一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用专利检索-·酶或微生物细胞固定在有机载体上或在其中的专利检索查询-专利查询网

一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202211229768.7	申请日	2022-10-09
公开(公告)号	CN115948379A	公开(公告)日	2023-04-11
申请人	湖北远大生命科学与技术有限责任公司;	申请人类型	企业
发明人	孙华君; 姚其凤; 江汝泳; 刘婷芬; 韩丹; 郭晨; 赵威; 胡琪; 钱志强;	第一发明人	孙华君
权利人	湖北远大生命科学与技术有限责任公司	权利人类型	企业
当前权利人	湖北远大生命科学与技术有限责任公司	当前权利人类型	企业
省份	当前专利权人所在省份：湖北省	城市	当前专利权人所在城市：湖北省黄石市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：湖北省黄石市阳新县富池镇王坟路12号	邮编	当前专利权人邮编：435229
主IPC国际分类	C12N11/096	所有IPC国际分类	C12N11/096 ; C12N11/02 ; C12N9/12 ; C12P19/30
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	10	专利文献类型	A
专利代理机构	上海弼兴律师事务所	专利代理人	袁文正; 黄益澍;
摘要	本发明公开了一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用。所述固定化酶使用PHBV作为固定化载体。本发明所述固定化酶更易于分离，能降低后续除杂成本，节约流程；所用固定化载体环保易分解；同时固定化后的酶提高了转化率以及转化过程的稳定性，提高了酶的利用次数，节约了成本。
权利要求	1.一种固定化酶，其特征在于，所述固定化酶使用PHBV作为固定化载体。 2.如权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述固定化酶中被固定的酶为NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白；优选地，所述NRK酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述包含NRK酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白的质量比为1:10～10:1，例如2:1和10:1。 3.一种制备如权利要求1所述固定化酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤S1：将所述PHBV溶于有机溶剂，得到混合物1；步骤S2：将所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白加入所述混合物1，得到混合物2，即得所述固定化酶。 4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一种或多种，优选地为二氯甲烷和乙醇；和/或，所述步骤S1包括使用超声混匀，所述超声的时间为8～15min，例如10min；和/或，步骤S2中，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白质量比为1:10～ 10:1，例如2:1和10:1；和/或，步骤S2包括搅拌；优选地，所述搅拌的温度为25～40℃，例如37℃；和/或，所述搅拌的转速为100～200rpm，例如150rpm；和/或，所述搅拌的时间为1.0～4.0h，例如3.5h；和/或，对所述混合物2进行冻干，得到冻干粉形式的所述固定化酶；和/或，步骤S2中，所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白为酶液的形式。 5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤S1：将所述PHBV溶于二氯甲烷，再溶于乙醇得到混合物1；步骤S2：将所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白加入所述混合物1，得到混合物2，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白质量比为2:1和10:1，所述搅拌的温度为37℃，所述搅拌的转速为150rpm，所述搅拌的时间为3.5h，得所述固定化酶。 