一种用于麦芽糖生产的固定化催化剂及其制备方法
| 专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; 未缴年费; |
| 专利有效性 | 失效专利 | 当前状态 | 权利终止 |
| 申请号 | CN201110215771.9 | 申请日 | 2011-07-29 |
| 公开(公告)号 | CN102277308B | 公开(公告)日 | 2013-01-23 |
| 申请人 | 江南大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 王正祥; 左志锐; 沈微; 石贵阳; | 第一发明人 | 王正祥 |
| 权利人 | 江南大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 江南大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：江苏省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：江苏省无锡市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院 | 邮编 | 当前专利权人邮编： |
| 主IPC国际分类 | C12N1/19 | 所有IPC国际分类 | C12N1/19 ; C12N11/16 ; C12N15/81 ; C12P19/22 ; C12R1/865 |
| 专利引用数量 | 2 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 3 | 专利文献类型 | B |
| 专利代理机构 | 无锡市大为专利商标事务所 | 专利代理人 | 时旭丹; 刘品超; |
| 摘要 | 本 发明 涉及一种用于麦芽糖生产的固定化催化剂及其制备方法，属于酶工程和农副产品深加工技术领域。本发明以红薯为原料，用反转录技术提取其β- 淀粉 酶基因，再与来源于酿酒 酵母 的α凝集素编码基因在读框内进行融合，融合基因转化 酿酒酵母 W303-1A，获得了β-淀粉酶在酵母表面锚定的酿酒酵母，进一步大规模培养此重组酵母细胞， 收获 细胞，用化学、物理方法稳定和交联此重组酵母，获得固定化β-淀粉酶，该酶活为50~250DPo/g。运用该固定化β-淀粉酶可从 液化 淀粉直接生产出55%~65%的高麦芽糖浆；此固定化β-淀粉酶反复使用10次，酶活丢失率小于20%。 | ||
| 权利要求 | 1.一种用重组酵母CCTCC NO：M 2011220制备的用于高麦芽糖浆生产的固定化催化剂，其特征在于本质为β-淀粉酶，通过将β-淀粉酶分子在酿酒酵母W303-1A细胞表面锚定实现其固定化的； |
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| 说明书全文 | 一种用于麦芽糖生产的固定化催化剂及其制备方法技术领域背景技术[0002] 麦芽糖具有较高的营养价值，其甜度只有蔗糖的1/3，比蔗糖更为适口。在食品工业上主要有以下应用特点：1）麦芽糖不参加胰岛素代谢，有利于糖尿病的防治；2）结晶性低，有防止淀粉凝聚的作用；3）热稳定性高，耐酸稳定性高，焦化性低，受热不易产生有色物质；4）具有较小的吸水性，一般吸收6%~12%的水分后，就不再吸水也不再释放水分，有助于抑制糖果的脱水，使糖果保持柔软而延长糖果的货架期；5）适合于连续真空薄膜熬糖和浇模成型，尤其对制造硬糖效果明显，并可降低糖果的粘度，提高糖果的风味。在医药上，由于麦芽糖在人体代谢中不需胰岛素就能被吸收，因此是糖尿病患者的营养剂和辅助冶疗剂，用纯麦芽糖输液滴注静脉。此外，麦芽糖还是多种重大产品（如海藻糖、异麦芽糖）的原料。 [0003] 麦芽糖的生产是通过水解淀粉制得，通常以麦芽糖浆形式作为产品形式，也有高纯度结晶麦芽糖产品形式。麦芽糖浆是以淀粉为原料，经酶法水解而制成的一种以麦芽糖为主的糖浆，按制法与麦芽糖含量不同可分为饴糖、高麦芽糖浆和超高麦芽糖浆等（表1）。 [0004] 表1 各类麦芽糖浆的主要糖组成成分 [0005]类别 DE值 葡萄糖(%) 麦芽糖(%) 麦芽三糖(%) 其他(%) 饴糖 35-50 <10 20-30 10-20 30-40 高麦芽糖浆 35-50 0.5-3 45-60 10-25 -- 超高麦芽糖浆 45-60 1.5-2 70-85 8-21 -- [0006] 应用于以麦芽糖生产为主的淀粉加工中的酶主要有：a-淀粉酶、b-淀粉酶、真菌a-淀粉酶、普鲁兰酶、异淀粉酶等。单独使用或不同组合使用可用于生产不同产品。 [0007] 饴糖 [0008] 饴糖为我国自古以来的一种甜食品，以淀粉质原料——大米、玉米、高梁、薯类经糖化剂作用生产的，糖分组成主要为麦芽糖、糊精及低聚糖，营养价值较高，甜味柔和、爽口，是婴幼儿的良好食品。我国特产“麻糖”、“酥糖”，麦芽糖块、花生糖等都是饴糖的再制品。 [0009] 饴糖生产根据原料形态不同，有固体糖化法与液体酶法，前者用大麦芽为糖化剂，设备简单，劳动强度大，生产效率低；后者先用α-淀粉酶对淀粉浆进行液化，再用麸皮或麦芽（其中的β-淀粉酶）进行糖化。麦芽糖含量通常占总糖的20%~30%。 [0010] 高麦芽糖浆 [0011] 高麦芽糖浆与饴糖的制法相似，但麦芽糖含量要求在45%以上，而且产品应是经过脱色、离子交换精制过的糖浆，其外观澄净如水，蛋白质与灰分含量极微，糖浆熬煮温度远高于饴糖，一般达到140℃以上。 [0012] 制造高麦芽糖浆的糖化剂除麦芽β-淀粉酶外，也常用由甘薯、大麦、麸皮、大豆制取的β-淀粉酶。为保证麦芽糖生成量不低于45%，糖化时常用脱支酶。也可用真菌α-淀粉酶制造高麦芽糖浆。真菌α-淀粉酶能从淀粉分子内部切开α-1,4键，生成麦芽糖与带α-1,6键的α-极限糊精。后者的相对分子质量远比β-极限糊精为小，所制成的高麦芽糖浆黏度低而流动性好。欧美各国的高麦芽糖浆大多是用真菌a-淀粉酶作糖化剂来生产的，其组成中麦芽糖占45%~60%，麦芽三糖约20%，葡萄糖2%~7%以及其他低聚糖与糊精等，产品中葡萄糖含量偏高是其不足之处。 [0013] 超高麦芽糖浆或液体麦芽糖 [0014] 超高麦芽糖浆的麦芽糖含量超过70%，它的用途不同于一般高麦芽糖浆，主要是用于制造纯麦芽糖，干燥后制成麦芽糖粉，氢化后制造麦芽糖醇等。生产超高麦芽糖浆时必须同时或相继使用β-淀粉酶和脱支酶。有时为了提高麦芽糖的含量，常使用一种以上的脱支酶和糖化用酶，并严格控制液化程度，液化DE值应不超过10%或更低，底物浓度一般控制在30%以下或更低。 [0015] 如上可以看出，β-淀粉酶是麦芽糖制造中最核心酶制剂之一。 [0016] β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)，是一种外切型糖化酶，它可从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链，水解产物为麦芽糖、麦芽三糖和β-极限糊精，主要用于食品工业中饴糖、高麦芽糖浆、超高麦芽糖浆、啤酒等行业中。β-淀粉酶广泛存在于大麦、小麦、甘薯、大豆等高等植物中。植物来源的β-淀粉酶酶活力高、耐热性好、作用pH范围广，但目前所有工艺中，从植物提取获得的高纯度β-淀粉酶的制作成本较高。 [0017] 本发明通过提取红薯的β-淀粉酶基因，再与来源于酿酒酵母的α凝集素编码基因在读框内进行融合，融合基因再在酿酒酵母中表达，所表达的β-淀粉酶经过酵母α凝集素在酿酒酵母细胞表面锚定而得到固定。进一步大规模培养此重组酵母细胞，收获细胞，o用化学、物理方法稳定交联此重组酵母，获得固定化β-淀粉酶，酶活为50~250 DP/g。运用此固定化β-淀粉酶可由淀粉生产高麦芽糖浆和超高麦芽糖浆。 发明内容[0018] 本发明目的之一是提供一种用于从淀粉生产高麦芽糖浆和超高麦芽糖浆所需的固定化β-淀粉酶。 [0019] 本发明目的之二是提供一种固定化β-淀粉酶的制备方法。 [0020] 本发明的技术方案是： [0021] 一种重组酵母，命名为酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）HH20110602，所表达的β-淀粉酶经过酵母α凝集素在酿酒酵母W303-1A细胞表面锚定而得到固定，获得重组酵母，已保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011220。 [0022] 所述重组酵母制备的用于高麦芽糖浆生产的固定化催化剂，本质为β-淀粉酶，通过将β-淀粉酶分子在酿酒酵母W303-1A细胞表面锚定实现其固定化的； [0023] 所述固定化催化剂即为固定化β-淀粉酶； [0024] 所表达的β-淀粉酶经过酵母α凝集素在酿酒酵母W303-1A细胞表面锚定而得到固定，获得重组酵母CCTCC NO：M 2011220，进一步大规模培养此重组酵母细胞，离心收获细胞，用戊二醛溶液悬浮和紫外线下照射此重组酵母，获得固定化β-淀粉酶； [0025] 酶活为50~250 DPo/g；pH为3.0~10.5，温度为55~75℃，固定化催化剂稳定。 [0026] 1. 固定化β-淀粉酶产生菌重组酵母的构建 [0027] 1）制备β-淀粉酶基因amy-β：以红薯为原料，用十六烷基三甲基溴化铵法提取红薯RNA，用反转录技术获得其cDNA,以cDNA为模板，设计引物扩增β-淀粉酶基因amy-β，PCR扩增条件是：95℃预变性 5 min；以94℃ 1 min、54℃ 1 min、 72℃ 2 min进行循环30轮；最后72℃延伸10 min。 [0028] 所述PCR所用引物为： [0029] BB-F: 5’-ATGGCTCCAATCCCCGGT-3’ [0030] BB-R:5’-ATAAAAGAGCTTTTGGCGCTAATCAAACGGGTTTGAGCCAT-3’ [0031] 2）制备α凝集素编码基因ag-Sc：以酿酒酵母W303-1A（Thomas BJ, Rothstein RJ. Cell. 1989.）基因组DNA为原料，用多聚酶链反应（PCR）技术扩增来源于酿酒酵母染色体W303-1A的α凝集素编码基因ag-Sc，反应条件是：95℃预变性 5 min，以94℃ 30 s，56℃ 1 min， 72℃ 2 min进行循环30轮，最后72℃延伸10 min。 [0032] 所述PCR扩增ag-Sc，所用引物为： [0033] AF:5’-TGGCTCAAACCCGTTTGATTAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3’ [0034] AR:5’- TTTGATTATGTTCTTTCTAT-3’ [0035] 所述酿酒酵母W303-1A来源于中国典型培养物保藏中心； [0036] 3）制备融合基因amy-β-ag-Sc ：利用重叠PCR的方法，将上述β-淀粉酶基因amy-β和α凝集素编码基因ag-Sc 在读框内进行融合，获得融合基因amy-β-ag-Sc。所述重叠PCR，所用引物为： [0037] 上游引物BB-F:5’ -ATGGCTCCAA TCCCCGGT- 3’， [0038] 下游引物AR:5’-TTTGATTATGTTCTTTCTAT- 3’。 [0039] PCR程序如下：95℃预变性5 min，以94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 3 min进行30个循环，72℃延伸10 min。 [0040] 4）制备重组酵母CCTCC NO：M 2011220：将pMGK(Zhong-Peng Guo,Gui-Yang Shi. Yeast.2010)质粒经EcoRI酶切纯化、pfu聚合酶补平纯化后与上述融合基因amy-β-ag-Sc连接，获得重组质粒pBA-AG，将该重组质粒经SacII线性化，电转化入酿酒酵母W303-1A中，转化液涂布于G418浓度为300 µg /mL的YPD平板，30℃培养3~5d，挑取转化子点种于的YPGS平板（YNB0.34%，硫酸铵1%，淀粉1%，葡萄糖0.5%）30℃培养2 d后用碘液染色，筛选转化子，由此获得了β-淀粉酶锚定于其表面的重组酵母CCTCC NO：M 2011220。 [0041] 2. 固定化β-淀粉酶的生产 [0042] 1）发酵收获细胞：在15~1000 L发酵罐中分别加入发酵罐中分别加入70%体积的培养基，其质量浓度为1%~3%葡萄糖、0.5%~2.5%酵母膏、0.5%~3.0% NaCl、其余为超纯水、pH 3.5~5.5的培养基。