微生物固定化技术是指将微生物通过一定的技术手段(如利用载体材料、 包埋物质或合理控制水力条件等)使微生物保持在反应器内。菌丝球是由霉菌 的自絮凝现象产生具有一定机械强度和大小的球体，它除了自身具有一定的吸 附和降解效能以外，近来也逐渐被用来作为一种新型生物质载体，固定其他功 能微生物应用于污水生物处理中。但是，目前人们采用吸附法向菌丝球上固定 化微生物，这种方法操作步骤繁琐、耗时、固定微生物量有限、形成的混合菌 丝球内部微生物分布不均匀这样就势必影响固定化微生物的活性和整个球体 的传质效果。而且采用吸附法需要先培养单纯霉菌菌丝球成需要大小以后，再 将其取出，以无菌水反复冲洗待用，然后再富集培养待固定细菌，等其进入对 数生长期以后，经过离心收集细菌，然后细菌在无菌水中洗2-3次，然后再以 无菌水配成细菌悬液，再将洗好的单纯霉菌菌丝球放入制备好的细菌悬液中震 荡吸附10h达饱和，整个过程最短也需要耗时60h。

本发明是为了解决现有的以菌丝球作为载体的微生物固定化方法操作步 骤复杂及耗时时间长的问题，而提出一种以菌丝球作为载体的微生物固定化方 法。以菌丝球作为载体的微生物固定化方法通过以下步骤实现：一、富集培养： 取一环待固定化的好氧细菌接种到盛有80～110mL液体富集培养基的三角瓶 中，然后于30℃、120～140转/分钟的条件下将三角瓶置于摇床中富集培养 24～30小时后备用；二、制备孢子悬液：用无菌的生理盐水冲洗长有曲霉菌 孢子的斜面固体培养基的表面并用接种环轻刮斜面，直至菌体被完全冲洗下 来，在生理盐水冲洗培养基表面的同时用试管接住冲洗过程中流下来的含有曲 霉菌孢子的生理盐水，然后轻轻震荡试管，使悬液中的孢子呈均匀分散状态； 三、同时接种：取出步骤二中的孢子悬液2～5ml备用，再取出步骤一中已经 富集好的细菌培养液20～50ml，然后将2～5ml的孢子悬液和20～50ml的已 经富集好的细菌培养液同时接种到盛有200～350ml成球培养基的三角瓶中， 然后于30℃、120～140转/分钟的条件下将三角瓶置于摇床中培养48～54小 时，即达到细菌固定在曲霉菌菌丝球上的目的。本发明对曲霉菌菌体孢子和细 菌同时进行培养，节省了冲洗、制备细菌悬液和震荡吸附的过程，固定化时间 仅在48h左右，不但缩短了时间而且减少了步骤，还大大提高了效率。
附图说明
图1是吸附法形成的混合菌丝球内部结构的扫描电镜图，其中图1中的上 部分是吸附法形成的混合菌丝球内部结构的700倍扫描电镜图，下半部分是吸 附法形成的混合菌丝球内部结构的3500倍扫描电镜图；图2是没有进行固定 化的单纯霉菌菌丝球的内部结构的3000倍扫描电镜图；图3是采用本发明的 方法形成的混合菌丝球内部结构的3000倍扫描电镜图。

具体实施方式一：本实施方式中以菌丝球作为载体的微生物固定化方法通 过以下步骤实现：一、富集培养：取一环待固定化的好氧细菌接种到盛有80～ 110mL液体富集培养基的三角瓶中，然后于30℃、120～140转/分钟的条件下 将三角瓶置于摇床中富集培养24～30小时后备用；二、制备孢子悬液：用无 菌的生理盐水冲洗长有曲霉菌孢子的斜面固体培养基的表面并用接种环轻刮 斜面，直至菌体被完全冲洗下来，在生理盐水冲洗培养基表面的同时用试管接 住冲洗过程中流下来的含有曲霉菌孢子的生理盐水，然后轻轻震荡试管，使悬 液中的孢子呈均匀分散状态；三、同时接种：取出步骤二中的孢子悬液2～5ml 备用，再取出步骤一中已经富集好的细菌培养液20～50ml，然后将2～5ml的 孢子悬液和20～50ml的已经富集好的细菌培养液同时接种到盛有200～350ml 成球培养基的三角瓶中，然后于30℃、120～140转/分钟的条件下将三角瓶置 于摇床中培养48～54小时，即达到细菌固定在曲霉菌孢子体内的目的。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤一中富 集培养基是由5g NaCl、3g牛肉膏、10g蛋白胨和1000mL蒸馏水混合而成。 