一种用于催化缓释生物能量物质的生物酶及其固定方法专利检索-·酶或微生物细胞固定在有机载体上或在其中的专利检索查询-专利查询网

一种用于催化缓释生物 能量物质的生物酶及其固定方法

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202411878986.2	申请日	2024-12-19
公开(公告)号	CN119736278A	公开(公告)日	2025-04-01
申请人	中国科学院上海硅酸盐研究所;	申请人类型	科研院所
发明人	朱钰方; 赵超前;	第一发明人	朱钰方
权利人	中国科学院上海硅酸盐研究所	权利人类型	科研院所
当前权利人	中国科学院上海硅酸盐研究所	当前权利人类型	科研院所
省份	当前专利权人所在省份：上海市	城市	当前专利权人所在城市：上海市长宁区
具体地址	当前专利权人所在详细地址：上海市长宁区定西路1295号	邮编	当前专利权人邮编：200050
主IPC国际分类	C12N9/34	所有IPC国际分类	C12N9/34 ; C12N11/14 ; C12N11/02 ; C12N5/0775
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	8	专利文献类型	A
专利代理机构	上海瀚桥专利代理事务所	专利代理人	郑优丽; 王勇;
摘要	本发明涉及一种用于催化缓释生物能量物质的生物酶及其固定方法。所述用于催化缓释生物能量物质的生物酶包括：陶瓷基体，负载在所述陶瓷基体上的多巴胺，以及负载在所述多巴胺上的淀粉葡萄糖苷酶；以所述用于催化缓释生物能量物质的生物酶的总质量为100％计，所述陶瓷基体的质量占比为80‑90％，多巴胺的质量占比为5‑10％，淀粉葡萄糖苷酶的质量占比为1‑10％。
权利要求	1.一种用于催化缓释生物能量物质的生物酶，其特征在于，所述用于催化缓释生物能量物质的生物酶包括：陶瓷基体，负载在所述陶瓷基体上的多巴胺，以及负载在所述多巴胺上的淀粉葡萄糖苷酶；以所述用于催化缓释生物能量物质的生物酶的总质量为100％计，所述陶瓷基体的质量占比为80‑90％，多巴胺的质量占比为5‑10％，淀粉葡萄糖苷酶的质量占比为1‑10％。 2.根据权利要求1所述的用于催化缓释生物能量物质的生物酶，其特征在于，所述陶瓷基体为羟基磷灰石、β‑TCP、硅酸二钙中的至少一种，优选为β‑TCP。 3.一种权利要求1或2所述的用于催化缓释生物能量物质的生物酶的固定方法，所述固定方法包括以下步骤： (1)将陶瓷粉体与盐酸多巴胺混合得到原料混合粉体，然后向其中加入去离子水并进行搅拌，得到负载多巴胺的陶瓷粉体； (2)将所述负载多巴胺的陶瓷粉体与淀粉葡萄糖苷酶进行混合，然后加入去离子水并进行震荡混合，以使淀粉葡萄糖苷酶充分负载结合在多巴胺上，得到固定后的所述用于催化缓释生物能量物质的生物酶。 4.根据权利要求3所述的固定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述陶瓷粉体的粒径为 2 100nm‑10μm，优选为300nm‑10μm，比表面积为10‑50m/g。 5.根据权利要求3或4所述的固定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述陶瓷粉体与盐酸多巴胺的质量比为5‑10:1。 6.根据权利要求3‑5中任一项所述的固定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述原料混合粉体与去离子水的用量比为1g:5‑10mL。 7.根据权利要求3‑6中任一项所述的固定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述负载多巴胺的陶瓷粉体与淀粉葡萄糖苷酶的质量比为1：0.1‑0.4。 8.根据权利要求3‑7中任一项所述的固定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述负载多巴胺的陶瓷粉体与去离子水的用量比为1g:5‑50mL，优选为1g:20‑50mL。
