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一种农作物秸秆生产中链脂肪酸的方法
申请号	CN202311688829.0	申请日	2023-12-08	公开(公告)号	CN117701644A	公开(公告)日	2024-03-15
申请人	中国农业大学;			发明人	肖卫华; 贾惜文; 宗剑飞; 韩鲁佳; 张慧; 梁雪岩; 赵宗格; 刘东;
摘要	本发明涉及一种农作物秸秆生产中链脂肪酸的方法，所述方法首先利用秸秆进行同步糖化共发酵得到电子供体乙醇；进而利用巴氏醋杆菌将乙醇部分氧化为电子受体乙酸，通过控制发酵时间调控合适的乙醇/乙酸摩尔比；固液分离后，液体用于碳链延长，固体残渣通过热解制备生物炭，并将所制生物炭用于碳链延长过程的强化。最终添加秸秆发酵残渣热解炭得到己酸浓度5.74 g/L，是不添加的2.3倍。该方法通过两步发酵实现乙醇和乙酸的原位生产为碳链延长提供电子供体和电子受体，无需外源添加；秸秆发酵固体残渣制备生物炭有效提高己酸产量；实现了农作物秸秆全组分高效综合利用，为农业废弃物生物炼制路径提供经济可行的方法，具备产业应用价值。
权利要求	1.一种农作物秸秆生产中链脂肪酸的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）秸秆预处理：对秸秆原料进行超微粉碎，获得预处理原料；（2）同步糖化共发酵：在反应容器内加入步骤（1）预处理秸秆原料、纤维素酶、蛋白胨、酵母提取物、酿酒酵母细胞和水进行同步糖化共发酵；（3）乙醇部分氧化：向步骤（2）反应容器中接种巴氏醋杆菌进行二次发酵；（4）步骤（3）结束后进行固液分离，液体用于碳链延长，固体干燥后备用；（5）秸秆及发酵残渣热解炭制备：步骤（4）中干燥后的固体利用管式炉通过热解制备生物炭；（6）碳链延长：步骤（4）得到的液体部分稀释后加入含酵母膏、MgSO4•7H2O、K2HPO4和(NH4)2SO4的营养物质，调节pH后接种科氏梭菌并加入炭材料进行碳链延长。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中所述秸秆原料为玉米秸秆、棉花秸秆、小麦秸秆或水稻秸秆中的至少一种。 3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，控制固体含量为20%，纤维素酶添加量为15FPU/g，蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L，同步糖化共发酵反应温度为35 °C，反应时间为72 h。 4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中反应温度为30 °C，反应时间为0 48 h，当乙醇/乙酸=1：1（摩尔比）时停止反应。 ~ 5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中固液分离中离心参数为转速 6500 rpm，时间10 min。 6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（5）热解温度为500‑700 °C，热解时间为60 120 min。 ~ 7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（6）中将液体稀释到碳摩尔浓度为 250‑350 mM，营养物质添加量如下：18‑22g/L酵母膏、0.2‑0.6g/L MgSO4•7H2O、0.6‑1.0g/L K2HPO4和0.8‑1.2g/L (NH4)2SO4，初始pH调节为6.0~7.5。 8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤（6）中将液体稀释到碳摩尔浓度为 300 mM，营养物质添加量如下：20 g/L酵母膏、0.4 g/L MgSO4•7H2O、0.8 g/L K2HPO4和1.0 g/L (NH4)2SO4，初始pH调节为6.5~7.0。 9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（6）中所用炭材料为粒状活性炭、粉末活性炭、发酵残渣炭和秸秆炭中的一种。 10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，步骤（6）碳链延长得到丁酸和/或己酸。
