| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410475208.2 | 申请日 | 2024-04-19 |
| 公开(公告)号 | CN118389482A | 公开(公告)日 | 2024-07-26 |
| 申请人 | 浙江工业大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 杨根生; 刘弘周; 郭钫元; 杨庆良; | 第一发明人 | 杨根生 |
| 权利人 | 浙江工业大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 浙江工业大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：浙江省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：浙江省杭州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：浙江省杭州市拱墅区潮王路18号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：310014 |
| 主IPC国际分类 | C12N11/16 | 所有IPC国际分类 | C12N11/16 ; C12N9/00 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 8 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 杭州天正专利事务所有限公司 | 专利代理人 | 朱思兰; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种基于二 氧 化 钛 微球选择性富集分离载有FoF1‑ATPase的载色体囊泡的方法，包括：将TiO2微球与chroma溶液混合，调节pH至2.38～6.48，所得 混合液 静置，离心，得到表面 吸附 了chroma的TiO2微球和上清液①；将吸附了chroma的TiO2微球置于PBS缓冲液中，静置使chroma 解吸 附，离心，得到TiO2微球和上清液②；所得上清液②即为解吸后游离的chroma；其中，chroma表示载有FoF1‑ATPase的载色体囊泡；本发明较传统的超速离心法可以更快速、高效的分离chroma，且分离得到的chroma具有更高的ATP合成活性与比活 力 。 | ||
| 权利要求 | 1.一种基于TiO2微球选择性富集分离chroma的方法，其特征在于，所述方法包括： |
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| 说明书全文 | 基于二氧化钛微球选择性富集分离载有FoF1‑ATPase的载色体囊泡的方法 技术领域[0001] 本发明涉及一种获取载有FoF1‑ATPase的载色体囊泡(chromatophore)的方法，特别是涉及一种基于二氧化钛(TiO2)微球选择性富集分离载有FoF1‑ATPase的载色体囊泡的方法。 背景技术[0002] FoF1‑ATPase是一种广泛存在于线粒体内膜、叶绿体类囊体、异养菌和光合菌的质膜的分子马达蛋白。载有FoF1‑ATPase的载色体囊泡(chromatophore，以下简称chroma)既可以消耗ADP与化学势能合成ATP，也可以水解ATP并利用其释放的化学能逆浓度梯度转运质子。其合成、水解ATP的过程均会使其像马达一样旋转，且此过程中马达的载荷会影响其旋转速率进而影响合成/水解ATP的能力，利用这一点，可在FoF1‑ATPase上接枝各种探针以实现生物传感的功能。 [0003] 但目前获取chroma的方法主要是超速离心，此过程耗时耗力且超速离心机价格高昂，无法实现大批量生产。因此，开发一种简单高效且低成本的chroma分离方法尤为重要。 发明内容[0004] 本发明目的在于提供一种基于TiO2微球选择性富集分离chroma的方法，该方法仅需低速离心、在短时间内便可实现chroma在TiO2微球上的选择性吸附与分离。 [0005] 本发明的技术方案如下： [0006] 一种基于TiO2微球选择性富集分离chroma的方法，包括： [0007] 将TiO2微球与chroma溶液混合，调节pH至2.38～6.48，所得混合液静置，离心，得到表面吸附了chroma的TiO2微球和上清液①；将吸附了chroma的TiO2微球置于PBS缓冲液中，静置使chroma解吸附，离心，得到TiO2微球和上清液②；所得上清液②即为解吸后游离的chroma； [0008] 上述方法中， [0009] chroma表示载有FoF1‑ATPase的载色体囊泡； [0010] TiO2微球的晶型为锐钛矿型或金红石型，粒径在0.2～3.0μm，特别优选粒径在1μm左右； [0011] TiO2微球与chroma的质量比为0.01～4:13，特别优选1.2:13； [0012] pH的调节可以使用1M盐酸，特别优选所述混合液的pH调节至4.0； [0013] 所述混合液静置的温度为4℃，时间为20～120min；特别优选在4℃下静置1h； [0014] chroma解吸附时静置的温度为室温，时间为10～60min；特别优选在室温下静置30min； [0015] 解吸用PBS缓冲液的pH＝6.8～9.0，特别优选pH＝7.4的PBS缓冲液； [0016] 离心操作的离心力在3000～3500×g，离心时间3～5min； [0017] 所述上清液①、上清液②没有特殊的含义，标记为“①”、“②”只是用于区分不同离心操作中获得的上清液。 [0018] 本发明的优点和效果如下： [0019] 本发明较传统的超速离心法可以更快速、高效的分离chroma，传统超速离心法分离需100000×g的离心力持续30min，本发明在3000×g下仅需3min便可分离出chroma(其他条件参照实施例1)，且分离得到的chroma具有更高的ATP合成活性与比活力。 [0020] 将本发明分离得到的chroma与经超速离心法得到的chroma做SDS‑PAGE电泳，并以未经纯化处理的chroma为对照，结果见图4。超速离心纯化是目前最常用的chroma纯化方法，故采用其作为对照来评估TiO2微球通过对chroma的选择性吸附以提纯的效果。经超速离心与TiO2微球吸附解吸得到的chroma均保留了其上的FoF1‑ATPase的全部亚基。B条带与C条带对比可见，经超速离心纯化后的chroma少了42kD和约120kD的条带，且在42‑52kD、35kD与约59‑66kD处条带颜色明显变淡，说明这些分子量的部分蛋白可通过超速离心法除去。经TiO2微球纯化的A条带，同样在42‑52kD、35kD与约59‑66kD处条带颜色明显变淡，表明对此区间蛋白的纯化上，TiO2微球也具有较好的效果；且在约100kD处，A条带比B、C条带颜色更浅，表明此部分蛋白超速离心法无法除去，但TiO2微球则可以通过选择性吸附来除去。 [0021] 将本发明分离得到的chroma与经超速离心法得到的chroma置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，以37℃下15min内ATP的合成量为指标测定其FoF1‑ATPase的活性(用ATP检测试剂盒检测其化学发光强度)，结果见图5。