说明书全文	一种用于催化缓释生物能量物质的生物酶及其固定方法技术领域 [0001] 本发明属于组织工程和骨修复技术领域，具体涉及一种用于催化缓释生物能量物质的生物酶及其固定方法。背景技术 [0002] 由感染、创伤及多种疾病(如骨坏死、骨质疏松和骨肿瘤等)引发的骨缺损，对患者2+ 3‑ 2+ 的生命健康和生活质量构成了严重威胁。传统的骨修复材料主要通过释放Ca 、PO4 、Mg 2+ 和Zn 等离子，来促进细胞分化和激活相关细胞通路，进而促进骨组织的修复过程。然而，骨缺损区域往往伴随着血供的严重受损，这导致生物能量物质(包括葡萄糖、脂肪酸和氨基酸等)的输送通道受阻，进而造成骨缺损部位的组织和细胞缺乏必要的营养支持，最终影响了骨修复的效果。细胞通过将食物中获得的或者体内储存的葡萄糖、脂肪酸和氨基酸分解来获取三磷酸腺苷(ATP)以满足细胞正常的能量需求，而葡萄糖是体内大多数细胞的首选能量物质。那么，直接在缺损处缓释葡萄糖是解决骨缺损处营养物质匮乏的最佳选择，特别是早期阶段。 [0003] 生物酶是一种由活细胞产生的具有催化功能的有机物，能够显著降低化学反应的活化能，从而加速化学反应的速率。根据作用底物和催化反应类型的不同，生物酶还可以进一步细分为多种类型，如果胶酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等。生物酶具有催化活性高、催化效率快、反应专一性、用量少及反应条件温和等优势，在制药、化妆品、纸浆、生物燃料、纺织、食品、水处理、石油、酿造和生物医疗等领域具有广泛的应用。 [0004] 人体所需的葡萄糖通常以碳水化合物的形式(如淀粉)存在于食物中。富含碳水化合物的食物，如米饭、面食、面包、水果和蔬菜等，都是葡萄糖的重要来源。当人体摄入这些食物后，消化系统会借助多种生物酶(唾液淀粉酶，胰淀粉酶和肠淀粉)将其分解为葡萄糖单糖，然后吸收进入人体组织提供能量。因此，可以利用生物酶实现葡萄糖的原位催化缓释来解决骨缺损处能量物质匮乏问题。 [0005] 研究发现，淀粉葡萄糖苷酶可以实现对淀粉的催化产生葡萄糖单糖。但是，其应用目前存在稳定性差的难题：生物酶的活性容易受到各种因素的干扰，如温度、溶液中各种盐及其浓度和pH值的变化等，这些因素可能导致生物酶的结构发生改变，从而失去催化活性。另外，随着时间的延长，其也容易因自身结构不稳定而失活和失去催化活性。因此，如何提高生物酶稳定性至关重要。发明内容 [0006] 针对淀粉葡萄糖苷酶稳定性差的技术问题，本发明的目的在于提供一种提高淀粉葡萄糖苷酶稳定性的固定方法。 [0007] 第一方面，本发明提供了一种用于催化缓释生物能量物质的生物酶，所述用于催化缓释生物能量物质的生物酶包括：陶瓷基体，负载在所述陶瓷基体上的多巴胺，以及负载在所述多巴胺上的淀粉葡萄糖苷酶；以所述用于催化缓释生物能量物质的生物酶的总质量为100％计，所述陶瓷基体的质量占比为80‑90％，多巴胺的质量占比为5‑10％，淀粉葡萄糖苷酶的质量占比为1‑ 10％。 [0008] 较佳地，所述陶瓷基体为羟基磷灰石、β‑TCP、硅酸二钙中的至少一种，优选为β‑TCP。 [0009] 第二方面，本发明提供了一种上述用于催化缓释生物能量物质的生物酶的固定方法，所述固定方法包括以下步骤：(1)将陶瓷粉体与盐酸多巴胺混合得到原料混合粉体，然后向其中加入去离子水并进行搅拌，得到负载多巴胺的陶瓷粉体； (2)将所述负载多巴胺的陶瓷粉体与淀粉葡萄糖苷酶进行混合，然后加入去离子水并进行震荡混合，以使淀粉葡萄糖苷酶充分负载结合在多巴胺上，得到固定后的所述用于催化缓释生物能量物质的生物酶。 [0010] 较佳地，步骤(1)中，所述陶瓷粉体的粒径为100nm‑10μm，优选为300nm‑10μm，比表2 面积为10‑50m/g。 [0011] 较佳地，步骤(1)中，所述陶瓷粉体与盐酸多巴胺的质量比为5‑10:1。 [0012] 较佳地，步骤(1)中，所述原料混合粉体与去离子水的用量比为1g:5‑10mL。 [0013] 较佳地，步骤(2)中，所述负载多巴胺的陶瓷粉体与淀粉葡萄糖苷酶的质量比为1：0.1‑0.4。 [0014] 较佳地，步骤(2)中，所述负载多巴胺的陶瓷粉体与去离子水的用量比为1g:5‑50mL，优选为1g:20‑50mL。 [0015] 有益效果本发明通过淀粉葡萄糖苷酶的固定，显著提高了生物酶的稳定性；同时，通过将固定后的生物酶采用同轴3D打印的方法制备同轴支架，由于同轴支架具有更长的葡萄糖缓释效果，从而促进了骨髓间充质干细胞的增殖。附图说明 [0016] 图1为实施例1中淀粉葡萄糖苷酶固定表征：(a)、(b)为经过研磨后的β‑TCP粉SEM形貌，(c)、(d)为负载多巴胺的β‑TCP粉SEM形貌，(e)、(f)为负载淀粉葡萄糖苷酶的β‑TCP粉SEM形貌；图2为实施例1中淀粉葡萄糖苷酶负载表征：(a)、(b)为经过研磨后的β‑TCP粉粒径分布与比表面示意图，(c)、(d)为不同负载下的β‑TCP粉XRD与Raman表征；图3为淀粉葡萄糖苷酶固定前后的性能表征：(a)为不同浓度葡萄糖溶液与DNS反应后的吸光度，(b)为吸光度与浓度关系曲线，(c)为淀粉葡萄糖苷酶的活力与其固定后负载量示意图，(d)为淀粉葡萄糖苷酶与其固定后在不同浸泡时间的活力曲线；图4为以PCL/β‑TCP为外层的同轴3D打印支架：(A)为实心结构支架(Control)，(B)为内层纯淀粉材料(STA)支架，(C)为内层含葡萄糖的淀粉材料(GLU)支架，(D)为内层含2％TDA的淀粉材料(2％TDA)支架，(E)为内层含5％TDA的淀粉材料(5％TDA)支架，(F)为内层含 10％TDA的淀粉材料(10％TDA)支架；图5为同轴支架葡萄糖释放曲线；图6为支架上rBMSCs细胞的增殖与粘附示意图：(A)为酶标仪的吸光度表示的细胞增殖，(B)为细胞形态荧光成像，(C)为细胞SEM形貌。具体实施方式 [0017] 以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。 [0018] 首先，本发明提供了一种用于催化缓释生物能量物质的生物酶。其中，所述用于催化缓释生物能量物质的生物酶包括：陶瓷基体，负载在所述陶瓷基体上的多巴胺，以及负载在所述多巴胺上的淀粉葡萄糖苷酶。 [0019] 在一些实施方式中，所述陶瓷基体可以为羟基磷灰石、β‑TCP和硅酸二钙中的至少一种，优选为β‑TCP(中文：β‑磷酸三钙)。 [0020] 其中，β‑TCP在研磨过程中表面会生成纳米级板条状羟基磷灰石，进一步增大其比表面积，有利于多巴胺负载。 [0021] 在一些实施方式中，以所述用于催化缓释生物能量物质的生物酶的总质量为100％计，所述陶瓷基体的质量占比可以为80‑90％，多巴胺的质量占比可以为5‑10％，淀粉葡萄糖苷酶的质量占比可以为1‑10％。 [0022] 其中，陶瓷集体质量占比过大，会导致多巴胺负载量低，从而影响淀粉葡萄糖苷酶的负载；多巴胺质量占比过大，会导致其不能充分负载于陶瓷颗粒上，造成浪费，另会生成较厚的多巴胺层，影响负载；生物酶质量占比过大时，会导致其难以充分负载，造成实质上的浪费。 [0023] 以下，示例性说明本发明提供的用于催化缓释生物能量物质的生物酶的固定方法。其中，所述固定方法可以包括以下步骤：(1)将陶瓷粉体与盐酸多巴胺混合得到原料混合粉体，然后向其中加入去离子水并进行磁力搅拌1‑4h，经离心、去离子水洗涤、冷冻干燥，得到负载多巴胺的陶瓷粉体； (2)将所述负载多巴胺的陶瓷粉体与淀粉葡萄糖苷酶进行混合，然后加入去离子水并进行震荡混合4‑12h以使淀粉葡萄糖苷酶充分负载结合在多巴胺上，经洗涤、干燥，得到固定后的用于催化缓释生物能量物质的生物酶。 [0024] 在一些实施方式中，步骤(1)中，所述陶瓷粉体的粒径可以为100nm‑10μm，优选为2 300nm‑10μm，比表面积为10‑50m/g。 [0025] 陶瓷粉体粒径过大，会导致颗粒的比表面积小，最终生物酶负载较少；陶瓷粉体粒径过小，会使得其比表面积较大，但是容易团聚。通过选用适宜的中等颗粒表面生成纳米结构的方法，既规避的团聚问题，又保证了粉体的比表面积。 [0026] 在一些实施方式中，步骤(1)中，所述陶瓷粉体与盐酸多巴胺的质量比可以为5‑10:1。 [0027] 在一些实施方式中，步骤(1)中，所述原料混合粉体与去离子水的用量比可以为1g:5‑10mL。 [0028] 在一些实施方式中，步骤(2)中，所述负载多巴胺的陶瓷粉体与淀粉葡萄糖苷酶的质量比可以为1：0.1‑0.4。淀粉葡萄糖苷酶的用量过大，会导致部分生物酶无法成功负载，发挥不了催化作用，从而导致浪费；淀粉葡萄糖苷酶的用量过小，会导致陶瓷颗粒上的负载不足，影响最终催化效果。 [0029] 在一些实施方式中，步骤(2)中，所述负载多巴胺的陶瓷粉体与去离子水的用量比可以为1g:5‑50mL，优选为1g:20‑50mL。 [0030] 使用3,5‑二硝基水杨酸比色法和紫外‑可见吸收光谱仪可以定量测定葡萄糖浓度。具体测定方法如下：取1g淀粉，溶于100ml去离子水中，并加热煮沸；待淀粉溶液冷却后，加入0.01‑0.1g固定和未固定的酶，反应30min；使用DNS法测定淀粉溶液的葡萄糖的浓度，然后计算出固定酶和未固定酶的真实活力，并得出淀粉葡萄糖苷酶的固定负载量；然后测定固定酶和未固定酶在在37℃和pH＝7.4环境中的相对活性，以评估固定对活性的影响。 [0031] 使用专利ZL202110277324.X所公开的方法打印以淀粉‑固定后的淀粉葡萄糖苷酶为内层、以β‑TCP/PCL为外层的同轴支架，可以研究同轴支架葡萄糖释放性能：将同轴支架置于离心管中并加入PBS溶液，按预设时间定期取样和更换新的浸泡溶液；测定同轴支架于37℃下不同时间的葡萄糖释放曲线，以评估不同同轴支架的葡萄糖释放性能。 [0032] 此外，可以使用上述同轴支架培养骨髓间充质干细胞以研究同轴支架对其增殖的影响。 [0033] 下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 [0034] 实施例1 [0035] 本实施例提供的用于催化缓释生物能量物质的生物酶的固定方法包括以下步骤：(1)使用行星球磨机将β‑TCP粉于水溶液中研磨24h以获得更小的颗粒度(Milling TCP，T)，并使用激光粒度仪和比表面孔径分析仪表征其粒径和比表面积；将研磨后的β‑TCP粉体与盐酸多巴胺按照质量比10:1混合；接着按照10ml/g粉体的比例加入去离子水，室温下磁力搅拌4h；使用离心机和去离子水分别将负载多巴胺的β‑TCP粉体离心和洗涤3次，冷冻干燥后得到负载多巴胺的陶瓷粉体备用(Milling TCP‑Dopa，TD)； (2)按照1g TD粉体/0.2g淀粉葡萄糖苷酶的比例进行混合，并按照5ml去离子水/ 1g粉体的比例加入去离子水，在振荡器中震荡12h，使淀粉葡萄糖苷酶充分负载，最后离心和洗涤3次，将样品冷冻干燥，得到固定后的用于催化缓释生物能量物质的生物酶(Milling TCP‑Dopa‑AGS，TDA)。 [0036] 分别使用X射线衍射仪(XRD)、扫描电镜(SEM)、拉曼光谱仪(Raman)来表征实施例1中制备的β‑TCP粉体(T)、负载多巴胺的β‑TCP粉体(TD)和负载淀粉葡萄糖苷酶的β‑TCP粉体(TDA)的晶体结构、微观形貌以及官能团，以确定酶的负载，见附图1和2。从图1、2中可以看出，研磨后的β‑TCP上生成了纳米级板条状羟基磷灰石，研磨后的颗粒粒径分布和比表面积2 分别为300nm‑10μm和31.132m/g；XRD和Raman测试表明，多巴胺和淀粉葡萄糖苷酶成功地负载于陶瓷颗粒上。 [0037] 以下使用3,5‑二硝基水杨酸比色法和紫外‑可见吸收光谱仪定量测定葡萄糖浓度：首先，配置浓度为1mg/ml的葡萄糖溶液，然后以此为基础配置浓度为0.2、0.4、0.6和0.8mg/ml的葡萄糖溶液；取0.5ml上述葡萄糖溶液分别加入到15ml离心管中，然后加入 0.5ml DNS溶液；离心管在沸水浴中10min，取出冷却后待测；取0.3ml反应溶液加入比色皿中，并使用去离子水将其稀释至3ml；使用紫外可见分光光度计测定不同浓度的葡萄糖溶液在400‑700nm下的吸收光谱，每组样品测量3次；统计每条曲线的最高吸光度值，绘制吸光度‑浓度标准曲线；在后续测试过程中，如果测定葡萄糖浓度高于1mg/ml，需按比例稀释至 0‑1mg/ml范围内。 [0038] 取1g淀粉，溶于100ml去离子水中，并加热煮沸；待淀粉溶液冷却后，加入0.01g固定和未固定的酶，反应30min；使用DNS法测定淀粉溶液的葡萄糖的浓度，然后计算出固定酶和未固定酶的真实活力，并得出淀粉葡萄糖苷酶的固定负载量；然后测定固定酶和未固定酶在在37℃和pH＝7.4环境中1、3、7、14、21和28天的相对活性，以评估固定对活性的影响。 [0039] 图3为淀粉葡萄糖苷酶固定前后的性能表征：(a)为不同浓度葡萄糖溶液与DNS反应后的吸光度，(b)为吸光度与浓度关系曲线，(c)为淀粉葡萄糖苷酶的活力与其固定后负载量示意图，(d)为淀粉葡萄糖苷酶与其固定后在不同浸泡时间的活力曲线。从图中可以看出，由于吸光度与葡萄糖浓度具有高度的线性关系，因此可以运用DNS法来反推溶液葡萄糖浓度，负载淀粉葡萄糖苷酶的陶瓷颗粒所具有的活性为110U/g，固定后的淀粉葡萄糖苷酶与未固定的相比具有更高的稳定性和持续的催化活性。 [0040] 使用高温煮沸法制备淀粉浆料，并于低温下将不同比例的固定淀粉葡萄糖苷酶(TDA)均匀地加到淀粉浆料中。具体流程为：取1g、1g、0.98g、0.95g和0.9g淀粉，分别加入烧杯中；向烧杯中加入10g水，然后于磁力搅拌下煮沸淀粉溶液直至变成粘稠澄清的浆料；待淀粉浆料冷却后，从第二个烧杯开始向上述烧杯分别加入1g无水葡萄糖、0.02g TDA、0.05g TDA和0.1g TDA。向所有烧杯中补充适量的去离子水，使淀粉(+TDA)与去离子水的总质量为5g。