一种通过发酵制备银杏提取物和莽草酸的方法 |
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| 申请号 | CN202311211226.1 | 申请日 | 2023-09-18 | 公开(公告)号 | CN117604041A | 公开(公告)日 | 2024-02-27 |
| 申请人 | 成都大学; | 发明人 | 何正有; 肖文艳; 王镜雅; 陈智杨; 姚瑞娇; 蒋文艺; 牛志渝; 蒋用; 李佳; 毕建军; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于天然药物制药工程技术领域，具体涉及通过 发酵 制备 银 杏提取物和莽 草酸 的方法，包括：S1、将银杏叶、枝 破碎 ；S2、将原料与 碳 源混合，或将原料经回流提取有用成分后与碳源混合；之后调节发酵浓度、加热灭菌，加入酒曲或酿酒 酵母 进行厌 氧 发酵，之后回流提取得到醇提液；S3、去除醇提液中的 乙醇 ，之后调节pH为弱 碱 性，使用大孔 吸附 树脂 柱，依次用碱溶液、20％浓度乙醇和70％浓度乙醇进行洗脱，分段收集洗脱液；S4、将70％浓度乙醇洗脱液去除乙醇，干燥得到银杏提取物；S5、将碱洗脱液加入 活性炭 ，调节pH至酸性、过滤后得到的滤液浓缩、丙 酮 结晶得莽草酸提取物。本发明提高了莽草酸、银杏提取物得率和纯度、降低了有毒物质含量。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种通过发酵制备银杏提取物和莽草酸的方法，其特征在于，由以下步骤组成： |
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| 说明书全文 | 一种通过发酵制备银杏提取物和莽草酸的方法技术领域[0001] 本发明属于中药与天然药物制药工程技术领域，具体涉及一种通过发酵制备银杏提取物和莽草酸的方法。 背景技术[0002] 我国银杏资源丰富，占全球银杏资源总量的85％以上，但对其开发利用率还不到5％，因此还有极大的产业化开发前景。银杏中可药食用开发的部位主要有银杏叶、树枝和果实，其中银杏叶和果实是明确可以利用的药用或食用部位。银杏资源中银杏叶的用量最大，已经大量应用于制药与保健品行业；银杏的果实又叫白果，在我国属药食同源中药材，可加工成食品；而银杏的树枝被大量丢弃，基本上没有被开发利用。现代研究表明，银杏的活性物质在不同部位的含量虽然相差较大，但都具有一定的开发利用价值。因此，开展银杏不同部位精深加工技术的研究，提高银杏资源的综合利用效率，对综合利用我国的银杏资源，助力生物医药产业抢占国际高端市场，都具有深远的战略意义。 [0003] 近年来，研究人员发现银杏中含有丰富的有机酸，其中包括占干叶总重约4％左右的莽草酸。工业上，莽草酸主要来源于化学合成、微生物发酵和植物提取，其中，化学合成法对环境污染大，而微生物发酵法采用转基因技术，技术尚不成熟，产率不稳定。目前，从植物八角茴香中提取依然是该原料的主要工业来源，但也存在生产成本高等问题。莽草酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗凝血等多种药理活性，同时也是国际上合成多个抗病毒、抗癌药物的起始原料，如：流感病毒药物奥司他韦、磷酸奥司他韦(商品名为“达菲”)等。另外，我国工业上采用树脂吸附法制备银杏叶提取物，其中，莽草酸在水洗阶段就被洗脱下来，通常被当成废弃物进行排放处理。