其它步骤与具体实施方式二相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤一中取 一环待固定化的好氧细菌接种到盛有90～100mL液体富集培养基的三角瓶 中。其它步骤与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤一中于 30℃、125～130转/分钟的条件下将三角瓶置于摇床中富集培养26～28小时后 备用。其它步骤与具体实施方式二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中的 成球培养基是由30g蔗糖、0.5g NH4Cl、0.1g K2HPO3·H2O、0.1g MgSO4·7H2O、 0.1g FeSO4·7H2O和1000mL蒸馏水混合而成。其它步骤与具体实施方式二 相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中取 出步骤二中的孢子悬液3～4ml备用，再取出步骤一中已经富集好的细菌培养 液30～40ml，然后将3～4ml的孢子悬液和30～40ml的已经富集好的细菌培 养液同时接种到盛有240～300ml成球培养基的三角瓶中。其它步骤与具体实 施方式二相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤三中于 30℃、125～130转/分钟的条件下将三角瓶置于摇床中培养50～52小时。其它 步骤与具体实施方式二相同。
具体实施方式八：本实施方式中以菌丝球作为载体的微生物固定化方法通 过以下步骤实现：一、富集培养：取一环待固定化的好氧细菌接种到盛有100mL 液体富集培养基的三角瓶中，然后于30℃、140转/分钟的条件下将三角瓶置 于摇床中富集培养24小时后备用；二、制备孢子悬液：用无菌的生理盐水冲 洗长有曲霉菌孢子的斜面固体培养基的表面并用接种环轻刮斜面，直至菌体被 完全冲洗下来，在生理盐水冲洗培养基表面的同时用试管接住冲洗过程中流下 来的含有曲霉菌孢子的生理盐水，然后轻轻震荡试管，使悬液中的孢子呈均匀 分散状态；三、同时接种：取出步骤二中的孢子悬液2ml备用，再取出步骤一 中已经富集好的细菌培养液20ml，然后将2ml的孢子悬液和20ml的已经富集 好的细菌培养液同时接种到盛有200ml成球培养基的三角瓶中，然后于30℃、 140转/分钟的条件下将三角瓶置于摇床中培养48小时，即达到细菌固定在曲 霉菌菌丝球上的目的。
本实施方式中的富集培养基是由5g NaCl、3g牛肉膏、10g蛋白胨和 1000mL蒸馏水混合而成；成球培养基是由30g蔗糖、0.5g NH4Cl、0.1g K2HPO3·H2O、0.1g MgSO4·7H2O、0.1g FeSO4·7H2O和1000mL蒸馏水 混合而成。
采用吸附法和本发明中的方法同时进行以曲霉菌菌丝球作为载体的细菌 固定化培养，待两种方法均固定完成后，随机取两种固定化方法形成的混合菌 丝球各一个，切开后在电子显微镜下观察各自的内部结构，同时以没有进行固 定化的单纯霉菌菌丝球的内部结构进行对比，由图可知：图1中的上部分是吸 附法形成的混合菌丝球内部结构的700倍扫描电镜图，下半部分是吸附法形成 的混合菌丝球内部结构的3500倍扫描电镜图，图1中采用吸附固定化方法形 成的混合菌丝球内部的细菌只固着在菌丝交叉形成平台的地方，而在没有交叉 的菌丝上就没有细菌存在；图3是采用本发明中的方法形成的混合菌丝球内部 结构的3000倍扫描电镜图，无论菌丝交联与否，细菌都非常均匀的排列生长 在每一根菌丝上，而且单位面积上固定化生长的细菌数量也明显多于图1的混 合菌丝球，图3中细菌均匀排列，很少出现堆积和分层的现象，这样就不影响 菌丝球内部的能量和氧气的供给，不会影响菌丝球对内部细菌的传质，这样被 固定的细菌就能够保持较高的活性。图2是没有进行固定化的单纯霉菌菌丝球 的内部结构的3000倍扫描电镜图。