一种水体沉积物原状富集与驯化功能微生物的方法 |
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| 申请号 | CN202010304483.X | 申请日 | 2020-04-17 | 公开(公告)号 | CN111440725B | 公开(公告)日 | 2024-03-01 |
| 申请人 | 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心); | 发明人 | 杨旭楠; 刘丛竹; 钟咪; 许玫英; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种 水 体 沉积物 原状富集与驯化功能 微 生物 的方法。本发明利用水体沉积物原状富集与驯化装置进行驯化培养获得功能微生物，其中水体沉积物原状富集与驯化装置包括富集驯化仓、布水部件、水相循环部件、培养液供给部件以及曝气部件。本方法在不破坏沉积物的结构原状的前提下，富集功能微生物，提高生境敏感型微生物被分离的概率；通过气相 环境控制 沉积物培养条件，同时向沉积物内部或表面持续缓慢地提供选择性培养基，达到调控沉积物的微生物向目标方向演替，可作为研究沉积物微生物生态学的有 力 工具。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种水体沉积物原状富集与驯化功能微生物的方法，其特征在于，利用水体沉积物原状富集与驯化装置进行原状富集与驯化培养获得功能微生物； |
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| 说明书全文 | 一种水体沉积物原状富集与驯化功能微生物的方法技术领域[0001] 本发明属于微生物资源挖掘与利用领域，具体涉及一种水体沉积物原状富集与驯化功能微生物的方法。 背景技术[0002] 地表水体伴随着人类的发展，承担着水运、泄洪、景观甚至纳污等功能，为人类社会发展作出了重要的贡献。近几十年来，特别是发展中国家及地区，经济的快速发展和城市人口激增伴随滞后的环境管理，致使地表水体遭受严重的污染，失去其自有的生态调节功能。特别是，污染物进入水体后趋向于与颗粒物结合并沉降到底质，富集了大量污染物的沉积物成为了內源污染源。 [0003] 微生物强化法是水体修复的重要方法，主要通过施放高效功能微生物，加速污染物降解脱毒的效果，因其环境友好性和低能耗的特点而被广泛应用于饱和介质(地下水层、沉积物)的难降解污染物的修复中。功能微生物作为环境生物治理的核心，功能菌种资源的挖掘与选育是重中之重。 [0004] 微生物富集与驯化的主要方法有两种。第一种方法是取样培养，即将样品采集后加入到选择性培养基进行驯化与富集培养，然后经过多次传代，将能够生长在选择性培养基的微生物富集，便于后续分离纯化。第二种方法是原位富集，即将带有附着物(如填料、培养基)的富集装置置于目标环境中，让微生物生长在具有功能选择性的附着物上富集，取回装置，获得富集的微生物。第一种方法是常规方法，适用性强，通过此方法人们已挖掘到大量微生物资源；然而，此方法在取样和培养过程中，已将样品的空间结构破坏，微生物生长的生境已发生巨大的改变；丰度较低或无法适应生境骤变的微生物将在培养初期即被淘汰，因此，难以富集到这类生境敏感型微生物。第二种方法解决了生境的骤变问题，然而，该方法属于被动富集，无法有效控制富集和驯化的条件。 