目前，虽然从银杏叶发现了大量的莽草酸，但能配套制备莽草酸的生产企业依然不多，分析其原因，主要是水洗液中成分极其复杂，含有大量的叶绿素、油脂、糖类、蛋白和矿物质等成分，进一步纯化的技术难度大，生产成本高。已报道的从银杏叶中提取莽草酸的方法，主要为溶剂萃取法、吸附剂柱层析法(填料为活性炭、硅胶等)和阴离子交换树脂法，以上方法均存在投入大、成本高、工艺复杂的不足。因此，用微生物先将以上废水进行生物转化，提前消耗其中的糖、蛋白和叶绿素，能有效地提高莽草酸的提取效率、降低生产成本。 [0004] 专利CN109053419A公开了一种莽草酸的提取方法，所述的莽草酸提取于如八角、雪松、银杏叶、马尾松针、枫香树叶、柠檬桉树叶等天然物质中，将原料粉碎后加水进行提取，然后接种甜酒曲进行发酵，利用根霉和毛霉将原料分解成葡萄糖，然后酵母利用糖发酵生成乙醇，最后加入β‑环糊精溶液与发酵产物酒精一起进行二次提取，经过脱色过滤结晶后即可得到莽草酸。本发明提取莽草酸的工艺简单，原料利用率高，具有很好的经济效益。 [0005] 专利CN109593034A公开了一种从银杏叶废液中制备莽草酸的方法。该方法先是对银杏叶层析废水进行酶解，过有机膜后，再上阴离子树脂柱，进行分离纯化。该方法通过添加果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶或淀粉酶中的一种或者多种，将银杏叶层析废水中的果胶、纤维素、木瓜蛋白和淀粉分解，但是银杏叶层析废水中的大分子物质远不止果胶、纤维素、木瓜蛋白和淀粉这四大类物质，层析废水中的其他大分子物质并不参与酶解反应，酶解反应不彻底，后续需要再用截留8000分子量和截留800分子量的有机膜进行截留。 [0006] 专利CN113480420A公开了一种将银杏叶提取物层析废水中有机酸盐转化成有机酸的方法。该方法以银杏叶提取物生产过程中产生的层析废水为原料，加入米根霉进行有氧发酵产酸，发酵结束后，过陶瓷膜，收集滤液，滤液浓缩至稠膏，经混合溶剂萃取、浓缩、萃取除杂、浓缩、结晶、干燥等步骤，制备得到含量≥99％的莽草酸。利用米根霉发酵产酸的机理，分解利用层析废水中的总糖及总蛋白等大分子物质，产生乳酸等小分子有机酸及乙醇等其他代谢产物，降低了层析废水的pH值，同时使得层析废水中的有机酸盐部分转化成有机酸，其中莽草酸盐转化成莽草酸的转化率达到100％。 [0007] 文献报道，银杏枝叶中含有银杏酸类毒性成分，需要通过一定的技术手段进行破坏或脱除。银杏酸主要属烷基酚酸类，占枝叶总重的0.5～2％、占白果总重的0.03％左右；具体由银杏酸、白果酚和白果二酚等组成，其中与不良反应直接有关的为银杏酸。而银杏酸主要有白果酸(Ginkgolic acid)、氢化白果酸(Hydroginkgolic acid)、氢化白果亚酸(Hydroginkgolinic acid)和白果新酸(Ginkgoneolic acid)，分子结构上烃基的双链越多，越容易致敏。药理上，银杏酸具有潜在的致敏和致突变作用，还有强烈的细胞毒性，可引起严重的过敏反应、基因突变、神经损伤，导致恶心和胃灼热、过敏性休克、剥脱性皮炎、过敏性紫癜、消化道黏膜过敏、痉挛和神经麻痹等不良反应。因此银杏相关制剂需要严格控制这类有机酸的含量，通常在银杏叶提取物中《( 中华人民共和国药典2020年片一部》)银杏酸不得高于5ppm。工业上脱除银杏酸的方法主要为溶剂萃取法、泡沫分离法、碱水浸泡法和超声辅助萃取法等，而生物转化法是近年来新发展起来的一类新型环境友好型预处理方法。 总之，有必要将银杏酸尽可能地破坏或脱除，使其含量越低越好，这样才能更好地发挥其功效性作用，避免安全性事件的发生。 [0008] 专利CN104739898A公开了一种去除银杏提取物中银杏酸的方法。该方法先检测银杏提取物中银杏酸的含量，然后将银杏提取物加水，充分搅拌使溶解，加碱性物质调pH值为7～10，再加入表面活性剂，混合均匀后，所得原液加入泡沫分离器中，从泡沫分离器底部连续鼓入空气，形成泡沫，收集泡沫分离器顶端排出的泡沫直至无泡沫产生，所得泡沫液即为含银杏酸的溶液，泡沫分离器内剩余的无泡沫溶液即为去除银杏酸的溶液，去除银杏酸的溶液浓缩、烘干，即得到去除银杏酸的银杏提取物，表面活性剂为多元醇表面活性剂。 [0009] 专利CN109077277A公开了一种基于益生菌发酵降低白果汁中银杏酸含量的方法，是将白果与水混合打浆得到浆液，所述浆液中加入α淀粉酶和糖化酶进行酶解，得到白果汁，再将所述白果汁灭菌后，接入益生菌进行发酵。通过上述方式，白果汁通过益生菌发酵后，其总银杏酸含量的降解率超过了70％，脱毒效果显著，加强了其使用安全性，白果汁的风味及营养品质得到了提升，同时还被赋予了一定的保健功效。本专利采用的益生菌为嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌或干酪乳杆菌。 [0010] CN106036886A提出了一种银杏酵素及其制备方法，包括以下原料制成：银杏果35～50wt％、海洋鱼皮胶原肽粉4～6wt％、桑葚10～20wt％、茯苓10～15wt％、陈皮5～10wt％、山楂5～10wt％与调配剂2～6wt％。制备方法为：将银杏果进行粉碎，然后用果胶酶进行酶解处理，得到银杏果酶解液；然后，将海洋鱼皮胶原肽粉、茯苓、陈皮、山楂以及步骤 2)得到的银杏果酶解液先后进行乳酸发酵与酵母发酵，将得到的发酵液均质，浓缩，离心，过滤，在滤液中添加调配剂，再进行过滤、灭菌即可。该酵素致敏成分银杏酸含量低于0.5μg/L，4‑甲氧基吡哆醇低于0.02μg/L，增强机体免疫力。 [0011] 传统酒曲在我国主要用于生产白酒，含有丰富的微生物菌落群，对白酒的酿造发挥着核心与关键作用。其中，白酒酒曲中主要有负责糖化作用的根霉、生产酒精的酵母菌以及风味物质合成的酯化菌，不同企业培育的酒曲中微生物菌群种类存在一定差异，因而各企业生产的菌种发酵效果存在差异。从传统酒曲中分离根霉菌和酿酒酵母，采用液态发酵或固态发酵二种发酵方式，严格按照发酵工业的技术规程，避免杂菌污染，不论有氧发酵还是厌氧发酵，发酵过程中都不会产生有害毒素。因此，采用微生物转化法，生产过程安全可控，为银杏资源的综合利用开拓了一条新的技术路径。 [0012] 利用传统酒曲或酿酒酵母进行生物发酵，待植物成分经微生物充分转化后，再按常规方法制备得到银杏枝叶的功效性提取物，同时获得高纯度的莽草酸副产物。或者将银杏叶或银杏树枝按固态或液态发酵方式进行生物转化，再经处理或提取后获得各相关原料，这也是该技术产业化应用的一个方面。目前，还没有利用传统酒曲/酿酒酵母发酵制备银杏提取物和莽草酸，能够实现同时提高产物莽草酸、银杏提取物产量和纯度，且降低毒性物质含量的工艺和方法。 [0013] 总之，利用微生物发酵转化，可以降低银杏酸等烷基酚酸类物质的含量，获得高安全性且功效性增强的银杏提取物，还可以得到副产物莽草酸，有利于提高产品在行业中的竞争力，这是一件相当有趣且非常值得探索的工作。 发明内容[0014] 本专利提供了一种将银杏各部位资源或初级提取物进行生物转化的方法，该方法利用传统酒曲或酿酒酵母进行生物发酵转化，在发酵过程中微生物分解银杏各部位或其提取物中的油脂、烷基酚酸、叶绿素、糖和蛋白等物质，新产生乳酸、富马酸等有机酸和乙醇等物质，有利于更好地提取莽草酸，从而极大地减少莽草酸的分离纯化步骤和生产成本，同时也减少了银杏提取物中以银杏酸为代表的烷基酚酸的含量，有利于提高银杏相关衍生产品的安全性，减少相关药品与食品的安全性风险。