[0001] 本发明属于果汁制备技术领域，具体涉及一种固定化酶转化枣中蔗糖为葡聚糖的方法及富含葡聚糖的枣汁和应用。

[0002] 枣作为一种药食同源的食物，具有很好的保健效果。枣中的蔗糖含量为15～66％，蔗糖由一分子葡萄糖和一分子果糖组成，是一种容易快速被利用的糖，过高的糖含量使不能被高血糖人群食用。葡聚糖是乳酸菌在生长代谢过程中产生的一种胞外多糖，具有抗炎症、抗肿瘤、调节肠道菌群以及免疫调节等一系列生物功能。目前缺少一种能够有效将蔗糖转化为葡聚糖的方法。

[0003] 本发明的目的在于提供一种固定化酶转化枣中蔗糖为葡聚糖的方法及富含葡聚糖的枣汁和应用。本发明所述方法能够高效的将蔗糖转化为葡聚糖，在降低容易利用糖的同时产生葡聚糖。

[0004] 本发明提供了一种固定化酶转化枣中蔗糖为葡聚糖的方法，包括以下步骤：

[0005] 将固定化葡聚糖蔗糖酶与枣汁混合，进行糖转化，离心弃沉淀，得到富含葡聚糖的枣汁；编码所述葡聚糖蔗糖酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0006] 优选的是，所述糖转化的温度为30～35℃；所述糖转化的时间为12～20h。

[0007] 优选的是，所述固定化葡聚糖蔗糖酶基于细菌增强基质和乳酸乳球菌肽聚糖水解酶表达系统表达、固定化获得。

[0008] 优选的是，所述固定化葡聚糖蔗糖酶的方法包括以下步骤：

[0009] 将编码所述葡聚糖蔗糖酶的基因构建到带有乳酸乳球菌肽聚糖水解酶标签的质粒中，得到重组质粒；

[0010] 将所述重组质粒转化到大肠杆菌中，培养，诱导，收集菌体，超声破碎，离心取上清，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；

[0011] 使用细菌增强基质纯化固定化酶的方法对得到的葡聚糖蔗糖酶粗酶液进行固定化，得到固定化葡聚糖蔗糖酶。

[0012] 优选的是，所述质粒包括pET‑28a。

[0013] 优选的是，所述固定化的方法包括：将细菌增强基质与所述葡聚糖蔗糖酶粗酶液混合，结合后离心取沉淀，洗涤。

[0014] 优选的是，所述结合的时间为30～60min；所述结合的温度为0～4℃。

[0015] 优选的是，所述细菌增强基质的制备用细菌包括乳酸乳球菌。

[0016] 本发明还提供了上述技术方案所述方法制备得到的富含葡聚糖的枣汁。

[0017] 本发明还提供了固定化葡聚糖蔗糖酶在提高枣汁中葡聚糖含量中的应用，编码所述葡聚糖蔗糖酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0018] 本发明提供了一种固定化酶转化枣中蔗糖为葡聚糖的方法。本发明利用固定化酶将枣中蔗糖转化为葡聚糖，能在降低蔗糖含量的同时提高益生元/膳食纤维葡聚糖的含量。附图说明

[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0020] 图1为本发明提供的琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物结果图；

[0021] 图2为本发明提供的重组葡聚糖蔗糖酶SDS‑PAGE分析结果图；

[0022] 图3为本发明提供的诱导温度对重组葡聚糖蔗糖酶表达量的影响结果图；

[0023] 图4为本发明提供的重组葡聚糖蔗糖酶的SDS‑PAGE分析结果图；其中，泳道M：蛋白marker；泳道1：诱导前的全菌；泳道2：诱导后的全菌；泳道3：超声破碎的上清液；泳道4：超声破碎的沉淀物；泳道5：BEM(固定材料)；泳道6：BEM结合的上清液；泳道7：BEM结合的沉淀物；