发明内容[0005] 本发明的目的是解决现有技术中上述两种方法的缺陷，本发明针对水体沉积物空间异质性的特点，保持沉积物的原状结构，并使其在连续流装置中通过控制微生物代谢因子，达到富集和驯化沉积物中目标功能微生物的目的；因此，本发明提供一种水体沉积物原状富集与驯化功能微生物的方法。 [0006] 本发明的方法，由于不破坏沉积物天然沉积结构，能够避免生境敏感型微生物的消亡，同时，能调控代谢因子，让自然丰度低的目标微生物能够在原生环境中得到驯化和增殖，有利于后续分离纯化，在挖掘饱和介质中的功能微生物方面颇具优势。 [0007] 本发明的水体沉积物原状富集与驯化功能微生物的方法，利用水体沉积物原状富集与驯化装置进行原状富集与驯化培养获得功能微生物； [0008] 所述的水体沉积物原状富集与驯化装置包括富集驯化仓、布水部件、水相循环部件、培养液供给部件以及曝气部件，富集驯化仓的顶部设有进气孔和出气孔，曝气部件与进气孔连接，富集驯化仓的底部设有进水孔，布水部件通过进水孔插入到富集驯化仓的腔体内，布水部件留置在富集驯化仓外的一端通过其中一组水相循环部件连接到培养液供给部件的出液口，富集驯化仓的侧壁设有出水孔，出水孔通过另一组水相循环部件连接到培养液供给部件的进液口； [0009] 所述的原状富集与驯化培养为：采集原状水体沉积物于驯化富集仓，往驯化富集仓注入取样水体沉积物的原生水体，在培养液供给部件中加入用于富集和驯化目标功能微生物的培养液，启动水相循环部件通过布水部件向水体沉积物表面或内部输入培养液，适时调整培养液组分，完成原状富集与驯化培养。 [0010] 优选，所述的水体沉积物原状富集与驯化功能微生物的方法，在完成原状富集与驯化培养后，还包括液相富集培养的步骤：取驯化培养的水体沉积物置于富集培养基中培养并多次传代培养，获得目标功能微生物菌群。 [0011] 优选，所述的原状富集与驯化培养步骤中的培养液为腐殖酸培养基，每升含有：0.2g硫酸镁、0.25g硝酸钾和0.2‑6g腐殖酸，余量为水；其中，每过5天，腐殖酸浓度由0.2g/L依次提高至0.4g/L、1.6g/L、6g/L；所述的液相富集培养步骤中的富集培养基为富集腐殖酸培养基，每升含有：0.2g硫酸镁、0.25g硝酸钾和2g腐殖酸，余量为水；所述的多次传代培养是5次传代培养。 [0012] 优选，所述的水体沉积物原状富集与驯化功能微生物的方法，在完成原状富集与驯化培养后，还包括筛选培养的步骤：取驯化培养的水体沉积物置于目标功能筛选培养基中培养，分离获得目标功能微生物菌株。 [0013] 优选，所述的布水部件包括进水管和布水盘，进水管为中空结构、其侧面密封，用于向布水盘传输培养液，进水管的长度大于水体沉积物的厚度，布水盘为石英砂材质。 [0014] 优选，所述的布水部件为一个石英砂材质的中空结构进水管，顶部封口，进水管的长度不大于水体沉积物的厚度。 [0016] 优选，所述的培养液供给部件包括容器以及安装在容器顶部的盖体，盖体轴向设置有出、入液口，出、入液口的孔边缘设有硅胶缓冲胶圈，出液口设置有出液管，用于从容器内抽出培养液，入液口设置有入液管，用于向容器输入从富集驯化仓内抽出的沉积物上层液体。 [0017] 优选，所述的曝气部件包括依次连接的气瓶、气体控制阀、曝气管以及曝气头，曝气管通过进气孔插入到富集驯化仓的腔体内，曝气头吊装在富集驯化仓的腔体内并没入沉积物上层液体。 [0018] 本发明的有益效果是： [0019] (1)在不破坏沉积物的原状结构的前提下，富集功能微生物，提高生境敏感型微生物被分离的概率； [0021] 图1是水体沉积物原状富集与驯化装置的示意图1。 [0022] 图2是水体沉积物原状富集与驯化装置的示意图2。 