一株新的藤仓镰刀菌及其发酵生产赤霉素A4的方法专利检索-含赤霉素烷环体系的化合物（如赤霉素）的制备专利检索查询-专利查询网

一株新的藤仓镰刀菌及其发酵生产赤霉素A4的方法
申请号	CN201510630480.4	申请日	2015-09-29	公开(公告)号	CN105524840B	公开(公告)日	2018-06-22
申请人	浙江钱江生物化学股份有限公司;			发明人	吴烨飞; 李震宇;
摘要	一种赤霉菌，菌种于2015年7月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.11101，分类命名藤仓镰刀菌，菌种的拉丁学名Fusarium fujikuroi。所述菌株是从原赤霉素A4+7生产菌种筛选诱变而成。利用所述的藤仓镰刀菌发酵生产赤霉素A4的方法为：先经平板培养将菌种活化，然后经种子培养、发酵培养得到目标产物赤霉素A4。其发酵水平达到1447mg/L，同时副产物赤霉素A7占发酵混合产物（GA4+7）的4%以下，产物情况稳定，适合于工业化生产。
权利要求	1.一株新的藤仓镰刀菌，拉丁学名Fusarium fujikuroi，2015年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.11101。 2.如权利要求1所述的藤仓镰刀菌菌株，其特征在于，在正常发酵条件下发酵产生赤霉素A4，发酵水平达到1447 mg/L，副产物赤霉素A7在赤霉素A4+7混合物中所占比例小于4%。 3.一种利用权利要求1所述藤仓镰刀菌发酵生产赤霉素A4的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将权利要求1所述菌种接至PDA培养基，PDA培养基的组成为(g/L)：土豆汁150 250、~ 葡萄糖10 30和琼脂15 20，在pH6.0 7.0，温度24 30 ℃条件下，培养3 6天，得到活化的藤~ ~ ~ ~ ~ 仓镰刀菌菌落；（2）将活化的藤仓镰刀菌菌落接种至含有种子培养基的摇瓶中，种子培养基组成如下(g/L)：蔗糖30 50、黄豆粉 10 15、NH4NO3 1.0 2.0、MgSO4·7H2O 1.4 2.0和KH2PO4 1.0~ ~ ~ ~ ~ 2.0，在pH 6.0 7.0，温度26 32 ℃，摇床转速160 220 rpm条件下，培养1 3天，得到种子液； ~ ~ ~ ~ （3）将种子培养物以3% 10%（v/v）的比例接种至发酵培养基，发酵培养基组成如下(g/~ L)：碳源100~150、氮源20~60、K2SO4 1.0~3.0、MgSO4·7H2O 0.8~1.2和ZnSO4·7H2O 5×10-3~ 1×10-2，在pH 6.0 7.0，温度26 35 ℃，摇床转速160 220 rpm条件下，培养7 10天，得到发~ ~ ~ ~ 酵液。 4.如权利要求3所述的利用藤仓镰刀菌发酵生产赤霉素A4的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的碳源，可以是淀粉、乳糖、蔗糖和葡萄糖中的一种或者几种的组合。 5.如权利要求3所述的利用藤仓镰刀菌发酵生产赤霉素A4的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的氮源，可以是黄豆饼粉、玉米浆干粉和玉米蛋白粉中的一种或者几种的组合。
说明书全文	一株新的藤仓镰刀菌及其发酵生产赤霉素A4的方法技术领域 [0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，涉及到利用一株新的藤仓镰刀菌发酵生产赤霉素A4的方法，特别是发酵液中副产物赤霉素A7占赤霉素A4+7在4%以下。背景技术 [0002] 本发明涉及的赤霉素A4，其结构式如下： [0003] [0004] 赤霉素（Gibberellins, GA）属四环二萜类化合物，是一类内源性植物调节物质，广泛存在于植物中，至今已分离鉴定129种该类物质。该类物质对种子萌发、茎叶生长、抽苔座果和块茎形成等有显著调节作用，于粮食、蔬菜水果的种植生产上应用广泛。 [0005] 目前，赤霉素A3及赤霉素A4+7是市面上主要的赤霉素类产品，工业上常用微生物发酵生产。近年来，赤霉素A4+7在经济作物方面的应用得到关注，如保花保果、打破休眠等。但是，在应用过程中赤霉素A4和赤霉素A7发挥的作用存在明显差异，甚至起到反作用。