[0024] 图5为本发明提供的固定化葡聚糖蔗糖酶在蔗糖溶液和枣汁中反应前后变化结果图；

[0025] 图6为本发明提供的葡聚糖全波长扫描结果图；

[0026] 图7为本发明提供的固定化酶最适温度结果图。

[0027] 本发明提供了一种固定化酶转化枣中蔗糖为葡聚糖的方法，包括以下步骤：

[0028] 将固定化葡聚糖蔗糖酶与枣汁混合，进行糖转化，离心弃沉淀，得到富含葡聚糖的枣汁；编码所述葡聚糖蔗糖酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0029] 在具体实施例中，所述固定化葡聚糖蔗糖酶基于细菌增强基质和乳酸乳球菌肽聚糖水解酶表达系统表达、固定化获得。

[0030] 在具体实施例中，所述固定化葡聚糖蔗糖酶的方法包括以下步骤：将编码所述葡聚糖蔗糖酶的基因构建到带有乳酸乳球菌肽聚糖水解酶标签的质粒中，得到重组质粒；将所述重组质粒转化到大肠杆菌中，培养，诱导，收集菌体，超声破碎，离心取上清，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液；使用细菌增强基质纯化固定化酶的方法对得到的葡聚糖蔗糖酶粗酶液进行固定化，得到固定化葡聚糖蔗糖酶。

[0031] 本发明将编码所述葡聚糖蔗糖酶的基因构建到带有乳酸乳球菌肽聚糖水解酶标签的质粒中，得到重组质粒。在具体实施例中，所述质粒包括pET‑28a。本发明对带有AcmA标签的质粒的来源没有特殊限定，采用常规方法进行构建即可。可以参考赵芳坤在《天津大学》发表的“基于BEM和AcmA表达系统的重组蛋白纯化与固定化方法的研究”的文章，构建pET28a‑AcmA。在具体实施例中，本发明根据柠檬明串珠菌CBA3627(GenBank:CP042418.1)设计正向引物5'‑CGCCCATGGGAGATAGCACAAACACAGTGAC‑3'(SEQ ID NO.2)和反向引物5'‑ATAGAATTCAGCGACTGAGACAAAGTAAC‑3'(SEQ ID NO.3)。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到葡聚糖蔗糖酶基因。编码所述葡聚糖蔗糖酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在具体实施例中，使用限制性核酸内切酶EcoRI和HindIII剪切，将葡聚糖蔗糖酶基因与质粒pET‑28a‑AcmA进行连接转化。

[0032] 得到重组质粒后，本发明将所述重组质粒转化到大肠杆菌中，培养，诱导，收集菌体，超声破碎，离心取上清，得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液。在具体实施例中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌BL21。在具体实施例中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21感受态细胞。在具体实施例中，使用IPTG进行诱导表达。在具体实施例中，诱导的温度可以为16～37℃，也可以为16℃、25℃或37℃。在具体实施例中，所述诱导的时间可以为24h。

[0033] 得到葡聚糖蔗糖酶粗酶液后，本发明使用细菌增强基质纯化固定化酶的方法对得到的葡聚糖蔗糖酶粗酶液进行固定化，得到固定化葡聚糖蔗糖酶。在具体实施例中，所述固定化的方法包括：将细菌增强基质与所述葡聚糖蔗糖酶粗酶液混合，结合后离心取沉淀，洗涤。在具体实施例中，所述结合的时间为30～60min，具体为30min、40min、50min或60min。在具体实施例中，所述结合的温度为0～4℃，具体为4℃。在具体实施例中，所述细菌增强基质的制备用细菌包括乳酸乳球菌。在具体实施例中，所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌NZ9000。本发明对细菌增强基质的制备方法没有特殊限定，可以参考赵芳坤在《天津大学》发表的“基于BEM和AcmA表达系统的重组蛋白纯化与固定化方法的研究”的文章。在具体实施例中，本发明对乳酸乳球菌NZ9000进行过夜培养后，离心收集菌体，重悬并煮沸，冷却后离心，得到的沉淀为BEM。在具体实施例中，离心收集菌体的条件为4000rpm，室温离心20min。在本发明中，所述室温为20～30℃。在具体实施例中，加入0.1M HCl进行所述重悬；具体的，每100mL菌液收集的菌体加入100mL 0.1M HCl。在具体实施例中，所述煮沸的时间为30min，煮沸用来去除蛋白和DNA。在具体实施例中，冷却后在室温离心，离心条件为8000rpm离心20min。得到沉淀后，本发明利用PBS充分洗涤BEM。本发明制备的BEM可以长期储存于4℃冰箱。

