一种嗜酸性纤维素酶与木聚糖酶组合及其编码基因和应用 |
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| 申请号 | CN202410156736.1 | 申请日 | 2024-02-04 | 公开(公告)号 | CN118006589A | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 南京农业大学; | 发明人 | 缪有志; 王景梵; 谷金; 位亚宁; 夏燕维; 王伟; 徐志辉; 张瑞福; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种嗜酸性 纤维 素酶与木聚糖酶组合及其编码基因和应用；所述酶组合由嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2以及嗜酸性内切木聚糖酶XYN1组成；所述EGL1的 氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述EGL2如SEQ ID NO.4所示，所述XYN1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的多酶组合具有极高的酸 稳定性 (pH0.5‑4.0)，且在pH 1.5‑4.0区间稳定维持高效 水 解 酶活性，能够满足果汁澄清、动物 饲料 以及 微 生物 肥料 木霉孢子生产等酸性应用环境对低pH值下高效水解 纤维素 的特殊需求。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种酶组合，其特征在于，所述酶组合由嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、嗜酸性内切葡聚糖酶EGL2以及嗜酸性内切木聚糖酶XYN1组成；所述嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述嗜酸性内切葡聚糖酶EGL2如SEQ ID NO.4所示，所述嗜酸性内切木聚糖酶XYN1如SEQ ID NO.6所示。 |
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| 说明书全文 | 一种嗜酸性纤维素酶与木聚糖酶组合及其编码基因和应用技术领域[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种由两个嗜酸性内切葡聚糖酶和一个嗜酸性内切木聚糖酶构成的多酶组合及其编码基因和应用。技术背景 [0002] 植物残体是自然界中储量极其丰富的可再生资源，其主要成分包括纤维素和木聚糖。纤维素由D‑葡萄糖残基通过β‑1,4‑糖苷键串联形成长链分子，并以结晶结构形式大量存在；木聚糖则由D‑木糖残基通过β‑1,4‑糖苷键串联形成，是继纤维素之外储量最丰富的多聚糖物质。自然界中，微生物能够分泌包括内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶等对植物残体中复杂纤维素和木聚糖成分进行高效水解，从而发挥长链断裂和释放寡糖的作用。因此，内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶等多聚糖(纤维素和木聚糖)水解酶被广泛应用于工业的各个领域，包括造纸、纺织、生物能源、饲料、食品等。 [0003] 随着工业的不断发展，对极端环境下依然能够高效发挥酶解作用的纤维素酶和木聚糖酶产品需求迫切。例如，生物能源领域中植物残体预处理的酸性环境、果汁澄清处理的酸性环境、动物饲料的胃酸环境等急需耐酸或嗜酸性纤维素酶和木聚糖酶在低pH值环境下(pH 2‑4)高效水解纤维素和木聚糖促进糖化、澄清以及消化等关键过程。除此之外，农业微生物肥料制造领域通常采用酸处理植物残体在低pH值(3.0左右)条件下发酵制备木霉功能菌孢子产品，然而在此环境下大部分多聚糖水解酶活性低下。因此，发掘能够在酸性环境下(pH 2‑4)高效发挥水解作用且具有优异酸稳定性特征的内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶能够满足不同领域的工业应用需求。 发明内容[0004] 本发明目的是针对不同领域对酸性条件下(pH<4)高效发挥酶解作用且稳定的内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶的迫切需求，而常规酶在此条件下结构不稳定、易失活的现状，提供一种包括两个嗜酸性内切纤维素酶基因和一个嗜酸性内切木聚糖酶基因的多酶组合。 [0005] 本发明的另一目的是提供表达所述三个基因的基因工程菌。 [0006] 本发明的又一目的是提供所述三个基因的应用。利用所述三个基因生产的多酶制剂可用于果汁澄清、动物饲料、微生物有机肥的木霉孢子制备等领域，满足低pH值条件下稳定且高效发挥水解作用的需求，带来可观的经济效益。 [0007] 本发明的目的可通过如下技术方案实现： [0008] 一种嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因的全长(包含起始密码子和终止密码子)为663bp，G+C含量为49％，编码由219个氨基酸组成的嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。 [0009] 一种嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl2，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。该基因的全长(包含起始密码子和终止密码子)为1200bp，G+C含量为49％，编码由399个氨基酸组成的嗜酸性内切葡聚糖酶EGL2，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。 [0010] 一种嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5。该基因的全长(包含起始密码子和终止密码子)为750bp，G+C含量为54％，编码由249个氨基酸组成的嗜酸性内切葡聚糖酶XYN1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.6。 [0011] 第一方面，本发明保护一种酶组合，所述酶组合由嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、嗜酸性内切葡聚糖酶EGL2以及嗜酸性内切木聚糖酶XYN1组成；所述嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述嗜酸性内切葡聚糖酶EGL2如SEQ ID NO.4所示，所述嗜酸性内切木聚糖酶XYN1如SEQ ID NO.6所示。 [0012] 第二方面，本发明保护一种与前文所述酶组合相关的基因组合，所述基因组合包括编码嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1的基因egl1、编码嗜酸性内切葡聚糖酶EGL2的基因egl2以及编码嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的基因xyn1组成；所述基因egl1的如核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述基因egl2如核苷酸序列SEQ ID NO.3所示；所述基因xyn1的如核苷酸序列SEQ ID NO.5所示。 [0013] 第三方面，本发明保护一种与前文所述基因相关的重组载体组合，所述重组载体组合包括含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1的重组载体、含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl2的重组载体以及含有嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的重组载体。 [0014] 在具体的实施方案中，所述重组载体为重组质粒。 [0015] 在更具体的实施方案中，本发明公开了三种重组质粒，分别为含有上述嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1的pPICZαA‑egl1，嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl2的pPICZαA‑egl2，以及嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的pPICZαA‑xyn1。均是通过EcoRI和XbaI双酶切法分别将egl1、egl2和xyn1基因cDNA序列插入pPICZαA表达质粒的多克隆位点处并融入质粒正确表达框中，通过博来霉素(zeocin)筛选正确突变子并测序验证获得。 [0016] 第四方面，本发明还保护含有前文所述的基因组合或前文所述的重组载体的基因工程菌。 [0017] 在具体的实施方案中，所述基因工程菌为分别含有所述嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1、egl2以及嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的基因工程菌Pichia pastoris X33‑egl1、P.pastoris X33‑egl2和P.pastoris X33‑xyn1。 [0018] 在具体的实施方案中，所述的基因工程菌均采用如下方法构建：所述的含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1、egl2和嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的重组质粒pPICZαA‑egl1、pPICZαA‑egl2和pPICZαA‑xyn1分别通过电转导入宿主菌P.pastoris X33感受态中，‑1接着通过含有25mg·L 博来霉素的YPD(2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母粉，2％(w/v)葡萄糖，1M山梨醇，pH 6.0)平板进行突变体筛选，30℃培养48h后挑取转化子，经测序验证和预发酵酶活测定无误后获得正确基因工程菌P.pastoris X33‑egl1、P.pastoris X33‑egl2和P.pastoris X33‑xyn1，‑80℃甘油保存。 [0019] 所述的嗜酸性内切葡聚糖酶蛋白EGL1和EGL2以及嗜酸性内切木聚糖酶蛋白XYN1的生产方法如下： [0020] 1)将基因工程菌P.pastoris X33‑egl1、P.pastoris X33‑egl2和P.pastoris ‑1X33‑xyn1分别少量菌体接种到含100mg·L 博来霉素的BMGY液体培养基中(1％(w/v)酵母‑5 粉，2％(w/v)蛋白胨，4×10 ％(w/v)生物素，1.34％(w/v)YNB，1％(v/v)甘油)，黑暗条件下 28℃、250rpm摇床培养24h，8000rpm离心5min去上清，收获菌体。 [0021] 2)将各工程菌菌体分别重新转接至含1％甲醇的BMMY液体培养基中(1％(w/v)酵‑5母粉，2％(w/v)蛋白胨，4×10 ％(w/v)生物素，1.34％(w/v)YNB，1％(v/v)甲醇)，黑暗条件下28℃、250rpm摇床培养，每24h添加一次甲醇(1％(v/v)含量)，72h后8000rpm离心5min去除菌体沉淀，分别获得EGL1、EGL2和XYN1蛋白发酵液。 [0022] 3)取少量发酵液经SDS‑PAGE凝胶电泳和DNS法酶活测定验证，确认无误后利用分子筛技术大批量纯化，纯化后各蛋白溶解于100mM磷酸钾溶液中(pH 6.6)，BCA法测定蛋白‑1含量均在1.0‑2.0g·L 之间，‑80℃保存待用。 [0023] 第五方面，本发明保护SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示基因编码的嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1三者组合或单独在果汁澄清、动物饲料或生物有机肥木霉孢子等生产酸性环境下的应用。 [0024] 第六方面，本发明还保护前文所述的基因组合、重组载体组合或基因工程菌组合在果汁澄清、动物饲料或生物有机肥木霉孢子等生产酸性环境下的应用。 [0025] 本发明的有益效果如下： [0026] 本发明提供一种嗜酸性多酶组合、基因组合、载体组合及其工程菌，包括嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1、egl2和嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1，其中表达蛋白EGL1和EGL2能够将微生物难降解的纤维素水解成可溶性纤维寡糖，XYN1能够将木聚糖水解成可溶性木寡糖。EGL1、EGL2和XYN1的最适反应温度均为为50℃，最适反应pH值在3.0‑3.5区间。EGL1、EGL2和XYN1能够分别在pH 3.0‑4.0、pH 2.5‑4.0和pH2.0‑4.0区间保持80％以上的酶活性。EGL1能够在极酸环境下(pH 0.5‑4.0)保持结构和酶活稳定，而EGL2和XYN1能够在pH≥2.0条件下保持结构和酶活稳定。三者形成的多酶组合能够实现在pH 2.0‑4.0条件下稳定高效水解纤维素、木聚糖等成分，协同效果显著。这一特性高度符合果汁澄清、动物饲料以及微生物有机肥木霉孢子生产等酸性环境，从而增强果汁澄清度、促进动物饲料吸收、提高木霉发酵效率和孢子产量。 附图说明 [0027] 图1嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的SDS‑PAGE图。 [0028] A：嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1；B：嗜酸性内切葡聚糖酶EGL2；C：嗜酸性内切木聚糖酶XYN1。 [0029] 图2嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的最适温度及温度稳定性测定。 [0030] A：EGL1最适温度，将适量EGL1与含有0.5％羧甲基纤维素钠(CMC‑Na)的柠檬酸缓冲液(pH 3.5)混合，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃水浴温度下反应30min，经DNS法测定酶活； [0031] B：EGL2最适温度，方法同EGL1； [0032] C：XYN1最适温度，将适量XYN1与含有1％燕麦木聚糖的柠檬酸缓冲液(pH 3.5)混合，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃水浴温度下反应10min，经DNS法测定酶活； [0033] D：EGL1温度稳定性，EGL1蛋白溶液不同温度下(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)孵育不同时间(15min、30min、45min、60min)，经DNS法测定剩余酶活； [0034] E：EGL2温度稳定性，方法同EGL1； [0035] F：XYN1稳定稳定性，方法同EGL1。 [0036] 图3嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的最适pH及pH稳定性测定。 [0037] A：EGL1最适pH，配置含有0.5％CMC‑Na的不同pH值(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、10.6)缓冲液，加入适量EGL1后50℃反应30min，经DNS法测定酶活； [0038] B：EGL2最适pH，方法同EGL1； [0039] C：XYN1最适pH，配置含有1％燕麦木聚糖的不同pH值(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、10.6)缓冲液，加入适量XYN1后50℃反应10min，经DNS法测定酶活； [0040] D：EGL1 pH稳定性，EGL1在不同pH值缓冲液中于4℃孵育1h，接着于50℃和pH 3.5条件下水解0.5％CMC‑Na反应30min，经DNS法测定剩余酶活。 [0041] E：EGL2 pH稳定性，方法同EGL1； [0042] F：XYN1 pH稳定性，XYN1在不同pH值缓冲液中于4℃孵育1h，接着在50℃和pH3.0条件下水解1％燕麦木聚糖反应10min，经DNS法测定剩余酶活。 [0043] 图4嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1在低pH值下高效协同分解玉米芯。 [0044] A：pH2.5情况下，2倍固定体积的酶液(2×EGL1、2×EGL2或2×XYN1)，1倍固定体积的酶液两两组合(EGL1+EGL2、EGL1+XYN1或EGL2+XYN1)，3倍固定体积酶液(3×EGL1、3×EGL2或3×XYN1)和1倍固定体积酶液三者混合(EGL1+EGL2+XYN1)，分别在40℃下水解3mL 2％(w/v)玉米芯颗粒10h释放的还原糖量的结果与差异比较。 [0045] B：pH 3.0情况下，处理同上。 [0046] 生物材料保藏信息 [0047] 哈茨木霉NJAU4742(Trichoderma harzianum NJAU4742)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号分别为CGMCC No.12166，因已在多篇文献中已公开，本申请未提供保藏证明。 [0048] 单链青霉(Penicillium singorens)ZL10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC No.40202，保藏日期：2022年05月23日。 具体实施方式[0050] 实施例1嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的制备1.嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1、egl2和嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的克隆 [0051] 木霉NJAU4742或青霉ZL10在以2％(w/v)葡萄糖作为唯一碳源的无机盐培养基中150rpm摇床培养48h后，将菌丝体转接到含有1％(w/v)结晶纤维的无机盐培养基中150rpm诱导培养12h。然后，将菌体液氮研磨后利用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)试剂盒提取结晶纤维诱导的木霉NJAU4742或青霉ZL10总RNA，经PrimeScript RT‑PCR Kit(TAKARA)反转试剂盒合成cDNA，并通过引物对F‑egl1(5’‑CCGgaattcCAAACCAGCTGCGAACAGTATG‑3’，SEQ ID NO.7)和R‑egl1(5’‑CTAGtctagaTTAGTTGATAGATGCGGTCCAGG‑3’，SEQ ID NO.8)，F‑egl2(5’‑CCGgaattcCAGCAAACTGTTTGGGGGC‑3’，SEQ ID NO.9)和R‑egl2(5’‑CTAGtctagaCTATTTCCGGGAAAGGCATGAG‑3’，SEQ ID NO.10)从木霉NJAU4742cDNA样品中PCR扩增分别获得egl1和egl2基因的cDNA序列；通过引物对F‑xyn1(5’‑CCGgaattcATGAACACCCCCAACTCAC‑3’，SEQ ID NO.11)和R‑xyn1(5’‑CCGgaattcCTAGCGTATTTCGGAGTACGTTTTG‑3’，SEQ ID NO.12)从青霉ZL10 cDNA样品中PCR扩增获得xyn1基因的cDNA序列。经切胶回收后溶于双蒸水中，‑20℃保存。 [0052] 其中，反转录反应体系的第一步为(dNTP Mixture(10mM each)1μL；Oligo dT Primer(2.5μM)1μL；Template RNA 1μg；RNase Free dH2O up to 10μL)反应条件为65℃反TM应5min，4℃保存10min。第二步为(第一步的反应液10μl；5×PrimeScript Buffer 4μL； ‑1 TM RNase Inhibitor(40U·μL )0.5μl；PrimeScript RTase(for 2Step)0.5μL；RNase Free dH2O 5μL)反应条件：42℃反应30min，95℃反应5min，4℃保存10min。