一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其构建方法和在赤霉菌中的应用 |
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| 申请号 | CN202110965413.3 | 申请日 | 2021-08-20 | 公开(公告)号 | CN113584033A | 公开(公告)日 | 2021-11-02 |
| 申请人 | 南京师范大学; | 发明人 | 黄和; 施天穹; 杨彩玲; 沈琦; 彭倩倩; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其构建方法和在赤霉菌中的应用，该系统为骨架质粒pCpf1Ff‑DR，包括Fncpf1基因、功能性crRNA基因、启动子pGPD、启动子pTRPC、强RNA聚合酶III型启动子5srRNA、潮霉素筛选标记hph。本发明系统效率高、通用性强、易于操作而被迅速应用于丝状 真菌 赤霉菌中，通过该基因编辑系统可用于赤霉菌中实现长达17kb的比卡菌素基因簇的敲除。本发明首次在赤霉菌中实现大 片段 基因敲除，且首次发现比卡菌素基因簇敲除有利于提高赤霉素产量，该方法有望进一步用于改造赤霉素工业菌，缩短菌株升级的时间，为提高赤霉素产量、增加经济效益提供了强有 力 保障。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统，其特征在于，所述系统为骨架质粒pCpf1Ff‑DR，主要包括Fncpf1基因、功能性crRNA基因、启动子pGPD、启动子pTRPC、强RNA聚合酶III型启动子5srRNA、潮霉素筛选标记hph；所述强启动子pGPD转录Fncpf1基因，强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA，所述启动子pTRPC表达潮霉素筛选标记hph。 |
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| 说明书全文 | 一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其构建方法和在赤霉菌中的应用 技术领域[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其构建方法和在赤霉菌中的应用。 背景技术[0002] 在丝状真菌如赤霉素中中进行基因编辑具有重大意义，丝状真菌是一类在蛋白分泌、活性次级代谢物生产、环境污染治理等方面起着重要作用的微生物，关于它们的各项基础和应用研究均高度依赖基因编辑平台。丝状真菌在商业化生产酶、异源蛋白质、广泛的初级和次级代谢产物以及生物燃料等方面具有巨大价值，提高真菌商业应用潜力的方法之一是通过基因工程进行菌株改良。然而，丝状真菌的顶端生长、异核性、同源重组效率低和遗传标记匮乏等生理特点为构建这类微生物成熟的基因编辑平台带来挑战。 [0003] 现有技术中丝状真菌的代谢途径进行编辑的方法有同源重组技术和CRISPR‑Cas9技术，这两种方法都存在一些问题：基于单同源交换或者双同源臂交换的基因敲除、整合技术效率低且费时费力，且面临着筛选标记不够的问题。CRISPR‑Cas9基因组编辑在加速这种微生物和其他微生物的代谢工程中发挥了重要作用，虽然有一套合成生物学工具用于赤霉菌的基因工程，但需要多用途的工具加快菌株的产生。近年来，基于CRISPR‑Cas系统在丝状真菌中得到越来越广泛的应用。由于构成简单、靶向特异，CRISPR‑Cas系统极大促进了丝状真菌的基因编辑，包括基因插入、缺失、碱基转换和转录激活等。编辑的基因包括标记基因、非筛选标记的其他功能基因、功能未知的基因，甚至多个基因。最近，CRISPR/Cas9在丝状真菌中的应用已经显示在几种真菌菌株中，例如烟曲霉、米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、里氏木霉等。 [0004] 赤霉菌以生产一系列的植物生长激素—赤霉素(Gibberellins，简称GAs)而闻名。赤霉素是一种天然的可以影响植物生长的激素，它的调节能力很强，包括具有解除种子和块茎的睡眠、促进植物生长发育、加快果实成熟等功能，因而在农业上得到了广泛的运用。 随着对赤霉素研究的不断加深，已经有超过136种不同结构的赤霉素类(编号GA1‑GA136)化合物被发现，其中只有GA1、GA3、GA4、GA7等具有生物活性，目前工业化生产的赤霉素主要为GA3，但是GA3发酵产量低，发酵时间长，导致价格及其昂贵，因此在赤霉菌中建立高效的基因编辑系统来提高GA3产量刻不容缓。 [0005] 比卡菌基因簇中包含有6个蛋白，分别为bik1，bik2，bik3，bik4，bik5，bik6，其中bik1、bik2和bik3酶被预测负责比卡菌素的合成，bik4和bik5被预测为转录调控因子，bik6被推测为是一个渗透酶或转运蛋白。 [0006] 赤霉菌由于内在遗传操作体系还不成熟，强启动子匮乏，丝状真菌做成感受态(原生质体)破壁效率不高，需要不断优化条件，还没有基因编辑相关报道，而CRISPR/Cpf1系统更没有应用在赤霉菌的基因编辑中，也没有通过CRISPR/Cpf1系统敲除基因提高赤霉素产量的方法。 发明内容[0007] 发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种可在丝状真菌如赤霉菌中进行基因编辑的CRISPR/Cpf1系统，该CRISPR/Cpf1系可以在赤霉菌中进行基因敲除和整合。解决了现有同源重组技术的基因敲除、整合技术效率低且费时费力，且面临着筛选标记不够的问题，也克服了CRISPR‑Cas9基因组编辑需要多用途的工具加快菌株的产生和多基因编辑效率不高等问题。本发明首次构建了一种全新的CRISPR/Cpf1基因编辑系统，不同于在植物、酵母中报道的CRISPR/Cpf1基因编辑系统，并可以有效用于丝状真菌赤霉菌中。