具体实施方式[0023] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 [0024] 本发明的水体沉积物原状富集与驯化功能微生物的方法需要利用水体沉积物原状富集与驯化装置来完成驯化培养。 [0025] 根据图1、2所示，本发明的水体沉积物原状富集与驯化装置，包括富集驯化仓1、布水部件2、水相循环部件3、培养液供给部件4以及曝气部件5，富集驯化仓1的顶部设有进气孔111和出气孔112，曝气部件5与进气孔111连接，富集驯化仓1的底部设有进水孔131，布水部件2通过进水孔131插入到富集驯化仓1的腔体内，布水部件2留置在富集驯化仓1外的一端通过其中一组水相循环部件3连接到培养液供给部件4的出液口，富集驯化仓1的侧壁设有出水孔121，出水孔121通过另一组水相循环部件3连接到培养液供给部件4的进液口。 [0026] 本装置设置盛装水体沉积物的富集驯化仓，不破坏水体沉积物的原状结构，使沉积物在采样与富集培养过程中保持空间结构的稳定，提高生境敏感型微生物被分离的概率；设置曝气部件调节控制沉积物培养气相环境条件，设置培养液供给部件和水相循环部件实现持续上升流营养供给，为沉积物提供培养液，布水部件可向沉积物内部或表面持续缓慢地提供培养液，通过调整培养液的成分来控制富集条件，主动地原位富集目的功能微生物，从而达到调控沉积物的微生物向目标方向演替的目的。 [0027] 更具体的，富集驯化仓1包括上盖11、主体12以及下盖13，上盖11和下盖13分别安装在主体12的上下两端，上盖11轴向设置进气孔111和出气孔112，下盖13轴向设置进水孔131，主体12的上半部径向设置出水孔122。 [0028] 主体12与上盖11、下盖13的连接方式可以是多样的，能够实现主体12与上盖11、下盖13之间的密封连接即可，下盖13与主体12连接后能稳固的承托底泥和上层液体；举例地说，主体12、下盖13为亚克力材质，上盖11可以是硅胶或者软塑料塞子，为了将主体12方便接驳在柱状的沉积物采样器中配套使用，本发明优选一种实施方式，即，主体12的两端设有螺纹，主体12通过螺纹与上盖11和下盖13固定连接。在取样时将富集驯化仓1的主体12预先接驳在柱状的沉积物采样器的底端，取样过程中水体沉积物即能原状保持在富集驯化仓的主体12内，取样后可以直接将富集驯化仓的主体12拆卸下来作为单独的培养仓，在不破坏水体沉积物的原状结构的前提下，通过水相循环部件以及培养液供给部件调控代谢因子。 [0029] 进气孔111、出气孔112以及进水孔131的孔边缘设有硅胶缓冲胶圈，硅胶缓冲胶圈起到了保护管道的作用。出气孔112的主要作用在于调整富集驯化仓1内的气压，保持在标准大气压。 [0030] 当需要在水体沉积物表面布水时，采用以下方法：布水部件2包括进水管21和布水盘22，进水管21为中空结构、其侧面密封，用于向布水盘22传输培养液，进水管21的长度大于水体沉积物的厚度，布水盘22为石英砂材质(实施例中为100‑160μm微孔的石英砂滤片)，用于向沉积物表面滤出培养液。进水管21上端设有开孔与布水盘22下端紧密结合，培养液通过布水盘22的外表面分散在水体沉积物的表面，该进水管21突出水体沉积物的长度优选为1cm以内，有利于从培养液供给部件4输送过来的培养液快速抵达水体沉积物的表面，为附着在水体沉积物表面的微生物提供营养。 [0031] 当需要在水体沉积物内部布水时，采用以下方法：布水部件2为一个中空结构进水管21，为石英砂材质构成的整体，用于向沉积物内部滤出培养液；与上述的表面布水方式不同，本实施方式中的进水管21顶部封口，进水管21的长度不大于水体沉积物的厚度。