本发明制备的提取物包括银杏叶提取物、银杏树枝提取物和莽草酸，这些提取物在生物制药、保健食品、功能性食品、日用化妆品等领域均有广阔的应用前景。 [0015] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种通过发酵制备银杏提取物和莽草酸的方法，由以下步骤组成： [0016] S1、破碎：将原料银杏叶和/或银杏树枝条破碎至40目～120目；优选破碎至40～60目； [0018] 之后调节发酵浓度得到发酵液，灭菌，再加入酒曲或酿酒酵母进行厌氧发酵，厌氧发酵结束后用乙醇溶液回流提取得到醇提液；所述厌氧发酵的温度范围为25℃～28℃，厌氧发酵时间为10～12天。 [0019] S3、洗脱：去除醇提液中的乙醇，之后使用氢氧化钠调节pH至7.3～7.5，使用大孔吸附树脂柱，依次用0.1％氢氧化钠溶液、20％浓度乙醇和70％浓度乙醇进行洗脱，分段收集洗脱液； [0020] S4、银杏提取物的制备：将70％浓度乙醇洗脱得到的洗脱液去除乙醇后，干燥得到所述银杏提取物； [0021] S5、莽草酸提取物的制备：将氢氧化钠溶液洗脱得到的洗脱液加入活性炭进行吸附除杂、脱色，调节pH至3～5、过滤后得到的滤液浓缩、丙酮结晶即得莽草酸提取物。 [0022] 进一步的，步骤S2中，所述碳源包括蔗糖、果葡糖浆、淀粉、高淀粉作物粉、果糖和麦芽糖中的一种或多种。所述高淀粉作物粉包括高粱、玉米、大米、糯米、燕麦、小麦、土豆等高淀粉食材中的一种或几种。 [0023] 进一步的，步骤S2中，将破碎后的原料用乙醇溶液回流提取得到提取液的方法具体为：将破碎后的原料与12倍的60％乙醇溶液混合后进行加热回流提取1h，趁热过滤，滤液即为所述提取液。优选的，所述加热回流可重复进行多次。 [0024] 进一步的，步骤S2中，所述发酵液的液固比范围为2～5：1。以此进行液态发酵。 [0025] 进一步的，步骤S2中，所述灭菌的方式为加热发酵液至90℃～100℃保温30min～40min。所述灭菌后需降温至白酒酒曲或酿酒酵母适应生存的温度。 [0026] 进一步的，步骤S2中，当使用白酒酒曲进行发酵时，所述白酒酒曲包括浓香型、酱香型、清香型或花香型白酒的酿酒酒曲中的一种或几种。优选白酒酒曲为华西酒曲、湖南土酒曲和泸州浓香大曲中的一种。 [0027] 进一步的，所述白酒酒曲的添加量为原料总量0.1～2.0％；所述酿酒酵母的添加量为0.1～2.0％。 [0029] 进一步的，步骤S3中，所述大孔吸附树脂为D101、AB‑8、ADS‑17、DM130、DA201、HPD417、HPD600、HPD722、HZ803、HZ806、HZ841和聚酰胺中的任一种。 [0030] 进一步的，步骤S2、S3、S4中，去除乙醇的方法为减压回收溶液中的乙醇。减压回收的温度优选为60℃～65℃，压力优选为0.09MPa。 [0031] 进一步的，步骤S5中，所述活性炭的用量为液体总质量约0.2％，然后用了三倍体积的碱水进行洗脱。 [0032] 本发明的原理为：酿酒酵母在代谢过程中需要一定的营养物质，包括碳源、氮源、矿物质、脂肪和维生素等。银杏提取物中含有丰富的糖类、淀粉、蛋白质、微量元素、脂肪、酚酸和维生素，可以为酿酒酵母的生长提供丰富的营养和代谢保障。而酿酒酵母对银杏中的有效成分，如黄酮、萜类、木质素等，几乎没有影响，反而更有利于这些成分的溶出和提取。