将重组酵母CCTCC NO：M 2011220以体积比为0.5%~10%接入培养基中，控制温度为30℃±2℃、溶氧不低于20%、pH4.0~5.0下培养48~72h。收获细胞。 [0043] 2）用0.1~1倍该细胞体积的0.1%~1.5%戊二醛溶液悬浮细胞，再在10~30 cm紫外线下照射30~120 min，40℃以下低温烘干至水分小于5%，获得产品固定化β-淀粉酶，即固定化催化剂。 [0044] 3. 固定化β-淀粉酶的使用 [0045] 上述固定化β-淀粉酶催化淀粉水解为麦芽糖，酶活为50~250 DPo/g。分别在不同的温度和pH下对固定化β-淀粉酶的酶活分析，结果显示pH为3.0~10.5，温度为55~75℃，固定化催化剂稳定。 [0046] 上述固定化β-淀粉酶分批或在流化床中连续使用，可以用于高麦芽糖浆的制备，质量分数为30%~33%的淀粉原料，经该固定化β-淀粉酶作用后得到麦芽糖，其转化率48.5%~55.0%。 [0047] 该固定化催化剂性能稳定，经简单的分离收集菌体即可反复使用10次以上，酶活损失小于20%。 [0048] 本发明的有益效果： [0049] 本发明将β-淀粉酶锚定于酿酒酵母细胞表面，以此作为固定化酶制剂，其催化活力较游离酶明显提高，且其耐热性、稳定性、反应pH宽度等皆明显提升，进一步，本发明获得的固定化酶可以在反应后经简单的分离收集菌体即可重复利用，由此，可以大幅度改善β-淀粉酶的工业使用属性并有效提高麦芽糖制造效率和工业附加值，可大幅度降低生产成本。另外，也提供了β-淀粉酶的一种新的工业来源方式。 [0050] 生物材料样品保藏：将基因ag-Sc，amy-β与克隆载体pMGK组成的重组质粒pBA-AG转化酿酒酵母W303-1A得到转化子，分类命名为酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）HH20110602，已保藏在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2011年6月26日，保藏编号CCTCC NO：M 2011220。附图说明 [0051] 图1 红薯β-淀粉酶编码基因核酸电泳图谱。 [0052] 图2 重组质粒pBA-AG的物理图谱。 [0053] 图3 合成固定化β-淀粉酶的重组酵母CCTCC NO：M 2011220。 [0054] 图4 固定化β-淀粉酶的生产工艺路线。 [0055] 图5 水解淀粉制备麦芽糖的工艺路线。 [0056] 图6 麦芽糖浆的HPLC分析图谱。 [0057] 图7 固定化催化剂的最适反应温度。 [0058] 图8 固定化催化剂的最适反应pH。 [0059] 图9 固定化催化剂的温度稳定性。 [0060] 图10 固定化催化剂的pH稳定性。 具体实施方式[0061] 实施例1 固定化β-淀粉酶的重组酵母的构建 [0062] 首先，根据红薯β-淀粉酶基因的核苷酸序列设计引物 [0063] 上游引物：5’-ATGGC TCCAATCCCCGGT-3’， [0064] 下游引物：5’-ATAAAAGAGCTTTTGGCGCTATCAAACGGGTTTGAGCCAT-3’ [0065] 以红薯cDNA为模板进行PCR扩增全长amy-β，PCR程序如下：95℃预变性5 min，以94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 2 min进行30个循环，72℃延伸10 min。 [0066] 其次，根据α凝集素的核苷酸序列设计引物： [0067] 上游引物5’- TGGCTCAAACCCGTTTGATTAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3’ [0068] 下游引物：5’-TTTGATTATGTT CTTTCTAT-3’。 [0069] PCR扩增采用50 μL体系：聚合酶pfu 0.5 μL，聚合酶缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，引物BB-F和BB-R（25 μmol）各0.5 μL，模板cDNA 0.2 μL，用双蒸H2O 补足至50 μL。 [0070] 以酿酒酵母染色体W303-1A为模板，进行PCR扩增全长ag-Sc，PCR程序如下：95℃预变性5 min，以94℃ 30s，56℃ 1 min，72℃ 2 min进行30个循环，72℃延伸10 min。 [0071] PCR扩增采用50 μL体系：聚合酶pfu 0.5 μL，聚合酶缓冲液5μL，dNTP 4 μL，引物AF和AR（25 μmol）各0.5 μL，模板染色体 0.2 μL，用双蒸H2O 补足至50 μL。 [0072] 分别纯化β-淀粉酶基因amy-β和α凝集素编码基因ag-Sc，各取1 µL作为模板加入重叠PCR体系，扩增amy-β-ag-Sc 融合基因片段（上游引物采用扩增amy-β的上游引物：5’-ATGGCTCCAA TCCCCGGT-3’，下游引物采用扩增ag-Sc 的下游引物：5’-TTTGATTATGTTCTTTCTAT- 3’，PCR程序如下：95℃预变性5 min，以94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 3 min进行30个循环，72℃延伸10 min。融合基因产物纯化，同时把质粒pMGK经EcoRI酶切后纯化，用pfu聚合酶72℃ 10 min补平，产物纯化后用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌JM109感受态，得到重组质粒pBA-AG。 [0073] 重组质粒pBA-AG经SacII线性化用电转化的方法转入酿酒酵母W303-1A。转化液涂布于G418浓度为300 µg /mL的YPD平板，30℃培养3~5d，挑取转化子点种于淀粉平板YPGS（YNB 0.34%，硫酸铵1%，淀粉1%，葡萄糖0.5%），30℃培养2 d后用碘染色，观察透明圈（见附图3）。 [0074] 将得到的转化子接种于 5 mLYPD培养液，30℃，200 r/min培养过夜，收集菌体，使o用标准的糖化力（DP）测定方法检测β-淀粉酶活力，不同的重组菌表面锚定的β-淀粉酶o 略有不同，酶活为50~250 DP/g。 [0075] 上述电转化方法如下： [0076] (1) 接酵母单菌落至30 mL 液体YPD培养基（2%蛋白胨，1%酵母膏，2%葡萄糖），30℃培养12 h； [0077] (2) 取培养物以1%的接种量转接到30 mL 新鲜YPD液体培养基中，30℃培养8 h，使菌体达到同步生长状态； [0078] (3) 将酵母培养物置于冰上放置30 min，6000 r/min 离心 5 min，收集菌体； [0079] (4) 弃上清，加入已预冷的15 mL 超纯水洗涤菌体一次； [0080] (5) 6000 r/min 离心5 min收集菌体，用15 mL 1 mol/L 山梨醇溶液重复洗涤菌体三次； [0081] (6) 离心收集菌体，加入100 μL 1 mol/L 山梨醇溶液悬浮菌体，取100 μL的菌悬液至1.5 mL 离心管中； [0082] (7) 在该100 μL菌悬液中加入20 μL(≤5 µg) 经SacII线性化的质粒 pBA-AG，轻轻混匀后冰浴10 min； [0083] (8) 将冰浴后的菌悬液转入已预冷的电转杯中，1500 V电击 5 ms； [0084] (9) 加入适量体积的1 mol/L山梨醇溶液将电转后的菌悬液从电转杯中洗出，取200 μL涂布于转化液涂布于G418浓度为300µg/mL的YPD平板，30℃培养3~5 d，挑取转化子点种于的YPGS平板30℃培养2 d，碘液染色，筛选转化子。 [0085] 实施例2. 固定化β-淀粉酶的生产 [0086] 1）在1000 L发酵罐中加入700L质量浓度为2%葡萄糖，2%酵母膏，2% NaCl，其余为超纯水，pH4.5~5.5的培养基。将重组酵母CCTCC NO：M 2011220以体积比为5%接入培养基中，控制溶氧不低于20% pH4.0下培养60~72 h。收获细胞。 [0087] 2）用0.5倍体积的1%戊二醛溶液悬浮细胞，再在20 cm紫外线下照射100 min。由此获得了一批酶活力高、稳定性好的固定化β-淀粉酶。 [0088] 实施例3. 固定化β-淀粉酶用于高麦芽糖浆的生产 [0089] 1）配料： 称取33 g绝干玉米淀粉为原料，加入57 mL 水、10 mL pH 6.0的缓冲液，加100 µL5 M的无水氯化钙，搅拌均匀。 [0090] 2）液化：按每克原料（干重）加 6~8 U中温淀粉酶投料，升温至75℃~80℃，保持40~80 min，高温灭酶，控制灭酶后DE为16~22。 [0091] 3）分批糖化：按液化的淀粉液按每克原料（干重）加0.2~0.3 DPo加入固定化β-淀粉酶，均匀搅拌，控制55±5℃，糖化20~30 h，得到转化率48.5%~63.0%的高浓度麦芽糖浆。 [0092] 连续糖化：按液化的淀粉液按每克原料（干重）加0.2~0.3 DPo加入固定化β-淀粉酶于流化床，控制55±5℃，料液循环反应20~30 h，得到转化率50.0%~65.0%的高浓度麦芽糖浆。 [0093] 将其中一份制得的麦芽糖浆经三氯乙酸处理后进行HPLC分析，氨基柱，流动相65%乙腈溶液。所得的HPLC图谱如图6所示。由HPLC分析计算得到麦芽糖175.7 g，麦芽糖转化率为53.2% [0094] 实施例4. 麦芽糖的制备 [0095] 称取330 g绝干玉米淀粉，加入570 mL 水、100 mL pH 6.0的缓冲液，加无水氯化钙，使终浓度为 5 mM，搅拌均匀。加入2000 U/mL的中温淀粉酶62 μL，加热以每分钟2℃的速度，升温至80℃，保温120 min，继续以每分钟3℃的速度升温至115℃，保持10 min灭酶。测得液化后DE值为15.23。 [0096] 在上述灭酶后的淀粉液化醪液中，按照固形物含量每克加入1~10 U的普鲁兰酶或o125~750 U的异淀粉酶，45~60℃下保温1~4 h，再加入0.2~0.3 DP 的本发明固定化β-淀粉酶，55~65℃下保温20~30 h并适当搅拌，获得330.2 g麦芽糖，淀粉到麦芽糖的转化率为 91.5%。 [0097] 实施例5. 固定化催化剂的最佳使用条件 [0098] 1）最适反应温度 [0099] 重组酵母细胞悬浮液分别在20、30、40、45、50、55、60、70℃，pH 5.0（0.04M Na2HPO4-柠檬酸缓冲液）条件下，与1%淀粉溶液反应0.5 h，测定结果如图7所示，该固定化酶在65℃左右具有最高的淀粉酶活性。 [0100] 2）最适pH条件 [0101] 重组酵母细胞悬浮液分别在pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、10.5和11.0，65℃的条件下，与1%淀粉溶液反应0.5 h，结果显示该固定化酶在pH 6.0左右具有最高的淀粉酶活性。 [0102] 3）温度稳定性 [0103] 重组酵母细胞悬浮液分别在30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和70℃、pH6.0温度下，保温10、20、30、40、50、60 min，测定其酶活，其结果如图9所示，该固定化酶在55℃~75℃以下酶活稳定。 [0104] 4）pH稳定性 [0105] 重组酵母细胞悬浮液分别在pH 3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.5和11.0、30℃条件下保温10、30、60 min，测定其酶活，其结果如图10所示，该固定化酶在pH3.0~10.5酶活稳定。 [0106] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他在任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，菌应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 |
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