用于制备塔格糖的组合物和利用其制备塔格糖的方法 |
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| 申请号 | CN201880036319.6 | 申请日 | 2018-03-30 | 公开(公告)号 | CN111601888B | 公开(公告)日 | 2024-04-12 |
| 申请人 | CJ第一制糖株式会社; | 发明人 | 梁成才; 赵显国; 李英美; 金成俌; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种包含果糖‑6‑ 磷酸 ‑4‑差向异构酶的用于制备塔格糖的组合物，以及利用其制备塔格糖的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.组合物用于制备塔格糖‑6‑磷酸的用途，所述组合物包含 |
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| 说明书全文 | 用于制备塔格糖的组合物和利用其制备塔格糖的方法技术领域背景技术[0002] 常规的塔格糖制备方法包括使用半乳糖作为主要原料的化学方法(催化反应)和生物方法(异构化酶反应)(参见韩国专利号10‑0964091)。然而，在已知的制备方法中，作为主要原料的半乳糖的基础原料为乳糖，而乳糖的价格不稳定，其取决于全球市场上生乳和乳糖的产量、供应和需求量等。因此，其稳定供应受到限制。为了克服常规的塔格糖制备方法中的此种问题，已有报告利用己糖醛酸C4‑差向异构酶(hexuronate C4‑epimerase)从低价且供应稳定的果糖(D‑fructose)制备塔格糖的方法(2011.Appl Biochem Biotechnol.163:444‑451；韩国专利号10‑1550796)，但是其存在异构化反应的转化率(conversion ratio)较低的局限。 [0003] 已知塔格糖‑二磷酸醛缩酶(tagatose‑bisphosphate aldolase:EC 4.1.2.40)可如下述[反应式1]所示，以D‑塔格糖1,6‑二磷酸(D‑tagatose1,6‑bisphosphate)为底物产生磷酸甘油酮(glycerone phosphate)和D‑甘油醛3‑二磷酸(D‑glyceraldehyde 3‑diphosphate)，并参与半乳糖代谢。然而，并无关于所述塔格糖‑二磷酸醛缩酶是否具有制备将果糖‑6‑磷酸转化成塔格糖‑6‑磷酸的活性的研究。 [0004] [反应式1]D‑塔格糖1,6‑二磷酸<＝>磷酸甘油酮+D‑甘油醛3‑二磷酸 [0005] 在此背景下，本发明的发明人进行了广泛的研究以开发可用于制备塔格糖的酶，结果，他们发现塔格糖‑二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.40)具有将葡萄糖‑6‑磷酸(glucose‑6‑phosphate)转化为塔格糖‑6‑磷酸的功能，从而完成本发明。 [0006] 因此，可以葡萄糖或淀粉为原料，依次制备葡萄糖‑1‑磷酸和葡萄糖‑6‑磷酸(glucose‑6‑phosphate)，然后利用本发明的塔格糖‑二磷酸醛缩酶将葡萄糖‑6‑磷酸转化为塔格糖‑6‑磷酸(tagatose‑6‑phosphate)，利用进行不可逆的反应路径的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶(tagatose‑6‑phosphate phosphatase)制备塔格糖，并且可显著提高自葡萄糖或淀粉向塔格糖的转化率。 发明内容[0007] 本发明的一目的在于提供一种用于制备塔格糖‑6‑磷酸的组合物，其包含塔格糖‑二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖‑二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物。 [0008] 本发明的另一目的在于提供一种用于制备塔格糖的组合物，其包含塔格糖‑二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖‑二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物；以及塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物。 [0009] 本发明的另一目的在于提供一种制备塔格糖的方法，其包括使果糖‑6‑磷酸与塔格糖‑二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖‑二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖‑6‑磷酸转化成塔格糖‑6‑磷酸，其中所述方法可进一步包括使塔格糖‑6‑磷酸与塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将塔格糖‑6‑磷酸转化为塔格糖。 附图说明[0011] 图1a‑1d为HPLC层析结果，显示本发明一实施方案中的塔格糖‑二磷酸醛缩酶(CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E和CJ_LP_F6P4E)具有果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的活性。 [0012] 图2a和2b为HPLC层析结果，显示在本发明一实施方案中，用塔格糖‑二磷酸醛缩酶(CJ_KO_F6P4E和CJ_RP_F6P4E)和塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶(CJ_T4)处理塔格糖‑6‑磷酸，将果糖‑6‑磷酸转化为塔格糖。 [0013] 图3为HPLC层析结果，显示本发明一实施方案中的酶T4具有塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的活性。 [0014] 图4为蛋白凝胶电泳(SDS‑PAGE)的结果，以分析本发明一实施方案中用于自淀粉、蔗糖或葡萄糖制备塔格糖的反应路径中的酶的分子量，其中M代表蛋白大小标准品(size marker，Bio‑RAD，美国)。 [0015] 图5为HPLC层析结果，显示本发明一实施方案中制备的酶TD1(CJ_TD1_F6P4E)具有果糖‑6‑磷酸4‑差向异构酶的活性。 [0016] 图6为HPLC层析结果，显示当同时添加参与自麦芽糊精制备塔格糖的反应路径的所有酶时，由复合酶反应生成塔格糖，其中将TD1(CJ_TD1_F6P4E)用作塔格糖‑二磷酸醛缩酶。 具体实施方式[0017] 以下具体地对本发明的内容进行说明。此外，本发明中公开的各项说明和实施方式中的共通事项均可应用到其他说明和实施方式。另外，本发明中公开的各种元素的组合均落入本发明的范围。而且，本发明的范围不限制于以下具体的描述。 [0018] 为达到本发明的一目的，本发明在一方面提供一种用于制备塔格糖‑6‑磷酸的组合物，其包含塔格糖‑二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖‑二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物。 [0019] 已知塔格糖‑二磷酸醛缩酶(tagatose‑bisphosphate aldolase:EC 4.1.2.40)可以D‑塔格糖1,6‑二磷酸(D‑tagatose 1,6‑bisphosphate)为底物产生磷酸甘油酮(glycerone phosphate)和D‑甘油醛3‑二磷酸(D‑glyceraldehyde3‑diphosphate)，并参与半乳糖代谢。例如，所述塔格糖‑二磷酸醛缩酶没有任何限制，只要其能够以果糖‑6‑磷酸为底物而产生塔格糖‑6‑磷酸。 [0020] 具体而言，塔格糖‑二磷酸醛缩酶可为由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的氨基酸序列组成的多肽，或者包含与SEQ ID NO：1、3、5、7和9的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％的同源性的多肽。同样很显然，具有所述同源性且表现出与SEQ ID NO：1、3、5、7或9的氨基酸序列组成的蛋白相应的功效(即，将果糖‑6‑磷酸中的果糖的第4碳位置差向异构化而将果糖‑6‑磷酸转化为塔格糖‑6‑磷酸的果糖‑6‑磷酸C4‑差向异构化的活性)的氨基酸序列的多肽，即便具有一部分序列缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列，都包括在本发明的范围内。