6.一种制备NMN的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将如权利要求1或2所述固定化酶与原料混合，反应得NMN；所述原料包括NR或其盐。 7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述原料还包括以下中的一种或多种：ATP或其盐、镁盐和六偏磷酸钠；优选地，所述固定化酶与所述NR或其盐浓度比为1～10g/L:50～100mM，例如为3g/L: 80mM；和/或，所述固定化酶与所述ATP或其盐浓度比为1～10g/L:5～80mM，例如3g/L:8mM和 3g/L:80mM；和/或，所述固定化酶与所述镁盐浓度比为1～10g/L:30～60mM，例如3g/L:50mM；和/或，所述固定化酶与所述六偏磷酸钠浓度比为1～10g/L:5～80mM，例如3g/L:8mM和 3g/L:30mM；和/或，所述步骤还包括调节混合物的pH，所述pH为5.0～6.0，例如5.5；和/或，所述步骤的反应温度为35～45℃，例如40℃。 8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将所述固定化酶与NR或其盐、ATP或其盐、镁盐和六偏磷酸钠混合，所述固定化酶与所述NR或其盐浓度比为 3g/L:80mM，所述固定化酶与所述ATP或其盐浓度比为3g/L:8mM和3g/L:80mM，所述固定化酶与所述镁盐浓度比为3g/L:50mM，所述固定化酶与所述六偏磷酸钠浓度比为3g/L:8mM和3g/L:30mM，调节pH为5.5，反应温度为40℃，即得NMN。 9.一种如权利要求1或2所述固定化酶在制备NMN中的应用。 10.一种PHBV在制备如权利要求1或2所述固定化酶中的应用。
说明书全文	一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用技术领域 [0001] 本发明涉及固定化酶领域，特别涉及一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用。背景技术 [0002] 在利用酶催化底物烟酰胺核糖(NR)或其盐转化为烟酰胺单核苷酸(NMN)的过程中，酶通常以游离形式加入到底物中，通过搅拌使其与底物充分接触，但这种方式不可避免地存在酶的分布不均匀以及活性不稳定的问题，从而导致转化过程不够稳定、转化率不够高，且后续对酶的分离操作较复杂，另外，游离酶只能利用一次，无法进行回收。 [0003] 在固定化酶领域方面，现有技术使用的固定化材料例如树脂、二氧化硅等，废弃后，均当固废处理，然而PHBV可以直接分解成CO2和水，绿色环保；此外，现有技术中固定化载体使用的量很多，例如50mg酶需要用1g的载体，或者90ml的酶液需要用160g载体。 [0004] CN112980906B公开了一种用于制备β‑烟酰胺单核苷酸的酶组合物及其应用，利用环氧树脂作为载体，将NRK酶和PNP酶固定化。 [0005] CN111961659A公开了一种将聚乙烯醇、海藻酸钠、PHBV共聚物混合在一起对反硝化细菌进行固定，PHBV共聚物为反硝化细菌提供碳源。 [0006] 目前的固定化酶载体较为不环保，且固定化所需载体量大，难以满足环保、成本和效率的综合要求。发明内容 [0007] 为了解决现有技术中尚未有效果较佳的固定化NRK酶(烟酰胺核糖激酶)，以及缺乏环保、高效的固定化载体的技术缺陷，本发明提供了一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用。本发明首次将PHBV(Poly(3‑hydroxybutyrate–co‑3‑hydroxyvalerate)，聚(3‑羟基丁酸‑co‑3‑羟基缬草酸))应用于酶固定化，PHBV可分解且环境友好，适合工业生产；所述固定化酶可重复使用，回用多次后NRK酶依旧保持较高的活性(回用5次后NMN收率较佳可达87.65％)；与游离酶的转化过程相比，本发明所述固定化酶的转化过程更稳定，且转化率有所提高，反应2小时后NMN生成率较佳可达97.42％；所述固定化酶更易于分离，能降低后续除杂成本，且提纯过程较常规化过程更为简化，节约流程。 [0008] 为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种固定化酶，其中，所述固定化酶使用PHBV作为固定化载体。 [0009] 在一些实施方案中，所述固定化酶中被固定的酶为NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白。 [0010] 在一些优选的实施方案中，所述NRK酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述包含NRK酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 [0011] 在一些实施方案中，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白的质量比为1:10～10:1，例如1:10、1:9、1:7、1:5、1:3、2:1、1:1、3:1、5:1、7:1、9:1和10:1。 [0012] 本发明第二方面提供了一种制备本发明第一方面所述固定化酶的方法，其中，所述方法包括如下步骤： [0013] 步骤S1：将所述PHBV溶于有机溶剂，得到混合物1； [0014] 步骤S2：将所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白加入所述混合物1，得到混合物2，即得所述固定化酶。 [0015] 在一些实施方案中，其中，步骤S1中，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一种或多种，优选为二氯甲烷和乙醇。 [0016] 在一些实施方案中，所述二氯甲烷和所述乙醇的体积比为1:4～4:1，例如3:7。 [0017] 在一些实施方案中，所述PHBV与所述二氯甲烷的质量体积比为5g/20mL～15g/10mL，例如10g/15mL。 [0018] 在一些实施方案中，所述步骤S1包括使用超声混匀，所述超声的时间为8～15min，例如10min。 [0019] 在一些实施方案中，其中，步骤S2中，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白质量比为1:10～10:1，例如1:10、1:9、1:7、1:5、1:3、1:1、2:1、3:1、5:1、7:1、9:1和10:1。 [0020] 在一些实施方案中，步骤S2包括搅拌。 [0021] 在一些优选的实施方案中，所述搅拌的温度为25～40℃，例如37℃。 [0022] 在一些优选的实施方案中，所述搅拌的转速为100～200rpm，例如150rpm。 [0023] 在一些优选的实施方案中，所述搅拌的时间为1.0～4.0h，例如3.5h。 [0024] 在一些优选的实施方案中，对所述混合物2进行冻干，得到冻干粉形式的所述固定化酶。 [0025] 在一些优选的实施方案中，所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白为酶液的形式。 [0026] 在一些优选的实施方案中，所述方法包括如下步骤： [0027] 步骤S1：将所述PHBV溶于二氯甲烷，再溶于乙醇得到混合物1，所述二氯甲烷和所述乙醇的体积比为3:7，所述PHBV与所述二氯甲烷的质量体积比为10g/15mL； [0028] 步骤S2：将所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白加入所述混合物1，得到混合物2，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白质量比为2:1和10:1，所述搅拌的温度为37℃，所述搅拌的转速为150rpm，所述搅拌的时间为3.5h，得所述固定化酶。 [0029] 本发明第三方面提供了一种制备NMN的方法，其中，所述方法包括以下步骤：将如本发明第一方面所述固定化酶与原料混合，反应得NMN；所述原料包括NR或其盐。 [0030] 在一些实施方案中，所述原料还包括以下中的一种或多种：ATP或其盐、镁盐和六偏磷酸钠。 [0031] 在一些优选的实施方案中，所述固定化酶所述NR或其盐浓度比为1～10g/L:50～100mM，例如为3g/L:80mM。 [0032] 在一些优选的实施方案中，所述固定化酶与所述ATP或其盐浓度比为1～10g/L:5～80mM，例如3g/L:8mM和3g/L:80mM。 [0033] 在一些优选地实施方案中，所述固定化酶与所述镁盐浓度比为1～10g/L:30～60mM，例如3g/L:50mM。 [0034] 在一些优选的实施方案中，所述固定化酶与所述六偏磷酸钠浓度比为1～10g/L:5～80mM，例如3g/L:8mM和3g/L:30mM。 [0035] 在一些实施方案中，所述步骤还包括调节混合物的pH，所述pH为5.0～6.0，例如5.5。 [0036] 在一些实施方案中，所述步骤的反应温度为35～45℃，例如40℃。 [0037] 在一些优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：将本发明第一方面所述固定化酶与NR或其盐、ATP或其盐、镁盐和六偏磷酸钠混合，所述固定化酶与所述NR或其盐浓度比为3g/L:80mM，所述固定化酶与所述ATP或其盐浓度比为3g/L:8mM和3g/L:80mM，所述固定化酶与所述镁盐浓度比为3g/L:50mM，所述固定化酶与所述六偏磷酸钠浓度比为3g/L:8mM和3g/L:30mM，调节pH为5.5，反应温度为40℃，即得NMN。 [0038] 本发明第四方面提供了一种本发明第一方面所述固定化酶在制备NMN中的应用。 [0039] 本发明第五方面提供了一种PHBV在制备本发明第一方面所述固定化酶中的应用。 [0040] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。 [0041] 本发明所用试剂和原料均市售可得。 [0042] 本发明的积极进步效果在于： [0043] 1、首次将PHBV应用于酶固定化，由于PHBV可分解，环境友好，适合工业生产，5ml的酶液(含0.5g纯酶粉)仅需1g的载体； [0044] 2、本发明所述固定化酶可重复使用，回用多次后NRK酶依旧保持较高的活性，回用5次后NMN生成率较佳可达87.65％； [0045] 3、本发明所述固定化酶的转化过程更稳定，且转化率有所提高，反应2小时后NMN生成率较佳可达97.42％； [0046] 4、本发明所述固定化酶更易于分离，能降低后续除杂成本，且提纯过程较常规化过程更为简化，节约流程，提高转化率以及转化过程的稳定性，提高了酶的利用次数，节约了成本。具体实施方式 [0047] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。 [0048] 实施例1新型固定化酶A的制备 [0049] 步骤1：取10g的PHBV(上海麦克林生化科技有限公司，CAS：80181‑31‑3，lot#:C14064478)，溶于15mL的二氯甲烷溶液，加入乙醇(95％)，定容至50mL，超声10min，制备得混合物1； [0050] 步骤2：取5mL的NRK酶液(含0.5g纯酶粉)加入足量去离子水中(NRK酶的序列如SEQ ID NO:1所示)，快速搅拌后加入5mL的混合物1，去离子水定容至100mL，37℃，150rpm，反应3.5小时，得到混合物2； [0051] 步骤3：将混合物2制备成冻干粉，得到固定化酶A。 [0052] 将步骤3得到的固定化酶A转入500mL反应罐，加入NR等反应原料，控制反应总体积为500mL，反应温度为40℃；从反应后1h起，每隔0.5个小时，取样进行HPLC检测，持续2小时。计算NMN的峰面积，再根据标曲计算反应体系中的NMN实际的质量，可得到生成率。生成率的计算公式为： [0053] (NMN实际质量/NR全部转化的理论质量)×100％ [0054] 反应结果如表1所示。 [0055] 表1.PHBV固定化NRK酶(SEQ ID NO:1)的反应结果 [0056] [0057] 由结果可知，在反应进行到2小时后，NMN生成率可达97.42％，表明该固定化方法制得的固定化酶的生成率与液态NRK酶相比有提高。 [0058] 实施例2新型固定化酶B的制备 [0059] 步骤1：取10g的PHBV(上海麦克林生化科技有限公司，CAS：80181‑31‑3，lot#:C14064478)，溶于15mL的二氯甲烷溶液，加入乙醇(95％)，定容至50mL，超声10min，制备得混合物1； [0060] 步骤2：取5mL的包含NRK酶的溶液(含0.5g纯酶粉)蛋白液加入足量去离子水中(包含NRK酶的融合蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示)，快速搅拌后加入25mL的混合物1，去离子水定容至100mL，37℃，150rpm，反应3.5小时，得到混合物2； [0061] 步骤3：将混合物2制备成冻干粉，得到固定化酶B。 [0062] 将步骤3得到的固定化酶B转入500mL反应罐，加入NR等反应原料，控制反应总体积为500mL，反应温度为40℃；从反应后1h起，每隔0.5个小时，取样进行HPLC检测，持续2小时。计算NMN的峰面积，再根据标曲计算反应体系中的NMN实际的质量，可得到生成率。生成率的计算公式为： [0063] (NMN实际质量/NR全部转化的理论质量)×100％ [0064] 反应结果如表2所示。 [0065] 表2.PHBV固定化包含NRK酶的融合蛋白(SEQ ID NO:2)的反应结果 [0066] [0067] 相似地，使用SEQ ID NO:2所示的包含NRK酶的融合蛋白，经固定化后，保持其他条件不变，仅使用8mM的ATP或其盐也能得到相似的NMN生成率。 [0068] 实施例1的NRK酶和实施例2的包含NRK酶的融合蛋白的序列分别如下所示。 [0069] NRK酶1的氨基酸序列SEQ ID NO:1 [0070] MGFTTGREFHPALRMRAKYNAKYLGTKSEREKYFHLAYNKHTQFLRYQEQIMSKTKEKKVGVIFGKFYPVHTGHINMIYEAFSKVDELHVIVCSDTVRDLKLFYDSKMKRMPTVQDRLRWMQQIFKYQKNQIFIHHLVEDGIPSYPNGWQSWSEAVKTLFHEKHFEPSIVFSSEPQDKAPYEKYLGLEVSLVDPDRTFFNVSATKIRTTPFQYWKFIPKEARPFFAKTVAILGGESSGKSVLVNKLAAVFNTTSAWEYGREFVFEKLGGDEQAMQYSDYPQMALGHQRYIDYAVRHSHKIAFIDTDFITTQAFCIQYEGKAHPFLDSMIKEYPFDVTILLKNNTEWVDDGLRSLGSQKQRQQFQQLLKKLLDKYKVPYIEIESPSYLDRYNQVKAVIEKVLNEEEISELQNTTFPIKGTSQ [0071] NRK酶2(包含NRK酶的融合蛋白)的氨基酸序列SEQ ID NO:2 [0072] MGFTTGREFHPALRMRAKYNAKYLGTKSEREKYFHLAYNKHTQFLRYQEQIMSKTKEKKVGVIFGKFYPVHTGHINMIYEAFSKVDELHVIVCSDTVRDLKLFYDSKMKRMPTVQDRLRWMQQIFKYQKNQIFIHHLVEDGIPSYPNGWQSWSEAVKTLFHEKHFEPSIVFSSEPQDKAPYEKYLGLEVSLVDPDRTFFNVSATKIRTTPFQYWKFIPKEARPFFAKTVAILGGESSGKSVLVNKLAAVFNTTSAWEYGREFVFEKLGGDEQAMQYSDYPQMALGHQRYIDYAVRHSHKIAFIDTDFITTQAFCIQYEGKAHPFLDSMIKEYPFDVTILLKNNTEWVDDGLRSLGSQKQRQQFQQLLKKLLDKYKVPYIEIESPSYLDRYNQVKAVIEKVLNEEEISELQNTTFPIKGTSQKESGSVSSEQLAQFRSLDMGQEKLYIEKELSWLSFNERVLQEAADKSNPLIERMRFLGIYSNNLDEFYKVRFAELKRRIIISEEQGSNSHSRHLLGKIQSRVLKADQEFDGLYNELLLEMARNQIFLINERQLSVNQQNWLRHYFKQYLRQHITPILINPDTDLVQFLKDDYTYLAVEIIRGDTIRYALLEIPSDKVPRFVNLPPEAPRRRKPMILLDNILRYCLDDIFKGFFDYDALNAYSMKMTRDAEYDLVHEMEASLMELMSSSLKQRLTAEPVRFVYQRDMPNALVEVLREKLTISRYDSIVPGGRYHNFKDFINFPNVGKANLVNKPLPRLRHIWFDKAQFRNGFDAIRERDVLLYYPYHTFEHVLELLRQASFDPSVLAIKINIYRVAKDSRIIDSMIHAAHNGKKVTVVVELQARFDEEANIHWAKRLTEAGVHVIFSAPGLKIHAKLFLISRKENGEVVRYAHIGTGNFNEKTARLYTDYSLLTADARITNEVRRVFNFIENPYRPVTFDYLMVSPQNSRRLLYEMVDREIANAQQGLPSGITLKLNNLVDKGLVDRLYAASSSGVPVNLLVRGMCSLIPNLEGISDNIRAISIVDRYLEHDRVYIFENGGDKKVYLSSADWMTRNIDYRIEVATPLLDPRLKQRVLDIIDILFSDTVKARYIDKELSNRYVPRGNRRKVRAQLAIYDYIKSLEQPE [0073] 实施例3新型固定化酶的固定化效果验证 [0074] 将实施例1步骤3中的最终反应液过滤(转速7000rpm/min、温度为10℃的条件下离心，时间为10min)，得到的固体用去离子水洗涤两次后转入反应罐，按照实施例1中的反应条件，加入与实施例1浓度相同的反应原料，控制反应总体积为500mL，反应温度为40℃，反应2h后，取样进行HPLC检测。