说明书全文	一种农作物秸秆生产中链脂肪酸的方法技术领域 [0001] 本发明涉及农业废弃物资源化利用领域，具体涉及一种农作物秸秆生产中链脂肪酸的方法。背景技术 [0002] 木质纤维素类有机废弃物作为一种可再生资源，在能源和化工利用方面具有得天独厚的优势。生物转化是其利用的主要途径，但以沼气、纤维素乙醇为代表的传统发酵技术始终存在成本高、产品附加值低等共性问题。因此，仍需探索生产具有高附加值产品转化路径。 [0003] 近年来，随着合成生物学和生物技术的快速发展，一种通过碳链延长合成中链脂肪酸的技术成为木质纤维原料高值化利用的研究热点。中链脂肪酸是指碳原子数在6～12的直链羧酸，包括己酸、庚酸、癸酸、壬酸、癸酸、十一酸和十二酸，主要用于有机合成、香料、医药、润滑剂、增稠剂和生物燃料等领域。通常，乙醇和乙酸是碳链延长常用的电子供体和电子受体，而乙醇和乙酸均可从木质纤维原料获得。使用木质纤维作为中链脂肪酸的底物来源优势如下(1)可再生生物质原料保证大规模生产中链脂肪酸底物的持续供应；(2)通过多环节设计，可从木质纤维原料中同时获得电子供体和电子受体，确保碳链延长过程高效稳定地进行。与工业乙酸和乙醇相比，MCFAs(3.0～5.0万元/吨)市售价值更高。因此，将纤维素乙醇转化为附加值更高的中链脂肪酸，对木质纤维原料尤其是秸秆的大规模资源化利用具有重要意义。 [0004] CN 115976120 A公开了一种豆渣两段式厌氧发酵产中链脂肪酸的方法，CN 112961884 A公开了一种种植废弃物合成中链脂肪酸的方法，CN 111394401 A公开了一种木质纤维原料厌氧发酵制备中链脂肪酸的方法。总结发现，中链脂肪酸的合成方法大多需要额外添加电子供体乙醇/乳酸或电子受体乙酸，而使用商品乙醇/乙酸并不具有经济性，同时外加底物的过程也会影响碳链延长的稳定性。此外，木质纤维原料发酵后的固体剩余物没有得到有效利用。 [0005] 外源介质的添加对于碳链延长过程具有促进效果，例如铁、苯酚、炭等。CN 113388648 A公开了一种四氧化三铁促进厌氧发酵产中链脂肪酸以及微生物种间电子传递效率的方法，CN 111909970A公开了一种外源介质强化厌氧微生物发酵生产中链脂肪酸的方法。而利用秸秆发酵剩余固体强化中链脂肪酸合成的工艺未见报道。发明内容 [0006] 鉴于上述，本发明在于提供一种农作物秸秆生产中链脂肪酸的方法，可以克服现有技术的缺陷。 [0007] 本发明的一种农作物秸秆生产中链脂肪酸的方法，包括如下步骤： [0008] (1)秸秆预处理：对秸秆原料进行超微粉碎，获得预处理原料； [0009] (2)同步糖化共发酵：在反应容器内加入步骤(1)预处理秸秆原料、纤维素酶、蛋白胨、酵母提取物、酿酒酵母细胞和水进行同步糖化共发酵，控制固体含量为20％； [0010] (3)乙醇部分氧化：向步骤(2)反应容器中接种巴氏醋杆菌进行二次发酵； [0011] (4)步骤(3)结束后进行固液分离，液体用于碳链延长，固体干燥后备用； [0012] (5)秸秆及发酵残渣热解炭制备：步骤(4)中干燥后的固体利用管式炉通过热解制备生物炭； [0013] (6)碳链延长：步骤(4)得到的液体部分进行适当稀释后加入营养物质(酵母膏、MgSO4·7H2O、K2HPO4和(NH4)2SO4)，调节pH后接种科氏梭菌并加入炭材料进行碳链延长，得到丁酸和己酸。 [0014] 具体情况下，上述步骤(1)中所述秸秆原料为玉米秸秆、棉花秸秆、小麦秸秆或水稻秸秆中的至少一种； [0015] 优选情况下，上述步骤(2)中纤维素酶添加量为15FPU/g，蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L，同步糖化共发酵反应温度为35℃，反应时间为72h。 [0016] 优选情况下，上述步骤(3)中反应温度为30℃，反应时间为0～48h，优选发酵时间24h，即乙醇/乙酸＝1：1(摩尔比)时停止反应。 [0017] 优选情况下，上述步骤(4)中固液分离中离心参数为转速6500rpm，时间10min。 [0018] 优选情况下，上述步骤(5)热解温度为500‑700℃，热解时间为60～120min。 [0019] 优选情况下，上述步骤(6)中将液体稀释到碳摩尔浓度为300mM，营养物质添加量如下：20g/L酵母膏、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.8g/L K2HPO4和1.0g/L(NH4)2SO4，初始pH调节为6.5～7.0，所用炭材料为粒状活性炭、粉末活性炭、发酵残渣炭和秸秆炭中的一种。 [0020] 在一个实施方式中，在步骤(6)中通过添加粒状活性炭强化碳链延长过程，具体步骤为向发酵瓶中添加15g/L的粒状活性炭进行碳链延长过程的强化。 [0021] 在另一个实施方式中，在步骤(6)中通过添加粉末活性炭强化碳链延长过程，具体步骤为向发酵瓶中添加15g/L的粉末活性炭进行碳链延长过程的强化。 [0022] 还一个实施方式中，在步骤(6)中通过添加发酵残渣热解炭强化碳链延长过程，具体步骤为向发酵瓶中添加15g/L的发酵残渣热解炭进行碳链延长过程的强化。 [0023] 再一个实施方式中，在步骤(6)中通过添加秸秆热解炭强化碳链延长过程，具体步骤为向发酵瓶中添加15g/L的秸秆热解炭进行碳链延长过程的强化。 [0024] 本发明优点在于：(1)利用农作物秸秆通过两步发酵一锅获得碳链延长所需电子，无需外源添加，提高生产效率的同时降低成本，提高工业生产可行性，解决现有工艺额外添加乙醇/乙酸导致发酵体系不稳定和经济性等问题。(2)利用秸秆发酵剩余固体残渣制备生物炭，强化碳链延长，显著提升己酸产量的同时解决发酵剩余固体未得到充分利用的问题；(3)建立秸秆资源化综合利用新模式，充分发挥秸秆全组分利用优势，工艺操作条件简单，原料成本低廉，通过对农业剩余物的高值化利用促进农业产业增值。附图说明 [0025] 结合下面附图的详细说明，本发明的特征和优势将会更明显： [0026] 图1所示为本发明方法的工艺流程图。 [0027] 图2所示为巴氏醋杆菌发酵过程乙醇和乙酸浓度变化曲线。 [0028] 图3为实施例1‑5不添加炭材料和添加不同炭材料的己酸浓度结果。具体实施方式 [0029] 为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体的实施例对本发明进行详细说明。 [0030] 本发明实施例中使用的秸秆原料为玉米秸秆，其中纤维素含量为32.6％，半纤维素含量为16.5％，木质素含量为16.6％，用粉碎机粉碎至颗粒大小为1mm。采用纳米冲击磨对粗粉的秸秆进行超微粉处理，球料体积比为2：1，超微粉碎时间为60min。 [0031] 纤维素酶(NovozymesCellicCTec3)，其中纤维素酶CTec3的酶活测定方法依据NREL的测定方法，测得酶活为240FPU/mL。 [0032] 所用的菌株如下： [0033] (1)酿酒酵母WXY74，由首都师范大学生命科学学院赠送(C Zhang,et al.,In‑depth two‑stage transcriptional reprogramming and evolutionary engineering ofSaccharomyces cerevisiae for efficient bioethanol production from xylose with acetate《.J.Agric.Food Chem.》.2019,第67卷,12002‑12012)。该菌株是通过引入毕赤酵母中木糖代谢相关基因实现了酿酒酵母对木糖的利用，经过四年实验室适应性进化，能够同时利用葡萄糖和木糖共发酵产乙醇。种子培养基为Yeast extract‑Peptone‑Dextrose medium(YPD液体培养基)，包括20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物。 [0034] (2)巴氏醋杆菌BNCC 335801，购自北京北纳创联生物技术研究院。