此外，根据已知核苷酸序列制备的探针，例如，可以在严格条件下与编码所述多肽的核苷酸序列的全部或部分的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽，亦可无限制地包括在内，只要其具有果糖‑6‑磷酸C4‑差向异构化活性即可。因此，用于制备塔格糖‑6‑磷酸的组合物可进一步包含果糖‑6‑磷酸。另外，所述组合物可包含一或多种由SEQ ID NO：1、3、 5、7或9的氨基酸序列组成的塔格糖‑二磷酸醛缩酶。 [0021] 本发明揭示了“塔格糖‑二磷酸醛缩酶”表现出果糖‑6‑磷酸4‑差向异构化活性，通过将果糖‑6‑磷酸的第4碳位置差向异构化而将果糖‑6‑磷酸转化成塔格糖‑6‑磷酸。因此，在本发明中，“塔格糖‑二磷酸醛缩酶”可以与“果糖‑6‑磷酸C4‑差向异构酶(fructose‑6‑phosphate C4‑epimerase)”互换使用。 [0022] 如本文所用，术语“严格条件”是指可实现多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件取决于多核苷酸的长度和互补程度，这些参数是本领域众所周知的，并且在文献中有具体描述(例如，下文的J.Sambrooket et al.)。严格条件可以包括，例如，具有高同源性的基因彼此杂交、具有80％或以上、90％或以上、95％或以上、97％或以上、或99％或以上的同源性的基因彼此杂交，同源性低于上述的基因彼此不杂交的条件；或于Southern杂交的常规清洗条件，即在60℃、1×SSC、0.1％SDS，具体而言60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，并且更具体而言68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下，清洗一次，具体而言，清洗两次或三次的条件。杂交中使用的探针可以是核苷酸序列的互补序列的一部分。此种探针可以通过PCR来制备，以基于已知序列的寡核苷酸为引物和包含这些核苷酸序列的DNA片段为模板。此外，本领域技术人员可视需要而根据诸如探针的长度的因素来调节温度和清洗溶液的盐浓度。 [0023] 如本文所用，术语“同源性”是指两个多肽部分(moiety)之间的相同性的百分比。可以通过本领域中的已知技术来确定自一部分至另一部分的序列间的相同性。例如，可以使用下列方式确定同源性：使用现成的并且能够比对序列信息的计算机程序(例如，BLAST2.0)直接地比对两个多肽分子的序列信息，例如得分(score)、相同性(identity)和相似性(similarity)等参数。另外，多核苷酸的同源性可以通过如下方式确定：在同源区域间形成稳定的双链的条件下杂交多核苷酸，然后用单链特异性核酸酶消化杂交的链来确定消化的片段的大小。 [0024] 在一具体实施方案中，本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶可为源自嗜热微生物的酶或其变体，例如，源自Thermanaerothrix sp.的酶或其变体、源自Kosmotoga sp.的酶或其变体、源自红嗜热盐菌(Rhodothermus sp.)的酶或其变体、源自Limnochorda sp.的酶或其变体，具体而言，源自Thermanaerothrix daxensis、Kosmotoga olearia、海红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)、Rhodothermus profundi或Limnochorda pilosa的酶，但不限于此。 [0025] 本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶或其变体的特征在于，通过将D‑果糖‑6‑磷酸(D‑fructose‑6‑phosphate)的第4碳位置差向异构化，将D‑果糖‑6‑磷酸转化成D‑塔格糖‑6‑磷酸。本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶可为已知具有塔格糖‑二磷酸醛缩酶活性的酶，塔格糖‑二磷酸醛缩酶以D‑塔格糖1,6‑二磷酸为底物产生磷酸甘油酮和D‑甘油醛3‑二磷酸，并参与半乳糖代谢。本发明首次揭示了塔格糖‑二磷酸醛缩酶具有果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶活性。因此，本发明一实施方案涉及塔格糖‑二磷酸醛缩酶的新用途，包括在自果糖‑6‑磷酸制备塔格糖‑6‑磷酸时将塔格糖‑二磷酸醛缩酶用作果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶。此外，本发明另一实施方案涉及一种将塔格糖‑二磷酸醛缩酶用作果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶，自果糖‑6‑磷酸制备塔格糖‑6‑磷酸的方法。 [0026] 在一实施方案中，本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶可为具有高耐热性的酶。具体而言，本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶可在50℃至70℃下表现出其最大活性的 50％至100％、60％至100％、70％至100％或75％至100％。更具体而言，本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶可于55℃至65℃、60℃至70℃、55℃、60℃或70℃下表现出其最大活性的 80％至100％或85％至100％。 [0027] 此外，由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的氨基酸序列组成的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶可以分别由SEQ ID NO：2、4、6、8或10的核苷酸序列编码，但不限制于此。 [0028] 本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶或其变体可以通过以下方式获得：用表达本发明的酶或其变体的DNA(例如，SEQ ID NO：2、4、6、8或10)转化微生物(例如大肠杆菌(Escherichia.coli))，培养所述微生物以获得培养物，粉碎培养物，然后使用层析柱进行纯化等。除大肠杆菌外，用于转化的微生物还可包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在一具体实施方案中，转化的微生物可为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F6P4E或大肠杆菌BL21(DE3)/pBT7‑C‑His‑CJ_td1。将大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E以保藏号KCCM11999P(保藏日：2017年3月24日)、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E以保藏号KCCM12096P(保藏日：2017年8月11日)、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E以保藏号KCCM12097P(保藏日：2017年8月11日)、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F6P4E以保藏号KCCM12095P(保藏日：2017年8月11日)以及大肠杆菌BL21(DE3)/pBT7‑C‑His‑CJ_td1以保藏号KCCM11995P(保藏日：2017年3月20日)，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms)。 [0029] 本发明所使用的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶可以由编码所述果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的核酸来提供。 [0030] 如本文所用，术语“核酸”具有涵盖DNA或RNA分子的含义，其中作为核酸的基本组成单元的核苷酸不仅可包括天然核苷酸，还可包括具有糖或碱基修饰的类似物(参见：Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman及Peyman,Chemical Reviews,90:543‑584(1990))。 [0031] 本发明的核酸可为这样的核酸，其编码本发明的由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的氨基酸序列组成的多肽，或编码与本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶具有至少80％、90％、95％、97％或99％的同源性且具有果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶活性的多肽。例如，编码由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的核酸可为这样的核酸，其与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性。此外，编码由SEQ ID NO：3、5、7或9的氨基酸序列组成的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的核酸可为这样的核酸，其分别与其相应的SEQ ID NO：4、6、8或10的核苷酸序列具有至少80％、 90％、95％、97％、99％或100％的同源性。同样显然地，本发明的核酸可包括由于密码子简并性(codon degeneracy)而翻译成本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的核酸和这样的核酸，其在严格条件下与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的核酸杂交，且编码具有本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶活性的多肽。 [0032] 可以在本发明中使用的表达果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的微生物可为包含重组载体的微生物，其中所述重组载体包含所述核酸。 [0033] 载体可以可操作地连接至本发明的核酸。如本文所用，术语“可操作地连接”是指为了执行一般功能而将核苷酸表达调节序列与编码目标蛋白的核苷酸序列可操作地彼此连接，从而影响编码核苷酸序列的表达。可以利用本领域已知的基因重组技术实现与载体的可操作连接，并且可以利用本领域已知的限制性酶和连接酶实现位点特异性的DNA切割和连接。 [0034] 如本文所用，术语“载体”是指用于将碱基克隆和/或转移至生物体(例如宿主细胞)中的任何介质。载体可为复制子(replicon)，其能够使组合有不同DNA片段的组合片段进行复制。在此，术语“复制子”是指任意遗传单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，其作为体内DNA复制的自复制单元起作用，即能够通过自调节来实现复制。如本文所用，术语“载体”可以包括用于在体外、离体或体内将碱基引入生物体(例如宿主细胞)中的病毒和非病毒介质，并且还可包括微环DNA、如睡美人(Sleeping Beauty)的转座子(Izsvak et al.,J.MoI.Biol.302:93‑102(2000))或人工染色体。常用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等作为噬菌体载体或粘粒载体；可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET等的载体作为质粒载体。可以在本发明中使用的载体没有特别限制，可以使用任何已知的表达载体。此外，载体可为重组载体，其特征在于还包含各种抗生素抗性基因。如本文所用，术语“抗生素抗性基因”是指对抗生素具有抗性的基因，并且具有该基因的细胞可在经相应抗生素处理的环境中存活。因此，在大肠杆菌中产生大量质粒的过程中，将抗生素抗性基因用作选择标记。本发明中的抗生素抗性基因并非对本发明的核心技术(由载体的最佳组合实现的表达效率)产生较大影响的因素，因此可以无限制地使用通常用作选择标记的抗生素抗性基因。具体实例可包括针对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素、链霉素或新霉素等的抗性基因。 [0035] 可使用将包含编码所述酶的核酸的载体导入宿主细胞的方法获得用于本发明的表达果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的微生物，转化所述载体的方法可为任何能将核酸导入细胞的方法。可以选择并执行本领域已知的适当标准技术。可以包括电穿孔、磷酸钙共沉淀、逆转录病毒感染、显微注射、DEAE‑葡聚糖法、阳离子脂质体法和热激法，但不限于此。 [0036] 只要转化的基因能在宿主细胞中表达即可，其可以插入宿主细胞的染色体中，也可以存在于染色体外。此外，所述基因包括DNA和RNA作为编码多肽的多核苷酸，并且可无限制地使用任何形式，只要能将其导入宿主细胞并在其中表达即可。例如，可以以表达盒的形式将基因导入宿主细胞，所述表达盒为包含自主表达所需的所有元件的多核苷酸构建体。通常，表达盒可包含与基因可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可为能够自我复制的表达载体的形式。另外，可以将基因本身或多核苷酸构建体形式的基因引入宿主细胞中，并与在宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接。 [0037] 本发明的微生物可以包括原核微生物或真核微生物，只要是通过包含本发明的核酸或重组载体而可产生本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的微生物即可。例如，所述微生物可以包括属于埃希氏菌(Escherichia)属，欧文氏菌(Erwinia)属，沙雷氏菌(Serratia)属，普罗威登斯菌(Providencia)属，棒状杆菌(Corynebacterium)属和短杆菌(Brevibacterium)属的微生物菌株，具体地，可为但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。所述微生物的具体实例可包括大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/pBT7‑C‑His‑CJ_td1等。 [0038] 除导入所述核酸或载体以外，本发明的微生物可包括经由各种已知方法而能够表达本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶或相关酶的任何微生物。 [0039] 本发明的微生物的培养物可通过在培养基中培养能够表达本发明的塔格糖‑二磷酸醛缩酶或相关酶的微生物来制备。 [0040] 如本文所用，术语“培养”指使微生物在控制得当的环境条件下生长。本发明的培养过程可根据本领域已知的适当的培养基和培养条件进行。本领域技术人员可根据选择的菌株容易地调整培养过程。培养微生物的步骤可以但不特别限定于通过分批培养、连续培养或补料分批培养等进行。至于培养条件，可使用碱性化合物(例如，氢氧化钠，氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)来调节恰当的pH(例如，pH5至9，具体而言，pH7至9)，但不特别限定于此。另外，可以在培养过程中加入如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来抑制泡沫的产生。此外，可向培养物中注入氧气或含氧气体以保持培养物的有氧状态；也可不注入气体或注入氮气、氢气或二氧化碳气体，以维持培养物的厌氧或微氧状态。培养温度可维持在25℃至40℃，具体地，30℃至37℃，但不限于此。可持续培养直至获得所需量的有用材料为止，具体地，可持续约0.5小时至约60小时，但不限于此。此外，使用的培养基可包括作为碳源的糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油脂(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)和有机酸(例如，乙酸)等。这些物质可单独或混合使用，但不限于此。