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一种利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法
申请号	CN202311839046.8	申请日	2023-12-28	公开(公告)号	CN117757849A	公开(公告)日	2024-03-26
申请人	海南大学;			发明人	董丽丽; 王婉晴; 王宇昊; 单宇涛; 杜心怡; 谢秋兰;
摘要	本发明涉及环境保护及生物质能源技术领域，尤其涉及一种利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法。该方法包括将乙酸钠、产氢培养基、微晶纤维素进行混和，然后加入对数生长期的暗发酵产氢细菌液进行厌氧发酵产氢。本发明解决了现有暗发酵生物制氢技术中产物抑制严重、pH下降过快、底物有机负荷低和氢气回收率低的关键技术问题，尤其是处理可溶性糖类以及纤维素类物质含量高的底物。本发明方法为暗发酵生物制氢反应过程的稳定性和高效产氢调控提供了技术支持，同时为暗发酵生物制氢规模化生产提供了必要的调控措施。
权利要求	1.一种利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法，其特征在于，包括将乙酸钠、产氢培养基、微晶纤维素进行混和，然后加入对数生长期的暗发酵产氢细菌液进行厌氧发酵产氢。 2.根据权利要求1所述的利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法，其特征在于，乙酸钠溶液添加的摩尔浓度为0.05～0.5mol/L。 3.根据权利要求2所述的利用构建缓冲溶液的暗发酵生物制氢方法，其特征在于，所述微晶纤维素的浓度为0.5％～5％TS。 4.根据权利要求1所述的利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法，其特征在于，所述产氢培养基中各组分的浓度：NH4Cl0.8～1.2g/L、NaCl 0.8～1.2g/L、K2HPO4 0.8～ 1.2g/L、KH2PO4 0.8～1.2g/L、半胱氨酸0.5～1.0g/L、MgCl2·6H2O 0.3～0.7g/L、KCl 0.1～0.3g/L、酵母粉1.5～2.5g/L、蛋白胨1.5～2.5g/L、0.1％的刃天青0.5～1.0mL/L、微量金属元素0.5～1.2mL/L、维生素0.5～1.2mL/L，所述产氢培养基pH为6.5～7.3。 5.根据权利要求4所述的利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法，其特征在于，所述微量金属元素中各组分浓度为：FeCl21.3～1.7g/L、ZnCl2 60～80mg/L、H3BO4 5～7mg/L、MnCl2·2H2O 80～120mg/L、CuCl2·2H2O 1.8～2.2mg/L、CoCl2·6H2O 18～20mg/L、NiCl2·6H2O23～25mg/L、Na2MO4·H2O 35～27mg/L、Na2WO4·2H2O 13～17mg/L和Na2SeO4· 5H2O 13～17mg/L；和/或，所述维生素中各组分浓度为：硫辛酸30～70mg/L、生物素10～30mg/L、异烟酸30～40mg/L、维生素B1 3～7mg/L、PABA 40～60mg/L、叶酸10～30mg/L、泛酸钙40～60mg/L、维生素B120.8～1.2mg/L和盐酸吡哆醇80～120mg/L。 6.根据权利要求1所述的利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法，其特征在于，所述暗发酵产氢细菌选自不限于热解糖厌氧芽孢杆菌、热梭菌属、拟杆菌属、肠杆菌属的暗发酵产氢细菌纯菌或混合菌。 7.根据权利要求6所述的利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法，其特征在于，所述暗发酵产氢细菌液采用Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M18；或Thermoanaero bacterium thermosaccharolyticum W16。 8.根据权利要求1‑7任一项所述的利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法，其特征在于，所述厌氧发酵产氢的条件：温度55～60℃，摇床转速为150～170rpm。 9.根据权利要求1‑7任一项所述的利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法，其特征在于，所述暗发酵产氢细菌液的添加体积为产氢培养基的1％～10％。 10.根据权利要求1‑7任一项所述的利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法，其特征在于，加入所述微晶纤维素后还包括：利用高纯氮气吹脱，密封后进行高压蒸汽灭菌；所述高温蒸汽灭菌的条件：121℃条件下处理20～30min。