碳源是酿酒酵母代谢的主要能源，它们可以转化为乙醇、二氧化碳和部分有机酸，而没有水解的淀粉等多糖类物质则在水解酶和根霉菌等的作用下进一步水解成单糖和糊精，有利于发酵的推进。当蛋白质代谢消耗掉绝大部分氮源后，酵母菌就会开始进行脂肪代谢，有利于消耗体系中的油脂类成分和叶绿素。这时，酵母会消耗体系中添加的脂质，包括银杏中的有机酸类、酚酸和叶绿素类物质，同时自身也会合成脂肪酸，而这类新合成的脂肪酸对人体几乎没有毒副作用。酿酒酵母不产生次生代谢产物，代谢途径简单清楚，对人体安全性高。因此，将银杏叶或银杏树枝条与酿酒酒曲或酿酒酵母一起发酵，无伦采用液态发酵还是固态发酵模式，都有利于提高提取物的收率，提高提取物对机体的顺应性，降低产品的安全性风险，扩大产品在临床的应用范围。 [0033] 本发明的有益效果是： [0034] 1、银杏叶或银杏树枝利用传统酒曲或酿酒酵母进行发酵后，植物组织中的纤维素和木质素遭到破坏，有利于有效成分的溶出和提取，因此可以提高提取物和/或莽草酸的收率。本发明实现了莽草酸纯度在99％以上，收率超过90％的技术效果。 [0035] 2、银杏叶、银杏树枝分别按固态或液态发酵方式进行生物转化后，起毒副作用的脂肪酸或酚酸参与了微生物的代谢过程，在提取物中的含量得到极大降低，有利于提高提取物的安全性。通过限定使用特定的发酵酒曲，与未生物转化样品相比，黄酮或内酯的收率提高了30％以上，使银杏提取物中毒性成分降低97.5％以上，含量在1ppm以下。 [0036] 3、采用大孔吸附树脂进行纯化的过程中，与常规方法不同的地方在于：采用弱碱性水进行树脂柱的第一次洗脱，该方法一方面有利于将莽草酸转化为莽草酸盐的形式被洗脱下来，另一方面也有利于进一步除去提取物中的脂肪酸或酚酸类物质，有利于降低提取物中银杏酸的含量，提高相关提取物的安全性。 [0037] 4、在莽草酸的纯化过程中，采用弱碱性条件下进行脱色处理，这时莽草酸转化为莽草酸盐的形式，有利于避免莽草酸被活性炭吸附而产生损失，而长链脂肪酸或银杏酸则不溶于水或与活性炭有较高的吸附率，而被活性炭吸附除去，因此，该工艺变化有利于提高莽草酸的收率和纯度。附图说明 [0038] 图1为大孔树脂水洗脱部位的HPLC色谱图(银杏叶)； [0039] 图2为大孔树脂20％乙醇洗脱部位的HPLC色谱图(银杏叶)； [0040] 图3为大孔树脂70％乙醇洗脱部位的HPLC色谱图(银杏叶)； [0041] 图4为大孔树脂水洗脱部位活性炭脱前后的溶液变化情况(银杏叶)； [0042] 图5为莽草酸产品的HPLC色谱图(银杏叶)。 具体实施方式[0043] 下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。 [0044] 实验条件： [0045] 1、高效液相色谱条件 [0046] 高效液相色谱仪：LC‑10AT(日本岛津仪器制作所)；色谱柱：Inertsil NH2柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：1％磷酸水‑乙腈(5：95，v/v)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：210nm。 [0047] 2、对照品溶液的制备 [0048] 取莽草酸对照品(纯度98.0％，中国食品药品检定研究院)5.0mg，置于10mL的容量瓶中，精密称定，加入甲醇使充分溶解，定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.49mg/mL的莽草酸对照品溶液。 [0049] 3、供试品溶液制备 [0050] 取药材粉末1.0g，置具塞三角瓶中，精密称定，加入100mL 65％乙醇溶液，精密称定，冷浸30min后超声(200W，40kHz)提取30min，取出冷至室温，用65％乙醇溶液补足重量，摇匀，滤过，精密移取续滤液5.0mL至25mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得药材的供试品溶液。 [0051] 4、莽草酸含量计算方法 [0052] 精密移取待测溶液，注入高效液相色谱仪中，记录色谱流出曲线，积分各色谱峰的峰面积，样品在对照品色谱峰相应保留时间处有对应的色谱峰，其中，莽草酸对照品的纯度为98.0％。按以下公式计算各样品中莽草酸的含量： [0053] [0054] C标：莽草酸对照品的质量浓度(mg*mL‑1) [0055] A样：莽草酸样品的峰面积 [0056] V：提取液体积(mL) [0057] A标：莽草酸对照品的峰面积 [0058] m：样品质量(g) [0059] 实施例1 [0060] 取银杏叶1.0kg，粉碎过40目筛网，加入1.0kg玉米粉，搅拌混合均匀，倒入5kg沸水，搅拌均匀，待温度降至40℃以下之后，加入14g醇中醇酱香酒曲，搅拌均匀，密封后于室温下进行发酵，发酵时间10天。发酵结束后，将发酵产物转入回流提取罐中，加入14L 70％乙醇，加热回流提取，提取1小时后，趁热滤过，取滤清液，药渣加入16L 50％乙醇，再提取1次，合并提取液，弃去药渣。提取液于60℃下减压回收乙醇，用1％NaOH溶液将浓缩液的pH值调至7.5左右，于已好理好的DA‑201大孔吸附树脂柱上，依次用0.1％ NaOH溶液、20％乙醇溶液和70％乙醇溶液进行洗脱，分段收集。将70％乙醇洗脱部位回收乙醇，真空干燥，粉碎后称量，得25.50g提取物。另取稀碱水洗脱部位，确定其pH值为弱碱性后，加入液体总质量0.3％的活性炭至完全脱色，于60℃下搅拌1小时，滤过，滤清液减压浓缩，加稀盐酸调pH值至为4，结晶，真空干燥后称量，共计39.50g莽草酸提取物。 [0061] 实施例2 [0062] 取银杏树枝1.0kg，粉碎过40目筛网，加入1.0kg大米粗粉，搅拌混合均匀，倒入5kg沸水，搅拌均匀，待温度降至40℃以下之后，加入14g醇中醇浓香酒曲，搅拌均匀，密封后于室温下进行发酵，发酵时间10天。发酵结束后，将发酵产物转入回流提取罐中，加入14L 70％乙醇，加热回流提取，提取1小时后，趁热滤过，取滤清液，药渣加入16L 50％乙醇再提取1次，合并提取液，弃去药渣。提取液于60℃下减压回收乙醇，用1％KOH溶液将浓缩液的pH值调至7.5左右，于已好理好的DM‑130大孔吸附树脂柱上，依次用0.1％ KOH溶液、20％乙醇溶液和70％乙醇溶液进行洗脱，分段收集。将70％乙醇洗脱部位回收乙醇，真空干燥，粉碎后称量，得11.20g提取物。另取稀碱水洗脱部位，确定其pH值为弱碱性后，加入液体总质量 0.2％的活性炭至完全脱色，于60℃下搅拌1小时，滤过，滤清液减压浓缩，加稀盐酸调pH值至为4，结晶，真空干燥后称量，共计2.80g。 [0063] 实施例3 [0064] 取1.0kg银杏叶，粉碎过40目筛网，置回流提取罐中，加入12倍量60％的乙醇溶液(v/v)，加热回流提取，回流提取1小时后，趁热滤过，取滤清液，药渣再同法提取1次，合并提取液，弃去药渣。取提取液，于60℃下减压回收乙醇，将浓缩后的水溶液完全转入发酵罐中，加入0.6kg果葡糖浆，搅拌使之分散均匀，加热至90℃，保温30min后，转入冰水浴，搅拌发酵罐中的溶液，使其温度快速降至30℃以下，加入6.0g活化好的酵母Mead Yeast M‑05，搅拌均匀，加上单向阀进行密封，贴上标签，于室温下液态发酵10天。