氮源可包括含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等。这些氮源也可单独或混合使用，但不限于此。磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或其相应的含钠盐等。这些磷源也可单独或混合使用，但不限于此。培养基可包含必需的生长刺激剂，例如金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。 [0041] 本发明的另一方面提供一种用于制备塔格糖的组合物，其包含塔格糖‑二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖‑二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物；以及塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物。 [0042] 用于制备塔格糖‑6‑磷酸的组合物的描述，也可适用于用于制备塔格糖的组合物。本发明的塔格糖‑6‑磷酸可以无限制地为任何蛋白，只要其具有去除塔格糖‑6‑磷酸的磷酸基而将塔格糖‑6‑磷酸转化成塔格糖的活性即可。本发明的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶可以为任何源自耐热微生物的酶，例如，源自栖热袍菌(Thermotoga sp.)的酶或其变体，具体而言，可为源自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的酶或其变体。 [0043] 根据本发明的一实施方案，本发明的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶可以为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶可由SEQ ID NO：12的核苷酸序列编码。 [0044] 本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含葡萄糖‑6‑磷酸异构酶(glucose‑6‑phosphate isomerase)、表达所述葡萄糖‑6‑磷酸异构酶的微生物或所述微生物的培养物。在所述酶的存在下，葡萄糖‑6‑磷酸可被异构化而生成果糖‑6‑磷酸。本发明的葡萄糖‑6‑磷酸异构酶可以无限制地包括任何蛋白，只要其具有将葡萄糖‑6‑磷酸异构化成果糖‑6‑磷酸的活性即可。本发明的葡萄糖‑6‑磷酸异构酶可以为源自耐热微生物的酶，例如，源自栖热袍菌的酶或其变体，具体而言，可为源自海栖热袍菌的酶或其变体。根据本发明的一实施方案，本发明的葡萄糖‑6‑磷酸‑异构酶可以为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、 95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的葡萄糖‑6‑磷酸异构酶可由SEQ ID NO：14的核苷酸序列编码。 [0045] 本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含葡萄糖磷酸变位酶(phosphoglucomutase)、表达所述葡萄糖磷酸变位酶的微生物或所述微生物的培养物。所述酶催化将葡萄糖‑1‑磷酸转化为葡萄糖‑6‑磷酸或将葡萄糖‑6‑磷酸转化为葡萄糖‑1‑磷酸的可逆反应。本发明的葡萄糖磷酸变位酶可无限制地包括任何蛋白，只要其具有将葡萄糖‑1‑磷酸转化为葡萄糖‑6‑磷酸或将葡萄糖‑6‑磷酸转化为葡萄糖‑1‑磷酸的活性即可。本发明的葡萄糖磷酸变位酶可以为源自耐热微生物的酶，例如，源自栖热袍菌的酶或其变体，具体而言，可为源自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的酶或其变体。根据本发明的一实施方案，本发明的葡萄糖磷酸变位酶可为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、 97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的葡萄糖磷酸变位酶可由SEQ ID NO：16的核苷酸序列编码。 [0046] 本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含葡萄糖激酶(glucokinase)、表达所述葡萄糖激酶的微生物或所述微生物的培养物。本发明的葡萄糖激酶可以无限制地包括任何蛋白，只要其具有磷酸化葡萄糖的活性即可。本发明的葡萄糖激酶可以为源自耐热微生物的酶，例如，源自异常球菌(Deinococcus sp.)、厌氧绳菌(Anaerolinea sp.)的酶或其变体，具体而言，可为源自中度嗜热菌(Deinococcus geothermalis)或嗜热厌氧绳菌(Anaerolinea thermophila)的酶或其变体。本发明的葡萄糖激酶可以无限制地为任何蛋白，只要其具有将葡萄糖转化为葡萄糖‑6‑磷酸的活性即可。具体而言，本发明的葡萄糖激酶可为磷酸依赖型的葡萄糖激酶。根据本发明的一实施方案，本发明的葡萄糖激酶可为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：17或19的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：17或19的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的葡萄糖激酶可由SEQ ID NO：18的核苷酸序列编码，且本发明的由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的葡萄糖激酶可由SEQ ID NO：20的核苷酸序列编码。 [0047] 本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含α‑葡聚糖磷酸化酶(α‑glucan phosphorylase)、淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase)、麦芽糊精磷酸化酶(maltodextrin phosphorylase)或蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase)、表达所述α‑葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培养物。所述磷酸化酶可以无限制地包括任何蛋白，只要其具有将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖‑1‑磷酸的活性即可。所述磷酸化酶可为源自耐热微生物的酶，例如，源自栖热袍菌的酶或其变体，具体而言，可为源自新阿波罗栖热袍菌的酶或其变体。本发明的磷酸化酶可以为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成的磷酸化酶可由SEQ ID NO：22的核苷酸序列编码。 [0048] 本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含α‑淀粉酶(α‑amylase)、支链淀粉酶(pullulanase)、葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)、蔗糖酶(sucrase)或异淀粉酶(isoamylase)；表达所述淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物；或表达所述淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物的培养物。 [0049] 本发明的用于制备塔格糖的组合物可单独包含上述可用于产生塔格糖的酶中的两种或更多种酶，或其转化子，或者经编码所述两种或更多种酶的核苷酸转化的转化子。 [0050] 本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含4‑α‑葡聚糖转移酶(4‑α‑glucanotransferase)、表达所述4‑α‑葡聚糖转移酶的微生物或表达所述4‑α‑葡聚糖转移酶的微生物的培养物。本发明的4‑α‑葡聚糖转移酶可无限制地包括任何蛋白，只要其具有将葡萄糖转化为淀粉、麦芽糊精或蔗糖的活性即可。