培养液通过进水管21石英砂间隙分散到水体沉积物的内部，为附着在水体沉积物内部的微生物提供营养。 [0032] 水相循环部件3包括软管31和蠕动泵32，两个蠕动泵32的一端通过两条软管31分别与出水孔121和进水孔131连接，两个蠕动泵32的另一端分别与培养液供给部件的出、入液口连接。两组水相循环部件3通过蠕动泵32控制流量，将培养液供给部件4储存的培养液输入到富集驯化仓1，同时，将富集驯化仓1上层液体(为水体沉积物的原生水体河水或培养液或二者的混合液)输入到培养液供给部件4，形成循环。 [0033] 培养液供给部件4包括容器41以及安装在容器41顶部的盖体42，盖体42轴向设置有出、入液口，出、入液口的孔边缘设有硅胶缓冲胶圈，出液口设置有出液管，用于从容器41内抽出培养液，入液口设置有入液管，用于向容器41输入从富集驯化仓1内抽出的沉积物上层液体(为水体沉积物的原生水体河水或培养液或二者的混合液)。该容器41优选为直立圆柱型亚克力杯子。根据筛选目的，在容器41中加入选择性培养基。 [0034] 曝气部件5包括依次连接的气瓶51、气体控制阀52、曝气管53以及曝气头54，曝气管53通过进气孔111插入到富集驯化仓1的腔体内，曝气头54吊装在富集驯化仓1的腔体内，曝气头54没入沉积物上层液体。曝气部件5的作用在于将气瓶51中的气体溶解到沉积物上层液体中，可控制培养环境。需要营造不同环境时，例如，好氧环境曝氧气或空气、厌氧环境曝氮气、发酵环境曝氮和二氧化碳的混合气，根据菌种的不同，选择使用储存有相应气体的气瓶51。 [0035] 在以下实施例中利用上述的水体沉积物原状富集与驯化装置来进行不同目标功能微生物的驯化培养。 [0036] 实施例1：富集筛选沉积物中反硝化芘降解菌试验 [0037] 在珠江广州航道某码头用底端接驳有富集驯化仓主体12的柱状采样器采集表层约5cm厚原状河道沉积物于富集驯化仓主体12(直径8.5cm，高25cm)中，将下盖13安装在富集驯化仓主体12的底部，从柱状采样器上取下富集驯化仓，下盖13的下端插入石英砂布水管；用玻璃针管，在沉积物表面随机均匀地滴加10mL芘溶液(0.06mg/mL，溶剂为正己烷)，静置30min(等待表面正己烷挥发)后，缓慢往富集驯化仓主体12注入河水形成约12cm高的水层，富集驯化仓主体12盖上上盖11；在培养液供给部件4中加入600mL反硝化培养基；连接进出水软管31，用蠕动泵32控制流速(1.5mL/min)；28℃驯化培养45天，每5天更换培养液供给部件中的反硝化培养基，过程中逐步提高硝酸盐的浓度。具体为：所用的反硝化培养基，每升含有：1.0g氯化铵、1.0g磷酸二氢钾、0.1g氯化镁、10mL微量元素溶液、10mL维生素溶液和0.17‑0.68g硝酸钠，余量为水；其中，每15天，硝酸钠浓度由0.17g/L依次提高至0.425g/L、 0.68g/L。所述的微量元素溶液，每升含30mg六水合氯化钴、0.15mg五水合氯化铜、5.7mg硼酸、20mg四水合氯化锰、25mg二水合钨酸钠、1.5mg二水合氯化镍、2.1mg氯化锌、5mg二水合氯化钙，余量为水。所述的维生素溶液，每升含有维生素B1、维生素B2、烟酸、泛酸、氨基苯甲酸、硫辛酸各50mg以及20mg维生素H、20mg叶酸、1mg维生素B12，余量为水。 [0038] 驯化结束后从富集驯化仓主体12中随机取表层3cm的沉积物1g，置于9mL无菌水中，震荡混匀获得10倍稀释度的泥悬液；再取1mL泥悬液置入9mL新的无菌水获得100倍稀释3 4 5 6 3 4 度的泥悬液，如此重复，获得10倍、10 倍、10倍和10 倍稀释度的泥悬液；取10 倍、10倍、 5 6 10倍和10倍稀释度的泥悬液各0.5mL，涂布到含芘的固体反硝化培养基上，在厌氧培养箱 28℃培养，约5天长出菌落后，在新的含芘的固体反硝化培养基上划线数次分离出单菌。