待果葡糖浆消耗完后，向发酵罐中加入500ml纯化水，搅拌使分散均匀，用1.0％NaOH溶液将发酵液的pH值调至7.5，上于已好理好的AB‑8大孔吸附树脂柱上，依次用0.3％NaOH水溶液、20％乙醇溶液和70％乙醇溶液进行洗脱，分段收集。将70％乙醇洗脱部位回收乙醇，真空干燥，得到26.30g银杏叶提取物。另取稀碱水洗脱部位，确定其pH值为弱碱性后，加入液体总质量0.6％的活性炭至完全脱色，于60℃下搅拌2小时，滤过，滤清液减压浓缩，加稀盐酸调pH值至为4，结晶，真空干燥，得到42.70g莽草酸提取物。 [0065] 实施例4 [0066] 取1.0kg银杏树枝，粉碎过40目筛网，置回流提取罐中，加入12倍量60％的乙醇溶液(v/v)，加热回流提取，回流提取1小时后，趁热滤过，取滤清液，药渣再同法提取1次，合并提取液，弃去药渣。取提取液，于60℃下减压回收乙醇，将浓缩后的水溶液完全转入发酵罐中，加入0.8kg蔗糖，搅拌使之分散均匀，加热至90℃，保温30min后，转入冰水浴，搅拌发酵罐中的溶液，使其温度快速降至30℃以下，加入6.0g活化好的酵母M‑12，搅拌均匀，加上单向阀进行密封，贴上标签，于室温下液态发酵10天。待蔗糖消耗完后，向发酵罐中加入500ml纯化水，搅拌使分散均匀，用1.0％NaOH溶液将发酵液的pH值调至7.5，上于已好理好的HPD‑417大孔吸附树脂柱上，依次用0.1％NaOH水溶液、20％乙醇溶液和70％乙醇溶液进行洗脱，分段收集。将70％乙醇洗脱部位回收乙醇，真空干燥，得到12.10g银杏叶提取物。另取稀碱水洗脱部位，确定其pH值为弱碱性后，加入液体总质量0.6％的活性炭至完全脱色，于60℃下搅拌2小时，滤过，滤清液减压浓缩，加稀盐酸调pH值至为4，结晶，真空干燥，得到3.01g提取物。 [0067] 对比例1 [0068] 按照《中国药典》2020年版一部银杏叶提取物项下的制法进行处理。取干燥后的银杏叶，粉碎，用50％乙醇加热回流提取，合并提取液，回收乙醇并浓缩至适量，用稀碱溶液调pH值至7.5左右，加在已处理好的DA201大孔吸附树脂柱上，依次用纯化水及不同浓度的乙醇洗脱，收集相应的洗脱液。取水洗脱部位，加入0.3％的活性炭，60℃下搅拌1小时，滤过，减压浓缩，加稀酸调pH值至弱酸性，结晶，干燥，得莽草酸提取物。取含黄酮和内酯的洗脱部位回收乙醇，浓缩成稠膏，真空干燥，粉碎，即得到银杏叶提取物。 [0069] 对比例2 [0070] 按照《中国药典》2020年版一部银杏叶提取物项下的制法进行处理。取干燥后的银杏树枝，粉碎，用50％乙醇加热回流提取，合并提取液，回收乙醇并浓缩至适量，用稀碱溶液调pH值至7.5左右，加在已处理好的DA201大孔吸附树脂柱上，依次用纯化水及不同浓度的乙醇洗脱，收集相应的洗脱液。取水洗脱部位，加入0.3％的活性炭，60℃下搅拌1小时，滤过，减压浓缩，加稀酸调pH值至弱酸性，结晶，干燥，得莽草酸提取物。取含黄酮和内酯的洗脱部位回收乙醇，浓缩成稠膏，真空干燥，粉碎，即得银杏树枝提取物。 [0071] 实验例1提取溶剂的选择 [0072] 采用10倍量水和不同浓度的乙醇溶液为提取溶剂，投料100克干燥银杏叶，其中水用煎煮法进行提取，20％、40％、60％乙醇溶液则采用加热回流提取，提取时间均为2小时，提取后滤过，取滤清液，分别用相应的溶剂定容至1.0L，采用HPLC法测定提取液中莽草酸的含量，在相同进样量下记录莽草酸标准品保留时间下对应色谱峰的峰面积，结果如下： [0073] 表1：不同提取溶剂对莽草酸提取效率的影响 [0074] [0075] 由以上表格数据可见，随着乙醇浓度升高，提取液中莽草酸的浓度也随之升高，水煎法中莽草酸的提取率还不及50％，因此，专利CN109053419A中莽草酸的提取效率较低，莽草酸浪费严重。