培养基组成为10g/L酵母提取物、10g/L葡萄糖和0.5％无水乙醇，无水乙醇在培养基灭菌后冷却至50～60℃加入。 [0035] (3)科氏梭菌CICC 10388，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。培养基组成为10g/L酵母膏、5g/L乙酸钠、0.4g/L K2HPO4、0.5g/L(NH4)2SO4、0.2g/L MgSO4·7H2O和2％无水乙醇，无水乙醇在培养基灭菌后冷却至50～60℃加入。 [0036] 实施例1： [0037] 同步糖化共发酵：向锥形瓶中加入4.5g超微粉碎60min预处理玉米秸秆、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，16g水，纤维素酶添加量为15FPU/g秸秆，接种酵母细胞(初始OD600＝2)，设定反应温度为35℃，转速为200rpm，反应72h。乙醇氧化：向同步糖化共发酵液中接种 10％巴氏醋杆菌，设定反应温度为30℃，转速为200rpm，二次发酵0～48h；固液分离：二次发酵结束后进行固液分离，离心参数为转速6500rpm，时间10min，固体用于生物炭的制备，液体用于碳链延长。将固液分离后获得的液体加入到血清瓶中，同时加入20g/L酵母膏、0.4g/LMgSO4·7H2O、0.8g/L K2HPO4和1.0g/L(NH4)2SO4，初始pH调节为6.5～7.0，氮气排空10min，灭菌后冷却至室温接种10％科氏梭菌，发酵30d，经气相色谱检测后分析计算，丁酸浓度为 1.80g/L，己酸浓度为2.47g/L。 [0038] 实施例2： [0039] 同步糖化共发酵：向锥形瓶中加入4.5g超微粉碎60min预处理玉米秸秆、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，16g水，纤维素酶添加量为15FPU/g秸秆，接种酵母细胞(初始OD600＝2)，设定反应温度为35℃，转速为200rpm，反应72h。乙醇氧化：向同步糖化共发酵液中接种 10％巴氏醋杆菌，设定反应温度为30℃，转速为200rpm，二次发酵0～48h；固液分离：二次发酵结束后进行固液分离，离心参数为转速6500rpm，时间10min，固体用于生物炭的制备，液体用于碳链延长。将固液分离后获得的液体加入到血清瓶中，同时加入20g/L酵母膏、0.4g/LMgSO4·7H2O、0.8g/L K2HPO4和1.0g/L(NH4)2SO4，15g/L粒状活性炭(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，初始pH调节为6.5～7.0,氮气排空10min，灭菌后冷却至室温接种10％科氏梭菌，发酵30d，经气相色谱检测后分析计算，丁酸浓度为1.88g/L，己酸浓度为3.85g/L。 [0040] 实施例3： [0041] 同步糖化共发酵：向锥形瓶中加入4.5g超微粉碎60min预处理玉米秸秆、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，16g水，纤维素酶添加量为15FPU/g秸秆，接种酵母细胞(初始OD600＝2)，设定反应温度为35℃，转速为200rpm，反应72h。乙醇氧化：向同步糖化共发酵液中接种 10％巴氏醋杆菌，设定反应温度为30℃，转速为200rpm，二次发酵0～48h；固液分离：二次发酵结束后进行固液分离，离心参数为转速6500rpm，时间10min，固体用于生物炭的制备，液体用于碳链延长。将固液分离后获得的液体加入到血清瓶中，同时加入20g/L酵母膏、0.4g/LMgSO4·7H2O、0.8g/L K2HPO4和1.0g/L(NH4)2SO4，15g/L粉末活性炭(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，初始pH调节为6.5～7.0,氮气排空10min，灭菌后冷却至室温接种10％科氏梭菌，发酵30d，经气相色谱检测后分析计算，丁酸浓度为1.97g/L，己酸浓度为5.26g/L。 [0042] 实施例4： [0043] 同步糖化共发酵：向锥形瓶中加入4.5g超微粉碎60min预处理玉米秸秆、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，16g水，纤维素酶添加量为15FPU/g秸秆，接种酵母细胞(初始OD600＝2)，设定反应温度为35℃，转速为200rpm，反应72h。乙醇氧化：向同步糖化共发酵液中接种 10％巴氏醋杆菌，设定反应温度为30℃，转速为200rpm，二次发酵0～48h；固液分离：二次发酵结束后进行固液分离，离心参数为转速6500rpm，时间10min，固体用于生物炭的制备，液体用于碳链延长。将固液分离后获得的液体加入到血清瓶中，同时加入20g/L酵母膏、0.4g/LMgSO4·7H2O、0.8g/L K2HPO4和1.0g/L(NH4)2SO4，15g/L秸秆发酵残渣热解炭，初始pH调节为6.5～7.0,氮气排空10min，灭菌后冷却至室温接种10％科氏梭菌，发酵30d，经气相色谱检测后分析计算，丁酸浓度为1.98g/L，己酸浓度为5.74g/L。 [0044] 其中，秸秆发酵残渣热解炭的制备方法为：将干燥后的固体残渣置于管式炉中，设置热解温度为500‑700℃，热解时间为60～120min。冷却至室温后取出备用。 [0045] 实施例5： [0046] 同步糖化共发酵：向锥形瓶中加入4.5g超微粉碎60min预处理玉米秸秆、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，16g水，纤维素酶添加量为15FPU/g秸秆，接种酵母细胞(初始OD600＝2)，设定反应温度为35℃，转速为200rpm，反应72h。乙醇氧化：向同步糖化共发酵液中接种 10％巴氏醋杆菌，设定反应温度为30℃，转速为200rpm，二次发酵0～48h；固液分离：二次发酵结束后进行固液分离，离心参数为转速6500rpm，时间10min，固体用于生物炭的制备，液体用于碳链延长。将固液分离后获得的液体加入到血清瓶中，同时加入20g/L酵母膏、0.4g/LMgSO4·7H2O、0.8g/L K2HPO4和1.0g/L(NH4)2SO4，15g/L秸秆热解炭，初始pH调节为6.5～ 7.0,氮气排空10min，灭菌后冷却至室温接种10％科氏梭菌，发酵30d，经气相色谱检测后分析计算，丁酸浓度为1.86g/L，己酸浓度为5.88g/L。 [0047] 其中，秸秆热解炭的制备方法为：将干燥后的球磨秸秆置于管式炉中，设置热解温度为500‑700℃，热解时间为60～120min。冷却至室温后取出备用。 [0048] 图2所示为巴氏醋杆菌发酵过程乙醇和乙酸浓度变化曲线。由图2可知随着发酵时间的延长乙醇逐渐被氧化为乙酸，可通过控制发酵时间来调控乙醇/乙酸(摩尔比)，经计算发现发酵时间为24h时，乙醇/乙酸(摩尔比)＝1：1。 [0049] 图3为实施例1‑5不添加炭材料和添加不同炭材料的己酸浓度结果。脂肪酸(丁酸和己酸)的浓度通过气相色谱进行测定，分析条件：氮气作为载气，30m×0.25mm×0.25mm的DB‑WAX作为检测柱，分流比35：1；检测器为氢火焰离子检测器，气化室温度280℃，FID温度280℃；采取程序升温：柱箱起始温度60℃，保持2min；然后，以20℃/min，升到140℃，再然后，以8℃/min升温至150℃，保持1.5min，再以120℃/min，升温到200℃，保持1.25min，最后，以120℃/min升温至240℃，运行3min。每次进样量为1.0μL。由图3可知，与对照组(不添加炭材料)相比，添加不同炭材料均可提高己酸浓度，由于炭材料本身的多孔性和表面官能团可以吸附一部分己酸从而减轻产物抑制对微生物生长的影响。其中秸秆发酵残渣热解炭组和秸秆热解炭组己酸浓度最高为5.74～5.88g/L，显著高于对照组、粒状活性炭组。此外，炭材料对于碳链延长的强化机制主要分以下为几个方面：(1)炭材料可以定殖碳链延长微生物，在发酵过程中对微生物起到一定的保护作用；(2)炭材料吸附己酸从而减轻产物抑制；(3)炭材料表面具有氧化还原官能团和内部π电子的作用起到电子传递作用，促进微生物生长代谢和碳链延长过程。

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