如赤霉素A4可促进植物花芽形成，而赤霉素A7会对第二年开花造成不良影响；在促进茎枝伸长方面，赤霉素A7的效果大于赤霉素A4，赤霉素A7含量过高会提高果锈病变的概率，等等。因此，研究如何得到高含量的赤霉素A4产品具有较大的实际意义。 [0006] 由于发酵工艺所限，目前工业上发酵法直接生产得到的都是赤霉素A4+7的混合物，且赤霉素A7的含量普遍大于30%。为得到高含量赤霉素A4产品，企业一般采用破坏发酵液中赤霉素A7组份的方法来提高赤霉素A4含量，如专利CN 1111286A，申请号95102240.7中提到利用酸水解法以破坏发酵液中的赤霉素A7以提高赤霉素A4含量，过程中占发酵混合物30%以上的赤霉素A7被破坏。该方法使下游分离工艺变得复杂，不利于企业生产成本的控制。而其他如高效液相色谱、薄层层析等分离方法则存在分离速度不好控制、设备昂贵、生产规模不易放大等缺点。非工业应用的只产赤霉素A4的菌种曾被报道，Wilhelm Rademacher等(Bioche. And Biophy.Res.Comm.91(1),1979)发现木薯疮痂病的病原菌Sphaceloma Monihoticola只产赤霉素A4，但赤霉素A4的产量仅为400μg/L发酵液，无法达到工业生产的最低水平，且至今未见进一步报道。 [0007] 高水平的适合于工业生产的发酵法直接生产得到高含量赤霉素A4产品的菌种及技术方法未见报道。发明内容 [0008] 本发明的目的在于提供一种藤仓镰刀菌及利用该藤仓镰刀菌发酵生产赤霉素A4的方法，其发酵液中副产物赤霉素A7含量占赤霉素A4+7总量4%以下；在于通过发酵培养基的优化提高赤霉素A4产量。 [0009] 本发明的技术方案为：第一个方面，一种藤仓镰刀菌，菌种于2015年7月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO.11101，分类命名藤仓镰刀菌，菌种的拉丁学名Fusarium fujikuroi。所述的藤仓镰刀菌，其发酵产生高水平的赤霉素A4，发酵水平达到1447 mg/L，同时副产物赤霉素A7占发酵混合产物（GA4+7）的4%以下。以上所述菌株是从原赤霉素A4+7生产菌种筛选诱变而成。具体诱变过程如下： [0010] （1）菌丝体富集从斜面挑取活化后的菌丝体于装有30mL液体培养基的250mL锥形瓶中，在26 35 ℃，摇床转速160 220 rpm条件下，培养2 3天。~ ~ ~ [0011] 富集培养基的组成为(g/L)：蔗糖30~50、黄豆粉 10~15、NH4NO3 1.0~2.0、MgSO4·7H2O 1.4~2.0和KH2PO4 1.0~2.0。 [0012] （2）原生质体制备将培养好的菌丝体用无菌滤纸过滤至无菌离心管，用缓冲液洗涤3次后吸干多余水分，按100mL制备好的湿菌丝对应加入1.5mL酶液的比例往菌丝体中加入预先配制好的酶液并置于30℃摇床上50 rpm震荡4h，得到原生质体。 [0013] 缓冲液的配制：称取2.6g Na2HPO4,12.8g NaH2PO4, 14.5g NaCl，用蒸馏水定容至500mL，用Na2HPO4调pH至6.0。高压蒸汽灭菌后待用。 [0014] 酶液的配制：称取纤维素酶、溶菌酶及蜗牛酶溶解于上述缓冲液中，使三种酶的浓度分别达到1.5%、0.7%、0.5%（w/v）。0.22nm微孔滤膜过滤除菌待用。 [0015] （3）原生质体紫外处理及再生将原生质体制备液用缓冲液稀释后涂于再生平板，紫外照射3min，遮光培养3天。 [0016] 再生培养基组成(g/L)：土豆汁150 250、葡萄糖10 30和琼脂15 20。~ ~ ~ [0017] （4）发酵培养及稳定性测试挑取再生平板上长势较好的单菌落，经种子培养、发酵培养后，检测发酵液中赤霉素A4及赤霉素A7的浓度。检测发现一株赤霉素A4含量占赤霉素A4+7 96%的菌株。经过五代发酵培养，赤霉素A4的含量均在96%以上，且赤霉素A4的浓度稳定在800ug/mL以上。该菌株发酵产赤霉素A4表现十分稳定。 [0018] 种子培养基组成为(g/L)：蔗糖30~50、黄豆粉 10~15、NH4NO3 1.0~2.0、MgSO4·7H2O 1.4~2.0和KH2PO4 1.0~2.0。 [0019] 发酵培养基的组成为(g/L)：玉米淀粉 80~100、花生粉 20~30、ZnCl2 0.5、Al2O3 0.8和CaCO3 15。 [0020] 筛选得到的菌株菌丝缠绕分枝、分隔；菌落白色，生长旺盛，质地绒状，表面平坦，菌落反面黄色，无渗出液和可溶性色素产生。该菌的宏观和显微形态图如图1和图2所示。 [0021] 第二个方面，一种利用上述藤仓镰刀菌发酵生产赤霉素A4的方法，先经平板培养将菌种活化，然后经种子培养、发酵培养得到目标产物赤霉素A4，其具体步骤为： [0022] （1）平板培养：将菌种接至PDA培养基，在pH6.0 7.0，温度24 30 ℃条件下，培养3~ ~ ~6天，得到活化的赤霉菌菌落。 [0023] PDA培养基的组成为(g/L)：土豆汁150 250、葡萄糖10 30和琼脂15 20。~ ~ ~ [0024] （2）种子培养：从PDA培养基上挑取1 2个活化的赤霉菌菌落到装有种子培养基的~摇瓶中，在pH 6.0 7.0，温度26 32 ℃，摇床转速160 220 rpm条件下，培养1 3天，得到种子~ ~ ~ ~ 液。种子培养基的装液量为摇瓶体积的10% 20%。 ~ [0025] 种子培养基的组成为(g/L)：蔗糖30~50、黄豆粉 10~15、NH4NO3 1.0~2.0、MgSO4·7H2O 1.4~2.0和KH2PO4 1.0~2.0。 [0026] （3）发酵培养：将种子液按发酵培养基体积的3% 10%比例接种于装有发酵培养基~的摇瓶中，在pH 6.0 7.0，温度26 35 ℃，摇床转速160 220 rpm条件下，培养7 10天，得到~ ~ ~ ~ 发酵液。发酵培养基的装液量为摇瓶体积的10% 20%。 ~ [0027] 发酵培养基的组成为(g/L)：碳源100~150，氮源 20~60、K2SO4 1.0~3.0、MgSO4·7H2O 0.8~1.2和ZnSO4·7H2O 5×10-3~1×10-2。附图说明 [0028] 图1是本发明所述藤仓赤霉菌的宏观形态图。 [0029] 图2是本发明所述藤仓赤霉菌的显微形态图。具体实施方式 [0030] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。 [0031] 实施例1： [0032] （1）种子培养：种子培养基组成为(g/L)：蔗糖40、黄豆粉12、NH4NO3 1.2、MgSO4·7H2O 1.5和KH2PO4 1.5，装液量25/250 mL。灭菌后用无菌牙签将单一的活化的菌落从平板刮下，置入装有2 mL水及约20颗直径0.3 mm无菌玻璃珠的试管中强烈震荡10 min，打散混匀，吸取0.5 mL于种子培养基中，在温度30 ℃，摇床转速200 rpm条件下，培养48 h，得到种子液。 [0033] 种子培养前，先将菌种接至PDA培养基，PDA培养基的组成为(g/L)：土豆汁150~250、葡萄糖10 30和琼脂15 20，在pH6.0 7.0，温度24 30 ℃条件下，培养3 6天，得到活化~ ~ ~ ~ ~ 的赤霉菌菌落。 [0034] （2）发酵培养：发酵培养基（配方1）组成为(g/L)：淀粉120，黄豆饼粉10、玉米浆干粉30、K2SO4 2.0、 MgSO4·7H2O 1.0和ZnSO4·7H2O 5×10-3，装液量50/500 mL。接种时，将2 mL种子液接入发酵培养基中，在31 ℃，摇床转速200 rpm条件下，培养9天，得到发酵液。 [0035] （3）产物检测：取0.25 mL发酵液加入4.75mL甲醇, 强烈震荡10 min后, 离心处理 (2600 rpm ,10 min), 取上清液HPLC 分析。HPLC条件：Hypersil BDS C18 反相色谱柱(150 mm × 4.6 mm)；流动相甲醇–水(60∶40，v/v)溶液，流速0.80 mL/min；紫外检测器波长203 nm；进样体积20 μL。检测结果：赤霉素A4 1447 mg/L，赤霉素A7 39 mg/L，赤霉素A4占GA4+7总量97.4%（重量比）。 [0036] 实施例2： [0037] （1）种子培养同实施例1。 [0038] （2）发酵培养：发酵培养基（配方2）组成为(g/L)：乳糖120，黄豆饼粉10、、玉米浆干粉30、K2SO4 2.0、 MgSO4·7H2O 1.0和ZnSO4·7H2O 5×10-3，装液量50/500 mL。接种时，将2 mL种子液接入发酵培养基中，在31 ℃，摇床转速200 rpm条件下，培养9天，得到发酵液。 [0039] （3）产物检测：检测方法同实施例1，检测结果：赤霉素A4 870mg/L，赤霉素A7 19mg/L，赤霉素A4占GA4+7总量97.9%（重量比）。 [0040] 实施例3： [0041] （1）种子培养同实施例1。 [0042] （2）发酵培养：发酵培养基（配方3）组成为(g/L)：葡萄糖120，黄豆饼粉10、玉米浆干粉30、K2SO4 2.0、 MgSO4·7H2O 1.0和ZnSO4·7H2O 5×10-3，装液量50/500 mL。接种时，将2 mL种子液接入发酵培养基中，在31 ℃，摇床转速200 rpm条件下，培养8天，得到发酵液。 [0043] （3）产物检测：检测方法同实施例1，检测结果为：赤霉素A4 761mg/L，赤霉素A7 28 mg/L，赤霉素A4占GA4+7总量96.5%（重量比）。 [0044] 实施例4： [0045] （1）种子培养同实施例1。 [0046] （2）发酵培养：发酵培养基（配方4）组成为(g/L)：蔗糖120，黄豆饼粉10、玉米浆干粉30、K2SO4 2.0、 MgSO4·7H2O 1.0和ZnSO4·7H2O 5×10-3，装液量50/500 mL。接种时，将2 mL种子液接入发酵培养基中，在31 ℃，摇床转速200 rpm条件下，培养8天，得到发酵液。 [0047] （3）产物检测：检测方法同实施例1，检测结果为：赤霉素A4 809 mg/L，赤霉素A7 32 mg/L，赤霉素A4占GA4+7总量96.2%（重量比）。 [0048] 实施例5： [0049] （1）种子培养同实施例1。 [0050] （2）发酵培养：发酵培养基（配方5）组成为(g/L)：淀粉120、黄豆饼粉15、玉米浆干粉30、K2SO4 2.0、 MgSO4·7H2O 1.0和ZnSO4·7H2O 5×10-3，装液量50/500 mL。接种时，将2 mL种子液接入发酵培养基中，在31 ℃，摇床转速200 rpm条件下，培养8天，得到发酵液。 [0051] （3）产物检测：检测方法同实施例1，检测结果为：赤霉素A4 1231 mg/L，赤霉素A7 51 mg/L，赤霉素A4占GA4+7总量96.0%（重量比）。 [0052] 实施例6： [0053] （1）种子培养同实施例1。 [0054] （2）发酵培养：发酵培养基（配方6）组成为(g/L)：淀粉120，黄豆饼粉8、玉米浆干粉30、K2SO4 2.0、 MgSO4·7H2O 1.0和ZnSO4·7H2O 5×10-3，装液量50/500 mL。接种时，将2 mL种子液接入发酵培养基中，在31 ℃，摇床转速200 rpm条件下，培养8天，得到发酵液。 [0055] （3）产物检测：检测方法同实施例1，检测结果为：赤霉素A4 1022 mg/L，赤霉素A7 24 mg/L，赤霉素A4占GA4+7总量97.7%（重量比）。 [0056] 实施例7： [0057] （1）种子培养同实施例1。 [0058] （2）发酵培养：发酵培养基（配方7）组成为(g/L)：淀粉120，黄豆饼粉40、K2SO4 2.0、 MgSO4·7H2O 1.0和ZnSO4·7H2O 5×10-3，装液量50/500 mL。接种时，将2 mL种子液接入发酵培养基中，在31 ℃，摇床转速200 rpm条件下，培养8天，得到发酵液。 [0059] （3）产物检测：检测方法同实施例1，检测结果为：赤霉素A4 923 mg/L，赤霉素A7 30 mg/L，赤霉素A4占GA4+7总量96.9%（重量比）。 [0060] 实施例8： [0061] （1）种子培养同实施例1。 [0062] （2）发酵培养：发酵培养基（配方8）组成为(g/L)：淀粉120，黄豆饼粉10、玉米浆干粉15、玉米蛋白粉15、K2SO4 2.0、MgSO4·7H2O 1.0和ZnSO4·7H2O 5×10-3，装液量50/500 mL。接种时，将2 mL种子液接入发酵培养基中，在31 ℃，摇床转速200 rpm条件下，培养8天，得到发酵液。 [0063] （3）产物检测：检测方法同实施例1，检测结果为：赤霉素A4 1119 mg/L，赤霉素A7 34 mg/L，赤霉素A4占GA4+7总量97.1%（重量比）。 [0064] 以上实施例改变了发酵培养基中淀粉的重量比例，并用乳糖、葡萄糖、蔗糖分别代替淀粉，以及改变黄豆饼粉的重量比例，或者用玉米浆干粉、玉米蛋白粉代替部分黄豆饼粉，其发酵结果均不如配方1，因此，采用配方1的实施例1是本发明的最佳实施例。

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