[0034] 在具体实施例中，所述糖转化的温度为30～35℃，具体可以为30～35℃。在具体实施例中，所述糖转化的温度可以为28℃、30℃、32℃或35℃。葡聚糖蔗糖酶的理想温度为30℃，温度超过30℃后，酶活性迅速下降。葡聚糖蔗糖酶的活性在20～30℃之间相对较高，35℃时仍有95％的活性。在具体实施例中，所述糖转化的时间为12～20h。在具体实施例中，所述糖转化的时间可以为12h、14h、16h、18h或20h。葡聚糖产量在20h时增长变缓，综合考虑经济效益等指标，得出最佳产糖时间为20h，葡聚糖产量为191.9g/L，理论产量达到77％。在具体实施例中，所述糖转化过程中，酶添加量为4000～7000U/mL，具体可以为6000U/mL。

[0035] 本发明还提供了上述技术方案所述方法制备得到的富含葡聚糖的枣汁。本发明利用固定化酶将枣中蔗糖转化为葡聚糖，反应结束后通过离心去除酶。本发明枣汁在降低蔗糖含量的同时提高了益生元/膳食纤维葡聚糖的含量。

[0036] 本发明还提供了固定化葡聚糖蔗糖酶在提高枣汁中葡聚糖含量中的应用，编码所述葡聚糖蔗糖酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0037] 为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种固定化酶转化枣中蔗糖为葡聚糖的方法及富含葡聚糖的枣汁和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0038] 采用高效液相法测定蔗糖含量。

[0039] 条件：以去离子水为流动相，流速为1mL/min，检测器采用示差折光检测器，进样体积为6uL，柱温与检测器温度均为30℃，色谱柱为Shodex AsahipakNH2P‑504E，测定枣中蔗糖的含量变化。

[0040] 枣汁的制备方法

[0041] 将若羌红枣经过洗涤、去核、烘干、研磨后得到红枣粉，将红枣粉与去离子水按照1g:20mL(w/v)的比例混合，使用热水浸提法在沸水浴中浸提4h将红枣汁体积缩小为原体积一半，在室温下离心(8000×g、15min)后弃去枣渣沉淀得到红枣汁。

[0042] 实施例1

[0043] 1)葡聚糖蔗糖酶的选择

[0044] 根据柠檬明串珠菌CBA3627(GenBank:CP042418.1)合成葡聚糖蔗糖酶DsrB，葡聚糖蔗糖酶DsrB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