含芘的固体反硝化培养基配制方法为，按上述反硝化培养基配方(其中硝酸钠的浓度为 425mg/L)加入终浓度为20g/L的琼脂，灭菌后倒平板，待培养基凝固后，用玻璃针管加入 0.2mL芘的正己烷溶液(浓度为0.15mg/mL)，在无菌环境中(酒精灯四周)待正己烷挥发干后，培养基表面形成一层浅白色的芘固体薄层，从而获得含芘的固体反硝化培养基。 [0039] 反硝化芘降解菌效果验证，挑取上述单菌，置于反硝化培养基(其中硝酸钠的浓度为425mg/L)中活化2天后，取2mL活化菌液加入到18mL含芘的(液体)反硝化培养体系中(其中芘的浓度为30g/L，硝酸钠的浓度为425mg/L，3个重复样)，厌氧28℃培养12天，加入10mL正己烷萃取，有机相用于测定芘的浓度，水相用于测定硝酸盐浓度；通过芘降解率筛选出一株高效的反硝化降解菌，鉴定为副球菌(Paracoccus sp.)，能将芘从30mg/L降解至13.83±0.24mg/L，降解率达53.9％，硝酸盐同步下降了72.6％。 [0040] 实施例2：富集筛选沉积物中金属抗性苯并芘降解菌试验 [0041] 在珠江广州航道某码头用底端接驳有富集驯化仓主体12的柱状采样器采集表层约5cm厚原状河道沉积物于富集驯化仓主体12(直径8.5cm，高25cm)中，将下盖13安装在富集驯化仓主体12的底部，从柱状采样器上取下富集驯化仓，下盖13的下端插入石英砂布水管；用玻璃针管，在沉积物表面随机均匀地滴加10mL苯并芘溶液(0.04mg/mL，溶剂为丙酮)，静置30min(等待表面丙酮挥发)后，缓慢往富集驯化仓主体12注入河水形成约12cm高的水层，富集驯化仓主体12盖上上盖11；在培养液供给部件4中加入600mL硝酸铅培养基；连接进出水软管31，用蠕动泵32控制流速(1mL/min)；30℃驯化培养60天，每15天更换培养液供给部件中的硝酸铅培养基。所用的硝酸铅培养基，每升含有：320mg硝酸铅(即含200mg铅离子)、2g硝酸钠、0.31g氯化铵、2.7722g二水合磷酸二氢钠、0.13g氯化钾、1.5420g十二水合磷酸氢二钠、12.5mL微量元素溶液和5mL维生素溶液，余量为水。所述的微量元素溶液，每升含30mg六水合氯化钴、0.15mg五水合氯化铜、5.7mg硼酸、20mg四水合氯化锰、25mg二水合钨酸钠、1.5mg二水合氯化镍、2.1mg氯化锌、5mg二水合氯化钙，余量为水。所述的维生素溶液，每升含有维生素B1、维生素B2、烟酸、泛酸、氨基苯甲酸、硫辛酸各50mg以及20mg维生素H、20mg叶酸、1mg维生素B12，余量为水。 [0042] 驯化结束后从富集驯化仓主体12中随机取沉积物120g，置于装有200mL硝酸铅培养基的锥形瓶中，滴加1mL苯并芘的丙酮溶液(0.1mg/mL)，在液面下通氮气10min后盖瓶盖密封，30℃避光培养7天后，震荡获得驯化泥悬液。取10mL驯化泥悬液，加到装有90mL硝酸铅培养基的锥形瓶中，滴加1mL苯并芘的丙酮溶液(0.4mg/mL)，30℃避光培养7天后，如此重复3 4 5 6 转接5次，获得菌悬液。用梯度稀释法获得稀释度10倍、10倍、10倍和10倍稀释菌悬液，在固体硝酸铅培养基上涂布，在厌氧培养箱30℃培养，约5天长出菌落后，在新的固体硝酸铅培养基上划线数次分离出单菌，取16S rDNA序列在GenBank比对，与噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)相似性达100％，称其为噬氨副球菌F2。