说明书全文	一种利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法技术领域 [0001] 本发明涉及环境保护及生物质能源技术领域，尤其涉及一种利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法。背景技术 [0002] 能源危机和环境持续退化是当今全球可持续发展面临的两大重要问题。世界能源更替是一个不断降碳和增氢的过程，从柴薪、煤炭、油以及天然气的主要元素构成比例可以发现，脱碳加氢和清洁高效是能源科技进步大趋势。作为可再生的二次能源，氢能被誉为第三次能源变革的重要媒介，是构建多元化能源体系关键一环。暗发酵生物制氢被认为是最有发展潜力的一种方式，然而目前暗发酵生物制氢技术方法，存在着可处理底物浓度、产物抑制强和产氢效率低，尤其是挥发酸积累造成体系内pH在短时间内大幅度下降对产氢细菌的抑制作用，是制约生物制氢工业化生产的关键技术瓶颈。 [0003] 因此，开发出有效的，通用性强、成本低廉的解除抑制或调控的方式方法对推进生物制氢产业化进程至关重要。发明内容 [0004] 为解决上述技术问题，本发明提供一种利用构建缓冲溶液调控暗发酵生物制氢的方法，具体为利用构建乙酸钠—乙酸缓冲溶液提升暗发酵生物制氢发酵过程pH稳定性和产氢效能的方法，本发明利用构建乙酸钠—乙酸缓冲溶液解除微生物暗发酵生物制氢过程中pH快速下降、抑制产生的小分子有机酸的解离而提升生物制氢效率，解决了现有生物制氢产气效率低、过程稳定性差、可处理底物浓度低、产物抑制显著等问题。 [0005] 具体而言，本发明提供的一种提升暗发酵生物制氢pH稳定性和产氢效能的调控方法，包括将乙酸钠、产氢培养基、微晶纤维素进行混和，然后加入对数生长期的暗发酵产氢细菌液进行厌氧发酵产氢。 [0006] 进一步优选，乙酸钠溶液添加的摩尔浓度为0.05～0.5mol/L。 [0007] 进一步优选，所述微晶纤维素的浓度为0.5％～5％TS。 [0008] 本发明中，所述微晶纤维素的浓度为0.5％～5％TS，即每升产氢培养基中含有微晶纤维素5～50g。 [0009] 作为优选，所述产氢培养基中各组分的浓度：NH4Cl 0.8～1.2g/L、NaCl 0.8～1.2g/L、K2HPO4 0.8～1.2g/L、KH2PO4 0.8～1.2g/L、半胱氨酸0.5～1.0g/L、MgCl2·6H2O 0.3～0.7g/L、KCl 0.1～0.3g/L、酵母粉1.5～2.5g/L、蛋白胨1.5～2.5g/L、0.1％的刃天青 0.5～1.0mL/L、微量金属元素0.5～1.2mL/L、维生素0.5～1.2mL/L，所述产氢培养基pH为 6.5～7.3。 [0010] 优选的，所述微量金属元素中各组分浓度为：FeCl2 1.3～1.7g/L、ZnCl2 60～80mg/L、H3BO4 5～7mg/L、MnCl2·2H2O 80～120mg/L、CuCl2·2H2O 1.8～2.2mg/L、CoCl2· 6H2O 18～20mg/L、NiCl2·6H2O 23～25mg/L、Na2MO4·H2O 27～35mg/L、Na2WO4·2H2O 13～ 17mg/L和Na2SeO4·5H2O 13～17mg/L；和/或，所述维生素中各组分浓度为：硫辛酸30～ 70mg/L、生物素10～30mg/L、异烟酸30～40mg/L、维生素B1 3～7mg/L、PABA 40～60mg/L、叶酸10～30mg/L、泛酸钙40～60mg/L、维生素B12 0.8～1.2mg/L和盐酸吡哆醇80～120mg/L。 [0011] 作为优选，所述暗发酵产氢细菌选自热解糖厌氧芽孢杆菌、热梭菌属、拟杆菌属、肠杆菌属的暗发酵产氢细菌纯菌或混合菌，但不限于上述菌株和菌系。 [0012] 本发明中，所述暗发酵产氢细菌液采用Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum M18(Accession no.M59119)(以下简称M18)或Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16(Accession no.EU563362)等。本发明对暗发酵产氢细菌不做限定，所用菌只要是能够利用例如葡萄糖、纤维素或秸秆产氢，或能够产氢的纯菌株、混菌都可以适用本发明提供的方法。 [0013] 本发明所用的M18暗发酵产氢菌液属于纯菌菌液，可以纤维素类生物质直接作为底物，55～60℃是其最佳的生长温度，pH 6.8～7.4。 [0014] 优选的，所述厌氧发酵产氢的条件：温度55～60℃，摇床转速为150～170rpm。 [0015] 进一步优选，所述暗发酵产氢细菌液的添加体积为产氢培养基的1％～10％。 [0016] 进一步优选，加入所述微晶纤维素后还包括：利用高纯氮气吹脱，密封后进行高压蒸汽灭菌；所述高温蒸汽灭菌的条件：115～121℃优选121℃条件下处理20～30min。 [0017] 为了提升暗发酵生物制氢反应的底物有机负荷，本发明的研究中，底物浓度，即微晶纤维素的浓度为5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L和50g/L。M18能够将酶解糖化和产氢同时进行。结果发现，未添加乙酸钠的实验组产气量随着底物浓度增加呈现降低的趋势，出现了严重的产物抑制。然而，添加乙酸钠的调控组氢气产量同乙酸钠的添加量呈指数关系，随着底物浓度的上升，氢气产量呈指数的升高，当微晶纤维素浓度为10g/L时，氢气产量为160.49mL/g，较未添加乙酸钠发酵组产氢效率提升161.17％。当底物浓度提升至30g/L时，添加乙酸钠发酵组产氢效率是57.73mL/g，是相同纤维素底物浓度未添加乙酸钠发酵组氢气产率的2.21倍。继续提升底物浓度时，产氢效率提升不明显。现有文献中这种调节发酵液的pH，都是采用磷酸盐溶液或柠檬酸盐缓冲液控制pH的变化，但是针对于暗发酵生物制氢过程，其主要产生乙酸和丁酸的发酵过程，这样会很大幅度降低缓冲液的缓冲能力。因此本发明通过大量试验发现：利用添加乙酸钠构建缓冲液中对调整发酵液中的pH，可以最大限度地降低有机酸H的解离常数，增加缓冲液对暗发酵生物制氢反应液的缓冲能力，从而进一步提高产氢量和底物的转化效率。现有文献中还未见通过外加调节剂与发酵液中生成的有机酸进行配对形成缓冲溶液来调整发酵液pH，以此最大限度提高暗发酵生物制氢效果。本发明为暗发酵生物制氢反应过程的稳定性和高效产氢调控提供了新的调控策略。同时为暗发酵生物制氢规模化生产提供了必要的技术支持。 [0018] 本发明的有益效果至少在于：采用本发明的方法，能够增加底物有机负荷和氢气产率。本发明的方法简单，易操作，大幅度提升底物的有机负荷和氢气产率。本发明的方法尤其适合乙酸型、乙酸丁酸混合发酵产氢过程。采用本发明方法提高发酵底物的有机负荷，为推进暗发酵生物制氢，尤其是利用纤维素进行发酵产氢提供技术理论依据和新调控策略。具体实施方式 [0019] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0020] 本发明实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用装置、仪器、试剂等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。本发明中所用的原料均可在国内产品市场方便买到。 [0021] 本发明实施例中，所使用的能够利用秸秆直接发酵产氢菌热解糖厌氧芽孢杆菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M18(Accession no.M59119)是由曹广丽博士于2009年在哈尔滨郊区的腐烂木根作为菌源筛选分离出来的纯菌(已公开在《Single‑stepbioconversion of lignocellulose to hydrogen using novel moderately thermophilic bacteria》)。葡萄糖木糖发酵产氢菌热解糖厌氧芽孢杆菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16(Accession no.EU563362)是曹广丽于2009年在鞍山唐岗子温泉底泥中筛选分离得到(已公开在《Acid hydrolysis of corn stover for biohydrogen production using Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16》)。本发明所用的菌是主要能够利用例如葡萄糖、纤维素或秸秆产氢，或能够产氢的纯菌株、混菌都可以适用本发明方法。 [0022] 实验例1 [0023] 本发明提供的一种利用构建特定缓冲溶液提升暗发酵生物制氢pH值稳定性和产氢性能的调控方法，按下述步骤进行：将一定摩尔数的CH3COONa与产氢培养基在厌氧瓶中混匀，再加入微晶纤维素混匀，然后通入99.99％的氮气创造无氧环境。密封后在高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌。之后加入对数期后期的热解糖厌氧芽孢杆菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M18(Accession no.M59119)菌液混合均匀，放入恒温水浴摇床中进行产氢发酵。 [0024] 具体的，一定摩尔数的CH3COONa摩尔数为0.05mol/L、0.075mol/L、0.1mol/L、0.125mol/L、0.15mol/L、0.175mol/L、0.2mol/L、0.225mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L、 0.35mol/L和0.4mol/L，添加的微晶纤维素分别为5g/L(0.5％TS)、10g/L、20g/L、30g/L、 40g/L和50g/L(5％TS)。 [0025] 具体的，所述产氢培养基中各组分的浓度为：NH4Cl 1g/L、NaCl 1g/L、K2HPO4 1g/L、KH2PO4 1g/L、半胱氨酸0.5g/L、MgCl2·6H2O 0.5g/L、KCl 0.2g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨2g/L、0.1％的刃天青1mL/L、微量金属元素1mL/L、维生素1mL/L、培养基pH 6.8～7.0。 [0026] 具体的，添加的微量金属元素中各组分浓度为：FeCl2 1.5g/L、ZnCl2 70mg/L、H3BO4 6mg/L、MnCl2·2H2O 100mg/L、CuCl2·2H2O 2mg/L、CoCl2·6H2O 19mg/L、NiCl2·6H2O 24mg/L、Na2MO4·H2O 36mg/L、Na2WO4·2H2O 15mg/L和Na2SeO4·5H2O 15mg/L。 [0027] 具体的，添加的维生素中各组分浓度为：硫辛酸50mg/L、Biotin20mg/L、Nicotinic acid 35mg/L、Thiamine hydrochloride 5mg/L、PABA50mg/L、Folic Acid 20mg/L、泛酸钙50mg/L、维生素B12 1mg/L和盐酸吡哆醇100mg/L。 [0028] 具体的，所用的热解糖厌氧芽孢杆菌Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum M18(Accession no.M59119)暗发酵生物制氢细菌，是一株严格厌氧革兰氏阴性菌，它的繁殖方式通过形成芽孢，芽孢成熟后脱落形成新的菌，其可以纤维素类生物质直接作为底物，55～60℃是其最佳的生长温度，pH 6.8～7.4。 [0029] 具体的，利用高温蒸汽灭菌锅灭菌条件为：在121℃条件下处理25min，得到无氧无菌培养液。 [0030] 具体的，在已经采用紫外消毒灭菌25min以上的无菌操台上接种培养基体积10％处在对数生长期的产氢菌M18，完成接种后将厌氧反应瓶放置在设定了60℃的恒温培养振荡器内进行厌氧发酵产氢试验。 [0031] 具体的，恒温培养振荡器的转速设置为170rpm。 [0032] 表1实施例1‑14和对比例1‑6测试结果 [0033] [0034] [0035] 结果表明，氢气产量同乙酸钠的添加量呈指数关系，随着底物浓度的上升，氢气产量呈指数的升高，当微晶纤维素浓度为10g/L时，氢气产率为243.03mL/g，较未添加乙酸钠发酵组(对比例2)产氢效率提升1.26倍。当底物浓度提升至30g/L时，添加乙酸钠发酵组产氢效率是221mL/g，是相同纤维素底物浓度未添加乙酸钠发酵组氢气产率的1.06倍。继续提升底物浓度时，产氢量提升不明显，发酵末端pH值结果同样表明添加乙酸钠的添加有效的缓冲了发酵过程中pH的下降进度和进程，添加乙酸钠的发酵组末端pH值均在5.3左右，而未添加乙酸钠发酵组则低于4.8。 [0036] 实验例2 [0037] 采用同实施例1的方法，将一定摩尔数的CH3COONa与产氢培养基在厌氧瓶中混匀，再加入葡萄糖混匀，然后通入99.99％的氮气创造无氧环境。密封后在高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌。区别为之后加入对数期后期的热解糖厌氧芽孢杆菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16(Accession no.EU563362)菌液混合均匀，放入恒温水浴摇床中进行产氢发酵。结果表明，当葡萄糖浓度为30g/L时，氢气产量为238.46mL/g，较未添加乙酸钠发酵组产氢效率提升近45.5％。发酵末端pH值结果同样表明添加乙酸钠的添加有效的缓冲了发酵过程中pH的下降进度和进程，添加乙酸钠的发酵组末端pH值均在5.3左右，而未添加乙酸钠发酵组则低于4.3。 [0038] 对比例7 [0039] 相对于实施例5，对比例7的区别为采用1N的氢氧化钠调控发酵过程中的pH，结果表明，当底物浓度提升至30g/L时，氢氧化钠调节发酵组产氢效率是146.89mL/g，相较于未调节组产氢效率提升37％。然而该结果相较于相同纤维素底物浓度添加乙酸钠发酵组氢气产率低73.33％。由此可以说明构建缓冲溶液的调控方式对于提升产氢发酵效率更为有效。 [0040] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

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