本发明的4‑α‑葡聚糖转移酶可为源自耐热微生物的酶，例如，源自栖热袍菌的酶或其变体，具体而言，可为源自海栖热袍菌的酶或其变体。根据本发明的一实施方案，本发明的4‑α‑葡聚糖转移酶可为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的4‑α‑葡聚糖转移酶可由SEQ ID NO：24的核苷酸序列编码。 [0051] 可用于上述实施方案的微生物的实例可包括大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_ct1、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_ct2、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_tn1、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_tn2和大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_t4等。将重组微生物于2017年3月20日保藏于韩国微生物保藏中心，保藏号分别为KCCM11990P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_ct1)、KCCM11991P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_ct2)、KCCM11992P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_tn1)、KCCM11993P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_tn2)和KCCM11994P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_t4)。 [0052] 本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含与上述酶的各底物对应的物质、成分或组合物。 [0053] 本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含通常用于相应的用于制备塔格糖的组合物的任何合适的赋形剂。赋形剂可包括，例如，防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂等，但不限于此。 [0054] 本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含金属。在一实施方案中，本发明的金属可为包含二价阳离子的金属。具体而言，本发明的金属可为镍、钴、铝、镁(Mg)或锰(Mn)。更具体地，本发明的金属可为金属离子或金属盐，更具体而言，所述金属盐可为NiSO4、MgSO4、MgCl2、NiCl2、CoCl2、CoSO4、MnCl2或MnSO4。 [0055] 本发明的又一方面涉及一种制备塔格糖‑6‑磷酸的方法，其包括使果糖‑6‑磷酸与塔格糖‑二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖‑二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖‑6‑磷酸转化为塔格糖‑6‑磷酸。 [0056] 用于制备塔格糖‑6‑磷酸的组合物的描述也可适用于制备塔格糖的组合物。 [0057] 本发明的另一方面涉及一种制备塔格糖的方法，其包括使果糖‑6‑磷酸与塔格糖‑二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖‑二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖‑6‑磷酸转化为塔格糖‑6‑磷酸。所述制备塔格糖的方法可进一步包括使塔格糖‑6‑磷酸与塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将塔格糖‑6‑磷酸转化为塔格糖。 [0058] 本发明的方法可进一步包括使葡萄糖‑6‑磷酸与本发明的葡萄糖‑6‑磷酸‑异构酶、表达所述葡萄糖‑6‑磷酸‑异构酶的微生物或表达所述葡萄糖‑6‑磷酸异构酶的微生物的培养物接触，来将葡萄糖‑6‑磷酸转化为果糖‑6‑磷酸。 [0059] 本发明的方法可进一步包括使葡萄糖‑1‑磷酸与本发明的葡萄糖磷酸变位酶、表达所述葡萄糖磷酸变位酶的微生物或表达所述葡萄糖磷酸变位酶的微生物的培养物接触，来将葡萄糖‑1‑磷酸转化为葡萄糖‑6‑磷酸。 [0060] 本发明的方法可进一步包括使葡萄糖与本发明的葡萄糖激酶、表达所述葡萄糖激酶的微生物或表达所述葡萄糖激酶的微生物的培养物接触，来将葡萄糖转化为葡萄糖‑6‑磷酸。 [0061] 本发明的方法可进一步包括使淀粉、麦芽糊精、蔗糖或其组合与本发明的α‑葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表达所述磷酸化酶的微生物或表达所述磷酸化酶的微生物的培养物接触，来将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖‑1‑磷酸。 [0062] 本发明的方法可进一步包括使淀粉、麦芽糊精、蔗糖或其组合与α‑淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶，表达所述α‑淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物，或表达所述α‑淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物的培养物接触，来将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖。 [0063] 本发明的方法可进一步包括使葡萄糖与本发明的4‑α‑葡聚糖转移酶、表达所述4‑α‑葡聚糖转移酶的微生物或表达所述4‑α‑葡聚糖转移酶的微生物的培养物接触，来将葡萄糖转化为淀粉、麦芽糊精或蔗糖。 [0064] 本发明方法的各种接触可以在pH 5.0至pH 9.0、30℃至80℃的条件下进行和/或进行0.5小时至48小时。具体而言，本发明的接触可在pH 6.0至pH 9.0或pH 7.0至pH 9.0的条件下进行。此外，本发明的接触可在35℃至80℃、40℃至80℃、45℃至80℃、50℃至80℃、55℃至80℃、60℃至80℃、30℃至70℃、35℃至70℃、40℃至70℃、45℃至70℃、50℃至70℃、 55℃至70℃、60℃至70℃、30℃至65℃、35℃至65℃、40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、 55℃至65℃、30℃至60℃、35℃至60℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或55℃至60℃的温度条件下进行。此外，本发明的接触可进行0.5小时至36小时、0.5小时至24小时、0.5小时至12小时、0.5小时至6小时、1小时至36小时、1小时至24小时、1小时至12小时、1小时至6小时、3小时至36小时、3小时至24小时、3小时至12小时、3小时至6小时、12小时至36小时或 18小时至30小时。 [0065] 在一实施方案中，本发明的接触可在金属、金属离子或金属盐的存在下进行。 [0066] 本发明的另一方面涉及一种制备塔格糖的方法，其包括使本文所述的用于制备塔格糖的组合物与淀粉、麦芽糊精、蔗糖或其组合及多磷酸盐(polyphosphate)接触。 [0067] 在本发明一具体实施方案中，提供一种制备塔格糖的方法，其包括： [0068] 使葡萄糖与本发明的葡萄糖激酶、表达所述葡萄糖激酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将葡萄糖转化为葡萄糖‑6‑磷酸； [0069] 使葡萄糖‑6‑磷酸与本发明的葡萄糖‑6‑磷酸‑异构酶、表达所述葡萄糖‑6‑磷酸‑异构酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将葡萄糖‑6‑磷酸转化为果糖‑6‑磷酸； [0070] 使果糖‑6‑磷酸与本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶、表达所述果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖‑6‑磷酸转化为塔格糖‑6‑磷酸；以及 [0071] 使塔格糖‑6‑磷酸与本发明的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将塔格糖‑6‑磷酸转化为塔格糖。 [0072] 各转化反应可以顺次进行或在同一反应体系中于原位(in situ)进行。在所述方法中，经由磷酸酶自塔格糖‑6‑磷酸上释放的磷酸，可用作葡萄糖激酶的底物用于产生葡萄糖‑6‑磷酸。因此磷酸并不堆积，因而可获得高转化率。 [0073] 在所述方法中，葡萄糖可以经如下方式产生：例如，使淀粉、麦芽糊精、蔗糖或其组合与本发明的α‑葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表达所述磷酸化酶的微生物或表达所述磷酸化酶的微生物的培养物接触，来将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖。因此，根据一具体实施方案的方法可进一步包括将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖。 [0074] 在本发明另一具体实施方案中，提供一种制备塔格糖的方法，其包括： [0075] 使葡萄糖‑1‑磷酸与本发明的葡萄糖磷酸变位酶、表达所述葡萄糖磷酸变位酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将葡萄糖‑1‑磷酸转化为葡萄糖‑6‑磷酸； [0076] 使葡萄糖‑6‑磷酸与本发明的葡萄糖‑6‑磷酸‑异构酶、表达所述葡萄糖‑6‑磷酸‑异构酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将葡萄糖‑6‑磷酸转化为果糖‑6‑磷酸； [0077] 使果糖‑6‑磷酸与本发明的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶、表达所述果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖‑6‑磷酸转化为塔格糖‑6‑磷酸；以及 [0078] 使塔格糖‑6‑磷酸与本发明的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将塔格糖‑6‑磷酸转化为塔格糖。 [0079] 各转化反应可顺次进行或在同一反应体系中于原位进行。 [0080] 在所述方法中，葡萄糖‑1‑磷酸可以如下方式产生：例如，使淀粉、麦芽糊精、蔗糖或其组合与本发明的α‑葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表达所述磷酸化酶的微生物或表达所述磷酸化酶的微生物的培养物接触，来将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖‑1‑磷酸。因此，根据一具体实施方案的方法可进一步包括将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖‑1‑磷酸。对此，经由磷酸酶自塔格糖‑6‑磷酸释放的磷酸可用作磷酸化酶的底物而用于产生葡萄糖‑1‑磷酸。因此，磷酸不会堆积，因而可获得高转化率。 [0081] 所述方法可进一步包括对制备的塔格糖进行纯化。所述方法中的纯化可以是本发明所属领域通常使用的方法，而无特别限制。非限制性实例可包括层析法、分级结晶法和离子纯化法等。可仅使用一种方法，也可使用两种或更多种方法进行纯化。例如，可通过层析法纯化产物塔格糖，通过层析法分离糖可利用欲分离的糖与附着于离子树脂的金属离子之间的弱结合力的差异来进行。 [0082] 另外，本发明的方法可进一步包括在本发明的纯化步骤之前或之后进行脱色、脱盐或既脱色又脱盐的步骤。通过进行脱色和/或脱盐，可获得无杂质的更纯的塔格糖。 [0083] 以下，参照下列实施例更详细地对本发明进行说明。然而，这些实施例仅为有助于理解本发明，并且本发明不受限于这些实施例。 [0084] 实施例 [0085] 实施例1：各酶的重组表达载体及转化子的制备 [0086] 为了提供本发明中塔格糖制备路径中所需的耐热性酶：α‑葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖‑6‑磷酸‑异构酶、4‑α‑葡聚糖转移酶，从登记于基因库(GenBank)的嗜热微生物新阿波罗栖热袍菌或海栖热袍菌的核苷酸序列选取了预期为所述酶的核苷酸序列(上述酶分别为SEQ ID NO：22(CT1)、SEQ ID NO：16(CT2)、SEQ ID NO：14(TN1)和SEQ ID NO：24(TN2))。 [0087] 基于所选核苷酸序列，设计并合成了正向引物(SEQ ID NO：21：CT1‑Fp、SEQ ID NO：27：CT2‑Fp、SEQ ID NO：29:TN1‑Fp和SEQ ID NO：31：TN2‑Fp)和反向引物(SEQ ID NO：26：CT1‑Rp、SEQ ID NO：28：CT2‑Rp、SEQ ID NO：30：TN1‑Rp和SEQ ID NO：32：TN2‑Rp)，并利用所述引物和新阿波罗栖热袍菌的基因组DNA作为模板通过PCR扩增了各酶的基因。使用限制性酶NdeI和XhoI或SalI将扩增的酶的各基因插入到用于大肠杆菌表达的质粒载体pET21a(Novagen)，从而制备分别命名为pET21a‑CJ_ct1、pET21a‑CJ_ct2、pET21a‑CJ_tn1及pET21a‑CJ_tn2的重组表达载体。 [0088] 利用常用的转化方法(参见Sambrook et al.,1989)将各表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)来制备转化子(转化微生物)，分别命名为大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_ct1、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_ct2、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_tn1和大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_tn2。于2017年3月20日，按照《布达佩斯条约》将所述转化子分别以保藏号KCCM11990P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_ct1)、KCCM11991P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_ct2)、KCCM11992P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_tn1)和KCCM11993P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_tn2)保藏于韩国微生物保藏中心。 [0089] 实施例2：重组酶的制备 [0090] 将实施例1中制备的表达各酶的大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_ct1、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_ct2、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_tn1及大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_tn2接种到装有5ml LB的液体培养基的培养管中，然后在37℃的振荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。 [0091] 将通过种菌培养获得的每种培养物接种在含有LB液体培养基的培养瓶中，然后进行主培养。当600nm的吸光度达到2.0时，加入1mM的IPTG诱导重组酶的表达和产生。培养期间，震荡速度保持在180rpm，培养温度保持在37℃。将各培养物在8,000×g和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris‑HCl(pH 8.0)缓冲液将回收的细胞清洗两次并用相同的缓冲液悬浮，随后用超声仪粉碎细胞。将细胞裂解液在13,000×g和4℃下离心20分钟，仅取上清液。通过多聚组氨酸标签亲和层析法纯化各种酶。