[0045] CAACACGATACTGTCGTTGACCAACAAACGACACCTGTCAAAAATAACCAAACAACACAACAAATCGCCGCAAATGCCAACCAAGCAGAAAAAGTAAAAGCATCAGACACAACGACTGATACGCAAAAGCAAGCTGAAACGGCAAACAACACTAACAAGGATTCGATAGATAATCTCACCAAGCAGTTGCCGACTGTTACGCCAACAGCTAATCAAAAAACTGGTTATCTGGAAAAAGATGGTAAATGGTACTATGTAACCAGTGATAACACACTTGCTAAGGGGTTGACTACTGTTGACAACCACAAGCAGTATTTTGACAACAATGGCGTGCAGGCAAAAGGCCAATTCGTTACTGATAACAGTAAAACATACTATCTCGATTCTAACTCCGGTAACGCAGTAACCGGGATACAACAAATTGGCTCACAAACATTAGCCTTCAATGACAACGGTGAACAAGTTTTTGCTGATTTCTATACAGCGCCAGATGGCAAAACTTATTATTTTGACGATAAAGGACAAGCAACTATTGGTCTAAAGGCCATTAATGGGCACAATTATTACTTCGATAGTTTGGGACAACTAAAAAAAGGATTTACCGGTGTCATTGACGGTCAAGTACGCTATTTTGATCAAGAATCAGGACAAGAGGTATCAACAACCGACTCACAAATCAAAGAAGGTTTAACTTCTCAAACAACAGACTATACAGCACATAATGCCGTTCACAGCACCGATAGCGCTGATTTCGACAATTTTAATGGTTATTTGACTGCTTCTTCATGGTATCGCCCTAAAGATGTTTTAAGAAATGGTCAACACTGGGAAGCAACAACAGCTAATGACTTCCGGCCCATTGTGTCAGTTTGGTGGCCTAGCAAGCAAACACAAGTAAATTACCTAAACTACATGTCTCAAATGGGACTCATTGACAATCGTCAGATGTTCTCGCTAAAAGACAATCAAGCCATGTTGAATATTGCTTGTACAACAGTCCAACAAGCAATTGAAACAAAAATCGGTGTGGCTAATAGTACAGCATGGCTTAAAACAGCCATTGATGATTTCATTCGTACACAGCCACAATGGAACATGTCGAGTGAAGATCCCAAAAATGATCATTTACAAAACGGCGCTTTGACTTTCGTCAACAGTCCATTGACACCAGATACTAACTCTAATTTCAGACTATTAAATCGCACACCAACAAACCAGACAGGTGTGCCAAAATATACAATTGATCAATCTAAGGGTGGTTTTGAACTCTTACTCGCTAATGATGTAGACAACTCTAATCCTGTTGTGCAAGCTGAGCAGTTAAATTGGTTACACTATTTGATGAATTTTGGTAGCATCACAGCAAACGATTCTGCTGCTAATTTTGATGGGATACGTGTCGATGCTGTCGATAATGTTGACGCTGATTTACTACAGATTGCAGCAGATTATTTCAAAGCTGCTTATGGTGTTGATAAAAATGACGCAACAGCAAATCAACATCTTTCAATTCTTGAAGATTGGAGCCATAACGACCCTGAATACGTGAAGGATTTTGGTAATAATCAACTCACAATGGATGATTACATGCATACCCAGTTAATCTGGTCGTTGACTAAAGATATGCGTATGCGTGGTACCATGCAACGCTTCATGGACTATTACCTCGTCAATCGCAATCACGATAGTACCGAAAACACTGCCATTCCAAATTACAGCTTTGTTCGCGCACACGATAGTGAAGTACAAACAGTCATTGCTCAAATTATTTCTGAGTTACATCCCGACGTAAAAAATAGTTTGGCACCAACAGCAGACCAGCTAGCCGAAGCCTTTAAAGTTTATAATAACGATGAAAAACAGGCGGATAAGAAATATACACAATACAACATGCCTAGCGCCTATGCGATGCTGTTAACTAATAAAGATACAGTACCGCGCGTTTATTATGGTGATTTATACACCGATGATGGTCAATATATGGCAAATAAGTCCCCTTATTTTGATGCCATCAACGGCTTGCTAAAGTCACGTATCAAATATGTTGCTGGTGGTCAGTCAATAGCTGTTGATCAAAACGATATCCTGACAAATGTTCGTTATGGTAAAGGTGCCATGAGTGTGACAGATAGCGGTAATGCAGACACACGAACACAAGGTATTGGTGTGATTGTCAGTAATAAAGAAAATCTGGCCTTAAAATCAGGCGACACGGTGACATTACACATGGGTGCCGCTCACAAAAATCAAGCATTCAGATTATTATTAGGGACAACTGCTGACAATTTGTCTTATTATGATAATGACAACGCCCCAGTAAAGTACACCAATGATCAGGGCGATTTAATCTTTGATAATACTGAAATCTATGGTGTCCGTAACCCGCAAGTCTCTGGCTTCTTAGCTGTTTGGGTGCCTGTTGGGGCTGACAGCCATCAAGACGCGCGTACTTTGTCTGACGACACAGCCCATCATGATGGCAAAACCTTCCACTCAAATGCTGCTTTAGATTCTCAGGTTATTTACGAAGGTTTTTCAAATTTCCAAGCTTTTGCCACAAACACTGAAGACTATACAAATGCTGTCATTGCAAAAAATGGTCAGTTATTCAAAGATTGGGGTATCACAAGTTTCCAGTTGGCACCACAATATCGTTCAAGCACCGATACCAGTTTCTTAGATTCAATTATCCAAAATGGTTATGCCTTTACAGATCGTTATGATTTGGGCTACGGTACACCAACAAAATATGGCACAGTTGACCAGTTACGCGATGCCATCAAGGCTCTGCACGCAAATGGCATCCAAGCAATCGCTGACTGGGTACCCGATCAAATTTATAATTTACCGGGTCAAGAATTAGCGACTGTCACACGAACAAACTCTTATGGTGATAAAGACACTAACTCAGATATTGATCAGTCGTTATATGTCATACAAAGTCGTGGTGGTGGTAAATACCAAGCACAGTATGGCGGTGCCTTCTTATCTGATATCCAGAAAAAATATCCAGCACTTTTCGAAACAAAACAAATTTCTACAGGGCTACCTATGGATCCTAGTCAGAAAATAACAGAATGGTCTGGTAAATACTTTAATGGCTCAAATATTCAAGGCAAAGGGGCTGGCTATGTCTTAAAAGACAGTGGTACCGATCAATACTATAAGGTTACATCAAACAATAATAATCGTGACTTCTTGCCAAAACAATTAACAGATGACTTATCTGAAACAGGATTTGTCCGCGATAACATTGGTATGGTCTACTACACATTGAGTGGCTATCTAGCTCGAAACACCTTTATACAAGATGATAATGGCAATTATTATTACTTTGATAGCACCGGCCATCTCGTTACTGGCTTCCAGAATATTAATAACCATCACTATTTCTTCCTACCAAACGGTATTGAACTCGTTCAATCTTTCTTGCAGAATGCTGACGGTTCAACGATTTATTTTGACCAAAAAGGGCGTCAAGTATTTAATCAATACATTACTGACCAAACCGGCACCGCCTATTACTTCCAGAATGATGGCACAATGGTCACTTCTGGCTTCACTGAAATCGATGGTCATAAGCAATACTTCTACAAGAACGGCACACAGGTCAAAGGGCAATTTGTATCAGACACTGATGGTAACGTTTTCTACTTAGAAGCTGGTAACGGCAACGTGGCGACACAAAGATTTGCACAAAATAGTCAAGGTCAGTGGTTCTATTTGGGTAATGATGGCATTGCCTTGACTGGTTTGCAAACAATCAATGGTGTTCAAAATTATTTCTACGCCGATGGTCATCAAAGTAAGGGTGATTTTATTACGATACAAAATCACGTATTATATACTAACCCACTAACTGGCGCTATAACGACAGGTATGCAACAAATTGGTGACAAGATTTTTGTCTTTGACAATACGGGCAACATGTTGACCAATCAATACTATCAAACACTAGATGGCCAATGGTTACATTTAAGTACTCAAGGTCCAGCAGACACTGGTTTGGTAAACATTAATGGTAATTTGAAATATTTCCAAGCTAATGGTCGGCAAGTGAAAGGTCAATTTGTGACTGATCCTATCACGAACGTGAGTTATTATATGAATGCCACTGATGGTTCGGCAGTATTTAATGACTACTTTGCCTATCAAGGCCAATGGTATTTAACGGATAGTAATTATCAACTCGTCAAAGGATTTAAAGTTGTTAATAATAAGCTACAACATTTTGATGAAATAACAGGCGTACAAACTAAATCAGCTCATATCATCGTTAATAATCGAACATACATTTTCGATGACCAAGGTTACTTTGTCTCAGTCGCT。