更重要的是，本发明首次将基因编辑系统应用于敲除大片段比卡菌素基因簇，不仅克服了大片段删除基因的难度，而且成功尝试了通过删除基因簇有效提高赤霉素产量，该系统有望进一步用于改造赤霉素工业菌，缩短菌株升级的时间，为提高赤霉素产量、增加经济效益提供了强有力保障。 [0008] 本发明还提供所述CRISPR/Cpf1基因编辑系统的构建方法和在赤霉菌中的应用。 [0009] 技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统，所述系统为骨架质粒pCpf1Ff‑DR，主要包括Fncpf1基因、功能性crRNA基因、启动子pGPD、启动子pTRPC、强RNA聚合酶III型启动子5srRNA、潮霉素筛选标记hph；所述强启动子pGPD转录Fncpf1基因，强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA，所述启动子pTRPC表达潮霉素筛选标记hph。 [0010] 作为优选，所述5srRNA与crRNA序列之间为SpeI酶切位点。 [0011] 其中，所述强启动子pGPD转录Fncpf1基因，pGPD的序列如SEQ ID NO.1所示，FnCpf1的序列如SEQ ID NO.2所示。 [0012] 其中，所述强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA，5srRNA序列如SEQ ID NO.3所示，crRNA的序列如SEQ ID NO.4所示。 [0013] 其中，所述所述启动子pTRPC转录潮霉素筛选标记hph，启动子pTRPC的序列如SEQ ID NO.5所示，潮霉素筛选标记hph的标记如SEQ ID NO.6所示。 [0014] 本发明所述的CRISPR/Cpf1基因编辑系统的构建方法，包括如下步骤： [0015] (1)以质粒pUC‑fFuCas9‑HTBNLS‑hph为模板设计引物，扩增得到不含fFuCas9基因的骨架线性片段，将此片段骨架与Fncpf1基因经过一步克隆之后得到的重组质粒为pCpf1Ff； [0016] (2)以重组质粒pCpf1Ff为骨架酶切得到线性化的质粒pCpf1Ff片段； [0017] (3)以质粒pUC‑FfCas9‑HTB‑5srRNA‑FCC1为模板，设计引物，扩增得到基因DR基因表达盒； [0018] (4)将线性化的质粒pCpf1Ff和构建的DR基因表达盒，克隆得到重组质粒pCpf1Ff‑DR即为本发明的CRISPR/Cpf1基因编辑系统。 [0019] 其中，步骤(1)中引物为SEQ ID NO.7‑8所示。 [0020] 其中，步骤(3)中引物为SEQ ID NO.9‑10所示。 [0021] 本发明所述的CRISPR/Cpf1基因编辑系统在丝状真菌基因编辑中的应用。 [0022] 本发明所述的CRISPR/Cpf1基因编辑系统在敲除赤霉菌细胞周期蛋白G1基因FCC1中的应用。 [0023] 其中，所述应用的具体步骤为：pCpf1Ff‑DR质粒经过SpeI酶切后，插入靶向FCC1基因的N23序列，构建质粒pCpf1Ff‑DR‑FCC1，将pCpf1Ff‑DR‑FCC1质粒转化入赤霉菌原生质体中用于基因敲除。 [0024] 其中，所述插入靶向FCC1基因的N23序列为FCC1‑N23，其序列如SEQ ID NO.11所示。 [0025] 利用本发明所述的CRISPR/Cpf1基因编辑系统在敲除赤霉菌细胞大片段比卡菌素基因簇提高赤霉素产量中的应用。 [0026] 其中，所述应用的具体步骤为： [0027] (1)pCpf1Ff‑DR质粒经过SpeI酶切后，插入靶向BIK3基因的N23序列，构建质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3； [0028] (2)pCpf1Ff‑DR‑BIK3质粒经过pmeI酶切后，插入比卡菌素基因簇的上游同源臂序列，构建质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑UP； [0029] (3)pCpf1Ff‑DR‑BIK3‑UP质粒经过swaI酶切后，插入比卡菌素基因簇的下游同源臂序列，构建质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑HR； [0030] (4)将pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑HR质粒转化入赤霉菌原生质体中用于大片段比卡菌素基因簇的敲除。 [0031] 其中，所述插入质粒pCpf1Ff‑DR的靶向BIK3基因的N23序列为BIK3‑N23，其序列如SEQ ID NO.14所示。所述插入质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3的比卡菌素基因簇的上游同源臂序列为BIKi‑UP，其序列如SEQ ID NO.17所示。所述插入质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3‑UP的比卡菌素基因簇的下游同源臂序列为BIKi‑Dn，其序列如SEQ ID NO.20所示。 [0032] 进一步地，步骤(1)中扩增BIK3‑N23的引物为SEQ ID NO.15‑16所示。 [0033] 步骤(2)中扩增比卡菌素基因簇的上游同源臂序列的引物为SEQ ID NO.18‑19所示。 [0034] 步骤(3)中扩增比卡菌素基因簇的下游同源臂序列引物为SEQ ID NO.21‑22所示。 [0035] 本发明的CRISPR/Cpf1系统是一种新型的基因组编辑技术，分为两个组成部分：Fncpf1基因和crRNA基因。当crRNA识别出基因组中的靶向目标序列时，Fncpf1基因表达的Cpf1蛋白将切割该序列，产生基因组双链断裂。细胞为了存活将通过非同源末端重组在断裂处随机插入或者缺失几个碱基用以修复基因组，导致基因失活。该系统效率高、通用性强、易于操作而被迅速应用于许多不同的物种，包括各种丝状真菌。