一种糖基转移酶突变体及其应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202411807281.1 | 申请日 | 2024-12-10 |
| 公开(公告)号 | CN119307467A | 公开(公告)日 | 2025-01-14 |
| 申请人 | 诸城市浩天药业有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 朱理平; 徐良平; 宋维才; 魏萍萍; 杜萌萌; 刘欢; 胡琳琳; 王滨; | 第一发明人 | 朱理平 |
| 权利人 | 诸城市浩天药业有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 诸城市浩天药业有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：山东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：山东省潍坊市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：山东省潍坊市诸城市辛兴镇驻地 | 邮编 | 当前专利权人邮编：262218 |
| 主IPC国际分类 | C12N9/10 | 所有IPC国际分类 | C12N9/10 ; C12N15/70 ; C12N15/54 ; C12N1/21 ; C12P19/56 ; C12P19/18 ; C12R1/19 |
| 专利引用数量 | 3 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京知迪知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 王胜利; |
| 摘要 | 本 发明 公开一种糖基转移酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。该糖基转移酶突变体具有如SEQ ID NO.1所示的 氨 基酸序列；或具有与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列同源性95％以上的序列。本发明提供的糖基转移酶突变体具有C19位偏好性，能够对多种甜菊醇糖苷的C19位进行糖基化修饰，且酶活是糖基转移酶UGT76G4的1.3倍。 | ||
| 权利要求 | 1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或具有与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列同源性95％以上的序列。 |
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| 说明书全文 | 一种糖基转移酶突变体及其应用技术领域[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种糖基转移酶突变体及其应用。 背景技术[0002] 甜菊醇糖苷是从甜叶菊中提取的一类天然甜味剂，具有高甜度和低热量的特点。它们被广泛应用于食品、饮料、保健品和药品等多个领域，作为蔗糖的替代品。通过合理的提取和应用，甜菊醇糖苷可以有效地帮助减少热量摄入，同时保持食品和饮料的良好口感。 [0003] 甜菊醇糖苷包括甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M等多种成分，其中一些成分在甜叶菊中的含量过少，不易提取，需要利用生物合成法通过其他甜菊醇糖苷转化制得，即使用糖基转移酶在其他甜菊醇糖苷的C13位或C19位进行糖基化修饰。例如，甜度高且没有苦涩后味的莱鲍迪苷M需要在莱鲍迪苷D的C19位第一个葡萄糖C3位上连接一个新的葡萄糖，然而现有的糖基转移酶UGT76G1对C19位的糖基化效率较低，导致莱鲍迪苷M的合成效率低。 [0004] 专利CN 115094074 B中公开了一种能够高效糖基化甜菊醇糖苷C19位的糖基转移酶UGT76G4，其具有C19位偏好性，提高了对C19位的催化活性。