每次反应结束后，按照上述方法，依次收集固定化的酶，进行回用，并检测反应2小时后，NMN的产率。回用效果如表3所示。 [0075] 表3.PHBV固定化NRK酶回用效果 [0076]回用次数 1 2 3 4 5 6 7 8 NMN生成率(％) 96.45 95.23 91.36 90.13 87.65 70.46 61.28 50.34 [0077] 由结果可知，当使用实施1的方法对NRK酶进行固定化后，酶回用5次，NMN收率依旧达87.65％，当回用到第8次，NMN收率为50.34％。 [0078] 当使用实施例2的方法对含有NRK酶的融合蛋白进行固定化得到固定化酶B，固定化酶B酶回用4‑5次，NMN收率依然可达80％以上。 [0079] 实施例4常规酶催化反应和本发明所述的反应提纯过程对比 [0080] 常规酶催化反应的提纯步骤如下： [0081] S1：用常规离心机进行离心 [0082] S2：超滤：除胞内酶、细胞内毒素，所用超滤机截留分子量为5000道尔； [0083] S3：纳滤：除去大分子杂质，纳滤机截留分子量为150‑200； [0084] S4：离子交换树脂：用弱碱性阴离子交换树脂和弱酸性阳离子树脂结合，除ATP/ADP/AMP、除二价盐及其他有机杂质。 [0085] 本发明所述的反应提纯步骤如下： [0086] S1：离心； [0087] S2：离子交换树脂：除ATP/ADP/AMP、除二价盐及其他有机杂质。 [0088] 对比两种不同的提纯步骤，可知本发明的提纯步骤更简洁、高效，省去了超滤、纳滤的步骤，简化了反应流程。 [0089] 对比例1PHVB对酶催化反应的影响 [0090] 将不同浓度的PHBV分别与5mL的NRK酶液(含0.5g纯酶粉)一起加入到100ml去离子水，放进摇床，37℃，150rpm，反应3.5小时，得到固定化溶液。 [0091] 将固定化溶液转入反应罐，加入等量的与实施例1浓度相同的反应原料，控制反应总体积为500mL，反应温度为40℃，每隔1个小时，取样进行HPLC检测。4个批次不同PHBV浓度的结果如表4所示。 [0092] 表4.PHBV对NRK酶催化反应的影响 [0093] [0094] [0095] 由结果可知，2g/L至10g/L浓度的PHBV材料，对NRK酶催化NR制备NMN没有负面作用。 [0096] 对比例2从PHBV和NRK酶混合物中回收酶再次投入反应 [0097] 将对比例1中反应结束后的体系，过滤，滤出的固体，再次投入反应，反应结果如表5所示： [0098] 表5.回收后再次催化反应的结果 [0099] [0100] 由结果可知，在对比例1的实验条件下，使PHBV与NRK酶进行吸附固定，并没有固定住，每次回收均会产生NRK酶的损失。 [0101] 对比例3常规的戊二醛交联固定化 [0102] 取4份1g的PHBV和5mL的NRK酶液(含0.5g纯酶粉)，制备编号为3.1、3.2、3.3和3.4的固定化酶，各编号制备方法中将前述PHBV和NRK酶液加入100ml的不同溶剂和2.5g戊二醛，3.1中加入的溶剂为去离子水，3.2中加入的溶剂为Tris‑HCL缓冲液，3.3中加入的是EDTA缓冲液，3.4中加入的是Tris‑HCL和EDTA的缓冲液，分别将混合溶液3.1、3.2、3.3、3.4放进摇床，4℃，50rpm，反应3.5小时，将得到混合溶液过滤，得到的固体用相应的溶剂清洗两次。将滤除的固体，转入反应罐，加入等量的NR等反应原料，控制反应总体积为500mL，反应温度为40℃，每隔1个小时，取样进行HPLC检测。结果如表6所示。 [0103] 表6.常规的戊二醛交联法固定化后催化反应的结果 [0104] [0105] 结果表明，常规的交联法，对于NRK酶固定在PHBV新材料上并没有起到促进作用，推测为使用常规的戊二醛交联剂对NRK酶的活性有毒害作用。

意见反馈