本发明在赤霉菌中开发了一套CRISPR/Cpf1基因组编辑系统，并选择了赤霉菌细胞周期蛋白(FCC1)验证该套系统的有效性，FCC1基因的破坏直接导致赤霉菌积累紫色色素。 [0036] 本发明首先构建CRISPR/Cpf1骨架质粒pCpf1Ff‑DR，该质粒主要包括两大部分:Fncpf1基因和crRNA基因。然后为了验证该套系统的有效性，选择FCC1基因作为靶位点进行敲除，即pCpf1Ff‑DR质粒骨架上插入靶向FCC1的N23序列，质粒命名为pCpf1Ff‑DR‑FCC1。将该质粒导入赤霉菌原生质体中进行基因编辑，该CRISPR/Cpf1系统利用crRNA识别目标DNA(FCC1)，Fncpf1对靶点进行切割，产生双链断裂。然后，细胞将通过非同源末端连接修复基因组，从而可用于基因敲除和整合。 [0037] 本发明利用CRISPR/Cpf1表达系统敲除赤霉素基因FCC1的方法，包括以下步骤： [0038] (1)基于赤霉菌中建立的CRISPR/Cpf1系统，首先构建CRISPR/Cpf1骨架质pCpf1Ff‑DR，该质粒骨架主要包括两大部分Fncpf1基因和crRNA基因。 [0039] (2)为了验证该套系统的有效性，选择FCC1作为靶位点进行敲除，即质粒骨架上插入FCC1的N23序列。 [0040] (3)将该质粒导入赤霉菌感受态中去进行基因编辑，敲除FCC1。 [0041] 本发明将的CRISPR/Cpf1表达系统应用于敲除大片段比卡菌素基因簇同时提高赤霉素的产量的方法，包括以下步骤： [0042] (1)已验证过该套系统的有效性，再选择大片段比卡菌素基因簇作为靶位点进行敲除，即构建质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3，选择基因簇上的BIK3的N23序列，插入到CRISPR/Cpf1骨架质粒pCpf1Ff‑DR。 [0043] (2)利用CRISPR/Cpf1系统结合同源重组技术以提高敲除大片段基因的效率，即在质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3上先后插入比卡菌素基因簇的同源臂BIKi‑UP和BIKi‑Dn，所构得质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑HR，敲除基因簇的同时将潮霉素抗性基因整合到赤霉菌基因组上，可作为阳性转化子的筛选标记。 [0044] (3)将该质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑HR导入赤霉菌感受态中去进行基因编辑，敲除卡菌素基因簇。 [0045] 本发明所述将重组质粒转化进赤霉菌的感受态中去，首先要将丝状真菌制备成球状的原生质体再进行转化。 [0046] 其中，制备赤霉菌原生质体：(1)赤霉菌单菌落接种至100mL的再生培养基,培养温度30℃，转速200RPM，培养48h。(2)接种10mL菌液到新的100mL再生培养基扩大培养12h。(3)培养液用无菌擦镜纸过滤，收集菌体。(4)配置10mL酶解液，用质量配比的混合酶Dryalase:Lysing＝3：7的混合酶(45mg：105mg)溶解于氯化钠缓冲液(10mL中有0.41g)，搅拌混匀。 0.22um滤头过滤除菌后，每10mL加入1g菌体，30℃，200RPM，酶解3.5‑4h。(5)酶解液经过3层擦镜纸过滤除去菌丝残片。(6)下面的为原生质体溶液，3000rcf离心10min，沉淀原生质体。 (7)原生质体沉淀用冰浴的STC溶液(1M山梨醇，10mM Tris‑cl，50mM CaCl2，PH＝7.5)悬浮 7 8 离心沉淀原生质体，重复一次。(8)原生质体悬浮于适量的STC溶液，调整原生质体10‑10 /mL。 [0047] 质粒转化：(1)取原生质体，加入50μLSTC溶液，加入10‑15μg(不超过20μg)质粒，冰浴20分钟。(2)加入50μL 25％的PEG6000的溶液(1M山梨醇，10mM Tris‑Cl，50mM CaCl2，PH＝7.5)混合后冰浴20分钟。(3)加入1mL PEG6000溶液，室温下混合5min，再加入2mLSTC溶液，混匀后取160μL涂布MYG固体再生平板，培养12h后，覆盖10mL浓度为100μg/ml的潮霉素软琼脂再生平板等待5‑7天转化子出现。 [0048] 本发明的利用CRISPR/Cpf1系统敲除赤霉素基因的方法，实验证明CRISPR/Cpf1系统可以在赤霉菌中进行基因FCC1的敲除，建立了高效稳定的赤霉菌遗传操作方法。 [0049] 设计原理：本发明在赤霉菌中建立了一种新型基因编辑工具:CRISPR/Cpf1，该系统分为两个组成部分：Fncpf1基因和crRNA基因。当crRNA识别出基因组中的靶向目标序列时，Fncpf1基因表达的Cpf1蛋白将切割该序列，产生基因组双链断裂。细胞为了存活将通过非同源末端重组在断裂处随机插入或者缺失几个碱基用以修复基因组，导致基因失活。具体来说，如图7所示重组载体pCpf1Ff‑DR中使用强启动子pGPD表达Fncpf1蛋白，启动子pTRPC表达潮霉素筛选标记，强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA。5srRNA与crRNA序列之间为SpeI酶切位点，用以插入靶向目标基因的N23序列，插入靶基因的N23序列之后，该质粒即为一套可进行基因敲除的完整系统。 [0050] 本发明中先选择了1个易于鉴定的靶位点FCC1验证该套系统的有效性，该靶基因的敲除直接导致积累紫色色素。pCpf1Ff‑DR质粒经过SpeI酶切后，插入FCC1基因的N23序列。利用CRISPR/Cpf1系统的基因编辑技术，可以实现在赤霉菌中进行敲除，并简化质粒构建流程。 [0051] Cpf1蛋白是一个Cas12a细菌内切酶家族，以与Cas9相似的方式靶向基因组位点，但具有处理自己的CRISPR‑RNA阵列的优势。本发明通过对crRNA的设计可以实现同时对多个基因进行编辑，从而简化了基因编辑工具的设计过程。