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工程化细胞-益生菌组合体和应用

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202410176859.1	申请日	2024-02-08
公开(公告)号	CN118086277A	公开(公告)日	2024-05-28
申请人	深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院);	申请人类型	企业
发明人	高成; 顾大勇; 赵晓娜; 王晶哲; 刘同功;	第一发明人	高成
权利人	深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院)	权利人类型	企业
当前权利人	深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院)	当前权利人类型	企业
省份	当前专利权人所在省份：广东省	城市	当前专利权人所在城市：广东省深圳市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：广东省深圳市福田区华富街道笋岗西路3002号	邮编	当前专利权人邮编：518048
主IPC国际分类	C12N11/16	所有IPC国际分类	C12N11/16 ; C12N1/20 ; C12N5/0786 ; A61K35/17 ; A61K35/15 ; A61K35/747 ; A61K35/745 ; A61K35/741 ; A61P1/00 ; A61P1/04 ; C12R1/01
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	10	专利文献类型	A
专利代理机构	华进联合专利商标代理有限公司	专利代理人	舒婉云;
摘要	本申请公开了一种工程化细胞‑ 益生菌组合体和应用，工程化细胞‑益生菌组合体包括：工程化免疫细胞以及交联固定于工程化免疫细胞内的益生菌。本申请的工程化免疫细胞有效保留了细胞的完整膜结构及重要膜蛋白，能够对益生菌起到保护作用并限制胞内益生菌的运动范围且不影响益生菌的活性，从而能够在保证有效装载益生菌、提高肠道富集率的同时发挥自身的抗炎作用，大大提高对肠道炎症疾病的治疗效果；同时由于工程化免疫细胞不具有生理活性，不易引起免疫排斥反应，保证了其生物安全性。
权利要求	1.一种工程化细胞‑益生菌组合体，其特征在于，所述工程化细胞‑益生菌组合体包括工程化免疫细胞以及交联固定于所述工程化免疫细胞内的益生菌。 2.根据权利要求1所述的工程化细胞‑益生菌组合体，其特征在于，所述工程化免疫细胞选自淋巴细胞、树突状细胞、单核巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞中的至少一种。 3.根据权利要求1所述的工程化细胞‑益生菌组合体，其特征在于，所述益生菌选自乳杆菌属细菌、双歧杆菌属细菌和革兰阳性球菌属细菌中的至少一种。 4.根据权利要求1～3任一项所述的工程化细胞‑益生菌组合体，其特征在于，所述工程化细胞‑益生菌组合体选自单核巨噬细胞‑Nissle1917组合体、中性粒细胞‑Nissle1917组合体、巨噬细胞‑E194a组合体和中性粒细胞‑E194a组合体中的至少一种。 5.根据权利要求4所述的工程化细胞‑益生菌组合体，其特征在于，所述工程化免疫细胞满足以下条件(1)～(4)： (1)所述工程化免疫细胞具有完整细胞形态； (2)所述工程化免疫细胞的细胞膜表面炎症相关受体蛋白和介导细胞黏附相关蛋白正常表达； (3)所述工程化免疫细胞具有可供益生菌穿过的细胞膜孔隙和用于交联固定益生菌的胞内孔隙； (4)所述工程化免疫细胞不具有细胞活性；可选地，所述工程化免疫细胞为凝胶化的免疫细胞。 6.根据权利要求1～4任一项所述的工程化细胞‑益生菌组合体的制备方法，其特征在于，包括：采用交联固定剂对免疫细胞进行预处理使得免疫细胞维持原始形态；将益生菌和预处理后的免疫细胞共同孵育，将交联固定剂固化使得益生菌交联固定于免疫细胞内。 