstI进行消化，并用T4 DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/PstI酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段正确。将所得质粒命名为pK18‑BBD29_15285(P373S)。 [0074] B、构建pK18‑BBD29_15285(A422T)重组质粒 [0075] 根据NCBI数据库中BBD29_15285基因的序列设计引物，引物序列如表1所示。利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，A422T‑UP‑1F/A422T‑UP‑1R，A422T‑DN‑2F/A422T‑DN‑2R作为引物对，以谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8的基因组为模板，制备重组片段，PCR程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸15s，循环30次，72℃彻底延伸10min。所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后以A422T‑UP‑1F/A422T‑DN‑2R为引物对，以上下游同源臂为模板，制备重组片段，PCR程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸30s，循环30次，72℃彻底延伸10min。所得重组片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，然后利用XbaI/PstI进行消化，同时将pK18‑mobsacB利用XbaI/PstI进行消化，并用T4 DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/PstI酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段正确。将所得质粒命名为pK18‑BBD29_15285(A422T)。 [0076] C、构建pK18‑BBD29_15285(T882I)重组质粒 [0077] 根据NCBI数据库中BBD29_15285基因的序列设计引物，引物序列如表1所示。利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，T882I‑UP‑1F/T882I‑UP‑1R，T882I‑DN‑2F/T882I‑DN‑2R作为引物对，以谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8的基因组为模板，制备重组片段，PCR程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸15s，循环30次，72℃彻底延伸10min。所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后以T882I‑UP‑1F/T882I‑DN‑2R为引物对，以上下游同源臂为模板，制备重组片段，PCR程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸30s，循环30次，72℃彻底延伸10min。所得重组片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，然后利用XbaI/PstI进行消化，同时将pK18‑mobsacB利用XbaI/PstI进行消化，并用T4 DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/PstI酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段正确。将所得质粒命名为pK18‑BBD29_15285(T882I)。 [0078] D、构建pK18‑BBD29_15285(P373S+A422T+T882I)重组质粒 [0079] 根据NCBI数据库中BBD29_15285基因的序列设计引物，引物序列如表1所示。利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，P373S‑UP‑1F/P373S‑UP‑1R、P373S‑DN‑2F/A422T‑UP‑1R、A422T‑DN‑2F/T882I‑UP‑1R、T882I‑DN‑2F/T882I‑DN‑2R作为引物对，以谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8的基因组为模板，制备重组片段，PCR程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸15s，循环30次，72℃彻底延伸10min。所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后以P373S‑UP‑1F/T882I‑DN‑2R为引物对，以4个单片段为模板，制备融合片段，PCR程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸30s，循环30次，72℃彻底延伸10min。所得融合片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，然后利用XbaI/PstI进行消化，同时将pK18‑mobsacB利用XbaI/PstI进行消化，并用T4 DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/PstI酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段正确。将所得质粒命名为pK18‑BBD29_15285(P373S+A422T+T882I)。 [0080] 实施例2在出发菌株MHZ‑0112‑8中突变引入 [0081] 将pK18‑BBD29_15285(P373S)转入谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以P373S‑UP‑1F/P85，P82/P373S‑DN‑2R引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR程序为：94℃30s，50℃30s，72℃45s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物对分别扩增出1.2kb、1.1kb的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗BHI培养基中培养12‑14h，将菌液稀释100‑1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，将得到的阳性重组子用ID‑F/ID‑R扩增测序，测序正确的菌株命名为MHZ‑0112‑16。 [0082] 将pK18‑BBD29_15285(A422T)转入谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以A422T‑UP‑1F/P85，P82/A422T‑DN‑2R引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR程序为：94℃30s，50℃30s，72℃45s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物对分别扩增出1.2kb、1.1kb的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗BHI培养基中培养12‑14h，将菌液稀释100‑1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，将得到的阳性重组子用ID‑F/ID‑R扩增测序，测序正确的菌株命名为MHZ‑0112‑17。 [0083] 将pK18‑BBD29_15285(T882I)转入谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以T882I‑UP‑1F/P85，P82/T882I‑DN‑2R引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR程序为：94℃30s，50℃30s，72℃45s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物对分别扩增出1.2kb、1.1kb的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗BHI培养基中培养12‑14h，将菌液稀释100‑1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，将得到的阳性重组子用ID‑F/ID‑R扩增测序，测序正确的菌株命名为MHZ‑0112‑18。 [0084] 将pK18‑BBD29_15285(P373S+A422T+T882I)转入谷氨酸棒杆菌MHZ‑0112‑8中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以P373S‑UP‑1F/P85，P82/T882I‑DN‑2R引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR程序为：94℃30s，50℃30s，72℃45s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物对扩增出2.95kb、2.8kb的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗BHI培养基中培养12‑14h，将菌液稀释100‑1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，将得到的阳性重组子用ID‑F/ID‑R扩增测序，测序正确的菌株命名为MHZ‑0112‑19。 [0085] 实施例3突变菌株产谷氨酸摇瓶验证 [0086] 对实施例2中构建的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵，验证其谷氨酸的生产性能，具体如下： [0087] 将冻存于‑80℃甘油管中的菌株接种于斜面培养基中进行活化，于31.5℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于上述种子培养基中，于31.5℃， 220rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养12h，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在31.5℃，220rpm振荡培养16h。在糖被完全消耗之后，测定培养基中积累的L‑谷氨酸的浓度。 [0088] 培养基配方如下： [0089] 斜面培养基：酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2.5g/L，pH 7.0‑7.2。将配制好的培养基于121℃0.1MPa灭菌30min。 [0090] 种子培养基：葡萄糖25g/L，尿素3g/L，K2HPO4·3H2O 2.2g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，玉米浆33mL/L，豆饼水解液22mL/L，pH 7.0‑7.2。将配制好的培养基于121℃0.1MPa灭菌15min。 [0091] 发酵培养基：葡萄糖60g/L，硫酸铵15g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，FeSO4·7H2O 1.0mg/L，MnSO4·5H2O 1mg/L，VB1 200μg/L，生物素300μg/L，大豆水解液0.48g/L，用NaOH调至pH 7.2‑7.5。将配制好的培养基于121℃0.1MPa灭菌15min，然后添加 1.0g热灭菌的碳酸钙。 [0092] 发酵结果如表2所示，以MHZ‑0112‑8为出发菌，对BBD29_15285进行P373S、A422T、T882I点突变改造后，谷氨酸转化率均有提升，特别是组合突变后糖酸转化率由51.8％提高至61.0％，相较出发菌株谷氨酸转化率提高了9.2个百分点。 [0093] 表2突变菌株谷氨酸含量检测 [0094] 菌株 OD600(×100) Glu(g/L) 糖酸转化率％MHZ‑0112‑8 0.413 31.1 51.8 MHZ‑0112‑16 0.398 33.4 55.7 MHZ‑0112‑17 0.405 32.9 54.8 MHZ‑0112‑18 0.412 33.7 56.2 MHZ‑0112‑19 0.391 36.6 61.0 [0095] 实施例4重组质粒pK18‑BBD29_15285(P373S+A422T+T882I)在出发菌株MHZ‑0701中突变引入及摇瓶验证 [0096] A、突变菌株构建 [0097] 将pK18‑BBD29_15285(P373S+A422T+T882I)转入谷氨酸棒杆菌MHZ‑0701中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以P373S‑UP‑1F/P85，P82/T882I‑DN‑2R引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR程序为：94℃30s，50℃30s，72℃45s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物对分别扩增出2.95kb、2.8kb的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗BHI培养基中培养12‑14h，将菌液稀释100‑1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，将得到的阳性重组子用ID‑F/ID‑R扩增测序，测序正确的菌株命名为MHZ‑0703。 [0098] B、突变菌株产脯氨酸摇瓶验证 [0099] 1、培养基 [0100] 种子活化培养基：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2％，pH 7.2。 [0101] 种子培养基：玉米浆2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO3 0.5％，pH 7.2。 [0102] 发酵培养基：玉米浆0.6％，葡萄糖12.0％，硫酸铵3.7％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO3 4％，VH 70μg/L，VB1·‑80μg/L，pH 7.2。 [0103] 2、摇瓶发酵 [0104] (1)种子培养：挑取MHZ‑0701、MHZ‑0703斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养16‑22h。 [0105] (2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养72h。 [0106] (3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L‑脯氨酸含量，结果如表3所示。 [0107] 表3 L‑脯氨酸含量检测 [0108]菌株 MHZ‑0701(出发菌) MHZ‑0703(工程菌) OD562 43.2 40.1 L‑脯氨酸浓度g/L 35.9 43.1 糖酸转化率％ 29.9 35.9 [0109] 可以看出，出发菌株MHZ‑0701的L‑脯氨酸的转化率为29.9％，而工程菌MHZ‑0703的L‑脯氨酸转化率为35.9％。转化率相对提高6个百分点。 [0110] 实施例5重组质粒pK18‑BBD29_15285(P373S+A422T+T882I)在出发菌株MHZ‑0912‑6中突变引入及摇瓶验证 [0111] A、突变菌株构建 [0112] 将pK18‑BBD29_15285(P373S+A422T+T882I)转入谷氨酸棒杆菌MHZ‑0912‑6中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以P373S‑UP‑1F/P85，P82/T882I‑DN‑2R引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR程序为：94℃30s，50℃30s，72℃45s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物对分别扩增出2.95kb、2.8kb的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗BHI培养基中培养12‑14h，将菌液稀释100‑1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，将得到的阳性重组子用ID‑F/ID‑R扩增测序，测序正确的菌株命名为MHZ‑0912‑7。 [0113] B、突变菌株产赖氨酸摇瓶验证 [0114] 1、培养基： [0115] 斜面培养基：酵母粉5.0g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2.5g/L，pH 7.0‑7.2。将配制好的培养基于121℃0.1MPa灭菌30min。 [0116] 种子培养基：葡萄糖25g/L，尿素3.0g/L，K2HPO4·3H2O 2.2g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，玉米浆33mL/L，豆饼水解液22mL/L，pH 7.0‑7.2。将配制好的培养基于121℃0.1MPa灭菌15min。 [0117] 发酵培养基：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO4 25g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 30g/L，NaOH调pH7.0。 [0118] 2、摇瓶发酵 [0119] 将冻存于‑80℃甘油管中的菌株接种于上述斜面培养基中进行活化，于31.5℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于上述种子培养基中，于31.5℃，220rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为12h，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在31.5℃，220rpm振荡培养16h。在葡萄糖被完全消耗之后，通过HPLC方法测定培养基中积累的赖氨酸的浓度。 [0120] 结果如表4所示(OD562是稀释100倍的培养液在562nm的浊度并表示细胞量，Lys(g/L)表示积累的L‑赖氨酸的量。在MHZ‑0912‑6中引入P373S+A422T+T882I突变后，赖氨酸从37.5g/L提高到40.4g/L，转化率从62.5％提高到67.3％，转化率提高了4.8％个百分点。 [0121] 表4突变菌株赖氨酸的含量检测 [0122]菌株 MHZ‑0912‑6(出发菌) MHZ‑0912‑7(工程菌) OD600 39.7 38.6 L‑赖氨酸浓度g/L 37.5 40.4 糖酸转化率％ 62.5 67.3 |
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