[0046] 构建重组质粒(构建方法同实施例2)进行表达，诱导温度为16℃，利用BEM固定化后(固定化方法同实施例3，BEM与粗酶液结合时间为60min)加入枣汁中进行糖转化，糖转化条件为：30℃，20h。测定转化前后蔗糖含量。测定结果为葡聚糖蔗糖酶DsrB可以将枣汁中蔗糖含量降低67％。

[0047] 实施例2

[0048] 构建pET‑28a‑AcmA‑DsrB重组质粒

[0049] 参考赵芳坤在《天津大学》发表的“基于BEM和AcmA表达系统的重组蛋白纯化与固定化方法的研究”的文章，构建pET‑28a‑AcmA。根据柠檬明串珠菌CBA3627(GenBank:CP042418.1)设计正向引物5'‑CGCCCATGGGAGATAGCACAAACACAGTGAC‑3'(SEQ ID NO.2)和反向引物5'‑ATAGAATTCAGCGACTGAGACAAAGTAAC‑3'(SEQ ID NO.3)。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到葡聚糖蔗糖酶基因。将PCR产物与质粒pET‑28a‑AcmA共同用限制性核酸内切酶EcoRI和HindIII剪切，连接转化。

[0050] 图1为琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物。如图1所示，泳道1、2、4、5和6为连接成功的质粒，结合测序结果，表明载体pET‑28a‑AcmA成功连接上了目的基因。

[0051] 3)带有AcmA标签葡聚糖蔗糖酶重组表达

[0052] 将重组质粒pET‑28a‑AcmA‑DsrB转化进大肠杆菌BL21感受态细胞中，并在含有50mg/L的卡那霉素的LB培养基中培养，利用IPTG进行诱导表达，选取37℃、25℃、16℃作为诱导温度进行优化，表达结束后收集菌体进行超声破碎、离心收集上清，利用BEM(制备方法同实施例3)对上清中的葡聚糖蔗糖酶粗酶液进行固定化(BEM与粗酶液结合时间为60min)后进行枣汁中糖转化(糖转化条件为：30℃，20h)，测定转化前后的蔗糖含量。测定结果为37℃下枣中蔗糖降低36％，25℃下枣中蔗糖降低54％，16℃下枣中蔗糖降低67％。与37℃和25℃两个诱导温度相比，在16℃的诱导条件下，葡聚糖蔗糖酶能够降低枣汁中更多的蔗糖含量。

[0053] 图2为重组葡聚糖蔗糖酶SDS‑PAGE分析。泳道M：蛋白质marker；泳道1：诱导前菌液；泳道2：诱导后菌液；泳道3：超声破碎上清；泳道4：超声破碎沉淀。经过IPTG诱导后，在150～250KDa范围内有目的条带，证明IPTG可以诱导重组葡聚糖蔗糖酶的表达；通过比较超声破碎的上清和超声破碎的沉淀得出，重组葡聚糖蔗糖酶DsrB属于胞内可溶性蛋白，在经过超声破碎以后可以使重组酶释放。

[0054] 图3为诱导温度对重组葡聚糖蔗糖酶表达量的影响。本发明采用不同的诱导温度对蛋白表达量的影响，结果如图3所示，在采用SDS‑PAGE进行测定的同时也采用酶活对其进行测定，在诱导温度为16℃的时候，目的蛋白的表达量是最大的，并且酶活最高，因此确定16℃为最佳诱导温度。