固体硝酸铅培养基为上述硝酸铅培养基加入2％琼脂灭菌后倒入培养皿，冷却后均匀滴加100μL苯并芘丙酮溶液(1mg/mL)在凝固的琼脂培养基表面，在无菌环境中静置，让丙酮挥发彻底。 [0043] 取噬氨副球菌F2在含铅和不含铅的培养基中验证苯并芘降解效果，并以另一株在不含铅离子的环境中筛得的同为副球菌属的善变副球菌(Paracoccus versutus)A1作为对照。取上述单菌，置于液体培养基中活化2天后，取2mL活化菌液分别加入到18mL含铅(铅离子浓度为200mg/L，3个重复样)和不含铅(铅离子浓度为0mg/L，3个重复样)的培养基(配方同上述硝酸铅培养基，只是其中的硝酸铅的浓度不同；其中苯并芘浓度为4mg/L)，厌氧30℃培养12天，加入10mL丙酮萃取，有机相用于测定苯并芘的浓度；结果显示：(1)菌株F2在不含铅的培养基中将苯并芘从3.715±0.167mg/L降解至1.663±0.236mg/L，降解率为55.2％；(2)菌株A1在不含铅的培养基中将苯并芘从3.697±0.183mg/L降解至1.632±0.151mg/L，降解率为55.9％；(3)菌株F2在含铅的培养基中将苯并芘从3.700±0.114mg/L降解至1.720±0.116mg/L，降解率为53.5％；(4)菌株A1在含铅的培养基中将苯并芘从3.686±0.181mg/L降解至2.246±0.130mg/L，降解率为39.1％；可见菌株F2在铅离子压力的影响下相对于菌株A1仍保持对苯并芘较高的降解率，说明通过本方法的原状沉积物驯化获得的噬氨副球菌F2是一株具有铅离子抗性的苯并芘降解菌。 [0044] 实施例3：富集沉积物中总有机碳降解菌群试验 [0045] 在广东省佛山市某黑臭河涌用底端接驳有富集驯化仓主体12的柱状采样器采集表层约5cm厚原状河道沉积物于富集驯化仓主体12(直径8.5cm，高25cm)中，将下盖13安装在富集驯化仓主体12的底部，从柱状采样器上取下富集驯化仓，下盖13的下端插入进水管21和布水盘22，缓慢往富集驯化仓主体12注入河水形成约12cm高的水层，富集驯化仓主体 12盖上上盖11；在培养液供给部件4中加入600mL腐殖酸培养基；连接进出水软管31，用蠕动泵32控制流速(1.5mL/min)；常温(20～25℃)驯化培养20天，每5天更换培养液供给部件中的腐殖酸培养基，过程中逐步提高腐殖酸的浓度。具体为：所用的腐殖酸培养基，每升含有： 0.2g硫酸镁、0.25g硝酸钾和0.2‑6g腐殖酸，余量为水；其中，每5天，腐殖酸浓度由0.2g/L依次提高至0.4g/L、1.6g/L、6g/L。 [0046] 驯化结束后从富集驯化仓主体12中取0.5g沉积物置于9mL新鲜配制的富集腐殖酸培养基(富集腐殖酸培养基，每升含有：0.2g硫酸镁、0.25g硝酸钾和2g腐殖酸，余量为水)中，培养3天后取1mL腐殖酸培养液加到9mL新鲜配制的富集腐殖酸培养基中，如此传代5次，获得的腐殖酸培养液即为腐殖酸降解菌群。 [0047] 取1mL腐殖酸降解菌群投放到5mL黑臭河涌沉积物(含水率为50％、总有机碳含量为140.03±6.12mg/g)中25℃培养14天，共3个重复处理；取出沉积物冷冻干燥，测定总有机碳；结果显示总有机碳含量下降为103.80±3.90g/g，有机碳降解率达25.8％，说明成功富集了沉积物有机质降解菌群。 |
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