用50mM Tris‑HCl(pH 8.0)缓冲液对纯化的重组酶溶液进行透析后用于反应。 [0092] 用SDS‑PAGE检测各纯化的酶的分子量，结果证实CT1(α‑葡聚糖磷酸化酶)的分子量为约96kDa，CT2(葡萄糖磷酸变位酶)的分子量为约53kDa，TN1(葡萄糖‑6‑磷酸‑异构酶)的分子量为约51kDa。 [0093] 实施例3：检测塔格糖‑二磷酸醛缩酶的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶的活性3‑1.包含塔格糖‑二磷酸醛缩酶基因的重组表达载体和重组微生物的制备 [0094] 为了鉴定本发明的新型耐热性的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶，获得了来自嗜热微生物Kosmotoga olearia、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)、Rhodothermus profundi和Limnochorda pilosa的塔格糖‑二磷酸醛缩酶的基因信息，并制备了可在大肠杆菌中表达的重组载体和重组微生物。 [0095] 具体而言，从登记于基因库和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书)中的Kosmotoga olearia或海洋红嗜热盐菌ATCC 43812、Rhodothermus profundi DSM 22212和Limnochorda pilosa DSM 28787的核苷酸序列中，选取塔格糖‑二磷酸醛缩酶的核苷酸序列，并且基于四种微生物的氨基酸序列信息(SEQ ID NO：1、3、5和7)和核苷酸序列(SEQ ID NO：2、4、6和8)，制备了包含所述酶的核苷酸序列且可在大肠杆菌中表达的重组载体pBT7‑C‑His‑CJ_KO_F6P4E、pBT7‑C‑His‑CJ_RM_F6P4E、pBT7‑C‑His‑CJ_RP_F6P4E和pBT7‑C‑His‑CJ_LP_F6P4E(Bioneer Corp.，韩国)。 [0096] 通过热激转化(Sambrook and Russell:Molecular cloning,2001)将制备的各表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中制备重组微生物，并冷冻保存在50％甘油后使用。将转化微生物分别命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E和大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F6P4E，并分别以保藏号KCCM11999P(保藏日：2017年3月24日)、KCCM12096P(保藏日：2017年8月11日)、KCCM12097P(保藏日：2017年8月11日)及KCCM12095P(保藏日：2017年8月11日)，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)。 [0097] 为了鉴定新型耐热性的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶，从登记在基因库中的嗜热微生物Thermanaerothrix daxensis的核苷酸序列选取了预期为所述酶的核苷酸序列，基于微生物的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)和核苷酸序列(SEQ ID NO：10)的信息，将基因插入到包含所述酶的核苷酸序列且可在大肠杆菌中表达的重组载体pBT7‑C‑His(Bioneer Corp.，韩国)，从而制备命名为pBT7‑C‑His‑CJ_td1的重组表达载体。利用常用的转化方法(参见Sambrook et al.1989)将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株，制备命名为大肠杆菌BL21(DE3)/pBT7‑C‑His‑CJ_td1的转化子(转化微生物)。于2017年3月20日，按照《布达佩斯条约》的规定，将所述转化子以保藏号KCCM11995P(大肠杆菌BL21(DE3)/pBT7‑C‑His‑CJ_td1)保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)。 [0098] 3‑2.重组塔格糖‑二磷酸醛缩酶的制备 [0099] 为了从制备的重组微生物中制备重组酶CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E、CJ_LP_F6P4E和CJ_TD1_F6P4E，将各重组微生物接种至装有5ml含有氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基的培养管中，然后在37℃的振荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将种菌培养中获得的培养物接种至含有LB液体培养基的培养瓶中，然后进行主培养。当600nm的吸光度达到2.0时，加入1mM的IPTG(异丙基‑β‑D‑1‑硫代吡喃半乳糖苷)诱导重组酶的表达和产生。在180rpm和37℃的条件下进行种菌培养和主培养。然后，将各主培养物在8,000×g和4℃下离心20分钟以回收细胞。用25mM Tris‑HCl(pH 7.0)缓冲液将回收的细胞清洗两次，然后于相同的缓冲液中悬浮，用超声仪粉碎悬浮的细胞。将各细胞裂解液在13,000×g和4℃下离心20分钟，仅提取上清液。使用多聚组氨酸亲和层析法纯化上清液，并应用10倍柱体积的含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以除去非特异性结合的蛋白。接下来，进一步用含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液进行洗脱和纯化。使用25mM Tris‑HCl(pH 7.0)缓冲液进行透析，获得纯化的酶CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E、CJ_LP_F6P4E和CJ_TD1_F6P4E用以进行酶表征。 [0100] 3‑3.重组塔格糖‑二磷酸醛缩酶的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构酶活性分析[0101] 对实施例3‑2中获得的重组塔格糖‑二磷酸醛缩酶的果糖‑6‑磷酸‑4‑差向异构化活性进行分析。具体而言，将1重量％的底物果糖‑6‑磷酸悬浮于25mM Tris‑HCl(pH 7.0)缓冲液，并加入各1单位/ml的纯化的CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E、CJ_LP_F6P4E和CJ_TD1_F6P4E，并于60℃反应1小时。为了去除磷酸，添加1单位/ml的磷酸酶(小牛肠碱性磷酸酶，NEB)并于37℃反应1小时。利用HPLC分析反应产物。HPLC分析在如下条件下进行：SP0810(Shodex)柱、流动相(水)80℃、流速1ml/min。利用折射率检测器对产物进行分析。 [0102] 结果，证实了CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E和CJ_LP_F6P4E均具有将果糖‑6‑磷酸转化为塔格糖‑6‑磷酸的活性(图1a‑1d)。 [0103] 也证实了CJ_TD1_F6P4E具有将果糖‑6‑磷酸转化为塔格糖‑6‑磷酸的活性(图5)。 [0104] 实施例4：塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶(D‑tagatose‑6‑phosphate phosphatase)的鉴定[0105] 为了于本发明的塔格糖制备路径中利用同步复合酶反应自果糖‑6‑磷酸制备塔格糖，鉴定了可与塔格糖‑二磷酸醛缩酶同时进行酶反应的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶。 [0106] 4‑1.包含塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶基因的重组表达载体及重组微生物的制备[0107] 从登记在基因库中的海栖热袍菌的核苷酸序列选取预期为塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：12，以下称为t4)和氨基酸序列(SEQ ID NO：11)，并且根据所述所选核苷酸序列设计并合成了正向引物(SEQ ID NO：33)和反向引物(SEQ ID NO：34)。