自身的引导RNA(gRNAs)的能力可以用于容易的多路复用，crRNA可以用Array形式排列，DR后面插入不同靶基因的N23序列，即可实现多基因编辑，FnCpf1、AsCpf1和Cas9在针对单个基因时具有相似的基因组编辑效率。在Cpf1家族中，只有本发明采用的FnCpf1基因被证明具有多基因靶向的能力，Cpf1家族中有Lbcpf1、Ascpf1其他两种不同来源的内切酶，不具有上述功能。 [0052] 本发明首次将构建的CRISPR/Cpf1基因编辑系统应用到了赤霉菌这种丝状真菌中，现有文献报道还没有在赤霉菌中进行基因编辑，大多都是通过优化发酵条件来提高代谢产物的产量，主要是因为赤霉菌的内在遗传操作体系还不成熟。传统的CRISPR‑Cas9编辑效率只有25％，多靶效率更低，而本发明的CRISPR/Cpf1基因编辑系统其编辑效率达50％及以上。同时本发明也验证出此系统可应用到删除大片段基因簇，一方面克服了删除大片段的难度，另一方面本发明中通过删除比卡菌素基因簇可有效提高赤霉素产量，是通过分子技术应用于赤霉菌的一项重要突破。 [0053] 本发明中CRISPR/Cpf1成功将赤霉菌中fcc1基因成功敲除，证明本发明的敲除系统能在后期应用于敲除赤霉素代谢途径中一些关键基因中，本发明是在赤霉菌中建立了一套高效的基因编辑系统，同时也为丝状真菌的基因编辑技术提供了参考依据。 [0054] 此外，基因敲除随机性较强，很容易引起其它基因功能的丧失，同时插入的拷贝数和位置不固定，所以要敲除的片段越长越难控制基因的表达水平和功能研究，导致传统的基因敲除方案敲除片段通常较短，而目前赤霉菌没有大片段比卡菌素基因簇的报道，其基因簇删除后其功能效果也是未知的。 [0055] 本发明首次在赤霉菌中开发了一套基因组编辑系统，并选择了赤霉菌细胞周期蛋白验证该套系统的有效性，FCC1基因的破坏直接导致赤霉菌积累紫色色素。随后验证该系统删除大片段基因的潜力。以比卡菌素基因簇为例，该CRISPR/Cpf1基因编辑系统可用于赤霉菌中并能够实现长达17kb的比卡菌素基因簇的删除。此外，基因簇删除后使得赤霉素产量提高19.7％。本发明首次在赤霉菌中实现大片段基因删除，且首次发现比卡菌素基因簇的删除有利于提高赤霉素产量，该技术有望进一步用于改造赤霉素工业菌，缩短菌株升级的时间，为提高赤霉素产量、增加企业经济效益提供了强有力保障。 [0056] 相比于CRISPR/Cas9有以下优势:(1)Cpf1蛋白更小，更容易进入赤霉菌中进行编辑。(2)Cpf1切出来的是粘性末端，双键断裂后细胞更容易进行修复。(3)CRISPR‑Cpf1系统只需要crRNA，相比于CRISPR/Cas9需要tracrRNA和crRNA来说更加简单。(4)Cpf1在构建多敲除质粒时更加简便。 [0057] 此外，本发明的CRISPR/Cpf1系统非常简单，因为它不使用分开的tracrRNA而只需要指定靶DNA序列和指导RNA与Cpf1核酸酶的结合两者的40‑45个碱基长的单个短crRNA，是一种即插即用的系统，不再需要其他的组分，且crRNA可以用Array形式排列，因此使用一个启动子可以实现多个靶点crRNA的转录，构建多靶点敲除质粒更加方便，具有进行多重基因编辑的天然优势。 [0058] 本发明先验证系统有效之后敲除赤霉菌细胞周期蛋白G1基因FCC1，其它基因只需要替换CRISPR中的间隔序列N23就可以靶定不同基因，如果想实现多个基因的同时编辑，由于FnCpf1的crRNA可以用Array形式排列，因此使用一个启动子可以实现多个靶点crRNA的转录，构建多靶点敲除质粒更加方便。系统中的FnCpf1的分子量比Cas9小，有利于质粒转化，可以实现在丝状真菌中的基因编辑。 [0059] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点： [0060] (1)系统中的FnCpf1的分子量比Cas9小，有利于质粒转化。 [0061] (2)系统中的FnCpf1剪切DNA所需的crRNA长度仅为42‑44nt，只需要替换CRISPR中的间隔序列就可以靶定不同基因，实现多个基因的同时编辑，设计步骤可以显著简化，实验成本也可以显著降低，同时降低了将CRISPR/Cpf1系统递送至编辑对象的难度。 [0062] (3)FnCpf1的crRNA可以用Array形式排列，因此使用一个启动子可以实现多个靶点crRNA的转录，构建多靶点敲除质粒更加方便。 [0063] (4)Cas9和FnCpf1均是单链RNA指导的核酸内切酶，但Cas9只具有DNA内切酶活性，而FnCpf1同时具有DNA和RNA内切酶活性。 [0064] (5)在建立CRISPR/Cpf1基因组编辑系统前，首先筛选在宿主微生物中的特殊功能基因FCC1。该基因敲除后，可以明显改变转化子表型特征，以便于能够直观地观察到基因编辑事件的发生以及减少筛选阳性克隆的工作量。该策略将有助于赤霉菌中CRISPR/Cpf1系统的早期验证和建立。 [0065] (6)本发明的CRISPR/Cpf1系统非常简单，系统效率高、通用性强，因为它不使用分开的tracrRNA而只需要指定靶DNA序列和指导RNA与Cpf1核酸酶的结合两者的40‑45个碱基长的单个短crRNA，是一种即插即用的系统，不再需要其他的组分，且crRNA可以用Array形式排列，因此使用一个启动子可以实现多个靶点crRNA的转录，构建多靶点敲除质粒更加方便，具有进行多重基因编辑的天然优势。 [0066] (7)本发明首次将构建的CRISPR/Cpf1基因编辑系统应用到了赤霉菌这种丝状真菌中，现有文献报道还没有在赤霉菌中进行基因编辑，大多都是通过优化发酵条件来提高代谢产物的产量，主要是因为赤霉菌的内在遗传操作体系还不成熟，强启动子匮乏，丝状真菌做成感受态(原生质体)破壁效率不高，需要不断优化条件，而本发明有效的解决了上述问题，其编辑效率达50％及以上。本发明在赤霉菌中开发了一套CRISPR/Cpf1基因组编辑系统，并选择了赤霉菌细胞周期蛋白FCC1验证该套系统的有效性，FCC1基因的破坏直接导致赤霉菌积累紫色色素，判定fcc1基因被成功敲除。