[0055] 实施例3

[0056] 酶的固定化

[0057] 使用BEM纯化固定化酶的技术对实施例2在16℃诱导温度下得到的葡聚糖蔗糖酶的粗酶液进行纯化。BEM的制备参考赵芳坤在《天津大学》发表的“基于BEM和AcmA表达系统的重组蛋白纯化与固定化方法的研究”的文章。乳酸乳球菌NZ9000过夜培养，离心20min收集菌体(4000rpm，室温)，加入0.1MHCl重悬菌体(每100mL菌液收集的菌体加入100mL 0.1M HCl)，然后煮沸菌体30min以去除蛋白和DNA，冷却后在室温下8000rpm离心20min，得到的沉淀即为BEM，利用PBS充分洗涤BEM，得到BEM颗粒沉淀物。制备的BEM储存于4℃冰箱。BEM的本质是肽聚糖，AcmA标签作为一种肽聚糖水解酶能够特异性结合到乳酸乳球菌的细胞壁上，从而一步实现蛋白质的纯化和固定化。

[0058] 将适量的BEM颗粒沉淀物与粗酶液在冰上结合10min、30min、60min后，在4℃条件下，12000×g离心10min去上清液，并用50mMTris‑Hcl对BEM结合后的葡聚糖蔗糖酶的沉淀进行清洗，得到固定化的葡聚糖蔗糖酶，利用固定化葡聚糖蔗糖酶进行枣汁中糖转化(糖转化条件为：30℃，20h)，测定转化前后的蔗糖含量。测定结果为结合10min后枣中蔗糖降低30％，结合30min后枣中蔗糖降低50％，结合60min后枣中蔗糖降低65％。

[0059] 图4为重组葡聚糖蔗糖酶的SDS‑PAGE分析。泳道M：蛋白marker，泳道1：诱导前的全菌；泳道2：诱导后的全菌；泳道3：超声破碎的上清液；泳道4：超声破碎的沉淀物；泳道5：BEM(固定材料)；泳道6：BEM结合的上清液；泳道7：BEM结合的沉淀物。由图4可知：纯化后的重组葡聚糖蔗糖酶与纯化前的相比，杂蛋白条带很少，获得了良好的纯化效果。

[0060] 实施例4

[0061] 枣汁中蔗糖转化葡聚糖

[0062] 枣汁中蔗糖的转化

[0063] 向枣汁中加入实施例3结合60min条件下获得的固定化葡聚糖蔗糖酶，30℃下进行枣汁中蔗糖的转化，反应时间分别为12h、14h、16h、18h、20h，反应温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，反应结束后12000×g离心10min去除固定化酶。测定转化前后的蔗糖含量。

[0064] 利用固定化酶将枣中蔗糖转化为葡聚糖，反应结束后通过离心去除酶。降低蔗糖含量的同时提高益生元/膳食纤维葡聚糖的含量。

[0065] 测定结果为反应12h枣中蔗糖降低30％，反应16h后枣中蔗糖降低58％，反应20h后枣中蔗糖降低67％。葡聚糖产量在20h时增长变缓，综合考虑经济效益等指标，得出最佳产糖时间为20h，葡聚糖产量为191.9g/L，理论产量达到77％。

[0066] 图5为固定化葡聚糖蔗糖酶在蔗糖溶液和枣汁中反应前后变化结果图，左图为固定化葡聚糖蔗糖酶在蔗糖溶液中反应的前后变化图，由图5左图可知，反应后蔗糖溶液变浑浊，证明蔗糖转化为了葡聚糖；右图为固定化葡聚糖蔗糖酶在枣汁中反应的前后变化图，由图5右图可知，反应后的枣汁明显变浑浊，固定化葡聚糖蔗糖酶成功将枣汁中的蔗糖转化为葡聚糖。

[0067] 图6为葡聚糖全波长扫描结果图。在蔗糖溶液反应后得到的葡聚糖经过纯化后，在波长200nm左右有最大的特征吸收峰，是碳水化合物的特征吸收峰，而在260～280nm的范围内没有特征吸收峰，就表明纯化后的葡聚糖中不含有核酸和蛋白质。

[0068] 图7为固定化葡聚糖蔗糖酶最适温度的结果图。右旋糖酐蔗糖酶的理想温度为30℃，温度超过30℃后，酶活性迅速下降。右旋糖酐蔗糖酶的活性在20～30℃之间相对较高，35℃时仍有95％的活性。

[0069] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。