7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，共同孵育的条件满足以下条件(1)～(5)中的至少一个： 7 7 (1)免疫细胞的孵育浓度为1×10/mL～5×10/mL； 8 9 (2)益生菌的孵育浓度为1×10CFU/mL～2×10CFU/mL； (3)共同孵育的温度为25～37℃； (4)共同孵育时间为4h～6h； (5)共同孵育的转速为200rpm～600rpm。 8.根据权利要求6或者7所述的制备方法，其特征在于，将益生菌和预处理后的免疫细胞共同孵育之后还包括：对共同孵育得到的混合液离心以收集免疫细胞；可选地，所述离心的条件1200rpm～2400rpm，离心3min～6min；可选地，所述交联固定剂包括凝胶化试剂；可选地，所述交联固定剂包括亲水性高分子聚乙二醇二丙烯酸酯和光敏引发剂2‑羟基‑2‑甲基丙酰苯基丙酮。 9.根据权利要求1～5任一项所述的工程化细胞‑益生菌组合体在制备治疗炎症性肠道疾病药物中的应用。 10.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的工程化细胞‑益生菌组合体或者权利要求6～8任一项所述的制备方法制备的工程化细胞‑益生菌组合体。
说明书全文	工程化细胞‑益生菌组合体和应用技术领域 [0001] 本申请涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及工程化细胞‑益生菌组合体和应用。背景技术 [0002] 炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性炎症性肠道疾病，具有慢性病程、迁移不愈的特点，分为溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)两种。 [0003] 目前IBD的病因尚不完全清楚，大量研究与临床试验指出可能与持续的弥漫性肠道上皮炎症和肠道微生物组成改变有关，尽管已有临床处方药物用于缓解患者症状，但治疗效果远不能令人满意，不仅显示出高度无效，而且在大量患者中显示出严重的副作用，容易使病情处于失控状态。 [0004] 研究发现肠上皮单层细胞通过细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素‑1β(IL‑1β)，尤其是TNF‑α和IFN‑γ可直接影响肠上皮细胞的通透性以及生电离子转运能力。于是单克隆抗体如抗TNF‑α抗体和抗IL‑1β抗体等生物制剂被广泛用于治疗常规药物治疗失败的患者，但由于IBD涉及多种炎症细胞因子，一种抗体或其混合物仅加速相应炎症因子或其中几种的清除，其他与疾病特征相关的细胞因子仍然持续存在并损伤肠上皮细胞。 [0005] 此外，研究表明肠道微生物群失衡在IBD的发生发展中起重要作用，与正常对照组相比，在IBD患者和小鼠结肠炎中均发现肠道菌群失调。因此，基于调节肠道微生物群的治疗方法也被提出用于预防和治疗IBD，大量临床研究表明调节肠道菌群对动物模型(小鼠和大鼠)甚至IBD患者的结肠炎具有改善作用。 [0006] 益生菌可用于重新平衡肠道微生物群，增加肠道上皮屏障功能，同时提高细胞因子产生，最终促进宿主健康。然而，传统的口服益生菌大多对肠道内皮细胞的粘附能力较弱，尤其是在经过胃酸、肠液等强酸强碱环境后，最终导致其在肠道内富集率降低，很快就会被排出肠道，进而无法长时间停留在肠道炎症处发挥调节菌群失衡的作用。 [0007] 因此，如何有效避免口服过程中益生菌的降解同时提高其在肠道的富集是目前炎症性肠病治疗方面亟待解决的问题之一。发明内容 [0008] 为了解决上述问题，有效避免口服过程中益生菌的降解同时提高其在肠道的富集率，本申请的第一目的在于提供一种工程化细胞‑益生菌组合体，工程化细胞‑益生菌组合体工程化免疫细胞以及交联固定于工程化免疫细胞内的益生菌。 [0009] 本申请的工程化免疫细胞有效保留了细胞的完整形态结构及重要膜蛋白，能够对益生菌起到保护作用并限制胞内益生菌的运动范围且不影响益生菌的活性，从而能够在保证有效装载益生菌、提高肠道富集率的同时发挥自身的抗炎作用，大大提高对肠道炎症疾病的治疗效果；同时由于工程化免疫细胞不具有生理活性，不易引起免疫排斥反应，保证了其生物安全性。 [0010] 在其中一个实施方式中，免疫细胞选自淋巴细胞、树突状细胞、单核巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞中的至少一种。 [0011] 在其中一个实施方式中，益生菌选自乳杆菌属细菌、双歧杆菌属细菌和革兰阳性球菌属细菌中的至少一种。 [0012] 在其中一个实施方式中，工程化细胞‑益生菌组合体选自单核巨噬细胞‑Nissle1917组合体、中性粒细胞‑Nissle1917组合体、巨噬细胞‑E194a组合体和中性粒细胞‑E194a组合体中的至少一种。 [0013] 在其中一个实施方式中，工程化免疫细胞胞满足以下条件(1)～(4)； [0014] (1)工程化免疫细胞具有完整细胞形态； [0015] (2)工程化免疫细胞的细胞膜表面炎症相关受体蛋白和介导细胞黏附相关蛋白正常表达； [0016] (3)工程化免疫细胞具有可供益生菌穿过的细胞膜孔隙和用于交联固定益生菌的胞内孔隙； [0017] (4)工程化免疫细胞不具有细胞活性； [0018] 可选地，工程化免疫细胞为凝胶化的免疫细胞。 [0019] 本申请的第二目的在于提供上述工程化细胞‑益生菌组合体的制备方法，包括： [0020] 采用交联固定剂对免疫细胞进行预处理使得免疫细胞维持原始形态； [0021] 将益生菌和预处理后的免疫细胞共同孵育，将交联固定剂固化使得益生菌交联固定于免疫细胞内。 [0022] 在其中一个实施方式中，共同孵育的条件满足以下条件(1)～(5)中的至少一个： [0023] (1)免疫细胞的孵育浓度为1×107/mL～5×107/mL； [0024] (2)益生菌的孵育浓度为1×108CFU/mL～2×109CFU/mL； [0025] (3)共同孵育的温度为25～37℃； [0026] (4)共同孵育时间为4h～6h； [0027] (5)共同孵育的转速为200rpm～600rpm。 [0028] 在其中一个实施方式中，将益生菌和预处理后的免疫细胞共同孵育之后还包括：对共同孵育后的混合液离心以收集免疫细胞； [0029] 可选地，离心的条件1200rpm～2400rpm，离心3min～6min； [0030] 可选地，交联固定剂包括凝胶化试剂； [0031] 可选地，交联固定剂包括亲水性高分子聚乙二醇二丙烯酸酯和光敏引发剂2‑羟基‑2‑甲基丙酰苯基丙酮。 [0032] 本申请的第三目的在于提供上述工程化细胞‑益生菌组合体在制备治疗炎症性肠道疾病药物中的应用。 [0033] 本申请的第四目的在于提供一种药物组合物，包括上述工程化细胞‑益生菌组合体或者上述制备方法制备的工程化细胞‑益生菌组合体。附图说明 [0034] 为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0035] 图1为本申请实施例1提供的正常巨噬细胞(M)、凝胶化处理的巨噬细胞(GM)、正常益生菌(EcN)的扫描电镜图； [0036] 图2为本申请实施例1提供的工程化细胞装载带荧光益生菌形成组合体的共聚焦显微镜图； [0037] 图3为本申请实施例1提供的单独的益生菌以及工程化细胞‑益生菌组合体的透射电镜图，图3中的左图为单独的益生菌的透射电镜图，图3中的右图为工程化细胞‑益生菌组合体的透射电镜图； [0038] 图4为本申请实施例1提供的正常细胞、工程化巨噬细胞、益生菌、工程化细胞‑益生菌组合体的考马斯亮蓝全蛋白条带图； [0039] 图5为本申请实施例1提供的直接将不同浓度工程化细胞‑益生菌组合体涂板的结果图； [0040] 图6为本申请实施例1提供的直接将不同浓度工程化细胞‑益生菌组合体释放的益生菌数量统计结果图； [0041] 图7为本申请实施例1提供的正常益生菌和工程化细胞‑益生菌组合体中益生菌的生长曲线图； [0042] 图8为本申请实施例3提供的益生菌和工程化细胞‑益生菌组合体中益生菌的肠道保留情况示意图； [0043] 图9为本申请实施例3提供的工程化细胞‑益生菌组合体在IBD小鼠肠道中的工程化细胞与细菌共定位情况示意图。具体实施方式 [0044] 现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。 [0045] 因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。 [0046] 为了至少部分解决上述技术问题的至少一个，本申请的第一方面提供了一种工程化细胞‑益生菌组合体，包括工程化免疫细胞以及交联固定于工程化免疫细胞内的益生菌。 [0047] 本申请的工程化免疫细胞有效保留了细胞的完整形态结构及重要膜蛋白，能够对益生菌起到保护作用并限制胞内益生菌的运动范围且不影响益生菌的活性，延长益生菌的释放时间，从而能够保证有效装载益生菌、提高肠道富集率的同时发挥自身的抗炎作用，大大提高对肠道炎症疾病的治疗效果；同时由于工程化免疫细胞不具有生理活性，不易引起免疫排斥反应，保证了其生物安全性。 [0048] 一些实施方案中，工程化免疫细胞是指通过交联固化剂处理并对交联固化剂固化得到的免疫细胞。具体地，免疫细胞通过交联固化剂处理后仍具有完整细胞形态，能够对益生菌起到保护作用并限制胞内益生菌的运动范围，还具有可供益生菌穿过的细胞膜孔隙和用于交联固定益生菌的胞内孔隙。对免疫细胞中的交联固定剂固化后，可以限制胞内孔隙中的益生菌的运动，避免益生菌未到达肠道炎症部位提前释放，延长细菌的释放时间。 [0049] 本申请中工程化免疫细胞细胞膜表面炎症相关受体蛋白和介导细胞黏附相关蛋白正常表达，可发挥自身的抗炎作用；工程化免疫细胞不具有细胞活性，免疫应答弱，在保证不损害益生菌活性的前提下可作为生物载体，保护益生菌不受胃液肠液影响，靶向运输益生菌到肠道炎症部位，发挥菌群调节、治疗炎症作用。一些具体实施方案中，工程化免疫细胞为凝胶化的免疫细胞。 [0050] 具体地，凝胶化的免疫细胞通过免疫细胞与凝胶化试剂反应后得到，凝胶化试剂可以在保持细胞完整结构以及膜表面蛋白的前提下，使得细胞表面形成孔隙，以促进益生菌进入免疫细胞内部。益生菌进入免疫细胞内部后，通过固化凝胶化试剂可以将益生菌交联固定于免疫细胞内，在维持并保护益生菌活性的同时限制益生菌运动范围，延长益生菌释放时间。 [0051] 免疫细胞称白细胞，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛，主要是T淋巴细胞、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化，分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T淋巴细胞和B淋巴细胞外，还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞，共四种类型。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统的细胞。 [0052] 一些具体实施方案中，免疫细胞选自淋巴细胞、树突状细胞、单核巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞中的至少一种。 [0053] 本申请中，益生菌是通过定植在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。肠道定植益生菌有助于调节宿主黏膜与系统免疫功能进而调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康。 [0054] 一些具体实施方案中，肠道益生菌选自大肠杆菌属细菌、乳杆菌属细菌、双歧杆菌属细菌和革兰阳性球菌属细菌中的至少一种。 [0055] 一些具体实施方案中，工程化细胞‑益生菌组合体选自单核巨噬细胞‑Nissle1917组合体、中性粒细胞‑Nissle1917组合体、巨噬细胞‑E194a组合体和中性粒细胞‑E194a组合体中的至少一种。 [0056] 本申请的第二方面提供了一种工程化细胞‑益生菌组合体的制备方法，包括以下步骤： [0057] 采用交联固定剂对免疫细胞进行预处理使得免疫细胞维持原始形态； [0058] 将益生菌和预处理后的免疫细胞共同孵育，将交联固定剂固化使得益生菌交联固定于免疫细胞内。 [0059] 本申请发现采用交联固定剂对免疫细胞进行预处理，可以有效保留细胞的完整形态结构及重要膜蛋白，进一步将益生菌装载进入免疫细胞中进行交联固化，亦不影响细胞的完整形态结构及重要膜蛋白结构，并且能并对益生菌起到保护作用并限制胞内益生菌的运动范围且不影响益生菌的活性。 [0060] 具体地，将亲水性高分子聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG‑DA)与光敏引发剂2‑羟基‑2‑甲基丙酰苯基丙酮(I2959)的混合液与免疫细胞一起孵育，并迅速放入‑80℃冰箱冷冻，加速试剂进入胞内交联，维持细胞形貌的同时使得细胞表面穿孔。 [0061] 随后，将处理后的细胞与益生菌共同孵育后，离心弃上清，紫外照射使得细胞胞质与细菌相互交联成网，形成工程化免疫细胞‑益生菌的组合体。 [0062] 一些具体实施方案中，共同孵育体系中免疫细胞的孵育浓度为1×107/mL～9×7 7 7 7 7 7 10/mL，例如免疫细胞的孵育浓度为1×10/mL、2×10 /mL、3×10/mL、4×10/mL、5×10 / 7 7 7 7 mL、6×10/mL、7×10/mL、8×10/mL、9×10/mL。 [0063] 一些具体实施方案中，益生菌的孵育浓度为1×108CFU/mL～2×109CFU/mL，例如益8 8 8 8 8 生菌的孵育浓度为1×10CFU/mL、2×10CFU/mL、3×10 CFU/mL、4×10CFU/mL、5×10CFU/ 8 8 8 8 9 9 mL、6×10 CFU/mL、7×10CFU/mL、8×10 CFU/mL、9×10CFU/mL、1×10 CFU/mL、2×10CFU/mL。 [0064] 一些具体实施方案中，共同孵育的温度为37℃。 [0065] 一些具体实施方案中，共同孵育时间为4h～6h；例如孵育时间为4h、4.5h、5h、5.5h、6h。 [0066] 一些具体实施方案中，共同孵育的转速为200rpm～600rpm。例如孵育的转速为200rpm、300rpm、400rpm、500rpm、600rpm。 [0067] 一些实施方案中，对共同孵育后的混合液离心以收集免疫细胞，从而将含有益生菌的免疫细胞和益生菌分离。 [0068] 一些具体实施方案中，离心的转速为1200rpm～2400rpm，离心时间为3min～6min。例如，离心转速为1200rpm、1300rpm、1500rpm、1800rpm或2400rpm，离心时间为3min、4min、 5min或6min。 [0069] 本申请的第三方面提供了工程化细胞‑益生菌组合体在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。 [0070] 具体地，炎症性肠病是一种慢性炎症性肠道疾病，具有慢性病程、迁移不愈的特点，本申请的工程化细胞‑益生菌组合体能够有效保护菌体本身不受胃酸、小肠液的侵袭，顺利到达肠道，起到调节肠道菌群的作用；此外，益生菌载体——工程化免疫细胞由于具有炎症趋向性，能够将益生菌带到肠道炎症部位帮助其发挥菌群调节作用，同时工程化免疫细胞表面的炎症相关受体蛋白，如TNFR2、IL1R2等，以及介导黏附相关的蛋白分子，VCAM‑1、ICAM‑1、VLA‑1、IFA‑1等，可通过受体‑配体相互作用与炎症部位的细胞、炎症因子结合，达到中和炎症因子靶向治疗炎症的目的，实现靶向治疗炎症性肠病。 [0071] 本申请的第四方面提供了一种药物组合物，包含工程化细胞‑益生菌组合体。药物组合物包括活性成分和药学上可接受的辅料，活性成分包括工程化细胞‑益生菌组合体。药学上可接受的辅料是指药学上可接受的辅助材料或载体，是与药物制剂的其他成分相容并且适用于受药者(例如人或动物)的组织或器官的接触。在使用时并无或很小的毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或其他问题的并发症。 [0072] 下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但本申请不局限于这些实施例。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料，试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。 [0073] 实施例1 [0074] 本实施例的工程化细胞‑益生菌组合体包括工程化巨噬细胞和装载进入所述工程化免疫细胞胞内的益生菌Nissle1917(EcN)。 [0075] 工程化细胞‑益生菌组合体制备方法包括但不限于如下步骤： [0076] (1)巨噬细胞凝胶化前处理：配置PBS稀释的20％PEG‑DA和2％的I2959，按照1比1混合备用。巨噬细胞种板后，吸走培养基，PBS润洗3遍后加入1‑2mL混合后的凝胶化试剂覆盖培养皿底部，放入‑80°冰箱10min，使得试剂通过急冻进入细胞内部，随后，37°水浴使试剂融化后吸走，得到凝胶化处理的巨噬细胞。 [0077] (2)随后，将处于对数生长期的EcN菌液8000rpm离心8min，收集沉淀。 [0078] (3)将107/mL的步骤(1)中凝胶化处理的巨噬细胞与步骤(2)中108CFU/mL的EcN在摇床上以200rpm转速孵育4～6小时，将获得的溶液以1200rpm离心5分钟，收集沉淀后，将其置于冰上，紫外(15W)照射15分钟后，形成本实施例的工程化细胞‑益生菌组合体。 [0079] 观察及测试： [0080] (1)将正常巨噬细胞(M)、凝胶化处理的巨噬细胞(GM)、正常益生菌(EcN)在扫描电镜下观察，结果如图1所示。 [0081] (2)本实施例采用的益生菌EcN经转染后带EGFP荧光蛋白，因此将制备的工程化细胞‑益生菌构成组合体在共聚焦显微镜下观察，可看到细菌在胞内发出绿色荧光，具体如图2所示。 [0082] (3)将正常益生菌EcN(图3中左图)、制备成功的工程化细胞‑益生菌组合体(图3中右图)在透射电镜下观察，工程化细胞‑益生菌组合体的图像如图3中右图所示。 [0083] (4)通过考马斯亮蓝全蛋白条带图分析制备的工程化细胞‑益生菌组合体与正常巨噬细胞、益生菌相比全蛋白是否丢失，全蛋白分析结果如图4所示。 [0084] (5)为判断实施例1制备的组合体中益生菌是否能从胞内释放并增殖，将工程化细胞‑益生菌组合体在含50ug/mL卡那霉素的LB固体培养基中涂板培养并统计琼脂板上长出的细菌数，培养结果如图5所示，琼脂板上长出的细菌数统计结果如图6所示。将正常未经处理的益生菌和工程化细胞‑益生菌组合体分别置于含50ug/mL卡那霉素的LB培养基中37°细菌培养箱孵育，每隔1h后测量其在600nm处的OD值，并绘制生长曲线，得到生长曲线如图7所示。 [0085] 由图1和图4可知，凝胶化处理后的巨噬细胞与未处理的巨噬细胞相比，仍然维持正常的细胞形貌且细胞表达蛋白均一致。 [0086] 由图2、图3和图4可知，该方法可成功制备了工程化细胞‑益生菌组合体。 [0087] 由图6和图7的实验结果可知，制备成功的组合体中益生菌可从胞内释放并正常增殖。图6中琼脂板上长出的细菌数统计结果表明，随着工程化细胞的数量增多，琼脂板上长出的细菌数也逐渐增多，表明益生菌含量与细胞数呈正比。图7中的生长曲线结果表明与正常未经处理的益生菌组相比，工程化细胞‑益生菌组合体内益生菌从胞内释放重新回到适宜环境后仍可正常增殖，其生长不受抑制。 [0088] 实施例2 [0089] 本实施例的工程化细胞‑益生菌组合体包括工程化中性粒细胞和装载进入工程化中性粒细胞胞内的益生菌Nissle1917(EcN)。 [0090] 制备方法包括但不限于如下步骤： [0091] (1)中性粒细胞凝胶化前处理：配置PBS稀释的20％PEG‑DA和2％的I2959，按照1比1混合备用。中性粒细胞种板后，吸走培养基，PBS润洗3遍后加入1‑2mL混合后的凝胶化试剂覆盖培养皿底部，放入‑80°冰箱10min，使得试剂通过急冻进入细胞内部，随后，37°水浴使试剂融化后吸走，得到凝胶化处理的中性粒细胞。 [0092] (2)随后，将处于对数生长期的EcN菌液8000rpm离心8min,收集沉淀。 [0093] (3)将107/mL的步骤(1)中的中性粒细胞与步骤(2)中109CFU/mL的EcN在摇床上以200rpm转速孵育4小时，将获得的溶液以1600rpm离心5分钟，收集沉淀后，将其置于冰上，紫外(15W)照射15分钟后，形成本实施例的工程化细胞‑益生菌组合体。 [0094] 实施例3 [0095] 本实施例的工程化细胞‑益生菌组合体包括工程化巨噬细胞和装载进入工程化巨噬细胞胞内的益生菌E194a(Bifidobacterium Adolescentis Reuter)。 [0096] 工程化细胞‑益生菌的制备方法包括但不限于如下步骤： [0097] (1)巨噬细胞凝胶化前处理：配置PBS稀释的20％PEG‑DA和2％的I2959，按照1比1混合备用。巨噬细胞种板后，吸走培养基，PBS润洗3遍后加入1‑2mL混合后的凝胶化试剂覆盖培养皿底部，放入‑80°冰箱10min，使得试剂通过急冻进入细胞内部，随后，37°水浴使试剂融化后吸走，得到凝胶化处理的巨噬细胞 [0098] (2)随后，将处于对数生长期的E194a菌液8000rpm离心8min,收集沉淀。 [0099] (3)将107/mL的步骤(1)中的巨噬细胞与步骤(2)中108CFU/mL的E194a在摇床上以200rpm转速孵育4小时，将获得的溶液以1200rpm离心5分钟，收集沉淀后，将其置于冰上，紫外(15W)照射15分钟后，形成本实施例的工程化细胞‑益生菌组合体。 [0100] 实施例4 [0101] 本实施例的工程化细胞‑益生菌组合体包括工程化中性粒细胞和装载进入工程化中性粒细胞胞内的益生菌E194a。 [0102] 工程化中性粒的制备方法包括但不限于如下步骤： [0103] (1)中性粒细胞凝胶化前处理：配置PBS稀释的20％PEG‑DA和2％的I2959，按照1比1混合备用。中性粒细胞种板后，吸走培养基，PBS润洗3遍后加入1‑2mL混合后的凝胶化试剂覆盖培养皿底部，放入‑80°冰箱10min，使得试剂通过急冻进入细胞内部，随后，37°水浴使试剂融化后吸走，得到凝胶化处理的中性粒细胞 [0104] (2)随后，将处于对数生长期的E194a菌液8000rpm离心8min，收集沉淀。 [0105] (3)将107/mL的步骤(1)中的中性粒细胞与步骤(2)中108CFU/mL的E194a在摇床上以200rpm转速孵育4小时，将获得的溶液以1200rpm离心5分钟，收集沉淀后，将其置于冰上，紫外(15W)照射15分钟后，形成本实施例的工程化细胞‑益生菌组合体。 [0106] 实施例5工程化细胞‑益生菌组合体在提高益生菌肠道定植能力的效果验证[0107] 小鼠通过自由饮用7天3％葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液完成肠炎的造模，并以每只107个细胞数的剂量给构建的IBD小鼠灌胃分别给药单独EcN和实施例1中制备的工程化细胞‑益生菌组合体(GM‑EcN)。给药12小时、24小时、48小时和72小时后，收集结肠组织，通过体内成像系统(IVIS)进行离体成像。 [0108] 如图8中的a所示，EcN处理的小鼠的胃在给药12小时后胃内有益生菌残留，同时盲肠已聚集益生菌，24小时后胃内荧光明显减弱，大部分益生菌富集盲肠，48小时后肠道内益生菌排出较多。 [0109] 与单独EcN相比，用GM‑EcN处理的IBD小鼠在12时胃内显示出高荧光强度，给药24小时、48小时后仍能检测到胃内高强度荧光，说明GM‑EcN组益生菌胃内存活率高，同时盲肠益生菌富集较少，肠道益生菌富集较多，EcN在肠道内的滞留时间更久。 [0110] 半定量分析显示，如图8中的b所示，GM‑EcN中益生菌的肠道保留时间更长，24h开始出现显著性，48h、72h对比结果更为明显，该实验结果归因于GPM与结肠炎粘膜的化学附着，有助于增强GPM的肠道粘附和滞留。 [0111] 此外，用DiI染色的GM和GFP转化的EcN进行灌胃实验，以跟踪它们在体内的生物分布。IBD小鼠灌胃给予染色后的GM‑EcN，给药6小时、12小时、24小时和48小时后，如图9所示，EcN的荧光信号与荧光GPM重叠良好，证实GM以GM‑EcN的形式与包载的EcN齐头并进，在结肠炎组织中积累。 [0112] 总之，上述实验结果表明，GM优先粘附于炎症性结肠粘膜上皮，并能够保护益生菌在经过胃液后的存活率，同时延长益生菌的肠道保留时间，通过GM作为保护层实现了高肠道滞留时间和丰富的口服益生菌。 [0113] 以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。 [0114] 以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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