本发明在此基础上进一步提高了对甜菊醇糖苷C19位的糖基化效率，从而进一步提高了莱鲍迪苷M等甜菊醇糖苷的合成效率。 发明内容[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种糖基转移酶突变体及其应用，用于克服现有技术中糖基转移酶UGT76G1不具有C19位偏好性，莱鲍迪苷M等甜菊醇糖苷合成效率低的问题。 [0006] 第一方面，本发明提供一种糖基转移酶突变体，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或具有与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列同源性95％以上的序列。 [0007] 与现有技术相比，本发明提供的糖基转移酶突变体具有C19位偏好性，能够对多种甜菊醇糖苷的C19位进行糖基化修饰，且酶活是糖基转移酶UGT76G4的1.3倍。 [0008] 第二方面，本发明提供编码上述糖基转移酶突变体的核酸。 [0009] 优选的，所述核酸具有如SEQ ID NO.2所示的序列。 [0010] 第三方面，本发明提供一种表达单元，含有启动子和上述核酸。 [0011] 第四方面，本发明提供一种质粒载体，包括上述核酸或上述表达单元。 [0012] 第五方面，本发明提供一种宿主细胞，含有上述质粒载体，或基因组中整合有上述核酸。 [0013] 第六方面，本发明提供一种糖基转移酶突变体的制备方法，用于制备上述糖基转移酶突变体，包括：对上述宿主细胞进行诱导培养，诱导宿主细胞对糖基转移酶突变体进行表达。 [0014] 第七方面，本发明提供上述糖基转移酶突变体、核酸、表达单元、质粒载体或宿主细胞在制备甜菊醇糖苷中的应用。 [0015] 优选的，所述糖基转移酶突变体、核酸、表达单元、质粒载体或宿主细胞用于制备莱鲍迪苷M。本发明的糖基转移酶突变体能够以莱鲍迪苷E和UDPG或莱鲍迪苷D和UDPG为底物，催化合成莱鲍迪苷M，提高产物莱鲍迪苷M的转化效率。 [0016] 第八方面，本发明提供一种糖基转移酶突变体的应用，将上述糖基转移酶突变体用于糖基化甜菊醇糖苷。 [0017] 进一步的，所述糖基化甜菊醇糖苷包括在甜菊醇糖苷的C19位进行糖基化修饰。 [0019] 图1为实施例3中糖基转移酶UGT76G4、糖基转移酶突变体M1的酶活检测结果。 [0020] 图2为实施例4中糖基转移酶突变体M1在不同pH值下对STV的转化率。 [0021] 图3为实施例4中糖基转移酶突变体M1在不同温度下对STV的转化率。 [0022] 图4为实施例5中糖基转移酶突变体M1对Reb E的催化结果。 [0023] 图5为实施例5中糖基转移酶突变体M1偶联蔗糖合酶放大转化Reb E的反应结果。 [0024] 图6为实施例6中糖基转移酶突变体M1对RD的催化反应结果。 [0025] 图7为实施例6中糖基转移酶突变体M1偶联蔗糖合酶催化RD反应结果。 [0026] 图8为实施例6中糖基转移酶突变体M1偶联蔗糖合酶放大转化RD的反应结果。 具体实施方式[0027] 为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0028] 应理解，以下实施例中所用原料如无特殊说明均为市售原料。实施例1 [0029] 构建表达糖基转移酶突变体M1的重组菌株以ugt76G4‑F和ugt76G4‑R为引物，以糖基转移酶UGT76G4编码基因的cDNA为模板，用高保真DNA聚合酶（武汉爱博泰克生物科技有限公司）进行PCR扩增，得到正确的UGT76G4基因片段。所述糖基转移酶UGT76G4编码基因的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，糖基转移酶UGT76G4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述糖基转移酶UGT76G4在专利CN 115094074 B中被公开。 [0030] ugt76G4‑F：GAGATATACATATGGCTAGCATGGAAAATAAAACGGAGACCACC（SEQ ID NO.5）。 [0031] ugt76G4‑R：GTGGTGGTGGTGCTCGAGTTACAACGATGAAATGTAAGAAA（SEQ ID NO.6）。 [0032] 使用Gibson Assembly方法将UGT76G4基因片段连接在经NdeI、XhoI双酶切后的pET21a(+)载体上。取5μL连接产物转化入E.coli TOP10感受态细胞中，将转化后的菌株涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的固体Luria‑Bertani（LB）培养基上，37℃培养14h。培养完成后，从培养基中挑取单个菌落进行PCR验证，将PCR扩增产物长度正确的单克隆菌落接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria‑Bertani（LB）培养基中培养，在37℃的摇床上振荡培养过夜后，从菌落中提取重组质粒，该重组质粒中含有UGT76G4基因片段。 [0033] 以上述重组质粒为模板，以F1和F2为引物，用高保真DNA聚合酶（武汉爱博泰克生物科技有限公司）进行PCR扩增反应，PCR扩增反应产物经DpnI消化模板后，得到含有糖基转移酶突变体基因（SEQ ID NO.2）的重组质粒。该糖基转移酶突变体命名为M1。经测序突变体M1由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的第85位氨基酸由L突变为F所得，该突变体M1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 [0034] F1：CCGACTCATGGTCCGTTCGCTGGTATGCGGATTCCGATTA（SEQ ID NO.7）。 [0035] F2：TAATCGGAATCCGCATACCAGCGAACGGACCATGAGTCGG（SEQ ID NO.8）。 [0036] 将上述含有糖基转移酶突变体基因的重组质粒转入E .coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到表达糖基转移酶突变体M1的重组大肠杆菌。实施例2 [0038] 将上述重组大肠杆菌的单菌落接种到LB固体培养基中，35℃下培养16h，挑选出颜色均匀单一、菌落凸起、表面圆润光滑、菌落直径为2 3mm的菌落，接种到5mL的LB液体培养~基中，该LB液体培养基中含有50mg/L的氨苄青霉素，置于摇床中在37℃、220rpm下振荡培养 7h，得到种子液。 [0039] 将上述种子液以1v/v %的接种量接种到另一LB培养基中，摇床中37℃、220rpm下振荡培养，待培养液OD600为0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导培养，摇床中25℃、220rpm下继续振荡培养20h。 [0040] 诱导培养结束后，测培养液的OD600值为4，5000×g 离心10 min收集菌体，用15mL、100 mmol/L、pH值为7.0的磷酸钠缓冲液重悬菌体，超声破碎菌体细胞释放出胞内酶，超声功率为400W、超声30min，超声结束后在冷冻离心机内，4℃，8000×g离心10 min，收集上清液即为糖基转移酶突变体M1粗酶液。 实施例3 [0041] 测定酶活以糖基转移酶UGT76G4作为对照组，取上述实施例2中获得的糖基转移酶突变体M1粗酶液配制如下反应体系（1mL）测定酶活： （1）100mM的磷酸缓冲液(pH值为7.0)、2mM的UDPG、1mM的STV（甜菊苷）、5OD的糖基转移酶突变体M1粗酶液，在40℃、200rpm下反应30min。 [0042] （2）100mM的磷酸缓冲液(pH值为7.0)、2mM的UDPG、1mM的STV（甜菊苷）、5OD的糖基转移酶UGT76G4粗酶液，在40℃、200rpm下反应30min。 [0043] 上述2组反应结束后，分别取样，95℃加热5min终止反应，加入4倍体积的甲醇，12000rpm离心5min，上清液经0.22μm的滤膜抽滤后，滤液使用高效液相色谱进行检测，分别计算酶活力。 [0044] 高效液相色谱检测条件如下：进样量：10μL，色谱柱：5μm，250×4.6mm，柱温：45℃。色谱条件：UV 210nm，流动相： （A）乙腈，（B）10mmol磷酸二氢钠（用磷酸将pH值调节到2.6），流速：0.8 mL/min，洗脱程序：0 15min，26%体积的（A），74％体积的（B）；16 42min，33%体积的（A），67％体积的（B）。 ~ ~ [0045] 测定结果如图1所示：相较于糖基转移酶UGT76G4，糖基转移酶突变体M1的酶活显著提高，是糖基转移酶UGT76G4的1.3倍。实施例4 [0046] 1、检测pH值对糖基转移酶突变体M1稳定性的影响，具体检测过程如下：以实施例2获得的糖基转移酶突变体M1粗酶液配制如下5份不同pH值的反应体系 （1mL）： 100mM的磷酸缓冲液、5mM的UDPG、2mM的STV、5OD的糖基转移酶UGT76G4突变体M1粗酶液。 [0047] 上述5份反应体系中，100mM磷酸缓冲液的pH值分别设置为6、6.5、7、7.5、8。 [0048] 分别将上述各反应体系置于摇床上进行反应，在35℃、200rpm下转化0.5h。反应结束后，分别取样，95℃加热5min终止反应，冷却后加入4倍体积的乙醇，12000rpm离心5min，上清液经0.22μm的滤膜抽滤后，得到的滤液分别使用液相色谱进行检测，分别计算底物STV转化率。 [0049] 测定结果如图2所示：当反应体系的pH值为7 7.5时，底物STV的转化率最高，说明~该pH下糖基转移酶突变体M1的稳定性最高。 [0050] 2、检测温度对糖基转移酶突变体M1稳定性的影响，具体检测过程如下：以实施例2获得的糖基转移酶突变体M1粗酶液配制如下4份反应体系（1mL）： 100mM的磷酸缓冲液(pH值为7.0)、0.5mM的UDPG、5mM的STV、终浓度为5OD的糖基转移酶突变体M1粗酶液。 [0051] 将上述4份反应体系置于摇床上进行反应，分别在温度为30℃、35℃、40℃、45℃、转速为200rpm的条件下反应0.5h。反应结束后，分别取样，95℃加热5min终止反应，冷却后加入4倍体积的乙醇，震荡混匀后，12000rpm离心5min，上清液经0.22μM滤膜抽滤后，滤液使用液相色谱进行检测，分别计算STV转化率。 [0052] 测定结果如图3所示：当反应体系的温度为35℃ 40℃时，STV的转化率最高，说明~该温度下糖基转移酶突变体M1的稳定性最高。 实施例5 [0053] 1、检测糖基转移酶突变体M1对莱鲍迪苷E（Reb E）的催化活性，具体检测过程如下：将糖基转移酶突变体M1在体外配置如下4份反应体系进行检测（1mL）： 100mM的磷酸钠缓冲液（pH值为7.5），20OD的糖基转移酶突变体M1粗酶液、2mM的UDPG、0.5mM的Reb E。 [0054] 将上述各反应体系分别置于35℃、200rpm下反应，分别在反应进行10min、20min、30min、60min后，加入等体积的无水丁醇终止反应，震荡混匀，12000rpm离心10分钟，取上清液过0.22μm有机滤膜，滤液利用高效液相色谱定性定量检测反应产物组成。 [0055] 高效液相色谱检测条件如下：进样量10μL，色谱柱：5μm，250×4.6mm，柱温：45℃。色谱条件：UV 210nm，流动相： （A）乙腈，（B）10mmol磷酸二氢钠（用磷酸将其pH值调节为2.6），流速：0.8 mL/min，洗脱程序：0 15min，26%体积的（A），74%体积的（B）；16 42min，33%体积的（A），67%体积的（B）。 ~ ~ [0056] 结果如图4所示：在10min时，Reb E的糖基化产物不仅包括莱鲍迪苷D（Reb D）、莱鲍迪苷AM（Reb AM），还包括莱鲍迪苷M（Reb M），且Reb AM为主要产物，表明糖基转移酶突变体M1具有C19位偏好性。 [0057] 在30min时，已经基本实现Reb E向Reb M的完全转化，说明糖基转移酶突变体M1主要优先以C19糖基化的方式催化Reb E生成Reb AM，然后以C13位的糖基化方式在短时间内迅速生成Reb M。 [0058] 2、糖基转移酶突变体M1偶联蔗糖合酶后对Reb E催化活性的验证，具体过程如下：将糖基转移酶突变体M1在体外按照以下反应体系进行功能验证(5ml)：100mM的磷酸盐缓冲液（pH值为7.5），5OD的糖基转移酶突变体M1粗酶液，5OD的蔗糖合酶酶液，0.5mM的UDPG，5mM的Reb E，50mM的蔗糖，用1mM的NaOH维持转化体系的pH为7.5。 [0059] 于35℃、200rpm下反应12小时后，加入等体积无水丁醇终止反应，震荡混匀，过0.22μm有机滤膜，滤液利用高效液相色谱定性定量检测反应产物组成，检测条件同上。检测结果显示：反应12h后Reb E几乎全部被转化，Reb E残留占比＜5%，且转化产物莱鲍迪苷M（RM）占比＞85%。 [0060] 3、增加底物量：以Reb E为底物通过糖基转移酶突变体M1偶联蔗糖合酶生物合成RM，具体过程如下：体外摇瓶转化放大以下反应体系，物料终浓度如下：20OD的糖基转移酶突变体M1粗酶液、20OD的蔗糖合酶粗酶液、500mM的蔗糖，1.5mM的UDPG、30mM的Reb E，用100mM的磷酸缓冲液定容至10ml，用1mM的NaOH维持转化体系的pH为7.5，35℃摇床反应24h后终止反应。 在转化过程中的第4h、8h、16h、24h分别取样检测反应进程，取样稀释至澄清后过0.22μm有机滤膜得到过滤清液，分别利用液相色谱定性定量检测反应产物组成。 [0061] 结果如图5所示：当底物Reb E的浓度增加到30mM时，糖基转移酶突变体M1与蔗糖合酶偶联，可将大部分底物转化为RM。实施例6 [0062] 1、糖基转移酶突变体M1利用莱鲍迪苷D（RD）制备莱鲍迪苷M的催化效率检测，具体检测过程如下：在体外按照以下反应体系，检测其对RD的糖基化结果：10OD的糖基转移酶突变体M1粗酶液、2mM的UDPG、1mM的RD，使用磷酸缓冲液（pH值为7.5）定容至500ul。 [0063] 35℃、200rpm下反应60min后，加入等体积无水丁醇终止反应，震荡混匀，12000rpm离心10分钟，上清液过0.22μm有机滤膜，滤液利用液相色谱定性定量检测反应产物组成。液相检测条件与实施例5相同。 [0064] 结果如图6所示：糖基转移酶突变体M1可迅速的将底物RD转化为RM。 [0065] 2、糖基转移酶突变体M1偶联蔗糖合酶后对RD催化活性的验证，具体过程如下：糖基转移酶突变体M1在体外按照以下反应体系进行功能验证(5mL)：100mM的磷酸盐缓冲液（pH值为7）、5OD的糖基转移酶突变体M1粗酶液，5OD的蔗糖合酶粗酶液，1mM的UDPG，5mM的RD，30mM蔗糖，用1mM的NaOH维持转化体系的pH为7。 [0066] 35℃、200rpm下反应24小时后，加入等体积无水丁醇终止反应，震荡混匀，过0.22μm有机滤膜，滤液利用高效液相色谱定性定量检测反应产物组成，检测条件同上。 [0067] 检测结果如图7所示：反应24h后RD几乎全部被转化，转化产物RM的占比＞85%。 [0068] 3、增加底物浓度：以RD为底物通过糖基转移酶突变体M1偶联蔗糖合酶生物合成RM，具体过程如下：体外摇瓶转化放大以下反应体系，物料终浓度如下：30OD的糖基转移酶突变体M1粗酶液、20OD的蔗糖合酶粗酶液、300mM的蔗糖、1mM的UDPG、20mM的Reb D，体系用100mM磷酸缓冲液定容至20ml，其中RD每1h加一次，分2次加入，使用1mM的NaOH调节维持转化体系的pH为7。在转化过程中的第4h、8h、16h、24h分别取样检测反应进程，取样稀释至澄清后过0.22μm有机滤膜得到过滤清液，利用液相色谱定性定量检测反应产物组成。检测条件与实施例5中的相同。 [0069] 检测结果如图8所示：当底物RD的浓度增加到20mM时，糖基转移酶突变体M1偶联蔗糖合酶进行催化，24h内可基本实现大部分RD向RM的转化，且RM占比不低于85%。 [0070] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 |
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