另外，由于银杏叶提取物的标准生产工艺中，提取溶剂为稀乙醇溶液，结合以上数据结果，选择40～70％乙醇溶液为提取溶剂，既可以提高莽草酸提取率，又可以高效地提取银杏中的黄酮和萜类内酯等成分，符合工业生产实际。因此，专利CN109053419A中虽然也采用了发酵法进行莽草酸的制备，但与本发明有着本质不同。 [0076] 实验例2银杏各部位中毒性成分的含量测定 [0077] 银杏枝叶中含有银杏酸类毒性成分，白果中含有氢氰酸和银杏酸等毒性成分。采用HPLC测定银杏枝叶和白果中各毒性成分的含量，结果如下表所示： [0078] 表2：银杏各相关原料毒性成分的含量 [0079] 银杏酚酸含量(μg/g) MPN含量(μg/g)银杏叶 8703 0 银杏树枝 950 0 白果果仁 120.8 192.8 [0080] 由上表可知，银杏枝叶和白果中均含有银杏酚酸，仅在白果中发现MPN。 [0081] 实验例3不同来源酒曲对白果中银杏酸和MPN的分解作用 [0082] 银杏叶和银杏树枝中仅含有银杏酸等毒性银杏酚酸成分，而白果中既含有银杏酸又含有MPN，因此以银杏叶为研究对象进行发酵实验。白酒酒曲含多种不同微生物，具有显著的地域特色，也能体现不同地区的微生物菌群特色，因此采用不同地区的酒曲为发酵菌群，考察其对银杏叶中银杏酚酸的降解作用。相关结果见下表。 [0083] 表3：银杏提取物中各毒性成分的含量 [0084] 银杏酚酸含量(μg/g) MPN含量(μg/g) 银杏叶提取物 12.2 0 成都彭州华西酒曲 0.3 0 大邑醇中醇酒曲 0.95 0 湖北安琪酒曲 7.2 0 湖南土酒曲 0.3 0 宜宾李庄清香酒曲 2.4 0 泸州浓香大曲 0.1 0 酵母Mead Yeast M‑05 0.12 0 [0085] 注：表中银杏叶提取物为对比例1得到的银杏叶提取物，成都彭州华西酒曲、湖北安琪酒曲、湖南土酒曲、宜宾李庄清香酒曲和泸州浓香大曲分别为按照实施例1记载的方法，替代醇中醇酒曲制备得到的提取物，大邑醇中醇酒曲、酵母Mead Yeast M‑05分别为实施例1、3得到的提取物。 [0086] 由上表可见：银杏叶标准提取物中银杏酚酸的含量为12.2μg/g；相同批次的银杏叶经不同酒曲/酵母发酵后，银杏酚酸的含量均有降低趋势，其中华西酒曲、湖南土酒曲和泸州浓香大曲等传统酒曲/酵母发酵后，银杏酚酸极低，具有更好的市场应用价值；银杏酚酸含量低的提取物毒副作用更小、顺应性更好。 [0087] 实验例4 [0088] 参照《中国药典》2020年版一部银杏叶提取物项下的含量测定方法，分别测定了各实施例、对比例样品中的萜类内酯含量、总黄酮含量和银杏酸含量，再将各提取物样品的得率、莽草酸含量等相关数据列于以下各表： [0089] 表4：银杏叶生物转化后提取物中各关键指标的变化情况 [0090] [0091] 表5：银杏树技生物转化后提取物中各关键指标的变化情况 [0092] [0093] 由上表4、5可知，本发明提供的银杏叶、银杏树枝制备莽草酸、提取物的工业化方法，不仅大幅提高了莽草酸的得率和纯度，而且提取物得率、提取物中有效成分也得到了大幅提成，甚至提取物中的毒性物质含量大幅降低，较现有技术效果得到了大幅提升。 |
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