由图5可知，两种纯化方法均有所损失，但超速离心法得到的chroma活性损失大于TiO2微球吸附法，表明本发明对chroma的分离效率优于传统的超速离心法。 [0022] 将本发明分离得到的chroma、经超速离心法得到的chroma与同浓度未处理的chroma溶液各取2mL冻干称重，根据下式计算其比活力与纯化倍数： [0023] [0024] [0026] 图1：本发明方法流程图。 [0027] 图2：从左至右分别是：纯TiO2微球的SEM图、TiO2微球吸附chroma的SEM图、TiO2微球吸附chroma并经PBS解吸的SEM图。 [0028] 图3：从左至右分别是：纯TiO2微球的TEM图、TiO2微球吸附chroma的TEM图、TiO2微球吸附chroma并经PBS解吸的TEM图。 [0029] 图4：经TiO2微球吸附解吸后的chroma(A)、未处理的chroma(B)与超速离心纯化后的chroma(C)的SDS‑PAGE电泳结果。 [0030] 图5：经TiO2微球吸附解吸后的chroma(DAT)、未处理的chroma(Untreated)与超速离心纯化后的chroma(CY)的合成活性。 [0031] 图6：chroma经不同处理的比活力(A)与两种方法的纯化倍数(B)。 [0032] 图7：实施例1中ATP的合成量检测结果。 [0033] 图8：实施例2中ATP的合成量检测结果。 [0034] 图9：实施例3中ATP的合成量检测结果。 [0035] 图10：实施例4中ATP的合成量检测结果。 [0036] 图11：实施例5中ATP的合成量检测结果。 [0037] 图12：实施例6中ATP的合成量检测结果。 [0038] 图13：实施例7中ATP的合成量检测结果。 [0039] 图14：实施例8中ATP的合成量检测结果。 [0040] 图15：实施例9中ATP的合成量检测结果。 [0041] 图16：实施例10中ATP的合成量检测结果。 [0042] 图17：实施例11中ATP的合成量检测结果。 [0043] 图18：实施例12中ATP的合成量检测结果。 具体实施方式[0045] 以下实施例中， [0046] 锐钛矿型TiO2微球购自上海麦克林生化科技有限公司； [0047] 金红石型TiO2微球购自上海肴戈合金材料有限公司； [0048] chroma是直接从浙江摩达生物科技有限公司获取的浓缩版的溶液，溶剂为水相。 [0049] 实施例1：最优条件下的吸附分离 [0050] 将1μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝4.0，4℃下静置1h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝7.4的PBS中，室温静置30min，3286×g离心 5min得到上清液②和TiO2微球。 [0051] 由图2可见，空白TiO2微球光滑圆整，吸附了chroma的TiO2微球表面可见大量干瘪囊泡，而经PBS解吸后囊泡几乎全部被解离。 [0052] 由图3可见，空白TiO2微球光滑圆整，吸附了chroma的TiO2微球表面可见大量囊泡，而经PBS解吸后囊泡几乎全部被解离。 [0053] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图7。 [0054] 此条件下，上清液②中chroma合成活性为原液的96.3％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的2.3％，表明该条件下TiO2微球对chroma的吸附分离效果良好。 [0055] 实施例2：低吸附pH下的吸附分离 [0056] 将1μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝2.38，4℃下静置1h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝7.4的PBS中，室温静置30min，3286×g离心 5min得到上清液②和TiO2微球。 [0057] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图8。 [0058] 此条件下，上清液②中chroma合成活性仅为原液的55.12％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的10.9％，表明该条件下TiO2微球对chroma的吸附分离效果较差。 [0059] 实施例3：高吸附pH下的吸附分离 [0060] 将1μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝6.48，4℃下静置1h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝7.4的PBS中，室温静置30min，3286×g离心 5min得到上清液②和TiO2微球。 [0061] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图9。 [0062] 此条件下，上清液②中chroma合成活性仅为原液的21.1％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的90.4％，表明该条件下大部分chroma均未被TiO2微球吸附，分离效果很差。 [0063] 实施例4：高TiO2微球用量情况下的吸附分离 [0064] 将1μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取48μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝4.0，4℃下静置1h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝7.4的PBS中，室温静置30min，3286×g离心 5min得到上清液②和TiO2微球。 [0065] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图10。 [0066] 此条件下，上清液②中chroma合成活性仅为原液的54.12％，上清液①中留存的chroma合成活性仅为原液的0.79％，解吸后TiO2微球上残留的chroma活性仍有17.0％，表明该条件下TiO2微球对chroma具有一定吸附效果，但解吸附效果很差。 [0067] 实施例5：低TiO2微球用量情况下的吸附分离 [0068] 将1μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成0.5mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝4.0，4℃下静置1h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝7.4的PBS中，室温静置30min，3286×g离心5min得到上清液②和TiO2微球。 [0069] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图11。 [0070] 此条件下，上清液②中chroma合成活性为原液的55.2％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的59.2％，表明该条件下大部分chroma均未被TiO2微球吸附，分离效果较差。 [0071] 实施例6：较低解吸pH下的吸附分离 [0072] 将1μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝4.0，4℃下静置1h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝6.8的PBS中，室温静置30min，3286×g离心 5min得到上清液②和TiO2微球。 [0073] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图12。 [0074] 此条件下，上清液②中chroma合成活性为原液的65.0％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的2.4％，解吸后TiO2微球上残留的chroma活性仍有22.7％，表明该条件下大部分chroma均被TiO2微球吸附，但有较多chroma难以解吸附。 [0075] 实施例7：较高解吸pH下的吸附分离 [0076] 将1μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝4.0，4℃下静置1h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝9.0的PBS中，室温静置30min，3286×g离心 5min得到上清液②和TiO2微球。 [0077] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图13。 [0078] 此条件下，上清液②中chroma合成活性为原液的93.5％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的2.4％，解吸后TiO2微球上残留的chroma活性仅有0.6％，表明该条件下大部分chroma均被TiO2微球吸附，且吸附分离效果良好。 [0079] 实施例8：采用金红石型TiO2微球的吸附分离 [0080] 将1μm的金红石型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝4.0，4℃下静置1h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝7.4的PBS中，室温静置30min，3286×g离心 5min得到上清液②和TiO2微球。 [0081] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图14。 [0082] 此条件下，上清液②中chroma合成活性为原液的91.2％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的10.6％，表明金红石型TiO2微球对chroma的吸附分离效果较好。 [0083] 实施例9：TiO2微球粒径较大情况下的吸附分离 [0084] 将3μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝4.0，4℃下静置1h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝7.4的PBS中，室温静置30min，3286×g离心 5min得到上清液②和TiO2微球。 [0085] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图15。 [0086] 此条件下，上清液②中chroma合成活性为原液的61.8％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的44.5％，解吸后TiO2微球上残留的chroma活性有6.9％，表明该条件下有较多chroma未被TiO2微球吸附，分离效果较差。 [0087] 实施例10：TiO2微球粒径较小情况下的吸附分离 [0088] 将0.2μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝4.0，4℃下静置1h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝7.4的PBS中，室温静置30min，3286×g离心5min得到上清液②和TiO2微球。 [0089] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图16。 [0090] 此条件下，上清液②中chroma合成活性为原液的89.9％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的15.0％，解吸后TiO2微球上残留的chroma活性有9.6％，表明该条件下大部分chroma均被TiO2微球吸附，分离效果较好。 [0091] 实施例11：较长吸附时间下的吸附分离 [0092] 将1μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝4.0，4℃下静置2h，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝7.4的PBS中，室温静置30min，3286×g离心 5min得到上清液②和TiO2微球。 [0093] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图17。 [0094] 此条件下，上清液②中chroma合成活性为原液的81.9％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的20.0％，解吸后TiO2微球上残留的chroma活性有4.0％，表明该条件下大部分chroma均被TiO2微球吸附，分离效果较好。 [0095] 实施例12：较短吸附时间下的吸附分离 [0096] 将1μm的锐钛矿型TiO2微球加入纯化水中配置成50mg/mL的混悬液，加入混悬液1/6体积的1M盐酸，超声5min，静置12h；取12μL该TiO2混悬液加到500μL 13mg/mL的chroma溶液中，调pH＝4.0，4℃下静置20min，3286×g离心5min后即可得到表面吸附了chroma的TiO2和上清液①。将吸附了chroma的TiO2微球置于pH＝7.4的PBS中，室温静置30min，3286×g离心5min得到上清液②和TiO2微球。 [0097] 分别将chroma溶液、上清液①、上清液②和TiO2微球置于启动buffer(含8.1mg/mL Tricine,0.42mg/mL MgCl2,0.612mg/mL KH2PO4,18％甘油,0.15mg/mL ADP的水溶液)中，用ATP检测试剂盒测定其37℃下15min内ATP的合成量。结果见图18。 [0098] 此条件下，上清液②中chroma合成活性为原液的92.2％，上清液①中留存的chroma合成活性为原液的1.8％，解吸后TiO2微球上残留的chroma活性有9.2％，表明该条件下大部分chroma均被TiO2微球吸附，分离效果良好。 |
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