各基因cDNA序列扩增 2+ 体系为(Primer star酶(5U/μL)0.5μL；5×PCR Buffer II(Mg Plus)10μl；dNTP Mixture(2.5mM each)5μl；模板cDNA 1μL；上游引物(20μM)1μL；下游引物(20μM)1μL；灭菌双蒸水至 50μL；PCR扩增程序：98℃变性10sec，60℃退火10sec，72℃延伸1.5min，进行30个循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。 [0053] 2.表达载体pPICZαA‑egl1、pPICZαA‑egl2和pPICZαA‑xyn1构建 [0054] 将所述的嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1、egl2和嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的c DNA序列和pPICZαA质粒序列分别用EcoRI和XbaI进行酶切处理。酶切反应体系为(EcoRI 1μL；XbaI1μL；10×M Buffer 5μL；基因片段或表达质粒20μL；灭菌的蒸馏水加至50μL)，在 37℃水浴反应约3h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳切胶回收。回收后的egl1、egl2或xyn1基因片段和pPICZαA线性化质粒片段分别按10:1混合，在T4连接酶作用下，16℃水浴过夜反应。 酶连体系为(双酶切后的pPICZαA线性化质粒0.5μL；双酶切后的egl1、egl2或xyn1基因片段 4.5μL；Ligate Solution I 5μL；灭菌双蒸水加至10μL)。 [0055] 3.酶连产物转化及阳性克隆子的筛选 [0056] 将10μL上述酶连产物与200μL E.coli DH5α感受态细胞混匀，冰浴30min；然后42℃水浴锅中热激处理90s，快速转移至冰浴中冷切1‑2min；接着加入800μL液体LLB培养基，37℃摇床100rpm培育1h。然后，4000rpm离心3min，去除大部分上清，将剩余约200μL感受态‑1 细胞涂布于含有25mg·L 博来霉素的LLB琼脂平板上，37℃培养16h，挑选约10个单菌落并‑1 编号后接种于3mL含有25mg·L 博来霉素的LLB试管中，待长出菌落悬液后提质粒测序验证，确保其精确无误。将获得的正确质粒分别命名为pPICZαA‑egl1、pPICZαA‑egl2和pPICZαA‑xyn1。 [0057] 4.嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1、egl2和嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1分别在P.pastoris X33中高效表达 [0058] 将分别含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1、egl2和嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的pPICZαA‑egl1、pPICZαA‑egl2和pPICZαA‑xyn1重组质粒用限制性内切酶PmeI进行线性化‑1处理。10μL高浓度线性化质粒(>400ng·μL )与200μL P.pastoris X33感受态充分混匀并进行电转处理，电转后立刻加入1mL 1M山梨醇溶液，30℃静置1h，4000rpm离心后去除大部‑1 分上清保留约100μL菌液，涂布于含有25mg·L 博来霉素的YPD培养基上，30℃培养2‑3d后，‑1 挑取阳性克隆子菌落，转接至含有25mg·L 博来霉素的新鲜YPD培养基上，30℃培养3d后采用菌落PCR进行突变子验证。 [0059] 将上述阳性克隆子利用BMGY培养基30℃，200rpm培养20h，4000rpm离心5min得菌体，转接到等体积新鲜BMMY液体培养基中，30℃、200rpm继续培养，每24h按照1％体积比重新加入甲醇溶液。最低诱导48h后，发酵液离心去沉淀，即为嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2或嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的粗酶液。取10μL EGL1或EGL2纯化蛋白加入1mL含有0.5％羧甲基纤维素钠的柠檬酸缓冲液(pH 3.5)中，于50℃反应30min后，加入1mL的DNS试剂充分混匀后沸水浴10min，用520nm波长处的吸光值强弱测定酶解效率，利用葡萄糖溶液做标准曲线。酶活单位定义为每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，测得EGL1和EGL2比活力分别为‑1 ‑123.85U·mg 和31.61U·mg 。取2μL XYN1纯化蛋白加入1mL含有1％燕麦木聚糖的柠檬酸缓冲液(pH 3.0)中，于50℃反应10min后，利用DNS法测定酶活，以不同浓度木糖溶液做标准‑1 曲线。测得XYN1比活力为1631.28U·mg 。 [0060] 实施例2嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的最适反应温度与温度稳定性的检测 [0061] 将2μL纯化的嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1或EGL2分别加入到1mL含有0.5％CMC‑Na的柠檬酸缓冲液(pH 3.5)中，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃的水浴温度下反应30min，每个温度设3个重复。将2μL纯化的嗜酸性内切木聚糖酶XYN1加入到1mL含有1％燕麦木聚糖的柠檬酸缓冲液(pH 3.0)中，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃的水浴温度下反应10min，每个温度设3个重复。反应结束后立即加入1mL DNS试剂并充分混匀，沸水浴10min后吸取200μL溶液并利用分光光度计检测520nm波长下的吸光值，通过吸光值大小判断嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1或EGL2以CMC‑Na为底物时，嗜酸性内切木聚糖酶XYN1以燕麦木聚糖为底物时的最适反应温度。取适量EGL1、EGL2或XYN1酶液进行不同温度(30‑80℃，梯度为10℃)的水浴孵育，按照孵育15min、30min、45min、60min时间点取出酶液，置于冰上冷却。接着，在最适温度(50℃)和最适pH(3.5或3.0)条件下，利用DNS法检测酶解还原糖释放情况，从而计算剩余酶活。结果表明嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的最适反应温度均为50℃，在30℃‑50℃温度区间，EGL1和EGL2均能够保持80％以上的活性。温度稳定性上，EGL1、EGL2和XYN1均能在50℃及以下温度保持酶活稳定。 [0062] 实施例3嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的最适pH值与pH稳定性检测 [0063] 配置含有0.5％CMC‑Na或1％燕麦木聚糖的不同pH值缓冲液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.6)，分别对应添加2μL纯化的嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2或嗜酸性内切木聚糖酶XYN1并混匀，50℃下水浴反应30min，用DNS法测定产生的还原糖释放量并计算酶活，从而比较嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2或嗜酸性内切木聚糖酶XYN1在不同pH条件下水解底物CMC‑Na或燕麦木聚糖的能力。除此之外，将EGL1、EGL2或XYN1分别在pH值为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、 9.0、10.0、10.6的缓冲液中4℃孵育1h，之后在最适温度(50℃)和最适pH(3.5或3.0)条件下利用DNS法测定其剩余酶活。最终得出：嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1和EGL2的最适反应pH值均为3.5，嗜酸性内切木聚糖酶XYN1最适反应pH值为3.0，EGL1、EGL2和XYN1能够分别在pH 3.0‑4.0、pH 2.5‑4.0和pH2.0‑4.0区间保持80％以上的酶活性。EGL1能够在极酸环境下(pH 0.5‑4.0)保持结构和酶活稳定，而EGL2和XYN1能够在pH≥2.0条件下保持结构和酶活稳定。 [0064] 实施例4嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的多酶协同检测 [0065] 选择pH 2.5和pH 3.0作为协同效应检测的pH值，并以此pH值配置2％(w/v)的玉米芯颗粒悬液，3mL玉米芯颗粒缓冲液为一个标准反应体积。首先，加入适量的EGL1、EGL2或XYN1于3mL玉米芯缓冲液中，40℃反应10h后通过DNS法测定还原糖释放量。与此同时，不断增加EGL1、EGL2或XYN1的酶量，并重复上述实验，绘制随各自酶量增加对3mL 2％(w/v)玉米芯颗粒还原糖释放量的动态曲线图。分别选择各自曲线的拐点处对应的酶量作为EGL1、EGL2或XYN1各自的标准固定体积，即酶量的增加不会造成还原糖量的显著增加。 [0066] 接着，分别在pH 2.5或pH 3.0条件下设置不同组合于40℃下对3mL 2％(w/v)玉米芯颗粒进行酶解，反应时长为10h，通过比较还原糖释放量检测EGL1、EGL2和XYN1的多酶协同能力。组合包括：2倍固定体积的酶液(2×EGL1、2×EGL2或2×XYN1)，1倍固定体积的酶液两两组合(EGL1+EGL2、EGL1+XYN1或EGL2+XYN1)，3倍固定体积酶液(3×EGL1、3×EGL2或3×XYN1)和1倍固定体积酶液三者混合(EGL1+EGL2+XYN1)。检测结果表明，嗜酸性纤维素酶EGL1、EGL2和嗜酸性木聚糖XYN1三者间存在显著协同效应，两两组合或三者组合在低pH条件下(2.5‑3.0)对底物玉米芯颗粒的水解效果要显著高于任意单一酶。 |
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