同时本发明验证此CRISPR/Cpf1基因编辑系统可行且高效后应用于敲除大片段比卡菌素基因簇，不仅克服了大片段删除基因的难度，而且首次通过删除基因簇提高赤霉素产量，该技术有望进一步用于改造赤霉素工业菌，缩短菌株升级的时间，为提高赤霉素产量，为增加经济效益提供了强有力保障。附图说明 [0067] 图1为模板质粒pUC‑fFuCas9‑HTBNLS‑hph的结构图，其中HPH表示潮霉素筛选基因，pTRPC是表达HPH基因的启动子，AmpR表示氨苄抗性基因，AmpR promoter是表达AmpR基因的启动子，FfuCas9表示藤仓赤霉菌密码子优化的Cas9基因，pGPD是表达FfuCas9的强启动子，HTB表示组蛋白H2B核定位信号。 [0068] 图2为重组质粒pCpf1Ff的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpR promoter，pGPD，HTB序列与图1所示的一样。Fncpf1表示弗朗西丝菌来源的Fncpf1基因。 [0069] 图3为模板质粒pUC‑FfCas9‑HTB‑5srRNA‑FCC1的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpR promoter，pGPD，HTB，FfuCas9与图1所示的一样。5srRNA为表达sgRNA的启动子。 [0070] 图4是重组质粒pCpf1Ff‑DR的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpR promoter，pGPD，HTB序列与图1所示的一样，Fncpf1序列与图2所示的一样，5srRNA序列与图3所示的一样，crRNA为转录序列。 [0071] 图5为重组质粒pCpf1Ff‑DR的结构简化图。 [0072] 图6是重组质粒pCpf1Ff‑DR‑FCC1的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpR promoter，pGPD，HTB，5srRNA，crRNA序列与图4所示的一样，FCC1表示靶基因的N23序列。 [0073] 图7是重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpR promoter，pGPD，HTB，5srRNA，crRNA序列与图4所示的一样，BIK3表示靶基因的N23序列。 [0074] 图8是重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑UP的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpR promoter，pGPD，HTB，5srRNA，crRNA序列与图4所示的一样，BIK3表示靶基因的N23序列，UP表示比卡菌素基因簇的上游同源臂序列。 [0075] 图9是重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑HR的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpR promoter，pGPD，HTB，5srRNA，crRNA序列与图4所示的一样，BIK3表示靶基因的N23序列，Dn表示比卡菌素基因簇的下游同源臂序列。 [0076] 图10为未采用基因编辑的对照赤霉菌。 [0077] 图11为CRISPR/Cas9敲除fcc1基因后的紫色赤霉菌转化子。 [0078] 图12为CRISPR/Cpf1敲除fcc1基因后的紫色赤霉菌转化子。 [0079] 图13为比卡菌素基因簇敲除后PCR验证图。 [0080] 图14为改造菌株发酵液液相检测图，其中上图为对照赤霉菌发酵后的液相检测图，下图为敲除比卡菌素基因簇的赤霉菌(转化子4)发酵后的液相检测图。 [0081] 图15为原始赤霉菌和敲除比卡菌素基因簇的赤霉菌发酵后GA3产量对比图，图中包括原始赤霉菌与转化子1‑8的GA3产量。 具体实施方式[0082] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 [0083] 本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。 [0084] 本发明使用的赤霉菌为市面所售普通赤霉菌，购买于中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC AF 200026，或者采用野生型的赤霉菌均可，赤霉菌以生产一系列的植物激素—赤霉素(Gibberellins，简称GAs)而闻名。 [0085] 质粒pUC‑fFuCas9‑HTBNLS‑hph、质粒pUC‑FfCas9‑HTB‑5srRNA‑FCC1的构建方法可参考文献：(Shi,T.Q.；Gao,J.；Wang,W.J.；Wang,K.F.；Xu,G.Q.；Huang,H.；Ji,X.J.J.A.S.B.,CRISPR/Cas9‑based genome‑editing in the filamentous fungus Fusarium fujikuroi and its application in strain engineering for gibberellic acid production.2019.) [0088] Driselase崩溃酶，Lysing裂解酶，购买于sigma；Lysing崩溃酶的酶活≥10units/g；Driselase崩溃酶的酶活≥10％biuret。 [0089] 实施例1 [0090] 一、基因元件的扩增与目标质粒的制备 [0091] 1、目标基因的制备 [0092] 以构建的质粒pUC‑fFuCas9‑HTBNLS‑hph(SEQ ID NO.25)(图1)为模板，设计引物HTBnls‑R(SEQ ID NO.7)和HTBnls‑F(SEQ ID NO.8)，对质粒进行扩增，得到不含fFuCas9基因的骨架线性片段，该片段作为后续重组质粒的骨架。 [0093] 根据NCB1上提供的Fncpf1序列，委托擎科生物科技有限公司合成Fncpf1，Fncpf1核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将Fncpf1基因与上述骨架线性片段通过ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，构建得到质粒pCpf1Ff，其上含有启动子pGPD(SEQ ID NO.1)‑Fncpf1‑终止子trpc‑启动子pTRPC(SEQ ID NO.5)‑潮霉素筛选标记hph(SEQ ID NO.6)表达框(图2)。再用限制性内切酶EcoRI对质粒pCpf1Ff进行酶切，回收线性质粒。将从质粒pUC‑FfCas9‑HTB‑5srRNA‑FCC1(图3)为模板，以5srRNA‑F(SEQ ID NO.9)和5srRNA‑DR‑R(SEQ ID NO.10)为引物，PCR扩增下来的5srRNA(SEQ ID NO.3)与crRNA(SEQ ID NO.4)基因采用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆(pcr体系如表1所示，pcr程序为：预变性98℃，3min；变性:98℃,10s；退火；56℃,30s；延伸；72℃,30s/kb)，构建得到质粒pCpf1Ff‑DR(图4)。再用限制性内切酶SpeI将pCpf1Ff‑DR质粒进行酶切，插入靶向FCC1基因的N23序列，构建成功的质粒命名为pCpf1Ff‑DR‑FCC1(图5)。 [0094] 根据文献中所用质粒pUC‑FfCas9‑HTB‑5srRNA‑FCC1(SEQ ID NO.26)(图3)为模板，设计引物5srRNA‑F(SEQ ID NO.9)和5srRNA‑DR‑R(SEQ ID NO.10)，扩增目的基因5srRNA(SEQ ID NO.3)与crRNA(SEQ ID NO.4)。 [0095] 根据NCB1上提供的赤霉菌的基因组，找到FCC1靶基因序列，其中PAM区的TTTN序列之后紧接着的23个碱基序列即为要插入重组质粒的基因片段，FCC1‑N23序列如SEQ ID NO.11所示。由此设计引物委托擎科生物科技有限公司合成引物FCC1‑N23‑F(SEQ ID NO.12)和FCC1‑N23‑R(SEQ ID NO.13)，将进行引物退火延伸，通过碱基互补配对合成对应的基因片段FCC1‑N23序列。 [0096] 同样地，根据NCB1上提供的赤霉菌的基因组，找到比卡菌基因簇靶基因序列(CP023081.1)，其中PAM区的TTTN序列之后紧接着的23个碱基序列即为要插入重组质粒的基因片段，本发明所用N23在比卡菌基因簇中的基因BIK3片段上，BIK3‑N23序列如SEQ ID NO.14所示。由此设计引物委托擎科生物科技有限公司合成引物BIK3‑N23‑F(SEQ ID NO.15)和BIK3‑N23‑R(SEQ ID NO.16)，将进行引物退火延伸，通过碱基互补配对合成对应的基因片段BIK3‑N23序列。 [0097] 以赤霉菌基因组为模板，设计引物BIKi‑UP‑F(SEQ ID NO.18)和BIKi‑UP‑R(SEQ ID NO.19)，扩增目的基因BIKi‑UP(SEQ ID NO.17)；同样以赤霉菌基因组为模板，设计引物BIKi‑Dn‑F(SEQ ID NO.21)和BIKi‑Dn‑R(SEQ ID NO.22)，扩增目的基因BIKi‑Dn(SEQ ID NO.20)。 [0098] 二、重组质粒的构建 [0099] 1、重组质粒pCpf1Ff的构建 [0100] 据文献中所用的质粒pUC‑fFuCas9‑HTBNLS‑hph(图1)为模板，设计引物HTBnls‑R和HTBnls‑F，进行PCR扩增，得到不含fFuCas9基因的骨架线性片段，将此片段与委托擎科生物科技有限公司合成的Fncpf1进行一步克隆最终所得重组质粒为pCpf1Ff(图2)。 [0101] 上述PCR反应中所用PCR酶为TAKARA的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶。上述PCR扩增体系如下表1： [0102] 表1 PCR扩增体系 [0103] [0104] 上述PCR的程序如下：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min)，重复35个循环。用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化回收各片段。 [0105] 一步克隆的体系如下表2： [0106] 表2一步克隆体系 [0107] [0108] X＝(0.02×克隆载体碱基对数)ng(0.03pmol) [0109] Y＝(0.02×每个片段碱基对数)ng(0.03pmol) [0110] 将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒pCpf1Ff。 [0111] 2、重组质粒pCpf1Ff‑DR的构建 [0112] 重组质粒pCpf1Ff‑DR是以pCpf1Ff为骨架，用内切酶EcoRI在37℃酶切4h，将环状TM质粒酶切成线性片段。再用AxyPrep DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化该酶切体系，得到线性化的质粒pCpf1Ff片段。 [0113] 根据文献中所用质粒pUC‑FfCas9‑HTB‑5srRNA‑FCC1(图3)为模板，设计引物5srRNA‑F和5srRNA‑DR‑R，所用PCR酶为TAKARA的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶，PCR扩增体系见上表1，扩增基因DR基因表达盒(包括启动子P5srRNA终止子T8T)。 [0114] 用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化PCR原液。 [0115] 将线性化的质粒pCpf1Ff和构建的DR基因表达盒(包括启动子P5srRNA终止子T8T)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pCpf1Ff‑DR(SEQ ID NO.27)(图4、图5)，具体步骤同重组质粒pCpf1Ff的构建。 [0116] EcoRI酶切的体系如下表3： [0117] 表3 pCpf1Ff质粒酶切体系 [0118] [0119] 3、重组质粒pCpf1Ff‑DR‑FCC1的构建 [0120] 重组质粒pCpf1Ff‑DR‑FCC1是以pCpf1Ff‑DR为骨架，用SpeI酶37℃酶切4h，将环状TM质粒酶切成线性片段。再用AxyPrep DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化该酶切体系，得到pCpf1Ff‑DR线性片段。 [0121] 根据NCB1上提供的赤霉菌的基因组，找到FCC1靶基因序列，其中PAM区的TTTN序列之后紧接着的23个碱基即为要插入重组质粒的片段，由此设计引物委托擎科生物科技有限公司合成FCC1‑N23‑F和FCC1‑N23‑R，将单链引物退火延伸，通过碱基互补配对合成对应的双链片段FCC1‑N23。 [0122] 上述PCR的程序如下：将引物FCC1‑N23‑F和FCC1‑N23‑R各加20μL配成体系，从95℃开始到16℃结束，梯度设置温度，5℃为一梯度，每个阶段一分钟。 [0123] 将线性化的质粒pCpf1Ff‑DR和通过退火延伸得到的双链片段fcc1‑N23利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pCpf1Ff‑DR‑FCC1(SEQ ID NO.23)(图6)，具体步骤同重组质粒pCpf1Ff的构建。 [0124] SpeI酶切的体系如下表4： [0125] 表4 pCpf1Ff‑DR质粒酶切体系 [0126] [0127] [0128] 4、重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3的构建 [0129] 重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3是以pCpf1Ff‑DR为骨架，用SpeI酶37℃酶切4h，将环状TM质粒酶切成线性片段。再用AxyPrep DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化该酶切体系，得到pCpf1Ff‑DR线性片段。 [0130] 根据NCB1上提供的赤霉菌的基因组，找到比卡菌基因簇序列，其中PAM区的TTTN序列之后紧接着的23个碱基即为要插入重组质粒的片段，由此设计引物委托擎科生物科技有限公司合成BIK3‑N23‑F和BIK3‑N23‑R，将单链引物退火延伸，通过碱基互补配对合成对应的双链片段BIK3‑N23。 [0131] 上述PCR的程序如下：将引物BIK3‑N23‑F和BIK3‑N23‑R各加20μL配成体系，从95℃开始到16℃结束，梯度设置温度，5℃为一梯度，每个阶段一分钟。 [0132] 将线性化的质粒pCpf1Ff‑DR和通过退火延伸得到的双链片段BIK3‑N23利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3(图7)，具体步骤同重组质粒pCpf1Ff‑DR‑FCC1的构建。 [0133] 5、重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3‑HR的构建 [0134] 重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3‑UP是以pCpf1Ff‑DR‑BIKi为骨架，先用pmeI酶37℃酶TM切4h，将环状质粒酶切成线性片段。再用AxyPrep DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化该酶切体系，得到pCpf1Ff‑DR‑BIKi线性片段。 [0135] 以赤霉菌基因组为模板，设计引物BIKi‑UP‑F和BIKi‑UP‑R，所用PCR酶为TAKARA的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶，PCR扩增体系见上表1，扩增目的基因BIKi‑UP； [0136] 用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化PCR原液。 [0137] 将线性化的质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi和构建的目的基因BIKi‑UP利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑UP(图8)。 [0138] pmeI酶切的体系如下表5： [0139] 表5 pCpf1Ff‑DR‑BIKi质粒酶切体系 [0140] [0141] 重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIK3‑HR是以pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑UP为骨架，先用swaI酶37℃TM酶切4h，将环状质粒酶切成线性片段。再用AxyPrep DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化该酶切体系，得到pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑UP线性片段。 [0142] 同样以赤霉菌基因组为模板，设计引物BIKi‑Dn‑F和BIKi‑Dn‑R，所用PCR酶为TAKARA的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶，PCR扩增体系见上表1，扩增目的基因BIKi‑Dn； [0143] 用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化PCR原液。 [0144] 将线性化的质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑UP和构建的目的基因BIKi‑Dn利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑HR(SEQ ID NO.24)(图9)。 [0145] swaI酶切的体系如下表6： [0146] 表6 pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑UP质粒酶切体系 [0147] [0148] 本实施例中使用的引物序列如表7所示。 [0149] 表7所有的引物序列 [0150] [0151] [0152] 实施例2 [0153] 赤霉菌感受态的制备 [0154] (1)赤霉菌单菌落接种至100mL的再生培养基，培养温度30℃，转速200RPM，培养48h。(2)接种10mL菌液到新的100mL再生培养基扩大培养12h。(3)培养液用无菌擦镜纸过滤，收集菌体。(4)配置10mL酶解液：用质量配比Dryalase(崩溃酶)：Lysing(裂解酶)＝3：7的混合酶(45mg，105mg)溶解于氯化钠缓冲液(10mL中含0.41g)，搅拌混匀。0.22μm滤头过滤除菌后，每10mL加入1g菌体，30℃，200RPM，酶解3.5h。(5)酶解液经过3层擦镜纸过滤除去菌丝残片。(6)过滤得到原生质体溶液，3000RPM离心10min，沉淀原生质体。(7)原生质体沉淀用冰浴的STC溶液(1M山梨醇，10mM Tris‑cl，50mM CaCl2，pH＝7.5)悬浮离心沉淀原生质 7 8 体，重复一次。(8)原生质体悬浮于适量的STC溶液，调整原生质体10‑10个/mL。 [0155] 实施例3 [0156] 重组质粒的转化 [0157] (1)取100uL实施例2的原生质体，加入50μL STC溶液，加入10μg实施例1得到的重组质粒pCpf1Ff‑DR‑FCC1，混合后冰浴20分钟。(2)加入50μL 25％的PEG6000的溶液(1M山梨醇，10mM Tris‑Cl，50mM CaCl2，pH＝7.5)混合后冰浴20分钟。(3)加入1mL PEG6000溶液，室温下混合5min，再加入2mLSTC溶液，混匀后取160μL涂布MYG固体再生平板，培养12h后，覆盖10mL浓度为100μg/ml的潮霉素软琼脂再生平板等待5‑7天转化子出现。平板上得到了预期的紫菌，(赤霉菌本身是白色的，FCC1被敲除才会有的现象)，同时基因组测序结果说明FCC1基因被成功敲出了。 [0158] 通过将重组质粒pCpf1Ff‑DR‑FCC1转化到赤霉菌感受态涂布20个平板，又覆盖潮霉素抗性，结果长出来约30个转化子，其中有17个菌显紫色(图10为空白对照，图12为采用CRISPR/Cpf1技术敲除后FCC1基因后的紫色的赤霉菌)，也就是FCC1基因被成功敲除。 [0159] 此外，本发明中采用传统的CRISPR‑Cas9编辑效率一般只有20％(图11)，多靶效率更低，而本发明的CRISPR/Cpf1基因编辑系统其编辑效率达至少50％及以上(详见表1和2)。相对于传统的基因编辑技术CRISPR/Cpf1效率较高。 [0160] 计算公式：基因编辑效率＝验证敲除成功的转化子个数/板上所有长出来的转化子个数·100％。 [0161] 其中，传统的CRISPR‑Cas9采用同样的骨架，区别在于本发明是Fncpf1基因替换为cas9基因，同时两者的crRNA不同，cas9基因和crRNA可参考文献：(Shi,T.Q.；Gao,J.；Wang,W.J.；Wang,K.F.；Xu,G.Q.；Huang,H.；Ji,X.J.J.A.S.B.,CRISPR/Cas9‑based genome‑editing in the filamentous fungus Fusarium fujikuroi and its application in strain engineering for gibberellic acid production.2019.) [0162] 表1.三次对照试验CRISPR‑Cas9对FCC1基因的编辑效率 [0163] [0164] [0165] 表2.三次对照试验CRISPR‑Cpf1对FCC1基因的编辑效率 [0166] [0167] 实施例4 [0168] 按照实施例3的方法将重组质粒pCpf1Ff‑DR‑BIKi‑HR，转化到赤霉菌感受态涂布20个平板，又覆盖潮霉素抗性，挑出8个阳性转化子，转接到100mL的YPD培养基，30℃, 200RPM培养48h后提基因组进行PCR验证，如果扩增出2002bp，说明该基因簇已经敲除。图13显示8个转化子在2000bp左右都可以扩增出对应条带，说明这8个转化子中的比卡菌基因簇均被成功敲除，同时基因测序结果也验证了敲除成功。 [0169] 将原始赤霉菌和改造后的8个转化子接种到YPD，30℃，200RPM培养16h，按照体积比10％接种量转接到YPD培养基中，30℃，200rpm发酵培养5天后，过滤培养物，然后使用高效液相色谱检测GA3产量。检测方法：甲醇/水/磷酸(68∶32∶0.05)的流动相，以0.7毫升/分钟的流速分离预处理的样品，检测波长为210nm，进样量为10微升。GA3的保留时间分别为21.206分钟。通过液相测定结果表明敲除比卡菌基因簇的赤霉菌在相同的条件下GA3的产量比对照原始赤霉菌提高了19.7％(图14和图15)。 |
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