将上述烧杯中的浆料搅拌均匀，转移至料筒中待用。分别编号为STA、GLU、2％TDA、5％TDA和10％TDA。专利ZL202110277324.X中葡萄糖释放曲线基本与GLU组类似，因此以GLU代替该组数据。 [0041] 图4为以PCL/β‑TCP为外层的同轴3D打印支架：(A)为实心结构支架(Control)，(B)为内层纯淀粉材料(STA)支架，(C)为内层含葡萄糖的淀粉材料(GLU)支架，(D)为内层含2％TDA的淀粉材料(2％TDA)支架，(E)为内层含5％TDA的淀粉材料(5％TDA)支架，(F)为内层含10％TDA的淀粉材料(10％TDA)支架。从图中可以看出，除了Control组，其他组均为同轴结构，STA和GLU组淀粉层内无颗粒存在，2％‑10％TDA组淀粉层颗粒有明显增加趋势。 [0042] 图5为同轴支架葡萄糖释放曲线。从图中可以看出，GLU组基本在第三天时就已释放完；其他含有固定生物酶的组均表现出更长的缓释时间，且随着固定生物酶的增加，总的葡萄糖缓释量也呈现增加趋势。 [0043] 细胞增殖实验采用Cell Counting Kit‑8(CCK‑8)法测定。实验中设置内层为不含淀粉(实心结构)、含纯淀粉、含葡萄糖的淀粉、含2％TDA的淀粉、含5％TDA的淀粉和含10％TDA的淀粉的同轴支架为实验组别，并分别命名为Control、STA、GLU、2％TDA、5％TDA和10％TDA。首先，细胞实验所用支架均75％乙醇浸泡半小时处理，并用无菌PBS缓冲液洗涤3‑ 4 5次，每次5min；接着，在48孔板中加入处理后的支架并接种1×10个rBMSCs细胞，在37℃、 5％CO2和95％湿度环境中培养1、3和7天；分别在第3天和第5天换液一次。然后，在含支架的每孔中加入用纯DMEM稀释10倍的CCK‑8工作液继续培养2h，吸取溶液转移至新的96孔板中；最后，通过酶标仪测定溶液在450nm处的O.D.值(每组六个平行样)，以评估同轴支架对rBMSCs细胞的增殖情况的影响。首先使用胰酶将培养好的rBMSCs细胞消化下来，于1000rmp/min离心机中离心 5min。分别使用相应的培养基进行稀释，并进行计数。将消毒后的Control、STA、GLU、2％ 5 TDA、5％TDA和10％TDA六组支架置入48孔板中，按每孔1×10细胞植入。细胞在37℃、5％CO2和95％湿度环境中培养3天，吸取培养基。使用2.5％戊二醛固定2h，接着吸去戊二醛溶液，使用PBS洗涤3次。将固定的样品分别浸泡在30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％和100％的乙醇溶液3次，每次10min，逐步脱水。然后用50％六甲基二硅胺烷/乙醇溶液处理样品10min，最后使用100％六甲基二硅胺烷溶液浸泡样品10min，置于通风橱进行干燥过夜，用于SEM观察细胞的粘附行为。 [0044] 图6为支架上rBMSCs细胞的增殖与粘附示意图：(A)为酶标仪的吸光度表示的细胞增殖，(B)为细胞形态荧光成像，(C)为细胞SEM形貌。从图中可以看出，第一天时，没有较大差异，且GLU组表现出抑制效应；第三天是固定生物酶组表现出了更高细胞增殖，但是葡萄糖释放太多会影响细胞的活力；第七天与第三天的结果基本一致；细胞粘附SEM图和细胞染色图基本与第三天时细胞增殖结果一致。 [0045] 尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

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