用所述引物和海栖热袍菌的基因组DNA作为模板通过聚合酶链式反应(PCR)扩增t4基因。使用限制性酶NdeI和XhoI将扩增的基因插入到可在大肠杆菌中表达的质粒载体pET21a(Novagen)，从而制备命名为pET21a‑CJ_t4的重组表达载体。通过热激转化(Sambrook and Russell:Molecular cloning,2001)将制备的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以制备重组微生物，然后将其冷冻保存在50％甘油中待用。将所述重组微生物命名为大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_t4，，并于2017年3月20以保藏号KCCM11994P日，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)。 [0108] 4‑2.重组塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的制备 [0109] 将大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a‑CJ_t4接种到装有5ml的LB液体培养基的培养管中，然后在37℃的震荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将通过种菌培养获得的培养物接种到含有LB液体培养基的培养瓶中，然后进行主培养。当600nm的吸光度达到2.0时，加入1mM的IPTG诱导重组酶的表达和产生。在180rpm震荡速度和37℃的条件下进行种菌培养和主培养。然后，将主培养的培养物在8,000×g和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris‑HCl(pH 8.0)缓冲液将回收的细胞清洗两次，并悬浮于相同的缓冲液，随后用超声仪粉碎细胞。将细胞裂解液在13,000×g和4℃下离心20分钟，仅取出上清液。使用多聚组氨酸标签亲和层析法自上清液中纯化酶。使用50mM Tris‑HCl(pH 8.0)缓冲液对纯化的酶进行透析，将纯化的重组酶命名为CJ_T4。 [0110] 4‑3.CJ_T4的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶活性的分析 [0111] 为了分析CJ_T4的活性，将塔格糖‑6‑磷酸悬浮于50mM Tris‑HCl(pH7.5)缓冲液，向其中加入0.1单位/ml纯化的CJ_T4和10mM MgCl2，并于70℃下反应10分钟。然后，利用HPLC对反应产物进行分析。HPLC分析在如下条件下进行：HPX‑87H(Bio‑Rad)柱、流动相(水)60℃、流速0.6ml/min。利用折射率检测器对塔格糖和塔格糖‑6‑磷酸进行分析。 [0112] 结果，于反应产物中生成了塔格糖。在磷酸和塔格糖反应物中添加所述CJ_T4后进行相同的反应，结果未形成塔格糖，表明CJ_T4具有不可逆的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶活性(图3)。 [0113] 实施例5：利用同步复合酶反应制备塔格糖 [0114] 将悬浮于25mM Tris‑HCl(pH 7.0)缓冲液的1％(w/v)的果糖‑6‑磷酸添加至1单位/ml的CJ_KO_F6P4E或CJ_RP_F6P4E和1单位/ml的CJ_t4(保藏号KCCM11994P)的混合酶溶液中，并于60℃下反应1小时，然后利用HPLC分析反应产物。HPLC分析在如下条件下进行：SP0810(Shodex)柱、流动相(水)80℃、流速1ml/min。利用折射率检测器检测到塔格糖。 [0115] 结果，观察到了塔格糖的生成，表明可利用塔格糖‑二磷酸醛缩酶和塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶的同步复合酶反应由果糖‑6‑磷酸制备塔格糖(图2a和2b)。 [0116] 实施例6：利用同步复合酶反应自麦芽糊精制备塔格糖 [0117] 为了分析利用复合酶自麦芽糊精制备塔格糖的活性，将5％(w/v)的麦芽糊精添加至含有1单位/ml的CT1、1单位/ml的CT2、1单位/ml的TN1、1单位/ml的T4、1单位/ml的TD1、20mM至50mM磷酸钠(pH 7.0)的反应溶液中，并于60℃下反应1小时，然后利用HPLC分析反应产物。HPLC分析在如下条件下进行：SP0810(Shodex)柱、流动相(水)80℃、流速0.6ml/min，并利用折射率检测器检测塔格糖。 [0118] 结果证实，可以利用添加CT1、CT2、TN1、T4和TD1的复合酶反应自麦芽糊精制备塔格糖(图6)。 [0119] 有益效果 [0120] 根据本发明的制备塔格糖的方法由于使用葡萄糖或淀粉为原料而具有经济性，不堆积磷酸而达到较高的转化率，且因包含为不可逆反应路径的塔格糖‑6‑磷酸磷酸酶反应，因此显著提高向塔格糖的转化率。 [0121] 此外，可以利用复合酶反应以葡萄糖或淀粉为原料制备塔格糖，因此本发明的方法具有简单、经济且改善产率的优点。 [0123] 关于微生物保藏的说明 [0124] (细则13之二) [0125] [0126] PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版) [0127] 申请人或代理人档案号P18‑6041 国际申请号 [0128] 关于微生物保藏的说明 [0129] (细则13之二) [0130] [0131] PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版) [0132] 申请人或代理人档案号P18‑6041 国际申请号 [0133] 关于微生物保藏的说明 [0134] (细则13之二) [0135] [0136] PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版) [0137]申请人或代理人档案号P18‑6041 国际申请号 [0138] 关于微生物保藏的说明 [0139] (细则13之二) [0140] [0141] PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版) [0142] 申请人或代理人档案号P18‑6041 国际申请号 [0143] 关于微生物保藏的说明 [0144] (细则13之二) [0145] [0146] PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版) [0147] 申请人或代理人档案号P18‑6041 国际申请号 [0148] 关于微生物保藏的说明 [0149] (细则13之二) [0150] [0151] PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版) [0152] 申请人或代理人档案号P18‑6041 国际申请号 [0153] 关于微生物保藏的说明 [0154] (细则13之二) [0155] [0156] PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版) [0157] 申请人或代理人档案号P18‑6041 国际申请号 [0158] 关于微生物保藏的说明 [0159] (细则13之二) [0160] [0161] PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版) [0162]申请人或代理人档案号P18‑6041 国际申请号 [0163] 关于微生物保藏的说明 [0164] (细则13之二) [0165] [0166] PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版) [0167]申请人或代理人档案号P18‑6041 国际申请号 [0168] 关于微生物保藏的说明 [0169] (细则13之二) [0170] [0171] PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版) |
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